título do resumo

EFEITO DA INIBIÇÃO DA CICLOOXIGENASE-2 SOBRE A INVASÃO DE
CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS POR TRYPANOSOMA CRUZI
Fernando Fernandes dos Santos (CNPq), Sandra Cristina Heim Lonien,
Phileno Pinge Filho. E-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Laboratório de Imunopatologia
Experimental/CCB.
Área e sub-área do conhecimento: Ciências Biológicas, Imunologia
Celular
Palavras-chave: Célula dendrítica, Ciclooxigenase-2, Trypanosoma cruzi
Resumo
A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário
Trypanosoma cruzi. Este microorganismo possui formas infectantes chamadas
tripomastigotas e formas esféricas conhecidas como amastigotas. Durante a
infecção humana, o parasita provoca uma resposta inflamatória mediada por
várias moléculas secretadas pelas células do sistema imune que mobilizam
fagócitos mononucleares, tais como as células dendríticas (DCs). Tais
compostos químicos são eicosanoides, óxido nítrico e citocinas que são
responsáveis por modular a resposta celular diante da invasão do parasito. As
células dendríticas são responsáveis por fagocitar, processar e apresentar
antígenos para linfócitos e macrófagos com objetivo de controlar a infecção
pelo protozoário. A obtenção de células dendríticas humanas ocorreu através
da derivação de monócitos de sangue periférico de doadores voluntários
saudáveis. As células dendríticas foram tratadas com celecoxibe, um inibidor
seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2), em três concentrações diferentes,
durante uma hora antes da infecção por formas tripomastigotas de cultura de T.
cruzi cepa Y. Após 12 horas determinou-se o índice de internalização. As
dosagens da produção de óxido nítrico pelas DCs foram realizadas através da
reação de Griess. O tratamento com celecoxibe na concentração de 1,25mM
provocou uma redução no índice de internalização do parasito em torno de
50% em relação ao controle. Estes resultados indicam que a COX-2 exerce um
papel relevante na infecção de células dendríticas por T. cruzi.
Introdução e objetivo
Trypanosoma cruzi é o protozoário causador de uma doença negligenciada
conhecida como Doença de Chagas. Este microorganismo possui formas
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infectantes chamadas tripomastigotas e formas resistentes esféricas
conhecidas como amastigotas (revisado por SOUZA, CARVALHO; BARRIAS,
2010). A doença de chagas é caracterizada por uma fase aguda e possíveis
fases crônicas. A fase aguda pode ser sintomática ou não e sua sintomatologia
é representada por febre, edema localizado e generalizado, hepatomegalia,
esplenomegalia, poliadenia e sinal patognomônico de Romaña. Raramente a
fase aguda leva a óbito, sendo esse causado normalmente por
meningoencefalite e, mais raramente, falência cardíaca devido à miocardite
aguda difusa. A fase crônica assintomática é caracterizada por ausência de
sintomas relacionados a doença de Chagas. A fase crônica sintomática da
doença pode ser subdividida em forma cardíaca e forma digestiva (Neves,
2005).
Durante a infecção humana, o parasita gera uma resposta inflamatória
pelo sistema imunológico a fim de combater sua internalização nas células do
hospedeiro. Essa resposta é mediada por várias moléculas secretadas pelo
sistema imune que mobilizam fagócitos mononucleares. As células dendríticas
são responsáveis por fagocitar, processar e apresentar antígenos para
linfócitos e macrófagos com objetivo de sensibilizá-los a um ataque ao invasor
(Banchereau, Steinman, 1998). Durante o processamento, o qual envolve a lise
do parasito e adição de moléculas as proteínas antigênicas para apresentação
as células do sistema imune, são liberadas espécies reativas de oxigênio
(ROSs) e óxido nítrico (NO) que “desmontam” a parede celular do invasor. A
produção de citocinas inflamatórias durante a infecção depende da ação de
enzimas ciclo-oxigenases (COX). Existem dois isotipos de COX. O isotipo-1 é
constituinte e relacionada a função de housekeeping. O isotipo-2 é induzida e
relacionada com a produção de citocinas, quimiocinas e prostaglandinas da
inflamação.
O Celecoxibe é um inibidor seletivo da COX-2. A inibição seletiva da
COX-2 combate os sintomas da inflamação aguda devido ao bloqueio da
produção de citocinas inflamatórias. O uso desse composto traz alivio aos
sintomas da fase aguda da infecção na doença de chagas (ASHTON et al.,
2007). Desta maneira, é importante compreender os mecanismos envolvidos
na ativação e invasão de células dendríticas pelo protozoário e investigar os
efeitos da inibição da ciclooxigenase-2 (COX-2), sobre o processo de invasão
de células dendríticas por T. cruzi e sobre a produção de óxido nítrico pelas
células infectadas.
Procedimentos metodológicos
Os protocolos experimentais que foram adotados foram aprovados pela
Comissão de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (Processo 54912012). Foram usados tripomastigotas derivados do sobrenadante de cultura de
células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi. As células dendríticas foram obtidas
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a partir da cultura in vitro de monócitos do sangue periférico de doadores
voluntários saudáveis. As células polimorfonucleares do sangue foram
separadas por gradiente de densidade e colocadas para aderir em plástico
durante 2 horas. Após a incubação, as células não aderentes foram
desprezadas. As células aderidas foram incubadas por 6-7 dias na presença de
reagentes que permitem a diferenciação celular. As células dendríticas foram
tratadas com celecoxibe, um inibidor seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2), em
três concentrações diferentes, durante uma hora antes da infecção por formas
tripomastigotas de cultura de T. cruzi cepa Y. Após 12 horas determinou-se o
índice de internalização. As dosagens da produção de óxido nítrico pelas DCs
foram realizadas através da reação de Griess.
Resultados e discussão
O tratamento com celecoxibe na concentração de 1,25 mM reduziu o
índice de internalização em 52,55% em contraste ao controle, enquanto que o
tratamento na concentração de 0,625 mM reduziu em 37,5%. O tratamento na
concentração 0,312 mM demonstrou menor efeito, reduzindo o índice de
internalização em apenas 13,3%. Não houve relevância estatística na
comparação entre a produção de óxido nítrico (NO) das células tratadas não
infectadas com as tratadas e infectadas.
O estado inflamatório causado pela infecção por T. cruzi inibe a
produção de INF- e TNF-, consequentemente, aumentando os níveis de
TGF- que é responsável por auxiliar na internalização do parasita ao recrutar
para superfície celular e induzir a síntese de TLRs (Miao; Ndao, 2014). O uso
do celecoxibe para a inibição da COX-2 levou à inibição da produção de PGE2
responsável pelo início e manutenção do estado inflamatório, podendo ter
envolvimento na redução da capacidade fagocítica.
O óxido nítrico tem grande importância na maturação e função das DCs
quando associadas a outros citocinas, como TNF-alfa e IL-12 (Paolucci et al.,
2003), mas estudos relatam que essas células em humanos não expressam a
iNOS (Hänsel et al., 2011; Lowes et al., 2005).
Conclusão
O índice de internalização entre células tratadas com celecoxibe é menor que o
índice encontrado no controle (p<0.05). Isso indica um papel da COX-2 na
infecção parasitária. Mais estudos são necessários para elucidar
especificamente esse papel. O tratamento das células com o fármaco parece
não influenciar na produção de óxido nítrico, levando em conta que não há
diferença estatística em comparação com os controles.
Agradecimentos
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Ao CNPq, Fundação Araucária e Capes pela concessão de uma bolsa de IC e
uma bolsa de doutorado.
Referências
ASHTON, A. W. et al. Thromboxane A2 is a key regulator of pathogenesis
during Trypanosoma cruzi infection. J Exp Med. v. 204 n. 4 p. 929-940. 2007.
BANCHEREAU, J.; STEINMAN, R. Dendritic cells and the control of immunity.
Nature. v. 392, p. 245-252. 1998.
HÄNSEL, A. et al. Human slan (6-sulfo 11 LacNAc) dendritic cells are
inflammatory dermal dendritic cells in psoriasis and drive strong T(H)17/T(H)1
T-cell responses. J Allergy Clin Immunol. v. 127 n. 3 p 787-794, 2011.
LOWES, M. A. et al. Increase in TNFalpha and inducible nitric oxide synthaseexpressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (antiCD11a). Proc Natl Acad Sci; v. 102 n.52, p 19057-19062, 2005.
MIAO, Q.; NDAO, M. Trypanosoma cruzi infection and host lipid metabolism.
Mediators Of Inflammation, v. 2014, p. 10, 2014.
NEVES, D. P.; MELO, A. L.; LINARDI, P. M.; VITOR, R. W. Almeida
Parasitologia Humana. 11.ed. São Paulo: Atheneu, 2005. p. 494.
PAOLUCCI, C. et al. Synergism of nitric oxide and maturation signals on human
dendritic cells occurs through a cyclic GMP-dependent pathway. J Leukoc
Biol. v. 73 n. 2 p. 253-262, 2003.
SOUZA, W. de; CARVALHO, T. M. U. de; BARRIAS, E. S. Review on
Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. Int J Cell Biol. v. 2010 Article ID
295394, p. 18. 2010.
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