título do resumo

EFEITO DA ASPIRINA SOBRE A INVASÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
HUMANAS POR Trypanosoma cruzi
Helena Tiemi Suzukawa (UEL), Sandra Cristina Heim Lonien, Phileno Pinge
Filho. E-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas,
Departamento de Ciências Patológicas.
Grande área Ciências Biológicas, Área Imunologia, Subárea Imunologia
Celular
Palavras-chave: Célula dendrítica, Ciclooxigenase-1, Trypanosoma cruzi.
Resumo
A infecção humana e experimental por Trypanosoma cruzi provoca uma
intensa resposta imunológica iniciada na fase aguda que é responsável pela
resistência do hospedeiro ao parasito. Embora seja reconhecido o papel
relevante da resposta celular, ainda não se encontram completamente
esclarecidos quais os mecanismos envolvidos e qual a exata participação dos
fagócitos mononucleares, tais como as células dendríticas (DCs), no controle
da infecção por T. cruzi. A atividade funcional de fagócitos durante a infecção
chagásica tem sido correlacionada com elevação de produção de diversos
mediadores como óxido nítrico (NO), prostaglandinas (PG) e leucotrienos (LT).
Antiinflamatórios não esteroidais (AINES) como a aspirina inibem a
ciclooxigenase-1 (COX-1) resultando na inibição da produção de PG. O
objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da inibição da COX-1 sobre a
capacidade de invasão de DCs por T. cruzi e a produção de NO (agente
tripanocida) por essas células. As DCs foram obtidas por meio da derivação de
monócitos humanos de sangue periférico de doadores saudáveis. As DCs
foram previamente tratadas com aspirina (ASA, inibidor preferencial de COX-1),
nas concentrações de 0,312 mM a 1,25 mM, por uma hora antes da infecção
por formas tripomastigotas de cultura de T. cruzi (5:1, cepa Y). Após 12 horas,
determinou-se o índice de infecção. A produção de NO nos sobrenadantes das
culturas foi quantificada pelo método de Griess. A aspirina não demonstrou
efeito sobre a infecção ou sobre a produção de NO em nenhuma das três
concentrações utilizadas do fármaco.
Introdução e objetivo
As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos
(APC) que atuam como ponte entre a imunidade inata e a adaptativa,
1
apresentando antígenos aos linfócitos T e B. Em céulas fagocíticas, como
macrófagos e DCs, sabe-se que cascatas de reação induzidas por NO ocorrem
após a fagocitose de antígenos (NATHAN, 1992) e que durante a resposta
inflamatória, podem ser produzidos eicosanoides, podendo tornar-se moléculas
bioativas oxigenadas sendo o ácido araquidônico substrato para duas vias
enzimáticas, a via das cicloxigenases (COX) e a via das lipoxigenases (LO).
Dois tipos de ciclooxigenases estão melhor caracterizadas, a COX-1,
constitutivamente expressa em quase todos os tecidos; e a COX-2 induzida
localmente por citocinas produzidas por leucócitos em resposta a danos ou
invasão microbiana. A liberação de eicosanoides durante a infecção por T.
cruzi regula a resposta do hospedeiro e controla a progressão da doença,
entretanto, o papel desses lipídeos bioativos na doença de Chagas aguda e
crônica ainda não está bem esclarecido (ASHTON et al., 2007), sendo assim,
objetivando contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos
envolvidos na ativação e invasão de células dendríticas pelo protozoário
Trypanosoma cruzi, foram investigados os efeitos do tratamento de DCs com
aspirina (ASA), sobre a entrada do T. cruzi (Cepa Y) e a avaliação do efeito da
inibição de COX-1 sobre a produção de óxido nítrico por DCs infectadas pelo
parasito.
Procedimentos metodológicos
Os protocolos experimentais que foram adotados foram aprovados pela
Comissão de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (Processo 54912012). As DCs foram derivadas de monócitos do sangue periférico de doadores
humanos saudáveis. Células polimorfonucleadas (PBMC) foram separadas por
gradiente de densidade utilizando meio separador de linfócitos e colocadas
para aderir em garrafas de plástico por 2 horas. As células aderentes foram
cultivadas por 6 a 7 dias em meio RPMI suplementado na presença de
interleucina-4 e fator (IL-4; 100 ng/mL) e fator estimulador de colônia de
granulócito/monócito (GM-CSF; 50 ng/mL). Após esse período foi realizada a
fenotipagem das células. Para os ensaios de infecção e dosagem de óxido
nítrico (NO), as células foram tratadas com aspirina (ASA) nas concentrações
0,312mM a 1,25mM por 1 hora e infectadas com formas tripomastigotas de
cultura de T. cruzi (cepa Y) na proporção de 5:1. O sobrenadante foi utilizado
para dosagem de NO, pelo método colorimétrico de Griess e para o ensaio de
invasão as células foram fixadas com metanol e coradas com Giemsa,
contando-se 200 células por tratamento, em microscópio óptico.
Resultados e discussão
Para verificar a eficiência do método de derivação utilizado, foram
realizadas fenotipagens, onde se obteve 89,2% de DCs (Figura 1).
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Embora, Hackstein e col. (2001) ao investigarem a função endocítica da
DCs imaturas derivadas de medula óssea murina, tratadas com ASA e
incubadas com albumina ou dextran, encontraram um aumento na
macropinocitose e endocitose mediada por receptores, os dados obtidos
demonstram que o tratamento com aspirina (ASA) nas concentrações
ministradas, não apresentaram diferença significativa quando comparados com
o grupo controle nos ensaios de infecção (Figura 2). Sabe-se que o NO está
relacionado com a defesa contra a infecção por Trypanosoma cruzi; devido a
isso, investigamos a produção desta molécula pelas DCs tratadas e infectadas.
Tem sido demonstrado em células fagocíticas que o tratamento com ASA inibe
a infecção por T. cruzi e está associada com um aumento da produção do IL-1β
e NO (MALVEZI et al., 2014). Nossos dados mostram que o tratamento de DCs
com ASA não interferiu na capacidade de invasão do T. cruzi e nem na
produção de óxido nítrico por estas células.
F
i
g
u
r
a
Figura 1: Fenotipagem de células dendríticas derivadas de monócitos do sangue periférico de
humanos (MdDCs). 89,2% das células resultantes da derivação são DCs (CD11c + CD14-).
M
M
m
2
0
A
S
A
S
A
,3
,6
0
1
A
S
A
1
2
,2
5
5
T
C
0
A
50
M
100
m
150
m
Ín d ic e d e in t e r n a liz a ç ã o ( % )
M dDC
200
T ra ta m e n to s
Figura 2: Efeito do tratamento in vitro com ASA sobre o índice de internalização de células
dendríticas infectadas por T. cruzi (Cepa Y). Não houve diferença estatística considerando-se
p 0,05.
5
Figura 3: Efeito do tratamento in vitro com ASA sobre a produção de nitrito por células dendríticas.
Não houve diferença estatística considerando-se p0,05.
Conclusão
A partir dos nossos resultados, concluímos que o bloqueio de COX-1
pelo uso de aspirina nas concentrações utilizadas, não teve efeito sobre a
capacidade de invasão do T. cruzi ou sobre a produção de NO por células
3
dendríticas, sugerindo que a COX-1 não apresenta papel de relevância para
estas células frente à infecção por Trypanosoma cruzi.
Agradecimentos
À Fundação Araucária, CAPES e Universidade Estadual de Londrina pela
concessão de duas bolsas de estudos IC e uma de Doutorado. Ao Instituto Carlos
Chagas pela doação de alguns reagentes imprescindíveis para a realização dos
experimentos.
Referências
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