Análise de vitaminas Métodos ensaios biológicos em animais e
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4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos ensaios biológicos em animais e humanos apenas usados quando não existem métodos alternativos ensaios microbiológicos com protozoários, bactérias e leveduras requerem passos de extracção da vitamina resultados representam o teor total da vitamina numa dada matriz, não necessariamente a sua biodisponibilidade restritos a vitaminas hidrossolúveis lentos aplicáveis a diversos materiais biológicos, não necessitando de grandes modificações requerem menor preparação de amostra que os métodos físico-químicos Análise de vitaminas Métodos ensaios físico-químicos métodos espectrofotométricos, fluorimétricos, cromatográficos, enzimáticos, imunológicos e radiométricos requerem extracção das vitaminas resultados representam o teor total da vitamina numa dada matriz, não necessariamente a sua biodisponibilidade simples, precisos e rigorosos sobretudo os que usam HPLC aplicáveis à maioria das vitaminas 1 4/8/2007 Análise de vitaminas processos de extracção procedimentos específicos para cada vitamina usam: calor, ácidos, bases, solventes, enzimas ácido ascórbico extracção a frio com ácido metafosfórico/ácido acético vitaminas B1 e B2 aquecimento em ácido, seguido de tratamento enzimático niacina aquecimento em base (cereais) aquecimento em ácido (outros produtos) vitaminas A, E, D extracção com solvente orgânico, saponificação e nova extracção em solvente orgânico adição de antioxidantes Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina A adição de um antioxidante no início do procedimento pirogalol HPLC é único método capaz de dar resultados rigorosos ex. determinação de vitamina A em leite infantil trabalhar sempre com luz artificial fraca amostra saponificada vitamina A extraída com solvente orgânico e concentrada evaporação sob N2, com adição de hexadecano impedir degradação HPLC em coluna de sílica eluentes: heptano e isopropanol isocrático UV, 340 nm determinação de trans-retinol e cis-retinol 2 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina A cálculos trans-retinol(mg/mL) = AT x WT x DF A ST V AT – área do pico de trans-retinol na amostra AST – área do pico de trans-retinol no padrão WT – peso da amostra (mg) DF – factor de diluição V – volume da amostra (mL) cis-retinol(mg/mL) = AC x WC x DF A SC V AC – área do pico de cis-retinol na amostra ASC – área do pico de cis-retinol no padrão WC – peso da amostra (mg) DF – factor de diluição V – volume da amostra (mL) Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina E presente nos alimentos como 8 diferente compostos todos 6-hidroxicromanos , , , tocoferóis , , , tocotrienóis insaturados amostra saponificada sob refluxo, extraída com hexano e injectada num HPLC de fase normal detector de fluorescência ex = 290 nm; em = 330 nm para margarinas e cremes de barrar amostra dissolvida em hexano adiciona-se MgSO4 para remover água extracto filtrado e analisado em HPLC amostras de óleo são dissolvidas em hexano e directamente injectadas em HPLC 3 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina E Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina E saponificação feita na presença de pirogalol (antioxidante) e ao abrigo da luz quantificação feita por padrão externo 4 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C ácido L-ascórbico + ácido L-dehidroascórbico oxidação favorecida a pH elevado e na presença de iões Fe3+ e Cu2+ análise feita a baixo pH e na presença de agente quelante Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C titulação com 2,6-dicloroindofenol ácido L-ascórbico oxidado pelo indicador no ponto final, indicador que não reage é rosado em meio ácido ácido L-dehidroascórbico determinado após conversão em ácido L-ascórbico 5 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C em soluções coradas, ponto final determinado por absorção electrónica a 545 nm cálculos ácido ascórbico (mg/mL) = C x V x DF WT C – mg ácido ascórbico/mL indicador V – volume de indicador usado na titulação (mL) WT – peso da amostra (g) DF – factor de diluição Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C método microfluorométrico mede ácido L-ascórbico e ácido L-dehidroascórbico ácido ascórbico oxidado a ácido L-dehidroascórbico com o-fenilenediamina forma composto fluorescente ex = 356 nm, em = 440 nm cálculos ácido ascórbico (mg/mL) = A-B DF xSx C-D WT A e C – fluorescência da amostra e do padrão B e D – fluorescência dos brancos da amostra e do padrão S – concentração do padrão (mg/mL) WT – peso da amostra (g) DF – factor de diluição 6 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C ex: determinação de vitamina C por colorimetria com redução de iões cúpricos extracção (amostras húmidas - vegetais): picar amostra e pesar ~50 g adicionar 2 vezes peso de solução ácido metafosfórico a 5% homogeneizar em liquidificador retirar 5 – 20 g do extracto para balão de 100 mL completar volume com H2O agitar desprezar ~30 mL e adicionar 2 mL clorofórmio agitar e deixar sedimentar fase de CHCl3 fica no fundo com fenóis, terpenos, vitaminas lipossolúveis, pigmentos e lípidos Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C extracção (amostras secas – leite em pó, sopas em pó, sumos em pó, …): pesar ~1 - 4 g de amostra finamente moída transferir para tubo de 70 mL com tampa de rosca adicionar 20 mL de H2SO4 0.1 N e ácido metafosfórico 5% (1:1) adicionar 2 mL CHCl3 tapar e agitar deixar separar fases ou centrifugar CHCl3 dissolve lípidos ácido ascórbico fica na fase aquosa 7 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina C reacção: medir 5 mL da fase aquosa adicionar 1 mL de tampão acetato pH 4.6 e 5 mL de um reagente de complexação 95 mL de acetato cúprico 0.075% em álcool isoamílico + 5 mL 2,2-biquinolina 0.4% em tolueno tapar e agitar deixar separar fases ou centrifugar medir 3 mL da fase superior (álcool isoamílico) e adicionar 0.5 mL EtOH EtOH para clarificar ler absorvância a 545 nm contra branco construir curva padrão Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina B1 (tiamina) fosfatos de tiamina são extraídos e sofrem hidrólise enzimática segue-se purificação por cromatografia de permuta iónica tiamina oxidada a tiocromo determinado por fluorescência ex = 365 nm, em = 435 nm 8 4/8/2007 Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina B1 tiocromo é fotosensível análise feita sob luz fraca cálculos tiamina (μg/g) = S - Sb Std - Stdb x V C 25 x x 0 A VP WT S e Sb – fluorescência da amostra e do padrão Std e Stdb – fluorescência dos brancos da amostra e do padrão C – concentração do padrão (g/mL) A – volume da alíquota (mL) 25 – volume eluído na coluna (mL) Vp – volume que atravessa a coluna (mL) V0 – volume de diluição da amostra (mL) WT – peso da amostra (g) Análise de vitaminas Métodos químicos vitamina B2 (riboflavina) extracção, seguida de purificação determinação por fluorimetria ex = 440 nm, em = 565 nm riboflavina muito sensível a luz UV trabalhar sempre com luz pouco intensa riboflavina não dissolve bem em água cuidado a preparar padrões cálculos riboflavina (mg/g) = A-C CS DF x x B-A V WT A e C – fluorescência da amostra contendo respectivamente água e hidrossulfito de sódio B – fluorescência da amostra contendo padrão CS – concentração do padrão (mg/mL) V – volume da amostra (mL) WT – peso da amostra (g) DF – factor de diluição 9
