AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Trypanosoma cruzi DE

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE
SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
TANIRA MATUTINO BASTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Trypanosoma cruzi DE
NITROSILO/NITRO COMPLEXOS DE RUTÊNIO EM
MODELOS EXPERIMENTAIS IN VITRO E IN VIVO
Feira de Santana, BA
2013
TANIRA MATUTINO BASTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Trypanosoma cruzi DE
NITROSILO/NITRO COMPLEXOS DE RUTÊNIO EM
MODELOS EXPERIMENTAIS IN VITRO E IN VIVO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
a
a
Orientadora: Prof . Dr . Milena Botelho Pereira Soares
Feira de Santana, BA
2013
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todas as pessoas que me apoiaram durante esses 2
anos de mestrado e contribuíram para um período de muito aprendizado e
dedicação. Em especial, à Dra. Milena Botelho Pereira Soares, pela oportunidade de
fazer parte da equipe LETI e pela orientação e ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia/UEFS pela organização e eficiência. Agradeço também ao Professor
Alzir Azevedo Batista pela disponibilização dos compostos e a CAPES, pelo apoio
financeiro. Além disso, gostaria de agradecer aos colegas do LETI e CBTC pelo
convívio e pela contribuição na realização dos experimentos, especialmente ao
grupo Chagas (Cássio Meira e Elisalva Guimarães) pelas discussões, sessões e
crescimento do grupo, além do auxílio nos diferentes experimentos; a Diogo Rodrigo
de Magalhães Moreira pelo experimento da cruzaína; ao Serviço de Microscopia
Eletrônica pelo apoio com microscopia eletrônica; a Danielle Oliveira dos Anjos e
Carine Azevedo pela contribuição no experimento de detecção de vacúolos
autofágicos. Gostaria de agradecer também a Lucyvera Imbroinise pelo suporte
durante o mestrado. Por fim agradeço aos meus familiares e aos queridos amigos,
além do meu grande amor, Vinícius, pela compreensão, amizade, companheirismo,
alegria (...) enfim, por tudo aquilo que vocês me proporcionam e por existirem na
minha vida.
“(...) o laboratório representa em nossa terra uma esperança. Dele
esperamos esclarecidos os inúmeros problemas de patologia tropical, que
por aí prevalecem obscuros, zombando da sagacidade dos observadores e
cujas incógnitas estão repletas das ilações as mais benéficas ao nosso
bem-estar.”
Carlos Chagas, 1903.
RESUMO
Os fármacos nifurtimox e benzonidazol têm sido utilizados no tratamento da doença
de Chagas desde os anos 70. Ambos podem induzir efeitos colaterais nos pacientes
e não possuem eficácia na fase crônica. Portanto, se torna necessária a
identificação de medicamentos mais eficientes e menos tóxicos para o tratamento
desta doença. A síntese de complexos de metais de transição, especialmente o
rutênio, tem sido intensificada ao longo dos anos devido ao interesse nas aplicações
biológicas destes compostos. Este estudo teve, como objetivo, avaliar a atividade
anti-Trypanosoma cruzi dos nitro/nitrosilo complexos de rutênio, cis[RuCl(NO2)(dppb)(5-me93bipy)] (1), cis-[Ru(NO2)2(dppb)(5-mebipy)] (2), ct[RuCl(NO)(dppb)(5-mebipy)](PF6)2 (3) e cc-[RuCl(NO)(dppb)(5-mebipy)](PF6)2 (4).
Foram avaliadas a citotoxicidade, a atividade anti-T. cruzi in vitro e in vivo e a
inibição da atividade enzimática da cruzaína. Foi também avaliado o mecanismo de
ação do composto 3, o mais ativo dentre os demais. Os 4 compostos apresentaram
baixa citotoxicidade e atividade tripanocida para as três formas evolutivas do
parasito. Apenas o composto 1 não inibiu a forma epimastigota. Em relação à
atividade enzimática, o composto 2 foi o único que não inibiu a cruzaína. Em relação
ao composto 3, os parasitos tratados com este composto apresentaram alterações
na membrana e presença de vacúolos correlacionados às marcações positivas para
iodeto de propídio e monodansilcadaverina, respectivamente. Além disso, o
tratamento proporcionou redução de parasitemia e aumento de sobrevida dos
camundongos infectados. Desta forma, os nitro/nitrosilo complexos de rutênio
representam uma classe de fármacos em potencial para o tratamento da doença de
Chagas.
Palavras-chave: Doença de Chagas. Complexo de rutênio. Óxido nítrico. Atividade
tripanocida. Autofagia.
ABSTRACT
Nifurtimox and benznidazole have been used to treat Chagas’ disease since the 70s.
Both drugs can induce side effects on the patients and are not effective when given
during the chronic phase. Therefore, more efficient drugs with lower toxicity are
needed for the treatment of this disease. The synthesis of complexes of transition
metals, especially ruthenium has been increased over the years due to the interest in
the biological applications of these compounds. The present study aimed to evaluate
the activity of anti-Trypanosoma cruzi of nitro/nitrosyl ruthenium complexes, cis[RuCl(NO2)(dppb)(5-mebipy)]
(1),
cis-[Ru(NO2)2(dppb)(5-mebipy)]
(2),
ct[RuCl(NO)(dppb)(5-mebipy)](PF6)2 (3) and cc-[RuCl(NO)(dppb)(5-mebipy)](PF6)2 (4).
We evaluated the cytotoxicity, anti-T. cruzi activity in vitro and in vivo, and inhibition
of cruzain enzyme activity. We also evaluated the mechanism of action of compound
3, the most active among the others. All compounds showed low cytotoxicity and
trypanocidal activity against the three evolutionary forms of the parasite. Only
compound 1 did not inhibit the epimastigote form. Regarding the enzymatic activity,
compound 2 was the only one who did not inhibit the cruzain activity. Treatment with
compound 3 caused changes in the membrane and vacuoles of the parasites,
correlated to positive stains for propidium iodide and monodansylcadaverine,
respectively. Moreover, the treatment with compound 3 caused a reduction of
parasitemia and increased survival of infected mice. Thus, the nitro/nitrosyl ruthenium
complexes represent a potential class of drugs for the treatment of Chagas' disease.
Keywords: Chagas’ disease. Ruthenium complex. Nitric oxide. Trypanocidal activity.
Autophagy.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
8
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
2.2 ESPECÍFICOS
10
10
10
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 HISTÓRICO DA DOENÇA DE CHAGAS
3.2 PATOGENIA DA DOENÇA DE CHAGAS
3.3 TRASMISSÃO DA DOENÇA DE CHAGAS
3.4 EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
3.5 TRATAMENTOS DISPONÍVEIS
3.6 DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FÁRMACOS ANTI-T.cruzi
11
11
12
12
14
16
18
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 COMPLEXOS DE RUTÊNIO
4.2 ANIMAIS
4.3 PARASITOS
4.4 CULTIVO DE PARASITOS
4.5 ENSAIOS IN VITRO
4.5.1 Obtenção de macrófagos peritoneais
4.5.2 Avaliação de citotoxicidade
4.5.3 Avaliação da ação tripanocida
4.5.4 Infecção de macrófagos peritoneais por T. cruzi
4.5.5 Ensaio de inibição enzimática – cruzaína
4.5.5.1 Expressão e purificação cruzaína recombinante
4.5.5.2 Determinação da atividade inibitória
4.5.6 Avaliação de alterações ultraestruturais nos parasitos
4.5.6.1 Microscopia eletrônica de transmissão
4.5.6.2 Microscopia eletrônica de varredura
4.5.7 Marcação de vacúolos autofágicos
4.5.8 Dosagem de óxido nítrico (NO)
4.5.9 Marcação de células apoptóticas e necróticas
4.6 ENSAIO IN VIVO
4.6.1 Infecção e tratamento
4.6.2 Avaliação da parasitemia e mortalidade
4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
22
22
25
25
26
26
26
27
27
28
29
29
30
31
31
32
32
33
33
34
34
34
35
5 RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO TRIPANOCIDA IN VITRO
5.1.1 Avaliação da inibição enzimática
5.2 AVALIAÇÃO TRIPANOCIDA IN VIVO
5.3 AVALIAÇÃO TRIPANOCIDA – COMPOSTO 3
5.3.1 Avaliação in vivo
5.3.2 Avaliação in vitro
5.3.2.1 Infecção de macrófagos
5.3.2.2 Avaliações de alterações ultraestruturais
36
36
39
40
42
42
44
44
46
5.3.2.3 Marcação de vacúolos autofágicos
5.3.2.4 Dosagem de NO
5.3.2.5 Marcação de células apoptóticas e necróticas
50
52
52
6 DISCUSSÃO
54
7 CONCLUSÃO
59
REFERÊNCIAS
60
ANEXO
66
8
1 INTRODUÇÃO
As
doenças
negligenciadas
representam
hoje
cerca
de
90%
das
enfermidades que acometem a população de países pobres ou em desenvolvimento
e é estimado que menos de 10% das pesquisas globais envolvendo saúde são
dedicadas a elas (GLOBAL FORUM FOR HEALTH RESEARCH, 2002). Esse
descompromisso tem contribuído para a limitada disponibilidade de medicamentos
no tratamento de diferentes doenças, como a doença de Chagas (CHAGAS, 1909),
uma zoonose causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi.
As únicas opções de tratamento existentes por mais de quarenta anos têm
sido os fármacos benzonidazol e nifurtimox. Estes medicamentos são considerados
mais eficazes na fase aguda da doença, com uma taxa de cura em torno de 80%, e
menos eficazes em pacientes que evoluíram para a fase crônica. Além disso, o
benzonidazol e o nifurtimox não são considerados medicamentos ideais, uma vez
que os seus efeitos colaterais podem ser graves, e já existem relatos de cepas
resistentes a estas drogas (CLAYTON, 2010a). Sendo assim, existe uma grande
necessidade de novas pesquisas objetivando a identificação de possíveis moléculas
com atividade tripanocida, para o tratamento da doença de Chagas, tanto na fase
aguda, devido à ocorrência de novos casos em algumas regiões endêmicas da
América Latina e em regiões não endêmicas ao redor do globo, quanto na fase
crônica, que corresponde à forma mais prevalente da doença e com menores
opções de tratamentos disponíveis e eficazes.
Atualmente,
as
investigações
laboratoriais
demonstram
a
atividade
tripanocida de novas moléculas em modelos animais. Dentre elas, estão os
inibidores de cruzaína não peptídicos, inibidores da enzima esterol 14α-desmetilase,
os novos compostos sintéticos, tais como a arylimidamida DB766, os derivados de
nifurtimox, os complexos de rutênio e vários produtos naturais (BUCKNER &
NAVABI, 2010).
Em relação aos complexos de rutênio, a aplicação mais recente desta
abordagem utilizou esta classe de compostos para fornecer óxido nítrico às células
infectadas com o T. cruzi (GUEDES et al., 2010; SILVA et al., 2009; SILVA et al.,
2010).
9
O óxido nítrico (NO) tem um papel importante na resistência da célula
hospedeira à infecção por protozoários, incluindo o T. cruzi (WAGHABI et al., 2005).
Tem sido demonstrado, em modelo experimental de fase aguda, que camundongos
deficientes na expressão da enzima sintase induzível de óxido nítrico (iNOS) são
suscetíveis à infecção por T. cruzi, proporcionando o aumento da parasitemia e
consequente, mortalidade (HOLSCHER et al., 1998).
Com base nos estudos tripanocidas realizados com compostos metálicos e
nos conhecimentos sobre a importância do NO no controle da infecção, este
trabalho propôs a utilização de nitrosilo/nitro complexos de rutênio para a realização
de testes in vitro e in vivo para avaliar a atividade anti-T. cruzi, buscando, assim,
uma nova alternativa terapêutica para o tratamento da doença de Chagas.
10
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Identificar novos nitrosilo/nitro complexos de rutênio com atividade anti-T.
cruzi.
2.2 ESPECÍFICOS
- Avaliar o potencial citotóxico de quatro complexos de rutênio;
- Verificar a capacidade destes compostos em inibir o crescimento da forma
epimastigota em cultura axênica e a viabilidade da forma tripomastigota;
- Avaliar a capacidade dos compostos em inibir a replicação da forma
amastigota em macrófagos peritoneais infectados pelo T. cruzi;
- Avaliar a capacidade destes complexos de rutênio em inibir a atividade da
cruzaína;
- Avaliar a atividade tripanocida destes complexos em modelo de infecção in
vivo;
- Verificar a presença de alterações ultraestruturais decorrentes do tratamento
in vitro do composto mais ativo;
- Avaliar a morte parasitária em decorrência do tratamento com o composto
mais ativo.
11
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 HISTÓRICO DA DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas e seu agente causal foram descobertos no Brasil por
Carlos Chagas em 1909 (CHAGAS, 1909). Os vetores desta doença, mais de 150
espécies de triatomíneos, principalmente dos gêneros Triatoma, Panstrongylus e
Rhodnius, foram capazes de transmitir a doença, como uma enzoose, entre as mais
de cem espécies de mamíferos, sobretudo de espécies silvestres (marsupiais,
quirópteros, roedores, edentados, carnívoros, logomorfos e primatas) por quase dez
milhões de anos (revisto por COURA & VIÑAS, 2010).
A chegada dos seres humanos na América e o consequente aumento das
atividades agrícolas e da domesticação de animais proporcionaram a transmissão
acidental de T. cruzi na população humana, e a doença de Chagas, por milhares de
anos, passou a ser considerada uma antropozoonose (revisto por COURA & DIAS,
2009).
Evidências da presença de Triatoma infestans em habitações humanas em
tempos pré-colombianos, como nas culturas Inca e Chinchorro, e a identificação de
DNA de T. cruzi em múmias encontradas no norte do Chile e sul do Peru, com
datações de nove mil anos indicam uma introdução gradual da transmissão
domiciliar da doença de Chagas (AUFDERHEIDE et al., 2004).
Nos últimos 200-300 anos, como resultado do desmatamento provocado pela
expansão da agricultura e agropecuária, além da abertura de vias terrestres de
transporte, os insetos silvestres se adaptaram ao ambiente doméstico na procura de
nova fonte alimentar, a exemplo do sangue de animais domésticos e de seres
humanos. Deste modo, um novo ciclo de infecção foi estabelecido e a doença de
Chagas passou a ser classificada como uma zoonose, isto é, uma doença que se
transmite entre animais e seres humanos endemicamente (revisto por ZINGALES,
2011).
12
3.2 PATOGENIA DA DOENÇA DE CHAGAS
A infecção chagásica apresenta duas fases bem distintas: fase aguda e fase
crônica. A fase aguda é caracterizada por alta parasitemia e apresenta diferentes
manifestações clínicas, sendo elas: assintomática, oligossintomática ou sintomática.
Na
forma
sintomática
hepatoesplenomegalia,
observa-se
alteração
a
bipalpebral
presença
de
unilateral
(sinal
adenomegalia,
de
Romaña),
miocardite e meningoencefalite (revisto por COURA, 2003). A fase aguda pode levar
a mortalidade em até 10% dos casos graves, principalmente por meningoencefalite,
sendo que, esta manifestação clínica é quase sempre fatal nos menores de dois
anos de idade, segundo observações de próprio Carlos Chagas (CHAGAS, 1916).
Após um período de latência de 10 a 15 anos, no qual os indivíduos
permanecem assintomáticos na chamada forma indeterminada, em torno de 40 a
50% dos pacientes podem evoluir para os três tipos principais de doença crônica
(forma cardíaca, digestiva ou mista). A forma cardíaca é caracterizada por miocardite
crônica, insuficiência cardíaca e eventualmente morte súbita, por arritmia cardíaca.
Já a forma digestiva é caracterizada pela presença de megaesôfago e megacólon,
ou seja, aumento exagerado do esôfago ou cólon por contração dos esfíncteres
correspondentes. A forma mista é caracterizada pela presença da forma cardíaca e
digestiva, simultaneamente (revisto por COURA, 2003).
3.3 TRASMISSÃO DA DOENÇA DE CHAGAS
Classicamente, a doença de Chagas é transmitida pela via vetorial (CHAGAS,
1909), ou seja, através das fezes de triatomíneos contendo a forma tripomastigota
metacíclica do parasito. O triatomíneo se infecta através do repasto sanguíneo,
alimentando-se do sangue de um mamífero infectado com a forma tripomastigota
sanguícola. Dentro do inseto, o parasito se diferencia em epimastigota e se replica
no intestino do vetor por divisão binária. Antes de emergir em suas fezes a forma
epimastigota é diferenciada em tripomastigota metacíclica (revisto por GARCIA &
AZAMBUJA, 1991).
13
Quando o triatomíneo infectado realiza o repasto sanguíneo, ele defeca na
pele da vítima, depositando T. cruzi junto às fezes. O parasito também é capaz de
penetrar no novo hospedeiro através de cortes e abrasões na pele ou através dos
olhos ou da boca (revisto por GARCIA & AZAMBUJA, 1991).
O parasito pode infectar macrófagos e uma variedade de outras células, com
predominância de células do baço, fígado, linfonodos, tecido conjuntivo intersticial,
miocárdio ou músculos esqueléticos. A forma intracelular e replicativa nos
mamíferos, amastigota, se multiplica nos tecidos formando pseudocistos que se
rompem liberando as tripomastigotas sanguícolas na corrente sanguínea. Alguns
parasitos, sob a forma de tripomastigota, recirculam e voltam a se localizar em
outras células, reiniciando o ciclo (revisto por COURA, 2003) (Figura 1).
Figura 1 – Ciclo de vida do T. cruzi, o agente causal da doença de Chagas.
Fonte: Center for Disease Control and Prevention.
Nos últimos anos, a maioria dos novos casos da doença de Chagas está
relacionada às transmissões pelas vias oral, congênita e por transfusão de sangue.
No Brasil a via oral representa a principal forma de infecção atualmente. Também
14
são formas de transmissão o acidente de laboratório, a manipulação de animais
infectados, o transplante de órgãos e o ato sexual (feridas, esperma ou fluidos
menstruais) (COURA, 2007).
3.4 EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
A Organização Mundial de Saúde estima que existam 10 milhões de pessoas
infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina, onde
a doença de Chagas é endêmica. Estima-se que mais de 25 milhões de pessoas
estão em risco de doença e que, em 2008, esta doença tenha matado mais de
10.000 pessoas. (OMS, 2010).
No Brasil, atualmente, predominam os casos crônicos de doença de Chagas
decorrentes de infecções adquiridas no passado, com aproximadamente 3 milhões
de indivíduos infectados. No entanto, nos últimos anos, a ocorrência de doença de
Chagas aguda tem sido observada principalmente nos estados da Amazônia Legal,
com casos isolados em outros estados. No período de 2000 a 2011, foram
registrados no Brasil 1.252 casos de doença de Chagas aguda. Destes, 70%
(877/1.252) foram por transmissão oral, 7% por transmissão vetorial (92/1.252), e em
22% (276/1.252) dos casos não foi identificada a forma de transmissão
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).
Casos agudos resultantes da contaminação oral têm sido documentados por
surtos em diferentes localidades, com maior frequência na região amazônica, onde o
fruto do açaizeiro é uma importante fonte de contaminação (revisto por MONCAYO &
SILVEIRA, 2009). Outros casos de contaminação por via oral também já foram
documentados na Venezuela, Guiana Francesa e nas regiões nordeste e sul do
Brasil (revisto por ZINGALES et al., 2012). Em 2007, em uma escola em Caracas,
Venezuela, 103 crianças foram infectadas com o consumo de suco de goiaba
contaminado. Destas, 75 apresentaram sintomatologia para doença de Chagas
aguda e uma criança veio a óbito (ALARCÓN DE NOYA et al., 2010). No Brasil, em
2005, 24 casos agudos da doença foram registrados em Santa Catarina, e todos
eles foram relacionados com a ingestão de caldo de cana contaminado com o
parasito (STEINDEL et al., 2008).
15
A doença de Chagas endêmica na América Latina começou como uma
doença negligenciada de populações pobres e rurais. A urbanização da população
rural na América Latina fez com que a doença de Chagas se tornasse um importante
problema de saúde pública, introduzindo novos riscos, tais como a possibilidade de
transmissão de T. cruzi por meio de transfusão sanguínea (revisto por COURA &
VIÑAS, 2010).
No Brasil, em 2010, a Resolução da Diretoria Colegiada – RDC N° 57 passou
a determinar a triagem sorológica para a doença de Chagas nas transfusões
sanguíneas. Atualmente os bancos de sangue estão controlados no Brasil e em
muitos outros países da América Latina. Entretanto, o sangue infectado ainda é um
grande problema na Bolívia, onde, em cidades como Santa Cruz de la Sierra e
Cochabamba, até a metade de doadores de sangue podem estar infectados com o
T. cruzi (revisto por COURA & VIÑAS, 2010).
O aumento da migração da população no mundo mudou o cenário da
distribuição da doença de Chagas, principalmente entre os países não endêmicos. O
movimento populacional dos países endêmicos para os países não endêmicos, além
da possibilidade de transmissão da doença de Chagas por transfusão de sangue,
transplante de órgãos e via congênita, favoreceram a entrada do T. cruzi em
diferentes regiões geográficas, incluindo a América do Norte (Estados Unidos e
Canadá), oeste do Pacífico (principalmente Japão e Austrália) e, mais recentemente,
Europa (sobretudo a Bélgica, Espanha, França, Itália, Reino Unido e Suíça, e, em
menor grau Alemanha, Áustria, Croácia, Dinamarca, Holanda, Luxemburgo,
Noruega, Portugal, Romênia e Suécia) (SCHMUNIS, 2007).
Estima-se que mais de 300.000 indivíduos estejam infectados com o T. cruzi
nos Estados Unidos, mais de 5.500 no Canadá, mais de 80.000 na Europa e na
região do Pacífico ocidental, mais de 3.000 no Japão e mais de 1.500 na Austrália
(Figura 2) (SCHMUNIS, 2007).
16
Figura 2 – Rotas de migração da América Latina e estimativa do número total de indivíduos
infectados em países não endêmicos.
Fonte: COURA & VIÑAS, 2010.
Esses movimentos populacionais começaram a criar novos desafios
epidemiológicos, econômicos, sociais e políticos, uma vez que em decorrência do
novo cenário de distribuição da doença de Chagas, a necessidade de melhorar o
sistema de vigilância sanitária, com triagem sorológica nos bancos de sangue e
controle no transplante de órgãos, além da inclusão do diagnóstico diferencial e
tratamento específico para a doença de Chagas nos países não endêmicos se torna
urgente (COURA & VIÑAS, 2010).
3.5 TRATAMENTOS DISPONÍVEIS
Existe uma urgente necessidade de mais opções de tratamento para a
doença de Chagas. Os medicamentos existentes, benzonidazol e nifurtimox (figura
3), foram introduzidos na clínica há mais 40 anos atrás e apresentam eficácia
limitada no tratamento da fase crônica da infecção (revisto por COURA, 2003). Além
disso, já existem casos de cepas resistentes aos medicamentos na infecção aguda,
que requer longos períodos de tratamento (60 dias para o benzonidazol e até 90
dias para nifurtimox). A deficiência no sistema de saúde de muitas comunidades
17
rurais e pobres, em países endêmicos, também contribui para a redução da eficácia
do tratamento e o favorecimento de mecanismos de resistência aos medicamentos,
em decorrência da infraestrutura limitada e da falta de suporte para oferecer o
tratamento completo aos pacientes (CLAYTON, 2010b). Ambos os medicamento
podem causar efeitos colaterais potenciais, incluindo erupções cutâneas, náuseas e
insuficiência renal e hepática, além de convulsões e outros distúrbios do sistema
nervoso que o nifurtimox também pode causar (revisto por CLAYTON. 2010b).
A
B
Figura 3 – Estrutura química dos medicamentos benzonidazol (A) e nifurtimox (B)
O benzonidazol, um derivado 2-nitroimidazólico, e o nifurtimox, um derivado
5-nitrofurano, fazem parte de uma mesma família, a dos nitroheterocíclicos, mas
possuem diferentes grupos químicos e apresentam diferentes mecanismos de ação
contra o T. cruzi. A ação tripanocida do nifurtimox deve-se a redução metabólica do
grupo nitro gerando radicais nitroânion muito reativos e tóxicos ao parasito
(DOCAMPO & STOPANI, 1979). Acredita-se que o mecanismo de ação do
benzonidazol está envolvido com a ligação covalente de seus intermediários
nitroreduzidos a vários componentes celulares como DNA, proteínas e lipídios,
provocando a inibição do crescimento dos parasitos (DIAS DE TORANZO et al.,
1988).
18
3.6 DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FÁRMACOS ANTI-T. cruzi
Investigações bioquímicas e fisiológicas comparativas entre o parasito e o
hospedeiro representam uma interessante abordagem racional na quimioterapia
antiparasitária. A identificação de diferenças em processos metabólicos essenciais
ao parasito, mas não no hospedeiro, permite a inibição seletiva ao parasito, com
consequente redução dos possíveis efeitos adversos do tratamento (revisto por
SOEIRO & de CASTRO, 2011).
Além da determinação de alvo(s) específico(s) identificado(s) em vias
metabólicas chave para o parasito, outros métodos também estão sendo utilizados
na busca de novas quimioterapias para as doenças parasitárias. Dentre eles, o
reposicionamento de fármacos, ou seja, o uso de fármacos já aprovados no
tratamento de outras doenças, uma vez que já foram submetidos a ensaios clínicos
dispendiosos (revisto por CLAYTON. 2010b) e a terapia combinada (COURA, 2009).
Estudos recentes têm permitido a identificação de alvos potenciais em T.
cruzi, que incluem o metabolismo de esteróis, o DNA e diferentes enzimas, tais
como as cisteíno-proteases (revisto por SOEIRO & de CASTRO, 2011). O T. cruzi
possui uma cisteíno-protease semelhante à L-catepsina denominada de cruzipaína
(ou cruzaína), que é a principal responsável pela atividade proteolítica envolvida em
vários processos vitais, em todos os estágios do ciclo evolutivo do parasito
(SCHARFSTEIN et al., 1986; CAMPETELLA et al., 1990; SOUTO-PADRON et al.,
1990).
É descrito na literatura que a cruzaína parece ser importante para a
sobrevivência do parasito, para o seu crescimento e diferenciação celular (DOS
REIS et al., 2006; MCKERROW et al., 2006). Além disso, foi demonstrado que esta
enzima desempenha papel importante no processo de internalização do parasito em
células de mamíferos (SOUTO-PADRON et al., 1990) e na replicação intracelular do
T. cruzi (MEIRELLES et al., 1992).
Diante da importância desta enzima, a inibição da cruzaína do T. cruzi tem
sido proposta como uma abordagem terapêutica para o tratamento da doença de
Chagas.
Entre os inibidores da cruzaína, o composto K777 apresentou atividade
tripanocida in vitro, bloqueando a proliferação de ambas as formas replicativas do
parasito, epimastigota e amastigota, além da metaciclogênese (diferenciação de
19
epimastigotas em tripomastigotas metacíclicas). Este composto também foi capaz de
reduzir os níveis de parasitemia e prolongar a sobrevivência de camundongos
infectados em modelos de infecção aguda e crônica da doença de Chagas, com
mínima de toxicidade (ENGEL et al., 1998).
Além da cruzaína, outras enzimas têm importância fundamental na
sobrevivência do parasito e representam alvos atraentes na síntese de inibidores
para a terapia anti-chagásica. Dentre elas, a tripanotiona redutase, hipoxantinaguanina fosforibosiltransferase, a diidrofolato redutase, a gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase e as enzimas da síntese de esteróis, como C14-esterol desmetilase,
esqualeno sintetase e oxidosqualeno ciclase (revisto por SOEIRO & de CASTRO,
2011). Ensaios pré-clínicos com diferentes inibidores têm sido realizados, mas o
potencial clínico destes compostos só poderá ser determinado a médio e longo
prazo (10-15 anos) (revisto por URBINA, 2010).
Dentre os compostos testados contra o T. cruzi nas últimas três décadas, os
inibidores da biossíntese de ergosterol são considerados bons candidatos no
desenvolvimento da nova terapia para a doença de Chagas. Dentre os mais
promissores estão alguns novos derivados de triazol que são capazes de inibir a
enzima C14-esterol desmetilase do parasito. Os ensaios pré-clínicos de dois deles,
posaconazol e ravuconazol, demonstram atividade anti-T. cruzi promissora. Como
resultado, o posaconazol e um pró-fármaco do ravuconazol (E1224) estão sendo
avaliados em estudos clínicos de fase II para a doença de Chagas (revisto por
BUCKNER & URBINA, 2012). Apesar de promissores, o elevado custo para a
fabricação destes compostos pode representar um obstáculo na terapia da doença
de Chagas (revisto por URBINA, 2010).
Os compostos de coordenação, assim como o rutênio, mostram-se
promissores
agentes
terapêuticos,
exibindo
interessantes
propriedades
farmacológicas para aplicações metalofarmacêuticas (revisto por TFOUNI et al.,
2012). Assim, a síntese de novos complexos de rutênio, especialmente os doadores
de NO, representa uma alternativa interessante para o tratamento da doença de
Chagas (NAPOLI & IGNARRO, 2003), uma vez que é descrita na literatura a
atividade tripanocida de clássicos doadores de NO, como SNAP (S-nitroso-acetilpenicilamina) e SNP (nitroprussiato de sódio) como efeito do NO gerado (BOCEDI et
al., 2004).
20
As concentrações fisiopatológicas de NO produzidas durante a fase inicial da
infecção aguda da doença a partir dos macrófagos podem participar da morte
parasitária por mecanismos dependentes de NO (VESPA et al., 1994). A infecção
aguda da doença de Chagas induz o aumento de IL-12 e TNF-α, proporcionando a
produção de IFN-γ e a consequente expressão de iNOS, ou seja, a ativação de
síntese de NO que possui atividade tripanocida (GAZZINELLI et al., 1992;
CARDILLO et al., 1996). Já a inibição de iNOS reduz o efeito tripanocida, sugerindo
que o NO tem efeito inibitório no crescimento do parasito (SILVA et al., 1995;
CARDILLO et al., 1996).
Tem sido descrito na literatura o uso de diferentes complexos de rutênio
doadores de NO na terapia da doença de Chagas (GUEDES et al., 2010; SILVA et
al., 2007; SILVA et al., 2009; SILVA et al., 2010). GUEDES et al., 2010 descrevem a
redução da carga parasitária e da inflamação cardíaca, além da sobrevivência de
100% dos camundongos tratados com o composto trans-[RuCl([15]aneN4)NO]2+ em
modelo experimental de fase aguda da doença de Chagas. Em relação aos ensaios
in vitro, este composto apresentou atividade 10 e 100 vezes superior em relação ao
benzonidazol quando testados em amastigotas e tripomastigotas, respectivamente.
SILVA et al. (2010) descreveram a atividade anti-T.cruzi de diferentes
complexos de rutênio e sugeriram que os compostos cis-[Ru(NO)(bpy)2L](PF6)n são
eficazes agentes tripanocidas por um mecanismo envolvendo a S-nitrosilação da
Cys 166 presente no sítio ativo da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH) do parasito. SILVA et al. (2009) descreveram outra classe de complexos
de rutênio, trans-[Ru(NO)(NH3)4L]3+, e também demonstraram a atividade tripanocida
de alguns destes compostos, tais como o [Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3. Os resultados in
vivo demonstram ausência de ninhos de amastigota no tecido do miocárdio e
sobrevivência dos animais tratados com a dose de 400 nmol/kg/dia, durante 15 dias.
SILVA et al. (2007) sugerem que o NO liberado após redução dos nitrosilos
complexos
de
rutênio
trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3
e
trans-
[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 é o agente terapêutico responsável pela atividade
tripanocida destes compostos.
A estratégia do uso de doadores de NO na terapia da doença de Chagas
deve ser estudada com cautela, uma vez que os elevados níveis de NO podem
modificar o metabolismo celular normal, causando danos ainda não bem
caracterizados para a célula hospedeira (MARTINS et al., 1998; BONAVIDA et al.,
21
2006). SILVA et al. (2009) observaram um aumento paradoxal no número de
parasitos presentes no tecido miocárdico quando doses mais elevadas foram
utilizadas no tratamento dos camundongos infectados com o T. cruzi. Este
parasitismo aumentado reforça a idéia de que muitas questões importantes devem
ser abordadas antes que esta estratégia terapêutica seja utilizada clinicamente,
principalmente que relação à biodisponibilidade oral e segurança.
Assim, interações interdisciplinares dos diferentes campos da ciência, desde
a genética, a biologia celular e molecular, a química, a bioinformática e a
farmacologia, são necessárias para o desenvolvimento e/ou identificação de
fármacos eficazes, sem (ou com baixa) toxicidade e com baixo custo de produção
para serem utilizados no tratamento da doença de Chagas.
22
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 COMPLEXOS DE RUTÊNIO
Os complexos de rutênio cis-[RuCl(NO2)(dppb)(5-mebipy)] (composto 1), cis[Ru(NO2)2(dppb)(5-mebipy)]
(composto
2),
ct-[RuCl(NO)(dppb)(5-mebipy)](PF6)2
(composto 3) e cc-[RuCl(NO)(dppb)(5-mebipy)](PF6)2, (composto 4) onde dppb =
1,4-bisdifenilfofinabutano, 5-mebipy = 5,5’-dimetil-2,2’-bipiridina (Figura 4), foram
obtidos do Laboratório de Estrutura e Reatividade de Compostos Inorgânicos –
LERCI, no departamento de química da Universidade Federal de São Carlos, em
uma colaboração com o grupo chefiado pelo prof. Alzir Azevedo Batista.
23
Composto 1
Composto 2
24
Composto 3
Composto 4
Figura 4: Estrutura química dos complexos de rutênio avaliados neste estudo.
25
O complexo de rutênio 1 é o composto protótipo, uma vez que foi utilizado
como molécula base para a síntese dos demais compostos. As variações entre os
diferentes complexos de rutênio estão na presença ou ausência do grupo
nitro/nitrosol e do átomo de cloro. O composto 1 apresenta um grupo nitro e um
átomo de cloro. Já no composto 2, o átomo de cloro foi substituído por um grupo
nitro e, portanto, apresenta dois grupos nitro como substituintes. A partir do
composto 1, para a síntese dos compostos 3 e 4, houve substituição do grupo nitro
para o grupo nitrosilo. A diferença entre os compostos 3 e 4 está na localização do
NO. No composto 3, o NO está na posição cis ao cloro e trans ao fósforo. Já no
composto 4, o NO está cis ao cloro e cis ao fósforo.
4.2 ANIMAIS
Para este estudo foram utilizados 200 camundongos (Mus musculus) da
linhagem BALB/c, fêmeas, com o peso variando entre 18 e 20 g, provenientes do
biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, em condições de alimentação ad
libutum e livres de patógenos. Todos os procedimentos realizados foram aprovados
pela Comissão de Ética em Uso de Animais (CEUA/FIOCRUZ/CPqGM), projeto
nº.002/2011.
4.3 PARASITOS
Os parasitos na forma epimastigota da cepa Y foram obtidos de amostras
criopreservadas e armazenadas no Laboratório de Engenharia Tecidual e
Imunofarmacologia (LETI - CPqGM - FIOCRUZ) por sucessivas passagens in vitro.
Já os parasitos na forma tripomastigota da cepa Y foram coletados do sangue de
animais da linhagem BALB/c infectados por via intraperitoneal sete dias pósinfecção.
26
4.4 CULTIVO DE PARASITOS
Parasitos na forma tripomastigota foram cultivados em meio de cultura RPMI
1640 (Gibco®, Grand Island, NE, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal
(Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 50 μg/mL de gentamicina (Novafarma, Anápolis,
GO, Brasil), juntamente com células da linhagem LLC-MK2 (células de rim de
macaco rhesus) e mantidos em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por sete dias.
As formas epimastigotas do T. cruzi foram cultivadas em meio LIT (“liver
infusion tryptose”) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Cultilab), 1% de
hemina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 1% de meio R9 e 50 µg/mL de gentamicina
(Novafarma) e mantidos em estufa a 26 ºC por 11 dias.
4.5 ENSAIOS IN VITRO
4.5.1 Obtenção de macrófagos peritoneais
Macrófagos do exsudato peritoneal foram obtidos de camundongos da
linhagem BALB/c, a partir da indução de inflamação através da injeção de
tioglicolato a 3% (Sigma). Após cinco dias da indução, os animais foram submetidos
à eutanásia em câmara de gás de dióxido de carbono e, sob condições estéreis, a
pele da região abdominal foi retirada para a visualização do peritônio. Foram
injetados 10 mL de solução salina na cavidade peritoneal dos animais, e, após uma
massagem no abdômen, os macrófagos foram coletados com auxílio de uma
seringa. As células foram centrifugadas a 1500 RPM (363 x g) por 10 minutos,
contadas e plaqueadas para os ensaios de citotoxicidade e de infecção de
macrófagos.
27
4.5.2 Avaliação de citotoxicidade
A determinação da concentração letal para 50% da população celular (LC 50)
foi realizada através do ensaio de Alamar Blue® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA),
seguindo as recomendações do fabricante. Os macrófagos peritoneais (105/poço)
foram cultivados em placa de cultura de 96 poços e incubados em estufa umidificada
à 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas. Posteriormente, os compostos em diferentes
concentrações (100; 33,33; 11,11; 3,70 e 1,23 µg/mL) foram adicionados e
incubados por seis horas nas mesmas condições de temperatura e umidade. Após
este período de incubação, os poços foram lavados com salina e, em seguida, foi
adicionado o reagente Alamar Blue (Invitrogen) na concentração de 10%. Os
macrófagos foram incubados por mais 24 horas e, em seguida, foram realizadas as
leituras colorimétricas da placa de 96 poços com os comprimentos de onda de 570 e
600 nm. O cálculo para a obtenção do valor de LC50 foi efetuado, utilizando-se
regressão não linear no programa Prism 5.01 GraphPad (GraphPad Software, San
Diego, CA, EUA).
Apenas o composto 3, que apresentou a atividade tripanocida mais ativa, foi
testado em outras concentrações (25, 10, 5 e 1 µM) por 96 horas.
4.5.3 Avaliação da ação tripanocida
Parasitos na forma epimastigota (107 parasitos/poço) foram incubados em
placa de 96 poços, em triplicata, em meio LIT suplementado com 10% de soro
bovino fetal (Cultilab), 1% de hemina (Sigma), 1% de meio R9 e 50 µg/mL de
gentamicina (Novafarma) a 26ºC, na presença dos compostos em teste em
diferentes concentrações (100; 33,33; 11,11; 3,70; 1,23 e 0,41 µg/mL). Após o quinto
dia de incubação, os parasitos foram contados em câmara de Neubauer.
Os compostos também foram testados na forma tripomastigota. Neste ensaio,
os parasitos (4 x 105 tripomastigotas/poço) foram incubados em placa de 96 poços,
em triplicata, em meio de cultura RPMI (Gibco) suplementado com 10% de soro
bovino fetal (Cultilab) e 50 μg/mL de gentamicina (Novafarma) na presença dos
28
compostos em diferentes concentrações (100; 33,33; 11,11; 3,70; 1,23 e 0,41
µg/mL). Após 24 horas de incubação, os parasitos viáveis foram contados em
câmara de Neubauer.
As diferentes concentrações dos compostos foram avaliadas com o objetivo
de determinar a concentração que inibe em 50% o crescimento ou a viabilidade dos
parasitos (IC50). O valor da IC50 foi determinado com base na porcentagem de
inibição do crescimento do parasito para a forma epimastigota e na inibição da
viabilidade parasitária para a forma tripomastigota. O cálculo para a obtenção do
valor de IC50 foi efetuado, utilizando-se regressão não linear no programa Prism 5.01
GraphPad (GraphPad Software). O fármaco padrão utilizado como controle positivo
foi o benzonidazol (Rochagan®).
4.5.4 Infecção de macrófagos peritoneais por T. cruzi
Foi avaliada também a ação tripanocida dos compostos para a forma
amastigota. Os macrófagos estimulados por tioglicolato 3% (Sigma) obtidos por
lavagem peritoneal foram incubados em placa de 24 poços em uma concentração de
2 x 105 células/poço em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO 2 por 24 horas. Após
este período, os macrófagos foram infectados com 2 x 106 tripomastigotas/poço por
duas horas. Em seguida, os poços foram lavados e os compostos foram adicionados
em diferentes concentrações (25, 10, 5 e 1 µM). Após seis horas de incubação em
estufa a 37ºC e 5% de CO2, os poços foram lavados com solução salina e mantidos
com meio de cultura em estufa, nas mesmas condições, por quatro dias. As células
infectadas foram fixadas em álcool etílico absoluto, por dez minutos, as lamínulas
foram coradas por hematoxilina e eosina e montadas em lâminas com Entellan
(Entellan®, Merck Millipore, Billerica, MA, EUA). Foram avaliados o número de
macrófagos infectados e a quantidade de amastigotas por macrófagos. A avaliação
destes parâmetros foi realizada através de observação em microscópio óptico
(Olympus, Tóquio, Japão). O benzonidazol foi utilizado como controle positivo do
experimento, enquanto o controle negativo correspondeu às células infectadas com
os parasitos. O valor de IC50 para a forma amastigota foi realizado utilizando como
29
parâmetro a quantidade de amastigotas por macrófagos através da regressão não
linear no programa Prism 5.01 GraphPad (GraphPad Software).
Com o objetivo de verificar a ação do composto 3 de forma mais tardia, foi
realizado um ensaio alternativo de infecção de macrófago apenas com este
composto nas concentrações de (25, 10, 5 e 1 µM). Para este ensaio, foram também
utilizados macrófagos peritoneais elicitados de camundongos BALB/c estimulados
com tioglicolato (3%) (Sigma). Os macrófagos (2 x 105) foram incubados em placas
de 24 poços e mantidos em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas.
Após
este
período,
os
macrófagos
foram
infectados
com
2
x
106
tripomastigotas/poço por duas horas. Os poços foram lavados e mantidos nas
mesmas condições de temperatura e umidade por 48 horas. Em seguida, o
composto foi adicionado nas diferentes concentrações e a placa foi mantida em
estufa por mais 96 horas. As células foram fixadas e as lâminas foram montadas de
forma semelhante ao experimento anterior. Foram também avaliados o número de
macrófagos infectados e a quantidade de amastigotas por macrófagos. O fármaco
benzonidazol foi utilizado como controle positivo, enquanto as culturas sem
tratamento constituíram o controle negativo.
Os ensaios de citotoxicidade e de infecção de macrófagos foram realizados
utilizando as mesmas condições de concentração dos compostos e tempos de
incubação com o objetivo de avaliar o índice de seletividade (IS) dos compostos, ou
seja, para avaliar quão seletivo o composto é ao parasito em relação às células de
mamífero.
IS = LC50 ÷ IC50 (amastigota)
4.5.5 Ensaio de inibição enzimática - cruzaína
4.5.5.1 Expressão e purificação cruzaína recombinante
A bactéria BL21(DE3)pLysS foi transformada com o plasmídeo pChey Tc
Delta (gentilmente cedido ao nosso grupo pelos doutores James Hobson McKerrow
30
e Anna Tochowicz - University of California in San Francisco, School of Medicne,
Department of Pathology, USA). O lisado das bactérias transformadas foi submetido
à cromatografia de troca iônica em coluna HiTrap Q Sepharose Fast Flow (GE
Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suécia) através do cromatógrafo Akta purifier10
(GE Healthcare Life Sciences) para purificação da cruzaína recombinante.
4.5.5.2 Determinação da atividade inibitória
A cruzaína recombinante foi ativada em tampão acetato (0,1 M; pH 5,5)
contendo 50 μM de DTT e 0,01 % de triton-X. A enzima foi ajustada para obter uma
concentração final de 5 ng nos poços. Todos os ensaios foram realizados em placas
de 96 poços opacas (96 Thermo Electron CliniPlate). No ensaio de competição, 60
μL de uma solução de cada potencial inibidor químico (complexos de rutênio, 100
μM) e 20 μL da enzima foram adicionados nos respectivos poços e a reação foi
incubada por 30 minutos a 35 oC. Após esse tempo, adicionou-se 80 μL do substrato
Cbz-Phe-Arg-7-amino-4-metilcumarina (1,5 μM) e a reação foi incubada por 10
minutos. Em ambos os experimentos, a placa foi lida no fluorímetro EnVision
(PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) (λ excitação = 380 nm e λ emissão = 460 nm) em
diferentes tempos reacionais. A porcentagem de inibição da cruzaína foi calculada
usando a equação 100-(A1/Ax100), onde A1 corresponde a fluorescência relativa
(RFU) da enzima na presença do inibidor químico e A corresponde a RFU da enzima
na ausência do inibido químico (DMSO e substrato fluorescente) e a média de cada
duplicata foi calculada. Como controle positivo foi utilizado o inibidor químico E64-c
(Sigma). Uma curva concentração-resposta foi determinada variando-se as
concentrações do inibidor químico entre 1,5 nM até 100 μM. A curva concentraçãoresposta foi determinada usando ao menos oito pontos e a IC50 foi estimada usando
regressão não linear no programa OriginPro versão 8.5 (OriginLab, Northampton,
MA, EUA).
31
4.5.6 Avaliação de alterações ultraestruturais nos parasitos
4.5.6.1 Microscopia eletrônica de transmissão
Para a análise de alterações ultraestruturais da forma tripomastigota, os
parasitos (6 x 106 parasitos/mL) foram incubados na presença do composto mais
ativo (3) na concentração de IC50 (2,1 μM), durante 24 horas em estufa umidificada à
37ºC e 5% de CO2. Após este período, a suspensão contendo os parasitos foi
centrifugada (3000 RPM [1,452 x g] por 10 minutos), o pellet foi lavado em solução
salina e encaminhado para o processamento.
Foi também realizada a análise de alterações ultraestruturais de macrófagos
infectados com o parasito. Para esta análise, macrófagos peritoneais estimulados
com tioglicolato 3% (Sigma) foram incubados em placa de seis poços na
concentração de 3x106 células/poço em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por
24 horas. Após este período, os macrófagos foram infectados com 3 x 107
tripomastigotas/poço por duas horas. Em seguida, os poços foram lavados com
salina e o composto 3 foi adicionado. Após seis horas de incubação em estufa a
37ºC e 5% de CO2, as células foram obtidas através da raspagem dos poços com o
uso do “scraper” (raspador) de células, lavadas com solução salina e encaminhadas
para o processamento de células livres.
Os parasitos e as células infectadas foram processados de forma semelhante.
Estes foram fixados por uma hora em temperatura ambiente com formaldeído 2% e
glutaraldeído 2,5% (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA) diluídos em
tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2. Após a fixação, o material foi lavado três
vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2), pós-fixados com uma solução
de tetróxido de ósmio (Sigma) 1% contendo 0,8% de ferrocianeto de potássio.
Subsequentemente, o material foi desidratado em concentrações crescentes de
acetona (30, 50, 70, 90, e 100%) e incluído em resina Polybed (Polysciences,
Washington, PA, EUA) e acetona (1:1). Após o período de 24 horas, a resina, desta
vez, pura, foi trocada e mantida por seis horas. Uma nova troca de resina foi
realizada e o material foi mantido em estufa a 60 ºC por 72 horas para que essa
fosse polimerizada. Cortes ultrafinos foram obtidos em um ultramicrótomo Leica UC7
32
(Leica Microsystems, Wetzlar, Hesse, Alemanha) e coletados em grades de cobre
com 300 malhas, contrastado com acetato de uranila e citrato de chumbo e
observados em microscópio eletrônico de transmissão (JEOL JEM-1230) a 15 kV na
unidade de serviço de microscopia eletrônica - SME do CPqGM – FIOCRUZ.
4.5.6.2 Microscopia eletrônica de varredura
Parasitos na forma tripomastigota (6 x 106 parasitos/mL) foram submetidos ao
tratamento com o composto 3 na concentração de IC50 (2,1 μM) e mantidos durante
24 horas em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2. Após este período, os
parasitos foram obtidos a partir da centrifugação (3000 RPM [1,452 x g] por 10
minutos), lavados em solução salina e fixados por uma hora à temperatura ambiente
com formaldeído 2% e glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH
7,2. Em seguida, as amostras foram lavadas em tampão cacodilato 0,1 M e aderidas
em lamínulas previamente cobertas com poli-L-lisina (Sigma). Após a aderência, os
parasitos foram pós-fixados com uma solução de tetróxido de ósmio (OsO4) a 1%
contendo 0,8% de ferrocianeto de potássio. Em seguida, os parasitos foram
desidratados em concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 90, e 100%),
submetidas ao ponto crítico, metalizadas com ouro e observadas em microscópio
eletrônico de varredura JEOL JSM-6390LV a 12 kV em unidade de microscopia
eletrônica - UME do CPqGM – FIOCRUZ.
Foram realizadas quantificações (100 parasitos/grupo) para as principais
alterações
ultraestruturais
observadas
(encolhimento,
descontinuidade
e
fragmentação de membrana e presença de protusões) nos parasitos tratados e não
tratados.
4.5.7 Marcação de vacúolos autofágicos
Parasitos na forma tripomastigota (107 parasitos/poço) foram incubados em
placa de 24 poços, tratados com o composto 3 na concentração de IC50 (2,1 M) e
33
mantidos em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas. Em seguida, foi
adicionado o marcador de fluorescência monodansilcadaverina (MDC) (Sigma)
(revisado por DESOTI et al., 2012; revisado por FERNANDES et al., 2012) na
concentração de 0,05 mM por quinze minutos e os parasitos foram lavados com
PBS duas vezes. A marcação com MDC foi analisada através do microscópio
Confocal FV1000 (Olympus). Como controle positivo foi utilizado o fármaco
rapamicina (Sigma) na concentração de 0,1 µg/mL.
4.5.8 Dosagem de óxido nítrico (NO)
Células (106 células/poço) da linhagem J774 (macrófagos tumorais isolados
de camundongos BALB/c) foram incubadas em placas de 24 poços e infectadas com
tripomastigotas (2 x 105 parasitos/poço) por 3 horas. Após este período os poços
foram lavados com salina e foi adicionado o composto 3 na concentração de 10 μM
e a placa foi mantida em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2. Como controle
positivo foram utilizadas células estimuladas com IFN-γ (5 ng/mL) (R&D Systems,
Minneapolis, MN, EUA) e LPS (lipopolissacarídeo bacteriano) (500 ng/mL) (Sigma),
enquanto que a ausência destes estímulos e do tratamento representou o controle
negativo. A dosagem de óxido nítrico foi realizada através do método de Griess
(DING et al., 1988) após 24 horas da adição do composto 3. No grupo estimulado
(controle positivo), a adição de IFN-γ e de LPS ocorreu após as três primeiras horas
de incubação, ou seja, no mesmo momento em que o composto 3 foi adicionado aos
poços do grupo tratado.
4.5.9 Marcação de células apoptóticas e necróticas
Parasitos na forma tripomastigota (107) foram tratados ou não com composto
3 na concentração de IC50 (2,1 M) e mantidos durante 24 e 36 horas em estufa
umidificada à 37ºC e 5% de CO2. Os parasitos foram marcados com iodeto de
propídio (PI) para avaliar necrose e com anexina V para avaliar apoptose nas
34
concentrações de 10% e 1%, respectivamente, por quinze minutos na ausência de
luz, utilizando o Kit Anexina V-FITC (Biosource, CA, EUA) seguindo as instruções do
fabricante. Os dados foram adquiridos e analisados pela técnica de citometria de
fluxo, utilizando o citômetro FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, EUA), com o
software Cell Quest. Cerca de 10.000 eventos foram analisados.
4.6 ENSAIO IN VIVO
4.6.1 Infecção e tratamento
Camundongos da linhagem BALB/c (6 animais por grupo) foram infetados por
via intraperitoneal com 104 tripomastigotas sanguícola da cepa Y por animal. Os
camundongos foram tratados, por via oral, com os quatro compostos na dose de 25
mmol/kg/dia por cinco dias consecutivos, a partir do 5º dia de infecção. Como
controle positivo foi utilizado o benzonidazol na dose de 384 mmol/kg/dia (100
mg/kg/dia) e como controle negativo foi utilizada a solução salina. Os compostos e o
benzonidazol foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) a 10% em solução
salina. O grupo controle foi tratado com veículo (10% de DMSO em salina).
A atividade dose-resposta do composto 3 também foi avaliada. Os protocolos
de infecção e tratamento foram semelhantes ao anterior e as doses utilizadas para
este experimento foram 25, 50 e 75 mmol/kg/dia deste composto.
4.6.2 Avaliação da parasitemia e mortalidade
Cerca de 5 μL de sangue foram coletados da cauda dos camundongos
infectados e dispostos em lâmina, coberta com lamínula de 22 x 22 mm, obtendo-se
uma camada única e homogênea de hemácias. As lâminas foram levadas
diretamente ao microscópio óptico para a realização da contagem de 50 campos
microscópicos aleatórios em objetiva de 40x. O número de parasitos encontrados foi
35
dividido pelo número de campos microscópicos observados e multiplicado por um
fator de correção de 7. O resultado foi apresentado em gráfico com 10 5
tripomastigotas/mL (Método de BRENER baseado no de PIZZI – BRENER, 1962;
BRENER, 2000). A parasitemia foi acompanhada nos dias 5, 8, 10 e 12 pósinfecção.
A mortalidade dos animais foi avaliada através de acompanhamento diário por
30 dias.
4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Em relação aos experimentos in vitro, a análise estatística dos dados dos
experimentos de citotoxicidade celular, de infecção de macrófagos e de dosagem de
NO foi realizada através do programa Prism 5.01 GraphPad (GraphPad Software),
utilizando o teste One-Way ANOVA e o pós-teste de Bonferroni, ou o teste t
pareado, sendo considerado valores estatisticamente significante aqueles com
valores p < 0,05.
Já a análise estatística dos dados da microscopia eletrônica de varredura foi
realizada através do programa Prism 5.01 GraphPad (GraphPad Software),
utilizando o teste Two-Way ANOVA, sendo considerado valores estatisticamente
significante aqueles com valores p < 0,05.
Em relação aos experimentos in vivo, a análise estatística da parasitemia foi
realizada através do programa Prism 5.01 GraphPad (GraphPad Software),
utilizando o teste One-Way ANOVA e o pós-teste de Bonferroni, sendo considerado
valores estatisticamente significante aqueles com valores p < 0,05. Em relação à
mortalidade, a curva de sobrevida dos animais foi elaborado utilizando o programa
Prism 5.01 GraphPad (GraphPad Software).
36
5 RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO TRIPANOCIDA IN VITRO
Observamos a inibição in vitro do crescimento da forma epimastigota de três
dos quatro compostos testados (2, 3 e 4), sendo que o composto 3 apresentou valor
de IC50 inferior ao do benzonidazol. Além disso, foi observado que todos os
compostos inibiram a viabilidade dos parasitos na forma tripomastigota e a
replicação da forma amastigota, inclusive apresentando valores de IC50 inferiores
aos valores do fármaco de referência. A partir do valor de LC50 e de IC50 da forma
amastigota, foi possível calcular o índice de seletividade (IS), que indica quão
seletivo o composto é ao parasito em relação aos macrófagos de camundongos
BALB/c utilizados no ensaio de citotoxicidade. A partir destes dados, foi observado
que, dentre os compostos testados, o 3 apresentou o maior IS. É possível ainda
observar que dentre os quatro compostos em teste, o 1 foi o que apresentou valores
de IC50 e LC50 mais altos. Enquanto o composto 3 apresentou os menores valores
de IC50 e o IS mais elevado (Tabela 1).
Tabela 1 – Valores de IC50, LC50 e índice de seletividade dos complexos de rutênio
IC50 (µM)
Composto
1
2
3
4
Benzonidazol
Epimastigota Tripomastigota Amastigota
NA
16,6 ± 0,66
5,7 ± 0,63
26,7 ± 2,05
10,7 ± 1,62
8,4 ± 1,18
4,2 ± 1,60
2,9 ± 0,29
2,6 ± 0,78
2,1 ± 0,65
1,3 ± 0,22
5,9 ± 1,06
2,7 ± 0,67
11,4 ± 1,09 14,0 ± 0,39
LC50 (µM)
Citotoxicidade
Macrófago
>100,0
93,1 ± 7,76
51,4 ± 0,22
38,3 ± 2,37
>100,0
IS **
Índice de
seletividade
>24
36
40
14
>7
*NA = Não ativo ** em relação à atividade na forma amastigota
O cálculo de IC50 para a forma amastigota foi realizado a partir do ensaio de
infecção de macrófagos e o parâmetro utilizado no cálculo foi a porcentagem de
inibição de amastigota em relação ao controle negativo. Graficamente, os dois
37
parâmetros avaliados (porcentagem de redução de células infectadas em relação ao
controle negativo e porcentagem de inibição de amastigota em relação ao controle
negativo) (Figura 5 A e B) foram representados utilizando a concentração de 5 µM,
concentração esta que não induziu toxicidade em macrófagos peritoneais tratados
com os composto 1, 2 e 3 nas mesmas condições experimentais do ensaio de
infecção de macrófagos (Figura 6). Em relação à porcentagem de redução de
células infectadas (Figura 5 A), observa-se que os quatro compostos em teste na
concentração de 5 µM reduziram o número de células infectadas, inclusive de forma
estatisticamente significativa em relação ao benzonidazol. O benzonidazol, por
apresentar elevados valores de IC50, não reduziu o número de células infectadas
nesta concentração. O composto 1 foi aquele que apresentou menor atividade
tripanocida dentre os quatro compostos testados. Os compostos 3 e 4 apresentaram
porcentagens de redução no número de amastigota estatisticamente significativas
em relação ao composto 1, apresentando porcentagens de inibição em relação ao
controle negativo de 64% e 65%, respectivamente. Já em relação à porcentagem de
inibição de amastigota, também houve redução pelo tratamento com todos os quatro
compostos testados, com valores estatisticamente significativos em relação ao
controle positivo. O composto 3 foi aquele que reduziu a porcentagem de
amastigotas em relação ao controle negativo de forma mais acentuada (74%).
38
Figura 5 – Efeito dos compostos na infecção de macrófagos tratados por seis horas. Os gráficos A e
B representam a porcentagem de redução do número de células infectadas em relação ao controle
negativo e a porcentagem do número de amastigotas por 100 células contadas em relação ao
controle negativo, respectivamente. O controle negativo que corresponde o 0% do gráfico. Os quatro
compostos e o benzonidazol foram testados na concentração de 5 µM. * - representa a análise
estatística em relação ao benzonidazol (* p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001). # - representa a
análise estatística do composto 1 em relação aos demais. O número de * e # é correspondente em
relação ao valor p.
39
% de viabilidade celular
***
***
***
***
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
BDZ
Figura 6 – Viabilidade de macrófagos peritoneais tratados por seis horas. O gráfico representa a
porcentagem da viabilidade celular em relação ao controle negativo. Os quatro compostos e o
benzonidazol (BDZ) foram testados na concentração de 5 µM. *** representa a análise estatística em
relação ao composto 4 (p < 0,0001).
5.1.1 Avaliação da inibição enzimática
A partir do ensaio de inibição enzimática da cruzaína é possível observar que
os compostos 1 e 2 foram os que apresentaram os menores valores de IC 50,
apresentando uma porcentagem de inibição na concentração de 25 µM de 30,9% e
0%, respectivamente. Já os compostos 3 e 4 apresentaram uma melhor atividade
inibitória da ação catalítica da cruzaína, com valores de IC 50 14,4 e 0,41 µM,
respectivamente. Ambos os compostos apresentaram elevados valores inibitórios na
concentração de 25 µM, sendo eles 67,3% e 98,2%, respectivamente (Tabela 2).
Tabela 2 - Determinação da atividade inibitória dos compostos na atividade catalítica
da cruzaína
Composto
1
2
3
4
E64-c
a
% de inibição a 25 µM a
IC50 (µM)
30,9
0,0
67,3
98,2
100,0
Compostos foram testados na concentração de 25 µM, em triplicatas
30,2 ± 7,3
>100,0
14,4 ± 6,6
0,41 ± 0,13
0,001 ± 0,0008
40
5.2 AVALIAÇÃO TRIPANOCIDA IN VIVO
Os quatro compostos foram testados in vivo utilizando a dose de 25
mmol/kg/dia com objetivo de avaliar o composto que apresentava melhor redução de
parasitemia e aumento de sobrevivência. Em relação à parasitemia, observamos
que o composto 1 não foi capaz de reduzir o número de parasitos em relação ao
controle negativo de forma significativa nos dias 5, 8, 10 e 12 pós-infecção. Já o
composto 2 reduziu significativamente (p < 0,05) a parasitemia em relação ao
controle negativo apenas no dia 10 pós-infecção. O composto 3 reduziu a
parasitemia de forma estatisticamente significante em relação ao controle nos dias
10 (p < 0,01) e 12 (p < 0,001). O composto 4 também reduziu significativamente a
parasitemia nos dias 10 (p < 0,05) e 12 (p < 0,001) (Figura 7). O benzonidazol, na
dose de 384 mmol/kg/dia, reduziu significativamente em todos os dias avaliados
(Figura 7).
Em relação à mortalidade, o tratamento com os compostos 1 e 3 causou um
aumento de sobrevida dos camundongos quando comparados ao grupo do controle
negativo. Até o dia 30 pós-infecção, apenas um animal (16,7%) do grupo 3
permaneceu vivo, enquanto que o último óbito do grupo 1 foi observado no dia 26
pós-infecção. Os animais tratados com o benzonidazol apresentaram uma taxa de
sobrevida de 100% (Figura 8).
41
x 105 parasitos/mL
8
Veículo
Benzonidazol
1
2
3
4
7
6
5
4
3
2
1
0
5
6
7
8
9
10
11
12
Dias pós-infecção
Figura 7 – Parasitemia de animais infectados com T. cruzi tratados ou não com os complexos de
rutênio (1, 2, 3 e 4). Os camundongos foram tratados por via oral com a dose de 25 mmol/kg/dia por 5
dias consecutivos e a parasitemia foi realizada nos dias 5, 8, 10 e 12 pós- infecção. Foi utilizado
como controle positivo o fármaco de referência, benzonidazol, com a dose de 384 mmol/kg/dia (100
mg/kg/dia) e, como controle negativo, apenas o veículo. Os dados representam a mediana de 6
animais/grupo.
% de sobrevivência
100
Veículo
Benzonidazol
80
1
2
3
4
60
40
20
0
1
6
11
16
21
26
30
Dias pós-infecção
Figura 8 - Curva de sobrevivência. A taxa da mortalidade dos grupos foi observada até o dia 30 pósinfecção. Foi utilizado como controle positivo o fármaco de referência, benzonidazol, com a dose de
384 mmol/kg/dia (100 mg/kg/dia) e, como controle negativo, apenas o veículo. Os dados representam
o % de animais vivos (6 animais/grupo) em cada ponto analisado.
42
5.3 AVALIAÇÃO TRIPANOCIDA – COMPOSTO 3
5.3.1 Avaliação in vivo
A partir dos dados in vitro, observou-se que o composto 3 apresentou
melhores valores nos parâmetros avaliados. Em seguida, foi realizado um novo
experimento in vivo utilizando o mesmo protocolo de infecção e tratamento e a
mesma forma de avaliação da parasitemia e mortalidade. No entanto, apenas o
composto 3 foi testado, com três doses diferentes, 25, 50 e 75 mmol/kg/dia, a fim de
avaliar qual seria a dose ideal para o tratamento dos camundongos chagásicos.
É possível observar uma curva dose-resposta em relação à parasitemia. Foi
observado no pico da parasitemia (dia 10 pós-infecção) porcentagem de redução da
parasitemia dos camundongos tratados com a dose de 75 mmol/kg/dia de 46% em
relação ao controle negativo. Já a porcentagem do grupo tratado com 50
mmol/kg/dia foi 38% e de 25% em relação ao grupo tratado com a dose de 25
mmol/kg/dia (Figura 9). O grupo tratado com o benzonidazol zerou a parasitemia.
Em relação à curva de mortalidade, observa-se que o grupo tratado com o
benzonidazol apresentou 100% de sobrevida. O grupo tratado com a maior dose
apresentou uma taxa de sobrevida de 50%, enquanto que tanto o grupo de controle
negativo e o grupo tratado com a menor dose apresentaram taxa de sobrevida de
16,7%. Todos os animais do grupo tratados com a dose intermediária vieram a óbito,
sendo o primeiro óbito no dia 18 e o último no dia 27 pós-infecção (Figura 10).
x 105 parasitos/mL
43
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Veículo
Benzonidazol
25mmol/kg/dia
50 mmol/kg/dia
75 mmol/kg/dia
5
6
7
8
9
10
11
12
Dias de infecção
Figura 9 - Avaliação da parasitemia de animais infectados com T. cruzi tratados com o composto 3.
Os camundongos foram tratados com diferentes doses do composto 3 a partir do 5° dia pós-infecção
por 5 dias consecutivos e a parasitemia foi realizada nos dias 5, 8, 10 e 12 pós-infecção. Foi utilizado
como controle positivo o fármaco de referência, benzonidazol, na dose de 384 mmol/kg/dia (100
mg/kg/dia), e, como controle negativo, apenas o veículo. Os dados representam a mediana de 6
animais/grupo.
% de sobrevivência
100
Veículo
Benzonidazol
25 mmol/kg/dia
50 mmol/kg/dia
75 mmol/kg/dia
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
Dias de infecção
Figura 10 - Curva de sobrevivência. A taxa da mortalidade dos grupos foi observada até o dia 30 pósinfecção. Os dados representam o % de animais vivos (6 animais/grupo) em cada ponto analisado.
Foi utilizado como controle positivo o fármaco de referência, benzonidazol, com a dose de 384
mmol/kg/dia (100 mg/kg/dia) e, como controle negativo, apenas o veículo.
44
5.3.2 Avaliação in vitro
5.3.2.1 Infecção de macrófagos
Foi avaliada a atividade tripanocida do composto 3 em macrófagos infectados
e tratados por um maior período de incubação. Diferente do experimento de infecção
de macrófagos anterior, que o período de tratamento é de seis horas, neste os
macrófagos foram tratados por 96 horas. De forma semelhante, é possível observar
redução de ambos os parâmetros avaliados (número de células infectadas e número
de amastigotas por 100 células) de forma estatisticamente significativa em relação
ao controle positivo. Ambos os grupos, tratado e controle positivo, foram tratados
com a concentração de 1 µM. O benzonidazol, nesta concentração, não é capaz de
induzir redução de ambos os parâmetros (Figura 11 A e B).
Em relação à toxicidade celular, nesta mesma concentração, não foi
observado efeito citotóxico, indicando que o efeito tripanocida foi seletivo, sem
qualquer efeito tóxico ao macrófago de mamífero (Figura 12).
45
Figura 11 - Infecção de macrófagos utilizando o tratamento com 96 horas de duração. Os gráficos A e
B representam a porcentagem de redução de células infectadas e a porcentagem de inibição de
amastigotas, respectivamente. O cálculo da porcentagem foi feito em relação ao controle negativo,
que corresponde o 0% do gráfico. O composto 3 e o benzonidazol (BDZ) foram testados na
concentração de 1 µM. *** representa a análise estatística em relação ao composto 3 (*** p <
0,0001).
% de viabilidade celular
46
100
80
60
40
20
0
Composto 3
BDZ
Controle -
Figura 12 - Viabilidade de macrófagos peritoneais tratados por 96 horas. O gráfico representa a
porcentagem da viabilidade celular em relação ao controle negativo, que corresponde o 100% do
gráfico. As células do grupo tratado com o composto 3 e com o benzonidazol (BDZ) foram testados
na concentração de 1 µM.
5.3.2.2 Avaliações de alterações ultraestruturais
Os parasitos na forma tripomastigota tratados com o composto 3 foram
analisados por microscopia eletrônica de varredura e quantificados quanto à
presença
de
alterações
ultraestruturais,
dentre
elas
o
encolhimento,
descontinuidade e a fragmentação de membrana e a protusão (Figura 13).
a
47
% de alterações
100
80
***
Controle negativo
Composto 3
***
60
40
20
***
***
0
e
o
to
na
ais
sã
ad
ra
en
u
d
ur
i
t
b
t
m
u
o
ru
hi
em
Pr
tin
st
ol
m
n
e
c
o
a
e
n
r
d
E
lt
sc
ão
De
su
ç
e
ta
çõ
en
ra
e
m
t
ag
Al
Fr
Figura 13 – % de alterações ultraestruturais visualizadas por microscopia eletrônica de varredura. Os
parasitos na forma tripomastigota foram tratados por 24 horas com o composto 3 na concentração de
IC50 (2,1 µM). Foram quantificados 100 parasitos para determinar a presença de encolhimento,
descontinuidade de membrana, protusão e fragmentação de membrana. O controle negativo
representa os parasitos sem tratamento. *** p < 0,001.
As alterações ultraestruturais estão representadas na figura 14. As imagens A
e B representam o controle negativo, enquanto que as imagens C e D representam
os parasitos tratados com o composto 3 na concentração de IC50 (2,1 µM). As 4
imagens estão no aumento de 9000 vezes, facilitando assim a comparação entre os
grupos. Observa-se nas imagens C e D a presença das alterações que foram
consideradas estatisticamente significativas em relação ao controle, sendo elas,
encolhimento, descontinuidade e fragmentação da membrana (Figura 14).
48
Figura 14 – Alterações ultraestruturais observadas em tripomastigotas por microscopia eletrônica de
varredura. Os parasitos foram tratados ou não com o composto 3 na concentração de IC50 (2,1 µM)
por 24 horas. A e B representam o controle sem tratamento e C e D representam os parasitos
tratados. As setas brancas apontam as principais alterações observadas. Na imagem C é possível
verificar o encolhimento do parasito quando comparado ao controle sem tratamento (Imagens A e B)
e a fragmentação da membrana. Na imagem D é possível verificar a presença de descontinuidade e
fragmentação de membrana.
Os parasitos na forma tripomastigota tratados com o composto 3 também
foram visualizados por microscopia eletrônica de transmissão e foi possível observar
a formação de estruturas concêntricas na mitocôndria (setas, Figuras 15C e D), além
de regiões de abertura de retículo endoplasmático. Foram observados também, por
microscopia eletrônica de transmissão, macrófagos infectados com os parasitos e
tratados com o composto 3. Foi observada a presença de vacúolos nos parasitos do
grupo tratado quando comparado ao controle (setas, Figuras 16C e D).
49
Figura 15 – Alterações ultraestruturais observadas em tripomastigotas por microscopia eletrônica de
transmissão. Os parasitos foram tratados ou não com o composto 3 na concentração de IC50 (2,1 µM)
por 24 horas. A e B representam o controle sem tratamento e C e D representam os parasitos
tratados. As setas pretas representam as principais alterações observadas nos parasitos tratados
(estruturas concêntricas na mitocôndria e regiões de abertura de retículo endoplasmático). GA –
complexo de Golgi, K – cinetoplasto, N – núcleo e M – mitocôndria. Barras – 1 µm.
50
Figura 16 – Alterações ultraestruturais observadas por microscopia eletrônica de transmissão de
macrófagos infectados com tripomastigotas tratados ou não com o composto 3 por 6 horas. A e B
representam o grupo controle e C e D representam o grupo tratado. As setas pretas indicam a
presença de vacuolização citoplasmática. As figuras B e D são visualizações do mesmo campo das
figuras A e C, respectivamente, com maior aumento. Barras A e C – 2 µm, B - 1 µm e D – 0,5 µm.
5.3.2.3 Marcação de vacúolos autofágicos
Observamos a fluorescência positiva para o MDC, um marcador de vacúolos
autofágicos, nos parasitos tratados com o composto 3 na concentração de 2,1 µM. O
controle negativo não apresentou marcação fluorescente e o controle positivo
(rapamicina) apresentou marcação positiva (Figura 17).
51
A
B
C
D
E
F
Figura 17 - Marcação com MDC para determinação de autofagia no Trypanosoma cruzi após
tratamento com o composto 3. Os parasitos foram tratados ou não com o composto 3 por 24 horas e
marcados com MDC. A coluna cinza representa as figuras com DIC e a coluna preta com
fluorescência. (A,B) Imagens representativas do controle negativo; (C,D) Imagens representativas do
controle positivo – rapamicina 0,1 ug/mL; (E,F) Imagens representativas de parasitos tratados com o
composto 3 na concentração de 2,1 µM. As setas brancas indicam as estruturas autofágicas. As
imagens estão no aumento de 60x e zoom de 3x.
52
5.3.2.4 Dosagem de NO
A partir do conhecimento que o composto 3 é doador de NO, foi realizado o
ensaio de dosagem de NO no tempo de 24 horas pós-tratamento para observar a
concentração indireta de NO, a partir da quantificação de nitrito, presente em
macrófagos infectados com tripomastigotas. Observamos uma concentração
significativa de NO na cultura tratada com o composto 3 quando comparada ao
controle negativo. O controle positivo, estimulado com IFN-γ e LPS, aumentou a
produção de NO significantemente em relação aos demais grupos (Figura 18).
*
Dosagem de NO (M)
60
40
20
0
Composto 3
controle +
controle -
Figura 18 – Dosagem de NO realizada no período 24 horas pós-tratamento. O grupo tratado
corresponde a células J774 infectadas com tripomastigotas e tratadas com o composto 3 (10 μM) por
24 horas. O controle positivo não foi tratado e apenas estimulado com IFN-γ e LPS. O controle
negativo não recebeu tratamento nem estímulo. * representa a análise estatística do controle negativo
em relação ao grupo tratado com o composto 3 (p < 0,05).
5.3.2.5 Marcação de células apoptóticas e necróticas
Com o objetivo de avaliar o tipo de morte celular que o tratamento estava
induzindo nos parasitos, os parasitos foram marcados com PI e anexina V e os
dados foram adquiridos e analisados por citometria de fluxo. A partir da análise dos
53
gráficos (figura 19), foi possível observar, em ambos os tempos, 24 e 36 horas, que
houve marcação predominante de PI.
Figura 19 – Marcações com PI e anexina V e análise por citometria de fluxo. Os parasitos na forma
tripomastigota foram tratados ou não com o composto 3 (2,1 µM) durante 24 e 36 horas. A e C
representam o controle negativo e B e D representam o grupo tratado. O tratamento por 24 horas
está representado em A e B e o tratamento por 36 horas em C e D. É possível verificar marcação
predominantemente positiva para PI em ambos os tempos.
54
6 DISCUSSÃO
Apesar dos avanços alcançados nas últimas décadas quanto aos controles
vetoriais e pela via transfusional adotados por países do Cone Sul, a doença de
Chagas ainda representa um sério problema de saúde pública. No Brasil, o
benzonidazol é a única opção de tratamento disponibilizado pelo SUS, e como já
citado anteriormente, não é um medicamento ideal uma vez que pode desencadear
severos efeitos colaterais aos pacientes, apresenta eficácia variada durante o
tratamento (a depender da idade do paciente, região geográfica e fase da doença),
além da ocorrência de cepas do T. cruzi resistentes à medicação. Assim, torna-se
urgente a identificação de novas moléculas com atividade tripanocida.
Tem sido descrito na literatura o uso de diferentes complexos de rutênio na
terapia da doença de Chagas (GUEDES et al., 2010; SILVA et al., 2007; SILVA et
al., 2009; SILVA et al., 2010).
Neste contexto, os quatro nitro/nitrosilo complexos
de rutênio foram testados in vitro e in vivo a fim de avaliar o potencial anti-T. cruzi
destes compostos.
Uma análise comparativa da inibição da replicação de epimastigotas e da
viabilidade de tripomastigotas de cepa Y tratadas com diferentes complexos de
rutênio descritos na literatura demonstra que os compostos testados neste trabalho
apresentam melhor atividade anti-T. cruzi in vitro. Parasitos na forma epimastigota
tratados com os compostos cis-[RuII(NO+)(bpy)2(imN)](PF6)3, cis- [RuII(NO+)(bpy)2(1miN)](PF6)3, cis-[RuII(NO+)(bpy)2(SO3)]PF6, e trans-[RuII(NO+)(NH3)4L](BF4)3 (L = pz,
isn, L-hist, imN, py, ou nic) apresentaram valores de IC50 variando entre 56 e136 µM.
Já em tripomastigotas, os valores de IC50 dos compostos trans-[RuII(NO+)(NH3)4L]n+
(L = pz, L-hist, imN, SO3, P(OEt)3, ou ina) e cis-[RuII(NO+)(bpy)2(imN)](PF6)3 variaram
entre 50 a 63 µM (SILVA et al., 2007; SILVA et al., 2009; SILVA et al., 2010; revisto
por TFOUNI et al., 2012).
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, é possível observar que
pequenas alterações na estrutura dos compostos proporcionam atividade citotóxica
e tripanocida variadas. Tem sido descrito na literatura que a posição de cada
substituinte na molécula tem uma importância fundamental não só nos complexos de
rutênio, mas em outros compostos, como por exemplo, os complexos de platina. Foi
observado que os mesmos análogos em diferentes posições geométricas (cisplatina
55
e transplatina) demonstram atividade do isômero cis e inatividade do isômero trans
(COLUCCIA & NATILE, 2007).
Em suma, é possível sugerir que a presença de apenas um grupo nitro na
molécula (composto 1) não induz toxicidade celular, entretanto, não é capaz de inibir
a proliferação da forma epimastigota de T. cruzi. Já a presença de 2 grupos nitro
(composto 2)
proporciona uma melhora da atividade tripanocida, incluindo a
capacidade de inibir a proliferação de epimastigotas, apesar de também induzir um
aumento na citotoxicidade. A limitada ou ausente inibição da atividade da cruzaína
por esses compostos sugere que complexos de rutênio que apresentam grupo nitro
na sua molécula não agem por esta via enzimática.
A substituição do grupo nitro para o grupo nitrosilo nos compostos 3 e 4
proporcionou um aumento da toxicidade celular, mas melhora significativa da ação
tripanocida do composto 3, indicando que a posição do NO nesta molécula na
posição cis ao cloro e trans ao fósforo favorece a atividade anti-T. cruzi com uma
melhor seletividade. É possível ainda sugerir a importância do grupo nitrosilo como
substituinte do complexo de rutênio em relação à atividade inibitória da cruzaína.
Estudos envolvendo a identificação de possíveis alvos quimioterápicos de diferentes
nitrosilos complexos de rutênio demonstram atividade inibitória da cruzaína e da
enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (SILVA et al., 2010; revisado por
TFOUNI et al., 2012).
Atualmente, a combinação de fármacos com diferentes mecanismos de ação
tem sido muito utilizada no tratamento de diversas doenças dentre elas a AIDS,
tuberculose, hanseníase e a malária, e pode ser também uma alternativa viável para
o tratamento da doença de Chagas (COURA, 2009). A terapia combinada com o
benzonidazol e/ou nifurtimox permite a utilização de baixas doses destes
medicamentos, diminuindo os severos efeitos colaterais decorrentes do tratamento.
Além disso, a terapia combinada pode não só aumentar a resposta terapêutica como
ajudar a evitar o desenvolvimento da resistência quimioterápica pelo parasito
(COURA, 2009), uma vez que podem atuar em diferentes vias metabólicas. Tem
sido observado experimentalmente que camundongos tratados com o composto
trans-[RuCl([15]aneN4)NO]2+ apresentaram uma taxa de cura parasitológica de 30%,
entretanto quando este complexo de rutênio doador de NO foi combinado com o
benzonidazol esta taxa foi de 80% (GUEDES et al., 2010). A partir dos resultados in
vivo observados neste trabalho, é possível sugerir que o uso combinado de doses
56
mais baixas do benzonidazol com composto 3 proporcionem o aumento da
sobrevida dos camundongos tratados, com ausência de parasitos detectados no
sangue.
A utilização de maiores doses do composto 3 também pode ser uma solução
viável para se obter uma resposta tripanocida mais eficaz durante o tratamento.
Entretanto, é preciso observar a presença de possíveis efeitos tóxicos nos
camundongos, uma vez que, em geral, quanto menor a potência de um fármaco, e
maior a dose necessária, maior a probabilidade de que outros sítios de ação,
diferentes do sítio primário, ganhem importância, causando, assim, os efeitos
colaterais indesejados (RANG et al., 2008).
É descrito na literatura que o NO é um agente tripanocida (GAZZINELLI et
al., 1992) e os mecanismos pelos quais o NO destrói os patógenos invasores
incluem a nitrosilação de ácidos nucleicos e a combinação com enzimas que contêm
o grupo heme, tais como as enzimas mitocondriais envolvidas na respiração (RANG
et al., 2008). O NO pode atuar como radical livre e também pode ser convertido a
um ânion altamente reativo (peroxinitrito), além de nitrito e nitrato. O efeito dessas
espécies reativas pode proporcionar relevantes lesões celulares, dentre elas a
peroxidação lipídica das membranas, modificação oxidativa de proteínas e lesões no
DNA (KUMAR et al., 2005). Esse estresse fisiológico pode causar alterações
morfológicas importantes (KUMAR et al., 2005). Os estudos de alterações
ultraestruturais em tripomastigotas e amastigotas, realizados neste trabalho,
demonstram diversas alterações morfológicas como consequência do tratamento
com o composto 3. A atrofia celular assim como a hipertrofia e hiperplasia são
exemplos de respostas adaptativas celulares às diferentes condições adversas
(KUMAR et al., 2005). Assim, é possível sugerir que os parasitos na forma
tripomastigota tratados com o composto 3 e visualizados por microscopia eletrônica
de varredura apresentaram atrofia celular como resposta adaptativa ao tratamento,
uma vez que, foi observado predominantemente tamanho reduzido destes parasitos.
Em diversas situações a atrofia celular se acompanha de um aumento
acentuado no número de vacúolos autofágicos (vacúolos intracelulares ligados à
membrana que contêm fragmentos de componentes celulares como a mitocôndria,
por exemplo, que são destinados a serem digeridos por conteúdos hidrolíticos
liberados pelos lisossomos) (KUMAR et al., 2005). A marcação positiva para MDC
de tripomastigotas tratadas com o composto 3 sugere a presença desses vacúolos
57
no parasito. Ademais, em T. cruzi a autofagia é caracterizada por um aumento da
vacuolização citoplasmática (TSUJIMOTO & SHIMIZU, 2005) e presença de
estruturas citoplasmáticas concêntricas (revisado por FERNANDES et al., 2012),
alterações estas visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão em
parasitos tratados com o composto 3. Assim, uma vez que a autofagia é essencial
para a manutenção do equilíbrio metabólico da célula, a partir da reciclagem das
estruturas celulares, e que a sua desregulação leva à morte celular (REGGIORI &
KLIONSKY, 2002), é possível que o tratamento esteja induzindo morte parasitária
por via autofágica.
Uma característica constante da maioria dos tipos de lesão celular é a perda
inicial da permeabilidade seletiva da membrana plasmática. A perda desta
permeabilidade pode ser causada pelo uso de quimioterápicos e pela formação de
espécies reativas de oxigênio, por exemplo, e pode afetar a mitocôndria, a própria
membrana plasmática e outras membranas celulares. Esta lesão resulta em perda
de equilíbrio osmótico com influxo de íons e fluidos, assim como perda de enzimas,
proteínas e ácidos nucleicos, prejudicando o funcionamento normal da célula
(KUMAR et al., 2005). A predominante marcação positiva para PI de tripomastigotas
tratadas com o composto 3 demonstram a perda da permeabilidade da membrana
plasmática nos parasitos. Além disso, as alterações de membrana, fragmentação e
descontinuidade, visualizadas por microscopia eletrônica de varredura também
reforçam esta hipótese. A presença de alterações na mitocôndria, visualizadas por
microscopia eletrônica de transmissão nos parasitos tratados com o composto 3,
com formação de estruturas concêntricas e inchaço mitocondrial, também podem
indicar alteração da permeabilidade da membrana plasmática como efeito do NO
doado. Compostos antimicrobianos visando mitocôndrias são alvos valiosos para
quimioterapia (KITA et al., 2003) e podem ser particularmente relevantes contra
parasitos tripanossomatídeos, em que a própria via glicolítica, além da fosforilação
oxidativa, também é depende da mitocôndria (CLARKSON et al., 1989).
O presente trabalho demonstra a atividade anti-T. cruzi in vitro e vivo dos 4
complexos de rutênio testados. Foi observada além da redução da viabilidade de
tripomastigotas, uma redução no número de amastigotas e de células infectadas
para os 4 compostos. Em relação à forma epimastigota, apenas o composto 1 não
foi capaz de inibir a replicação desta forma. Este fato tem sido atribuído à presença
de apenas um grupo nitro em sua estrutura. Observou-se que o composto 4
58
apresentou excelente inibição da atividade enzimática da cruzaína. Entretanto, o
baixo índice de seletividade in vitro e a morte precoce dos animais tratados com este
composto em relação ao controle sugerem a presença de efeitos adversos
decorrentes deste tratamento. O composto 3, apesar de apresentar um menor valor
de IC50 em relação ao composto 4 neste ensaio de inibição, apresentou uma melhor
atividade tripanocida in vitro e in vivo. Isso pode indicar a possibilidade do composto
3 inibir o crescimento e a viabilidade do T. cruzi por um mecanismo que não seja
relacionado à cruzaína. Dentre os 4 compostos testados, o composto 3 apresentou
melhor atividade tripanocida e uma maior seletividade. Por fim, os resultados deste
trabalho sugerem que o NO doado pelo composto 3 é o agente farmacológico
responsável pelos diversos efeitos no parasito, desde a alteração na permeabilidade
da membrana, o encolhimento de tripomastigotas e alterações mitrocondriais, e que
o tratamento com este nitrosilo complexo de rutênio está induzindo morte parasitária
por via autofágica.
Como perspectivas futuras deste trabalho, é sugerido o uso combinado do
composto 3 com o benzonidazol para ensaios in vivo. Em modelo de infecção aguda
da doença de Chagas, é interessante que além dos parâmetros avaliados, nível de
parasitemia e mortalidade, seja também avaliada a cura parasitológica, por métodos
moleculares, dos camundongos tratados. É possível ainda sugerir o uso de
camundongos imunossuprimidos e mais suscetíveis à infecção aguda como modelo
experimental e o uso de cepas do T. cruzi mais resistentes ao tratamento com o
benzonidazol, como a cepa Colombiana, por exemplo. É extremamente importante
que seja avaliada a eficácia do tratamento combinado também na fase crônica da
doença de Chagas. Além disso, é interessante que sejam realizados outros ensaios
in vitro a fim de identificar a via de ação do composto 3 e confirmar a presença de
alterações mitocondriais sugeridas neste trabalho. E por fim, este trabalho sugere a
utilização do composto 3 como molécula base para a síntese de outros nitrosilos
complexos de rutênio visando potencializar a atividade tripanocida destes
compostos.
59
7 CONCLUSÃO
- Os quatro complexos de rutênio testados apresentaram baixa citotoxicidade;
- Apenas o composto 1 não foi capaz de inibir o crescimento da forma
epimastigota, enquanto todos os compostos testados inibiram a viabilidade da forma
tripomastigota;
- Os complexos de rutênio testados foram capazes de inibir a replicação da
forma amastigota em macrófagos peritoneais infectados pelo T. cruzi, apresentando
redução do número de células infectadas e de amastigotas por célula;
- Apenas o composto 2 não foi capaz de inibir a atividade enzimática da
cruzaína;
- O modelo experimental in vivo demonstra que os compostos 1 e 2
apresentaram baixa resposta tripanocida, enquanto os compostos 3 e 4
conseguiram reduzir os níveis de parasitemia de forma mais acentuada, apesar de
apenas o composto 3 ter aumentado a taxa de sobrevida dos camundongos;
- Foi observada a presença de alterações ultraestruturais, como encolhimento
do parasito, fragmentação e descontinuidade de membrana, além de presença de
vacúolos citoplasmáticos e estruturas concêntricas decorrentes do tratamento in vitro
com composto 3;
- É possível sugerir que o NO doado pelo composto 3 seja o agente
tripanocida responsável pelas alterações celulares e pela morte parasitária por via
autofágica.
60
REFERÊNCIAS
ALARCÓN DE NOYA, B. et al. Large urban outbreak of orally acquired acute Chagas
disease at a school in Caracas, Venezuela. J Infect Dis. v. 201, n. 9, p.1308-15,
2010.
AUFDERHEIDE, A. C. et al. A 9.000-years record of Chagas' disease. Proc Nat
Acad Sci USA. v. 101, p. 2034-2039, 2004.
BOCEDI, A. et al. Kinetics of parasite cysteine proteinase inactivation by NO-donors.
Biochem Biophys Res Commun. v. 315, p. 710–718, 2004.
BONAVIDA, B. et al. Therapeutic potential of nitric oxide in cancer. Drug Resist
Updat. v. 9, p. 157–173, 2006.
BRENER, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally
infected with Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. trop. v. 4, p. 389-96, 1962.
BRENER, Z.; ANDRADE, Z. A.; BARRAL-NETTO, M. Trypanosoma cruzi e
Doença de Chagas. Editora Guanabara Koogan 2ª Edição. Rio de Janeiro, 2000.
431 p.
BUCKNER, F. S.; NAVABI, N. Advances in Chagas disease drug development:
2009-2010. Curr Opin Infect Dis. v. 23, n. 6, p. 609-16, 2010.
BUCKNER, F. S.; URBINA, J. A. Recent Developments in Sterol 14-demethylase
Inhibitors for Chagas Disease. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. v. 2, p. 236-242,
2012.
CAMPETELLA, O.; MARTINEZ, J.; CAZZULO, J. A major cysteine proteinase is
developmentally regulated in Trypanosoma cruzi. FEMS Microbiol Lett. v. 55, p.
145-149, 1990.
CARDILLO, F. et al. Regulation of Trypanosoma cruzi infection in mice by gamma
interferon and interleukin-10: the role of NK cell. Infect Immun. v. 64, p. 128–134,
1996.
61
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). Parasites American Trypanosomiasis (also known as Chagas Disease). Disponível em:
http://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.html. Acessado em 20 de janeiro de
2013.
CHAGAS, C. - Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfologia e o ciclo
evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolójico de nova entidade
mórbida do homem. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v. 1, p. 159-218, 1909.
CHAGAS, C. Tripanomíase Americana. Forma aguda da moléstia. Mem Inst
Oswaldo Cruz. v. 8, p. 37-65, 1916.
CLARKSON, A. B. et al. Trypanocidal CoQ analogues: their effect on other
mitochondrial systems. Comp Biochem Physiol B. v. 94, p. 245–251, 1989.
CLAYTON, J. Chagas disease 101. Nature. v. 465, suppl. S6—S7, 2010a.
CLAYTON, J. Chagas disease: pushing through the pipeline. Nature. v. 465, suppl.
S12—S15, 2010b.
COLUCCIA, M.; NATILE, G. Trans-platinum complexes in cancer therapy.
Anticancer Agents Med Chem. v. 7, n. 1, p. 111-23, 2007.
COURA, J. R. Tripanosomose, doença de Chagas. Cienc. Cult. v. 55, n. 1, p. 30-33,
2003.
COURA, J. R. Chagas disease: what is known and what is needed - A background
article. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v. 102, suppl. 1, p. 113-122, 2007.
COURA, J. R. Present situation and new strategies for Chagas disease
chemotherapy: a proposal. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v. 104, n. 4, p. 549-554,
2009.
COURA, J. R.; DIAS, J. C. P. Epidemiology, control and surveillance of Chagas
disease: 100 years after its discovery. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v.104, suppl. 1, p.
31-40, 2009.
COURA, J. R.; VIÑAS, P. A. Chagas disease: a new worldwide challenge. Nature. v.
465, n. 7301, suppl. S6—S7, 2010.
62
DING, A. H.; NATHAN, C. F.; STUEHR, D. J. Release of reactive nitrogen
intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal
macrophages. Comparison of activating cytokines and evidence for independent
production. J. Immunol. v. 141, p. 2407-2412, 1988.
DESOTI, V. C. et al. Trypanocidal Action of (−)-Elatol Involves an Oxidative Stress
Triggered by Mitochondria Dysfunction. Mar Drugs. v. 10, n. 8, p. 1631–1646, 2012.
DIAS DE TORANZO E. G. D. et al. Interation of benzonidazole reactive metabolites
with nuclear na kinetoplastic DNA, proteins and lipids from Trypanosoma cruzi.
Experientia. v. 44, n. 10, p. 880-1, 1988.
DOCAMPO, R.; STOPANI, A. O. M. Generation of superoxide anion and hidrogen
peroxide induced by nifurtimox in Trypanosoma cruzi. Archives of Biochem. and
Biophys. v. 197, p. 317-321, 1979.
DOS REIS, F. et al. The substrate specificity of cruzipain 2, a cysteine protease
isoform from Trypanosoma cruzi. FEMS Microbiol Lett. v. 259, p. 215-220, 2006.
ENGEL, J. C. et al. Cysteine protease inhibitors cure experimental Trypanosoma
cruzi infection. J. Exp. Med. v. 188, p. 725–734, 1998.
FERNANDES, M. C. et al. A novel triazolic naphthofuranquinone induces autophagy
in reservosomes and impairment of mitosis in Trypanosoma cruzi. Parasitology. v.
139, p. 26–36, 2012.
GARCIA, E. S.; AZAMBUJA P. Development and interactions of Trypanosoma cruzi
within the insect vector. Parasitol Today. v. 7, n. 9, p. 240-4, 1991.
GAZZINELLI, R. T. et al. The microbicidal activity of interferon-gamma-treated
macrophages against Trypanosoma cruzi involves an L-arginine-dependent, nitrogen
oxide-mediated mechanism inhibitable by interleukin-10 and transforming growth
factor-beta. Eur J Immun. v. 22, p. 2501–2506, 1992.
GLOBAL FORUM FOR HEALTH RESEARCH. The 10/90 Report on Health
Research 2001–2002. Global Forum for Health Research, Geneva, Switzerland,
2002.
63
GUEDES, P. M. et al. Nitric oxide donor trans-[RuCl([15]aneN)NO] as a possible
therapeutic approach for Chagas’ disease. Br J Pharmacol. v.160, p. 270–282,
2010.
HOLSCHER, C. et al. Defective nitric oxide effector functions lead to extreme
susceptibility of Trypanosoma cruzi-infected mice deficient in gamma interferon
receptor or inducible nitric oxide synthase. Infection and Immunity. v. 66, p. 12081215, 1998.
KITA, K.; NIHEI, C.; TOMITSUKA, E. Parasite mitochondria as drug target: diversity
and dynamic changes during the life cycle. Curr Med Chem. v. 10, p. 2535–2548,
2003.
KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Robbins e Cotran: Patologia: Bases
Patológicas das Doenças. 7 ed. Elsevier: Rio de Janeiro, 2005.
MARTINS, G. A. et al. Nitric oxideinduced apoptotic cell death in the acute phase of
Trypanosoma cruzi infection in mice. Immun Lett. v. 63, p. 113–120, 1998.
MCKERROW, J. et al. Proteases in parasitic diseases. Annual Review Pathology
Mechanisms Disease. v. 1, p. 497-536, 2006.
MEIRELLES, M. et al. Inhibitors of the major cysteinyl proteinase (GP57/51) impair
host cell invasion and arrest the intracellular development of Trypanosoma cruzi in
vitro. Mol Biochem Parasitol. v. 52, p. 175- 184, 1992.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Aspectos Epidemiológicos. Disponível em:
http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/visualizar_texto.cfm?idtxt=31454.
Acessado em 19 de novembro de 2012.
MONCAYO, A.; SILVEIRA, A. C. Current epidemiological trends for Chagas disease
in Latin America and future challenges in epidemiology, surveillance and health
policy. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v. 104, Suppl. I, p. 17-30, 2009.
NAPOLI, C.; IGNARRO, L. J. Nitric oxide-releasing drugs. Annual Rev Pharmacol
Toxicol. v. 43, p. 97–123, 2003.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Chagas disease (American
trypanosomiasis. Disponível na Internet via:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/index.html. Acessado em: 1 de
dezembro de 2010.
64
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Neglected tropical diseases. Disponível em:
http://www.who.int/neglected_diseases/en/. Acessado em: 11 de março de 2013.
RANG, H. P, et al. Rang & Dale Farmacologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008,
829p.
REGGIORI, F.; KLIONSKY, D. J. Autophagy in the eukaryotic cell. Eukaryotic Cell.
v. 1, p. 11–21, 2002.
SCHARFSTEIN, J. et al. Trypanosoma cruzi: characterization and isolation of a
57/51,000 m.w. surface glycoprotein (GP57/51) expressed by epimastigotes and
bloodstream trypomastigotes. J Immunol. v. 137, p. 1336-1341, 1986.
SCHMUNIS, G. A. Epidemiology of Chagas disease in non endemic countries: the
role of international migration. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v.102, suppl.1, p. 75-86,
2007.
SILVA, J. S. et al. TNF mediates resistance to Trypanosoma cruzy infection in mice
by inducing nitric oxide production in infected IFN--activated macrophages. Infect
Immun. v. 63, p. 4862–4867, 1995.
SILVA J. J. et al. In vitro and in vivo antiproliferative and trypanocidal activities of
ruthenium NO donors. Br J Pharmacol. v. 152, n. 1, p. 112-21, 2007.
SILVA, J. J. et al. Experimental chemotherapy against Trypanosoma cruzi infection
using ruthenium nitric oxide donors. Antimicrob Agents Chemother. v. 53, p. 4414–
4421, 2009.
SILVA, J. J. N. et al. Novel ruthenium complexes as potential drugs for Chagas's
disease: enzyme inhibition and in vitro/in vivo trypanocidal activity. Br J Pharmacol.
v. 160, n. 2, p. 260-9, 2010.
SOEIRO, M. DE N.; de CASTRO. S. L. Screening of Potential anti-Trypanosoma
cruzi Candidates: In Vitro and In Vivo Studies. Open Med Chem J. v. 5, p. 21- 30,
2011.
SOUTO-PADRON, T. et al. Cysteine proteinase in Trypanosoma cruzi:
immunocytochemical localization and involvement in parasite-host cell interaction. J
Cell Sci. v. 96, p. 485-490, 1990.
65
STEINDEL, M. et al. Characterization of Trypanosoma cruzi isolated from humans,
vectors, and animal reservoirs following an outbreak of acute human Chagas disease
in Santa Catarina State. Brazil. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. v. 60, p. 25–32, 2008.
TFOUNI, E. et al. Biological activity of ruthenium nitrosyl complexes Nitric Oxide. v.
26, p. 38–53, 2012.
TSUJIMOTO, Y.; SHIMIZU, S. Another way to die: Autophagic programmed cell
death. Cell Death Differ. v. 12, p. 1528–1534, 2005.
URBINA, J. A. Specific chemotherapy of Chagas disease: relevance, current
limitations and new approaches. Acta Trop. v. 115, n. 1-2, p. 55-68, 2010.
VESPA, G. N.; CUNHA, F. Q.; SILVA, J. S. Nitric oxide is involved in control of
Trypanosoma cruzi-induced parasitemia and directly kills the parasite in vitro. Infect
Immun. v. 62, n. 11, p. 5177-82, 1994.
WAGHABI, M. C. et al. Activation of transforming growth factor beta by Trypanosoma
cruzi. Cell. Microbiol. v. 7, p. 511–517, 2005.
ZINGALES, B. Trypanosoma cruzi: um parasita, dois parasites ou vários parasitas da
doença de Chagas? Rev Biol. v. 6b, p. 44–48, 2011.
ZINGALES, B. et al. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature:
rationale, epidemiological relevance and research applications. Infect Genet Evol. v.
12, n. 2, p. 240-53, 2012.
66
ANEXO
Acta Tropica 122 (2012) 224–229
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Acta Tropica
journal homepage: www.elsevier.com/locate/actatropica
Short communication
Anti-Trypanosoma cruzi activity of nicotinamide
Milena B.P. Soares a,b,∗ , Cinara V. Silva a , Tanira M. Bastos a , Elisalva T. Guimarães a , Claudio P. Figueira a ,
Despina Smirlis c , Walter F. Azevedo Jr. d,e
a
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Rua Waldemar Falcão, 121, Candeal 40296-710, Salvador, BA, Brazil
Hospital São Rafael, Av. São Rafael, 2152, São Marcos 41253-190, Salvador, BA, Brazil
Laboratory of Molecular Parasitology, Microbiology Dpt, Hellenic Pasteur Institute, 127 Vasilissis Sofias avenue, 11521 Athens, Greece
d
Faculdade de Biociências, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose-CNPq, Laboratório de Bioquímica Estrutural, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul – PUCRS, Porto Alegre, Brazil
e
Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
b
c
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 13 May 2011
Received in revised form
13 December 2011
Accepted 1 January 2012
Available online 18 January 2012
Keywords:
Sirtuin
Trypanosoma cruzi
Nicotinamide
Virtual screening
a b s t r a c t
Inhibition of Trypanosoma brucei and Leishmania spp. sirtuins has shown promising antiparasitic activity, indicating that these enzymes may be used as targets for drug discovery against trypanosomatid
infections. In the present work we carried out a virtual screening focused on the C pocket of Sir2 from
Trypanosoma cruzi. Using this approach, the best ligand found was nicotinamide. In vitro tests confirmed
the anti-T. cruzi activity of nicotinamide on epimastigote and trypomastigote forms. Moreover, treatment of T. cruzi-infected macrophages with nicotinamide caused a significant reduction in the number
of amastigotes. In addition, alterations in the mitochondria and an increase in the vacuolization in the
cytoplasm were observed in epimastigotes treated with nicotinamide. Analysis of the complex of Sir2 and
nicotinamide revealed the details of the possible ligand–target interaction. Our data reveal a potential
use of TcSir2 as a target for anti-T. cruzi drug discovery.
© 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Trypanosoma cruzi is a hemoflagellate protozoan parasite
causative of Chagas’ disease, or American Trypanosomiasis, a disease affecting 16–18 millions of persons mainly in Latin American
countries (WHO, 2002). It is transmitted by reduviid bugs to mammalian hosts, and in humans the infection courses with two phases.
The acute phase is characterized by intense blood parasitemia and
tissue parasitism, whereas in the chronic phase the parasitism is
scarce, but persistent. The chronic symptomatic form of the disease appears in about 30% of the individuals, and manifests as
cardiomyopathy, megasyndromes (megacolon and megaesophagus), or both forms (Soares et al., 2001). Currently there are two
drugs available for the treatment of Chagas’ disease, Benznidazole
and Nifurtimox, which are endowed with high toxicity and low efficacy in the chronic phase of infection. Thus, there is a great need
for new drugs more effective against the parasite and less toxic to
humans (Moreira et al., 2009).
∗ Corresponding author at: Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, FIOCRUZ, Rua
Waldemar Falcão, 121, Candeal 40296-710, Salvador, BA, Brazil. Tel.: +55 71 3176
2260; fax: +55 71 3176 2272.
E-mail address: milena@bahia.fiocruz.br (M.B.P. Soares).
0001-706X/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.actatropica.2012.01.001
Sirtuins are NAD-dependent deacetylases conserved from bacteria to mammals, and genes coding for seven sirtuins (SIRT 1–7)
have been found in the human genome. Sirtuin catalyzes the
deacetylation of acetylated lysine residues of histone and nonhistone substrates. The structural basis for inhibition of sirtuins
has been established through previous structural and functional
studies (Denu, 2003, 2005; García-Salcedo et al., 2003; Hoff et al.,
2006). Involvement of sirtuins in the cell cycle strongly suggests
a role for these enzymes in cancer and the potential use of their
inhibitors as anticancer drugs (Irwin and Shoichet, 2005). In addition, inhibition of sirtuins from Trypanosoma brucei and Leishmania
sp. showed promising results, indicating that these enzymes may
be considered as targets for drug discovery in parasite infection
(Jackson et al., 2003; Kadam et al., 2006, 2008; Kowieski et al., 2008).
Several structures of complexes involving sirtuins and inhibitors
have been reported (Hoff et al., 2006; Lipinski et al., 1997; Moreira
et al., 2009). Nicotinamide, a well known sirtuin inhibitor, is a
water-soluble vitamin of the B complex, which together with nicotinic acid belongs to vitamin B3 or vitamin PP and it acts as
constituent of the enzyme cofactors NAD (nicotinamide adenine
dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) (pyridine nucleotides). These molecules function as electron
carriers in cell metabolism of carbohydrates, fatty acids and amino
acids. Nicotinamide has been used to treat pellagra, osteoarthritis
and is currently in trials as a therapy to prevent cancer recurrence
M.B.P. Soares et al. / Acta Tropica 122 (2012) 224–229
and insulin-dependent (type I) diabetes. This vitamin is safe even
when administered at high dosage (6 g/day) in human (Flodin,
1988; Sereno et al., 2005; Gazanion et al., 2011).
In this context, this study reports homology modeling of Sir2
from T. cruzi (TcSir2) and structure-based virtual screening (SBVS)
focused on the C pocket of TcSir2. The best hit identified in the
SBVS, nicotinamide, was submitted to biological activity test, which
confirmed its anti-T. cruzi activity.
2. Materials and methods
2.1. TcSir2 modeling, docking analysis and virtual screening
The web server PARMODEL was used to model the structure of
Sir2 (EC 3.5.1.) from T. cruzi (gene name: Tc00.1047053447255.20)
(Nguewa et al., 2004; Oprea et al., 2001). The complete amino acid
sequence of TcSir2 was obtained from the NCBI protein database
(Q4CNV0 TRYCR; SWISSPROT Accession Number Q4CNV0-1). We
used the atomic coordinates of Sir2 from Thermotoga maritima
(TmSir2) (PDB access code: 1yc5), which presents 33% identity with
Sir2 from T. cruzi (TcSir2). We applied the flexible docking protocol available in the program MolDock (Sali and Blundell, 1993).
In order to validate the present docking protocol we performed
the docking simulation against the nicotinamide-binding pocket
(also known as C pocket) of TcSir2 and compared with the modeled
structure, obtained directly from the crystallographic structure of
complex Sir2-nicotinamide (1yc5). We used the default protocol of
MolDock with center at coordinates x = 5.73, y = 24.93 and z = 8.31 Å
and docking sphere with radius of 7 Å. It has been proposed that
nicotinamide is an important template for inhibition of Sir2 from
Leishmania (Kowieski et al., 2008). Based on this observation, we
employed the nicotinamide core to carry out a search in the ZINC
database to build a small-molecule database, using the fingerprint
of nicotinamide with a Tanimoto coefficient cutoff of 90% (Sauve
et al., 2001). A total of 159 molecules were retrieved and used to
build this database (Sauve and Schramm, 2004).
2.2. Anti-T. cruzi assay on epimastigote and trypomastigote forms
Epimastigotes of T. cruzi (Y and Colombian strains) were cultured at 26 ◦ C in liver infusion tryptose medium (LIT) supplemented
with 10% fetal bovine serum (FBS) (Cultilab, Campinas, SP, Brazil),
1% hemin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1% R9 medium (Sigma), and
50 ␮g/mL gentamycin (Sigma). Parasites (107 cells/mL) were cultured in fresh medium in the absence or presence of nicotinamide
(Sigma, St. Louis, MO, USA) at various concentrations (2.46 mM,
0.82 mM, 0.27 mM, 0.09 mM, 0.03 mM, and 0.009 mM), in triplicates. Cell growth was determined after culture for 3–6 days by
counting viable forms in a hemocytometer. Trypomastigote forms
of Y and Colombian T. cruzi strains were obtained from supernatants
of infected LCC-MK2 cell cultures and cultured in 96-well plates
(4 × 105 /well) in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.10 mM
gentamycin in the absence or presence of different concentrations
of nicotinamide, in triplicates. Viable parasites were counted in a
hemocytometer 24 h later. The percentage of inhibition was calculated in relation to untreated cultures.
2.3. In vitro T. cruzi infection assay
Peritoneal exudate cells were obtained by washing with saline
solution the peritoneal cavity of BALB/c mice five days after
injection of 3% thioglycollate (1.5 ml per mouse). All animals
were maintained at the animal facilities at the Gonçalo Moniz
Research Center – FIOCRUZ, Salvador, Bahia, Brazil and the protocol was approved by the Animal Ethics Committee of the Centro
225
de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fiocruz (protocol number L-02909). Peritoneal exudate cells were washed twice with saline and
resuspended in RPMI medium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) supplemented with 10% FBS, l-glutamine (2 mM), sodium pyruvate
(1 mM), HEPES (10 mM), and gentamycin (0.10 mM). To evaluate
the trypanocidal activity of nicotinamide on amastigote forms, peritoneal exudate cells were plated at 2 × 105 cells/well in 24-well
plates with glass coverslips in the bottom and cultured during 24 h
prior to infection. Macrophages were infected with trypomastigotes of Y strain at a ratio of 10 parasites per macrophage. After 2 h
of infection, the free trypomastigotes were removed by successive
washes using saline solution. Cultures were incubated in complete medium alone or with nicotinamide (0.09 mM and 0.9 mM)
or 0.08 mM benznidazole (used as a reference trypanocidal drug).
Six hours later, wells were washed and cultures were incubated
in complete medium for 4 days. Cells were then fixed in methanol
and the percentage of infected macrophages and the mean number
of amastigotes/infected macrophages were determined by counting the slides after Giemsa staining using an optical microscope
(Olympus, Tokyo, Japan), by counting 100 cells per slide.
2.4. Electron microscopy analysis
Epimastigotes of Y strain T. cruzi were incubated for 6 days at
26 ◦ C in the absence or presence of nicotinamide. After incubation,
the parasites were fixed for 24 h at 4 ◦ C with 2.0% glutaraldehyde
in 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.2) and were post-fixed for 1 h at
4 ◦ C with 1% OsO4 with the same buffer. The samples were then
routinely processed for transmission electron microscopy and were
examined in an EM109 electron microscope (Zeiss, Germany).
2.5. Statistical analyses
To determine the IC50 value, we used nonlinear regression on
Prism 5.02 GraphPad software. Student’s t test was applied to ascertain the statistical significance of the observed differences in IC50
values. The one-way ANOVA and Bonferroni tests were used to
determine the statistical significance of the group comparisons in
the in vitro infection study. Results were considered statistically
significant when P < 0.05.
3. Results
3.1. TcSir2 modeling
First, we performed a multiple alignment of TcSir2 with the
canonical fold of the sirtuins from T. brucei (Tb927.7.1690), L.
infantum (LinJ.26.0200) and the Homo sapiens SIRT1 (uniprot id:
Q96EB6) (Fig. 1). We then performed homology modeling of TcSir2.
The structure obtained from homology modeling presents the
canonical fold of sirtuins, as shown in Fig. 2. The TcSir2 structure
presents a bilobal structure with the larger domain consisting predominantly of a modified Rossmann fold, found in many diverse
NAD(H)/NADP(H) binding enzymes, and the minor domain that
contains a structural zinc atom. At the interface of the two domains,
there is a large groove formed by the four crossovers and three loops
of the large domain. The larger lobe is formed by six ␤-strands
that shape a parallel ␤-sheet. This central ␤ sheet is tightly surrounded by six ␣ helices. Between the two lobes there is a cleft
where NAD+ binds. There is a zinc-binding pocket, where the zinc
atom is coordinated by Cys 121, Cys 144, and Thr124.
3.2. Docking studies on TcSir2
The use of the MolDock to the structure of TcSir2 in complex with nicotinamide was capable of correctly predicting the
226
M.B.P. Soares et al. / Acta Tropica 122 (2012) 224–229
Fig. 1. Multiple-sequence alignment of the sirtuin catalytic domain. Multiple-sequence alignment of the sirtuin catalytic domain in TcSir2 (template Tc00.1047053447255.20,
whole protein), in T. brucei (template Tb927.7.1690, aminoacid residues 18–327), in L. infantum (template LinJ.26.0200, aminoacid residues 20–351) and in Homo sapiens
SIRT1 (template uniprot id: Q96EB6). Identical residues are indicated in black shading and similar residues in gray. The multiple sequence alignment was based on the Clustal
W algorithm.
nicotinamide positioning in the binding pocket of TcSir2, the RMSD
of superposition is 0.59 Å. Similar docking protocols have been
employed in SBVS focused on Sir2 from Leishmania (Kowieski et al.,
2008). Since this docking protocol seems capable of reproducing the
crystallographic structure, we applied it to a dataset of molecules
Fig. 2. Structure of TcSir2. The ellipse indicates the larger domain, and the arrow
indicates the C pocket.
which presents nicotinamide core. Nicotinamide presents several
structural properties that make it a promising template for SBVS,
such as cLog P = −0.4, molecular weight of 122.13 g/mol, number of
rotatable bonds = 1, polar surface area = 56 Å2 , H-bond donor = 1 and
H-bond acceptor = 2. All these values satisfy the Lipinski and Veber
rules (Schmidt et al., 2004; Schuetz et al., 2007). In addition, combination of the ideas of lead-likeness, template conservation and
fragment-based screening has generated guidelines for the structural properties of scaffolds employed in screening libraries. This
knowledge is incorporated in the ‘rule of 3’, which is also satisfied by
nicotinamide (Soares et al., 2001). It has been observed that nicotinamide inhibits the deacetylation activity of SIRT1 by interacting
with a reaction intermediate. The catalyzed deacetylation conducts
to production of 2 - and 3 -O-acetyl-ADP-ribose and deacetylated
lysine. If nicotinamide binds to the enzyme when it contains
the O-akyl-amidate intermediate, nicotinamide can react with the
Fig. 3. C pocket of TcSir2 showing nicotinamide and acetylate lysine.
M.B.P. Soares et al. / Acta Tropica 122 (2012) 224–229
227
Fig. 4. Alterations in T. cruzi epimastigotes caused by nicotinamide. Y strain T. cruzi epimastigotes were cultured for 6 days in the absence (A and B) or presence (C and D) of
nicotinamide (2.46 mM). Transmission electron micrographs showing alterations in the mitochondria and kinetoplast in C and D, compared to untreated controls (A and B).
Arrows indicate the kinetoplasts; (n) nucleus; (fp) flagellar pocket; (f) flagellum; (↑) basal corpuscle; (§) lipid inclusions.
intermediate in a procedure known as nicotinamide exchange, in
which NAD+ and N6-acetyl-lysine are reformed (Szczepankiewicz
and Ng, 2008; Taunton et al., 1996; Thomsen and Christensen, 2006;
Timmers et al., 2008). Furthermore, the rate of the nicotinamide
exchange reaction can be increased by raising the nicotinamide
concentration, which happens at expense of the deacetylation
activity. These studies suggest that this moiety deserves further
investigation as a potential sirtuin inhibitor.
Docking simulations of these molecules against the active site
of TcSir2 returned nicotinamide as the best ligand (lowest score:
−48.67). Fig. 3 shows nicotinamide docked to TcSir2. Analysis of
the positioning of nicotinamide in the C pocket indicates that it
binds in the substrate binding cleft contiguous to the acetyl lysine
side chain (Fig. 3). Nicotinamide presents intermolecular interactions with main-chain oxygen from Trp32, side-chain oxygen of
Asp98, and main chain nitrogen from Asp98. These residues outline
a hydrophobic pocket, known as the C pocket, and forms hydrogen bond interactions that rotate the carboxamide approximately
150◦ from its favored coplanar conformation with the nicotinamide
ring. The residues Asp 98 presents strong intermolecular hydrogen
bonds with the carboximide moiety, which functions as an anchor
to fix nicotinamide in the C pocket. The positioning of nicotinamide
in the C pocket and the rotation of the carboxamide group are comparable to what has been observed in the structure of Sir2Af2 bound
NAD+ in the “productive” conformation (Szczepankiewicz and Ng,
2008).
3.3. Nicotinamide inhibits the growth and viability of T. cruzi
The growth of epimastigotes from Y and Colombian T. cruzi
strains in the presence of nicotinamide was inhibited in a
concentration-dependent manner in axenic cultures. The IC50
values are shown in Table 1. The observation by light microscopy
of epimastigotes cultured in the presence of nicotinamide showed
the presence of rounded parasites, some of them in division,
whereas in control cultures epimastigotes were highly mobile and
elongated (data not shown). Transmission electron microscopy
analysis was performed in order to evaluate morphological and
ultra-structural alterations in nicotinamide-treated parasites. As
shown in Fig. 4A and B, control parasites presented normal mitochondria with bar-shaped kinetoplasts. In contrast, epimastigotes
treated with 2.46 mM, but not 0.82 mM nicotinamide, had alterations in the mitochondria, such as swelling and disorganization
of the kinetoplast and an increase in the vacuolization in the cytoplasm (Fig. 4C and D). Approximately 60% of the parasites presented
these ultra-structural alterations. Treatment of trypomastigotes of
Y and Colombian T. cruzi strains with nicotinamide had a cytotoxic
effect in a concentration-dependent manner (Fig. 5A and B).
The effects of nicotinamide on the intracellular form of the parasite were also evaluated in cultures of macrophages infected with T.
cruzi. Treatment of macrophage cultures with nicotinamide caused
a significant reduction in the percentage of macrophages infected
by T. cruzi and in the number of intracellular parasites, in concentrations non-toxic to macrophages (Fig. 6A and B).
Table 1
IC50 values of nicotinamide on T. cruzi epimastigotes.
T. cruzi strain
3 days
6 days
Pa
Y
Colombian
0.037 ± 0.016
0.025 ± 0.001
0.126 ± 0.025
0.100 ± 0.007
0.0145
0.0004
Data are expressed as means ± SEM in mM of 3–6 independent experiments performed.
a
Compared between the third and sixth day/each strain.
228
M.B.P. Soares et al. / Acta Tropica 122 (2012) 224–229
Fig. 5. Effects of nicotinamide on trypomastigote forms of T. cruzi. Trypomastigotes of Y (A) and Colombian (B) T. cruzi strains were incubated with nicotinamide at different
concentrations. The number of viable trypomastigotes was determined 24 h later by counting the parasite preparations in a hemacytometer. Results are expressed as
means ± SEM of three independent experiments performed.
4. Discussion
Fig. 6. Effects of nicotinamide on macrophages infected with T. cruzi. Peritoneal
macrophages were infected with Y stran trypomastigotes at a ratio 10:1 (parasites/macrophages), and treated with benznidazole (0.08 mM) and nicotinamide
(0.09 and 0.9 mM) or not (control), as described in Section 2. The percentage of
infected macrophages (A) and the number of amastigotes (B) were determined
by counting Giemsa-stained slides using a light microscope. Results are expressed
as means ± SD of triplicates, and represent one of two independent experiments
performed. *P < 0.05 vs. control; **P < 0.01 vs. control.
In this study we show the antitrypanosomal properties of nicotinamide. Although not much is known on the mechanisms of entry
of nicotinic acid into trypanosoma parasites, we believe that since
these parasites rely on NADP levels for their survival (Leroux et al.,
2011), they should possess functional nicotinic acid/nicotinamide
transporters. Glucose transporters and proteins belonging to the
major facilitator superfamily have been implicated in the transport of nicotinate/nicotinamide (Jeanguenin et al., 2011; Sofue
et al., 1992). Homologs of this major facilitator superfamily are
also present in T. cruzi (i.e. glucose transporter). We have shown
here that nicotinamide is a potential inhibitor of T. cruzi Sir2. We
have also performed a molecular modeling of TcSir2. Little is known
about sirtuins from T. cruzi, compared to other trypanosomatids.
The expression of Sir2 homolog in amastigotes of Y strain T. cruzi
was suggested by using antibodies raised against the Leishmania
major Sir2 recombinant protein LmSir2 (Uchoa et al., 2004). In T.
brucei, a Sir2-related protein (TbSir2RP1) was cloned and characterized from the insect form of the parasite (Veber et al., 2002). This
protein is found located in the nucleus and kinetoplast, associated
to chromosome, and is a NAD-dependent ADP-ribosyltransferase
which also catalyzes the deacetylation of histones, mainly H2A and
H2B. TbSir2RP1 confers resistance to DNA damage caused by the
DNA alkylating agent MMS (Veber et al., 2002). Moreover, Alsford
et al. (2007) identified, in the mammalian-infective bloodstreamstage of T. brucei, three SirT2 homologs, Sir2rp1-3 (Zemzoumi et al.,
1998). Sir2rp1 had a nuclear localization, while Sir2rp2 and Sir2rp3
were found in the mitochondria. The role of the T. cruzi Sir2 homolog
is unknown, but the alterations in the kinetoplast and growth arrest
observed in our study suggest that this protein also play an important role in DNA repair in T. cruzi.
It has been proposed that Sir2 is a promising target for development of antitrypanosomal, antiplasmodial and antileishmanial
drugs (Kadam et al., 2008; Prusty et al., 2008; Kowieski et al., 2008).
The sequence alignment between the T. cruzi TcSir2 and the Homo
sapiens SIRT1 protein suggests that despite the homology there are
many differences in the aminoacid sequence of the sirtuin catalytic
domain that could be useful for the evaluation of this protein as a
putative drug target. In addition, an in silico structural and surface
analysis of trypanosomal and human sirtuins suggested the presence of potentially important structural differences in the inhibitor
binding domain of these proteins, indicating a possible selectivity of an inhibitor to a specific protein (Kaur et al., 2010). Sereno
et al. (2005) showed that overexpression of a Leishmania cytoplasmic SIR2-related protein promoted the survival of amastigote forms
by preventing programmed cell death. The authors suggested that,
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since nicotinamide is an inhibitor of certain deacetylase SIR2 proteins, it may have an impact on the parasite growth by interfering
with metabolic processes involving deacetylase activities dependent on SIR2-like proteins (Sereno et al., 2005). In our tests, SBVS
focused on TcSir2 identified nicotinamide as the best ligand from a
small-molecule database of 159 molecules. In vitro tests confirmed
the anti-T. cruzi activity of this molecule, both against epimastigote
and trypomastigote forms of the parasite, in two different strains. In
addition, nicotinamide was found active against amastigote forms
in an in vitro infection model. The inhibition of TcSir2 arrested the
parasite growth, implicating that it deregulated the parasite cellcycle. This is in accordance with Sereno et al. (2005), who suggested
that even at concentration as high as 80 mM, nicotinamide does not
kill instantly the T. brucei and Leishmania, but inhibits the parasite
growth.
Since nicotinamide presents low molecular weight and low
number of hydrogen donors and acceptors, its scaffold is adequate
for further optimization in order to enhance target affinity. Nicotinamide is very cheap, has low toxicity and can be administered
at a high dose (10 g/day) (Prusty et al., 2008). Further studies are
needed in order to understand the role of Sir2 on T. cruzi.
Acknowledgments
This work was supported by grants from CNPq, PRONEX, FAPESB
and RENORBIO. MBPS and WFA are senior researchers for CNPq
(Brazil).
References
Alsford, S., Kawahara, T., Isamah, C., Horn, D., 2007. A sirtuin in the African trypanosome is involved in both DNA repair and telomeric gene silencing but is
not required for antigenic variation. Mol. Microbiol. 63, 724–736.
Denu, J.M., 2003. Linking chromatin function with metabolic networks: Sir2 family
of NAD(+)-dependent deacetylases. Trends Biochem. Sci. 28, 41–48.
Denu, J.M., 2005. Vitamin B3 and sirtuin function. Trends Biochem. Sci. 30, 479–483.
Flodin, N.W., 1988. Niacin and niacinamide. Curr. Top. Nutr. Dis. 20, 129–138.
García-Salcedo, J.A., Gijón, P., Nolan, D.P., Tebabi, P., Pays, E., 2003. A chromosomal
SIR2 homologue with both histone NAD-dependent ADP-ribosyltransferase and
deacetylase activities is involved in DNA repair in Trypanosoma brucei. EMBO J.
22, 5851–5862.
Gazanion, E., Vergnes, B., Seveno, M., Garcia, D., Oury, B., Ait-Oudhia, K., Ouaissi, A.,
Sereno, D., 2011. In vitro activity of nicotinamide/antileishmanial drug combinations. Parasitol. Int. 60, 19–24.
Hoff, K.G., Avalos, J.L., Sens, K., Wolberger, C., 2006. Insights into the sirtuin
mechanism from ternary complexes containing NAD+ and acetylated peptide.
Structure 14, 1231–1240.
Irwin, J.J., Shoichet, B.K., 2005. ZINC—a free database of commercially available compounds for virtual screening. J. Chem. Inf. Model. 45, 177–182.
Jackson, M.D., Schmidt, M.T., Oppenheimer, N.J., Denu, J.M., 2003. Mechanism of
nicotinamide inhibition and transglycosidation by Sir2 histone/protein deacetylases. J. Biol. Chem. 278, 50985–50998.
Jeanguenin, L., Lara-Núñez, A., Rodionov, D.A., Osterman, A.L., Komarova, N.Y.,
Rentsch, D., Gregory 3rd, J.F., Hanson, A.D., 2011. Comparative genomics and
functional analysis of the NiaP family uncover nicotinate transporters from bacteria, plants, and mammals. Funct. Integr. Genomics, Sep 28, 2011 (Epub ahead
of print).
Kadam, R.U., Kiran, V.M., Roy, N., 2006. Comparative protein modeling and surface analysis of Leishmania sirtuin: a potential target for antileishmanial drug
discovery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 6013–6018.
229
Kadam, R.U., Tavares, J., Kiran, V.M., Cordeiro, A., Ouaissi, A., Roy, N., 2008. Structure
function analysis of Leishmania sirtuin: an ensemble of in silico and biochemical
studies. Chem. Biol. Drug Des. 71, 501–506.
Kaur, S., Shivange, A.V., Roy, N., 2010. Structural analysis of trypanosomal sirtuin:
an insight for selective drug design. Mol. Divers. 14, 169–178.
Kowieski, T.M., Lee, S., Denu, J.M., 2008. Acetylation-dependent ADP-ribosylation by
Trypanosoma brucei Sir2. J. Biol. Chem. 283, 5317–5326.
Leroux, A.E., Maugeri, D.A., Cazzulo, J.J., Nowicki, C., 2011. Functional characterization of NADP-dependent isocitrate dehydrogenase isozymes from Trypanosoma
cruzi. Mol. Biochem. Parasitol. 177, 61–64.
Lipinski, C.A., Lombardo, F., Dominy, B.W., Feeney, P.J., 1997. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery
and development settings. Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3–26.
Moreira, D.R., Leite, A.C., dos Santos, R.R., Soares, M.B., 2009. Approaches for the
development of new anti-Trypanosoma cruzi agents. Curr. Drug Targets 10,
212–231.
Nguewa, P.A., Fuertes, M.A., Valladares, B., Alonso, C., Pérez, J.M., 2004. Programmed
cell death in trypanosomatids: a way to maximize their biological fitness. Trends
Parasitol. 20, 375–380.
Oprea, T.I., Davis, A.M., Teague, S.J., Leeson, P.D., 2001. Is there a difference
between leads and drugs a historical perspective. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41,
1308–1315.
Sali, A., Blundell, T.L., 1993. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial
restraints. J. Mol. Biol. 234, 779–815.
Prusty, D., Mehra, P., Srivastava, S., Shivange, A.V., Gupta, A., Roy, N., Dhar, S.K., 2008.
Nicotinamide inhibits Plasmodium falciparum Sir2 activity in vitro and parasite
growth. Microbiol. Lett. 282, 266–272.
Sauve, A.A., Celic, I., Avalos, J., Deng, H., Boeke, J.D., Schramm, V.L., 2001. Chemistry
of gene silencing: the mechanism of NAD+-dependent deacetylation reactions.
Biochemistry 40, 15456–15463.
Sauve, A.A., Schramm, V.L., 2004. SIR2: the biochemical mechanism of NAD(+)dependent protein deacetylation and ADP-ribosyl enzyme intermediates. Curr.
Med. Chem. 11, 807–826.
Schmidt, M.T., Smith, B.C., Jackson, M.D., Denu, J.M., 2004. Co-enzyme specificity
of Sir2 protein deacetylases: implications for physiological regulation. J. Biol.
Chem. 279, 40122–40129.
Schuetz, A., Min, J., Antoshenko, T., Wang, C.L., Allali-Hassani, A., Dong, A., Loppnau,
P., Vedadi, M., Bochkarev, A., Sternglanz, R., Plotnikov, A.N., 2007. Structural
basis of inhibition of the human NAD+-dependent deacetylase SIRT5 by suramin.
Structure 15, 377–389.
Sereno, D., Monte Alegre, A., Silvestre, R., Vergnes, B., Ouaissi, A., 2005. In vitro
antileishmanial activity of nicotinamide. Antimicrob. Agents Chemother. 49,
808–812.
Soares, M.B., Pontes-de-Carvalho, L., Ribeiro-dos-Santos, R., 2001. The pathogenesis
of Chagas’ disease: when autoimmune and parasite-specific immune responses
meet. An. Acad. Bras. Cienc. 73, 547–559.
Sofue, M., Yoshimura, Y., Nishida, M., Kawada, J., 1992. Possible multifunction
of glucose transporter. Transport of nicotinamide by reconstituted liposomes.
Biochem. J. 288, 669–674.
Szczepankiewicz, B.G., Ng, P.Y., 2008. Sirtuin modulators: targets for metabolic diseases and beyond. Curr. Top. Med. Chem. 8, 1533–1544.
Taunton, J., Hassig, C.A., Schreiber, S.L., 1996. A mammalian histone deacetylase
related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p. Science 272, 408–411.
Thomsen, R., Christensen, M.H., 2006. MolDock: a new technique for high-accuracy
molecular docking. J. Med. Chem. 49, 3315–3321.
Timmers, L.F.S., Pauli, I., Caceres, R.A., De Azevedo Jr., W.F., 2008. Drug-binding
databases. Curr. Drug Targets 9, 1092–1099.
Uchoa, H.B., Jorge, G.E., Da Silveira, N.J.F., Camera, J.C., Canduri, F., De Azevedo, W.F.,
2004. Parmodel: a web server for automated comparative modeling of proteins.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 1481–1486.
Veber, D.F., Johnson, S.R., Cheng, H.Y., Smith, B.R., Ward, K.W., Kopple, K.D., 2002.
Molecular properties that influence the oral bioavailability of drug candidates.
J. Med. Chem. 45, 2615–2623.
WHO, 2002. Control of Chagas Disease. World Health Organ. Tech. Rep. Ser. 905, pp.
1–109.
Zemzoumi, K., Sereno, D., François, C., Guilvard, E., Lemesre, J.L., Ouaissi, A.,
1998. Leishmania major: cell type dependent distribution of a 43 kDa antigen related to silent information regulatory-2 protein family. Biol. Cell 90,
239–245.