Análise de Proteínas e Azoto não proteico nos alimentos proteínas
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3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico nos alimentos proteínas podem estar combinadas com lípidos e hidratos de carbono na maioria dos alimentos conteúdo de proteína dado por N x 6.25% procedimento mais comum para determinar proteínas: determinação de um elemento ou grupo pertencente à proteína elementos – C ou N grupos – aminoácidos e ligações peptídicas Análise de Proteínas e Azoto não proteico análise pode ser dificultada pela presença de N não proteico: aminoácidos livres pequenos peptídeos ácidos nucleicos fosfolídos açúcares aminados porfirinas algumas vitaminas alcalóides ácido úrico ureia NHŸ 1 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico análise de proteínas importante para: rotulagem investigação de propriedades funcionais determinação de actividade biológica conteúdo proteico total teor de uma dada proteína teor proteico durante isolamento e purificação de proteínas determinação de azoto não proteico composição em aminoácidos valor nutricional de uma proteína Análise de Proteínas e Azoto não proteico Análise de carbono digestão mais fácil que para N menores erros no resultado maior quantidade relativamente a N factor de correcção mais constante que para N maior dificuldade em separar os C proteicos dos restantes 2 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Análise de azoto mais utilizada proteínas têm em média 16% N transformação de azoto para proteína – 6.25 16 g N ––––– 100 g proteínas n g N ––––– x g proteínas x= n x 100 = n x 6.25 16 erros quando teor em N ʌ 16% tabelas com factores de conversão específicos Análise de Proteínas e Azoto não proteico Análise de azoto 3 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Kjeldahl – determinação através do N total mais utilizado na determinação de proteína diversas modificações ao longo do tempo método determina N orgânico total proteico e não proteico na maioria dos alimentos, N não proteico em muito pequena quantidade Análise de Proteínas e Azoto não proteico procedimento amostra triturada e homogeneizada aquecimento da amostra com H2SO4 digestão converte N (excepto o que está em forma de NO3 ou NO2) em amónia amónia está na forma de NHŸ ligado a SO‚ permanece em solução restantes compostos orgânicos convertidos em CO2 e H2O Amostra (N orgânico) + H2SO4 ↓ (NH4)2SO4 4 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico procedimento adiciona-se NaOH conc. converte sulfato de amónio em amónia gasosa aquece-se para libertar amónia num volume conhecido de ácido bórico forma borato de amónio (NH4)2SO4 + NaOH ↓ NH3 NH3 + H3BO3 ↓ (NH4)3BO3 (NH4)3BO3 doseado com HCl indicador usado para determinar ponto de viragem (NH4)3BO3 + HCl ↓ NH4Cl + H3BO3 Análise de Proteínas e Azoto não proteico procedimento concentração de H+ necessária para alcançar ponto de viragem é equivalente à concentração de N no alimento usa-se um branco subtrair N do reagente do N da amostra cálculo: %N = v -v x x s b x 14 x 100 1000 m m – peso da amostra (g) x – HCl (mol) vs – vol. titulação da amostra (cm3) vb – vol. titulação branco (cm3) 14 – PM azoto (g/mol) 5 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Kjeldahl vantagens: universal muito preciso boa reprodutibilidade barato micro Kjeldahl para determinar g desvantagens: não mede apenas proteína diferentes factores de conversão risco de utilização de H2SO4 conc. a temperatura elevada risco de utilização de catalisadores demorado (pelo menos 2 h) menos preciso que método do biureto Análise de Proteínas e Azoto não proteico modificações do método adição de óxidos de metais para acelerar a digestão da mistura mistura de Hg, Cu, Se Hg mais eficaz adição de sulfato de potássio aumenta ponto de ebulição da mistura na digestão acelera o processo adição de sulfito ou tiossulfato de sódio ao hidrolisado diluído ajuda a libertar azoto do Hg adição de ácido bórico recolha da amónia libertada em excesso de ácido bórico borato de amónio formado titulado com um ácido padronizado 6 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico modificações do método micro Kjeldahl permite determinar g de N Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Kjeldahl reagentes carbonato de sódio alaranjado de metilo 0.1% HCl 0.1 N NaOH 0.02 N NaOH conc. ác. bórico 2% fenolftaleína verde de bromocresol 0.1% em álcool HCl conc. mistura de catalisadores 96% K2SO4, 4% CuSO4.5H2O H2SO4 conc. 7 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico procedimento: digestão da amostra juntar num balão de microkjeldahl de 100 mL 200 mg amostra 1.5 g mistura de catalisadores 3 mL H2SO4 conc. colocar balão no digestor digerir 20 min tirar balão e arrefecer até temperatura ambiente juntar 5 mL H2O2 Análise de Proteínas e Azoto não proteico digestão da amostra repor balão no digestor aquecer devagar até se tornar translúcido e não haver resíduos carbonizados arrefecer 15-20 min à temperatura ambiente arrefecer em água da torneira juntar devagar, com agitação, 40 mL H2O 8 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico procedimento: destilação da amostra amostra transferida para destilador adicionar excesso NaOH NH4HSO4 passa a NH3 (volátil) colocar ~7 g NaOH num Erlenmeyer de 50 mL juntar 11 mL H2O agitar até dissolver NaOH arrefecer sob água corrente colocar ~10 mL ác. bórico num erlenmeyer adicionar 4 gotas vermelho de metilo e 6 gotas verde de bromocresol Análise de Proteínas e Azoto não proteico destilação da amostra erlenmeyer com ác. bórico e indicadores colocado à saída do destilador recolher ~⅔ do destilado no erlenmeyer 9 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico procedimento: titulação da amostra titular o destilado com solução padronizada de HCl 0.1 N nº equivalentes de ácido consumido igual a nº equivalentes de amónia Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Dumas determinação de N total, após combustão da amostra 700 – 800 ºC medida volumétrica do N gasoso GC com detector de condutividade térmica (TCD) N determinado convertido em teor de proteína 10 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Dumas procedimento: amostra de massa conhecida (100-500 mg) levada a combustão na presença de O2 libertação de CO2, H2O e N2 CO2 e H2O removidos por absorção em colunas teor de N medido após passagem dos gases restantes por outra coluna equipada com detector de condutividade térmica detector calibrado com EDTA ou outro composto puro com concentração de N conhecida necessário converter concentração de N em teor proteico factores de conversão variam com composição da proteína Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Dumas vantagens: mais rápido que Kjeldahl < 4 min por medida; Kjeldahl 1-2 h não requer compostos tóxicos nem catalisadores permite automatização (até 150 amostras) aplicável a todos os tipos de alimentos desvantagens: custo inicial elevado mede N proteico e não proteico requer amostras pequenas difícil obter amostras representativas 11 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica exigem curvas de calibração com diversas proteínas mede-se absorção ou turbidez amostra medida ao mesmo comprimento de onda obtém-se concentração proteica da amostra diferentes métodos divergem nos grupos químicos responsáveis pela absorção ou turbidez ligações peptídicas grupos aromáticos grupos alcalinos agregados proteicos Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método do biureto substâncias com 2 ou mais ligações peptídicas formam um complexo roxo com sais de cobre (Cu2+) em soluções alcalinas proteína misturada com reagente do biureto reagente contém sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio e potássio após 15-30 min, mede-se absorvância a 540 nm intensidade da cor proporcional à quantidade de proteína 12 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método do biureto Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método do biureto procedimento: 5 mL reagente biureto misturado com 1 mL solução de proteína 1-10 mg proteína/mL mistura estabiliza à temperatura ambiente 15-30 min se não estiver transparente requer filtração ou centrifugação absorvância lida a 540 nm contra branco do reagente fazer curva de calibração com albumina de soro bovino (BSA) 13 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método do biureto vantagens: bastante específico não tem problemas de interferentes simples, rápido (< 30 min) e mais barato que Kjeldahl determina proteína desvantagens: requer curva de calibração cor não é idêntica para todas as proteínas desvios causados menores que noutros métodos colorimétricos menos sensível que outros métodos espectrofotométricos Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Lowry (fenol) combina reagente do biureto com reagente de Folin-Ciocalteau interacção das proteínas com fenol e cobre em condições alcalinas reacção colorimétrica oxidação (catalisada por cobre) de aminoácidos aromáticos por um reagente heteropolifosfato cor azul, medida entre 500-750 nm e comparada com curva padrão pequeno pico a ~500 nm determinação de concentrações proteicas elevadas pico maior a ~750 nm determinação de menores concentrações 14 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Lowry procedimento: amostra diluída adição de tartarato de sódio e potássio/Na2CO3 incubar à temperatura ambiente 10 min adição de CuSO4/tartarato Na K/NaOH incubr 10 min à temperatura ambiente adicionar reagente de Folin misturar e incubar a 50 ºC, 10 min ler absorvância curva de calibração com BSA para calcular teor proteico Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Lowry vantagens: 10-20 vezes mais sensível que determinação por UV 100 vezes mais sensível que método do biureto relativamente rápido (1-1.5 h) bastante específico poucos interferentes sacarose, em elevada concentração, lípidos, tampão fosfato, ... 15 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método de Lowry desvantagens: intensidade da cor pode variar com composição em aminoácidos e com condições analíticas não é completamente proporcional à concentração proteica destrói a amostra múltiplas operações necessita período de incubação entre adição de reagentes requer curva padrão Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método espectrofotométrico directo maioria das proteínas absorve a 280 nm presença de tirosina, triptofano e fenilalanina aminoácidos aromáticos teor nos alimentos é relativamente constante absorvância permite calcular a concentração proteica proteínas solubilizadas num tampão ou base 16 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método espectrofotométrico directo vantagens: rápido e simples relativamente sensível mais que método do biureto não destrutivo poucas interferências Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método espectrofotométrico directo desvantagens: resultados com imprecisão dependem da concentração dos 3 a. a. na composição da proteína sais de amónio não interferem ácidos nucleicos podem interferir problema reduzido por medição da absorvância a 2 280 nm, 260 nm preparação da amostra muito longa funciona melhor em proteínas purificadas ou extraídas 17 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método espectrofotométrico determinação pode ser feita por fluorescência triptofano é fluorescente método inicialmente desenvolvido para leite e lacticínios também utilizado em produtos cárneos e vegetais Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos turbidimétricos medida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por um agente precipitante ácido tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido sulfosalicílico vantagens: rápido simples para amostras líquidas proteína está em solução desvantagens: não aplicável em amostras sólidas proteína tem que ser extraída para uma solução resultados variam com tipo de proteína pode haver precipitação de outras substâncias requer calibração com padrões 18 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método dye-binding utilização tem aumentado grãos de cereais, sementes de oleaginosas, lacticínios e outros produtos animais e vegetais amostra tratada com excesso de corante aniónico azul brilhante de Coomassie pH da proteína ajustado (< pI) proteínas carregadas positivamente corante e proteína reagem quantitativamente corante liga-se aos grupos catiónicos dos resíduos His, Arg, Lys e aos grupos terminais amina livres corante muda de vermelho para azul max passa de 465 nm para 595 nm formação de complexo insolúvel, separável por filtração ou centrifugação Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método dye-binding excesso de corante em solução medido colorimetricamente diferença dá indirectamente teor de proteína teor de proteína na amostra proporcional à quantidade de corante complexado Corantecomplex = Coranteinit – Corantelivre para cada alimento constrói-se uma tabela de conversão permite obter % de proteína 19 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método dye-binding procedimento: corante dissolvido em 95% EtOH acidificado com ácido fosfórico 85% amostras com 1-100 g/mL proteína e BSA adicionadas ao reagente ler absorvância a 595 nm contra branco do corante calcular concentração da proteína a partir da curva de calibração Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método dye-binding corantes utilizados: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo, preto amino 10B boa correlação com método de Kjeldahl equipamentos fazem: reacção colorimétrica filtração do complexo insolúvel medida colorimétrica da solução filtrada 20 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método dye-binding vantagens: simplicidade rapidez (2 min) menos interferências que método de Lowry mais sensível que método de Lowry exactidão reprodutibilidade preço desvantagens: dependência do equipamento cor varia com tipo de proteína dificuldade na escolha do padrão complexo pode ligar-se a cuvetes d quartzo usar vidro ou plástico Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método do ácido bicinchoninico (BCA) proteínas reduzem iões Cu2+ a Cu+ em condições alcalinas Cu+ complexa com reagente BCA (verde) tornando-o púrpura procedimento: misturar solução de proteínas com reagente BCA pH 11.25 incubar 30 min a 37 ºC, ou 2 h à temperatura ambiente, ou 30 min a 60 ºC escolha depende da sensibilidade pretendida temperatura mais elevada dá melhor resposta ler absorvância a 562 nm contra branco do reagente curva padrão com BSA 21 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Método do ácido bicinchoninico vantagens: sensibilidade semelhante a método de Lowry método micro BCA mais sensível que Lowry um único passo de mistura reagente mais estável que o de Lowry poucas interferências desvantagens: cor instável com tempo qualquer composto capaz de reduzir Cu2+ a Cu+ interfere açúcares redutores interferem mais que no método de Lowry concentrações elevadas de (NH4)2SO4 interferem Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica vantagens: rápidos simples sensíveis a baixas concentrações desvantagens: requerem soluções transparentes e diluídas maioria das amostras exigem preparação complexa homogeneização extracção por solventes centrifugação ou filtração em alimentos processados pode ser difícil extrair as proteínas absorvância depende das sequências de aminoácidos 22 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Outros métodos instrumentais medição de propriedades físicas brutas medição da adsorção de radiação medição da dispersão de radiação Análise de Proteínas e Azoto não proteico medição de propriedades físicas brutas densidade densidade das proteínas superior à da maioria dos componentes dos alimentos aumento do teor proteico provoca aumento da densidade teor proteico determinado através da medição da densidade índice de refracção índice aumenta com aumento do teor proteico teor proteico determinado por medição do índice de refracção 23 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico medição da adsorção de radiação UV-Vis IV grupos químicos no esqueleto polipeptídico possuem vibrações características 6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm, 1560-1670 nm absorção de radiação IV a determinados comprimentos de onda usada para quantificar concentração proteica numa amostra permite análise rápida e on-line não destrutivo não necessita muita preparação de amostra elevado custo incial requer calibração demorada Análise de Proteínas e Azoto não proteico medição da adsorção de radiação NMR usado para determinar concentração total de proteínas medição da área dos picos correspondentes à fracção proteica permite determinar o teor proteico 24 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico medição da dispersão de radiação dispersão de luz turbidez de uma solução directamente proporcional à concentração de agregados de proteínas presentes dispersão de ultra-sons velocidade e absorção de ultra-sons proporcionais à concentração de agregados proteicos presentes Análise de Proteínas e Azoto não proteico Outros métodos instrumentais vantagens: não destrutivos pouca preparação de amostra medidas rápidas e precisas desvantagens: requerem curvas de calibração dependem do tipo de proteína e do alimento válidos apenas para analisar alimentos com composições simples 25 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos físicos pouco utilizados índice de refracção densidade específica viscosidade tensão superficial condutividade polarização Análise de Proteínas e Azoto não proteico Comparação dos métodos aplicações oficiais métodos Kjeldahl e Dumas e em alguns casos UV-Vis controlo de qualidade métodos rápidos e simples IV estudos fundamentais em laboratório métodos rápidos, precisos e sensíveis a baixas concentrações UV-Vis 26 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Comparação dos métodos factores a ter em conta: métodos Kjeldahl, Dumas e IV requerem pouca preparação de amostra métodos de UV-Vis requerem muita preparação métodos Dumas e Kjeldahl medem N orgânico total método do biureto mede ligações peptídicas método de Lowry mede ligações peptídicas e aminoácidos aromáticos IV é um método indirecto métodos UV-Vis são mais sensíveis métodos de Lowry, dye-binding, BCA e UV mais sensíveis que Kjeldahl, Dumas e biureto Análise de Proteínas e Azoto não proteico Comparação dos métodos factores a ter em conta: métodos IV são rápidos (< 1 min) método de Dumas é automatizado e rápido (< 5 min) métodos UV-Vis permitem analisar diversas amostras simultaneamente disponibilidade de equipamento rigor da medida técnica destrutiva ou não facilidade de operação processamento do alimento (aquecimento,...) pode reduzir a eficácia da extracção de proteínas 27 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico proteínas separadas com base em: diferentes propriedades físico-químicas tamanho carga adsorção solubilidade estabilidade térmica Análise de Proteínas e Azoto não proteico métodos de purificação mais comuns: precipitação cromatografia de permuta iónica cromatografia de afinidade cromatografia de exclusão molecular 28 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico escolha da técnica de separação depende de: objectivo da análise quantidade de amostra disponível pureza desejada equipamento disponível tipo de proteínas presente preço ter em conta que estrutura tridimensional da proteína pode ser alterada durante separação efeito das condições ambientais sobre a estrutura da proteína e suas interacções pH força iónica solvente temperatura ... Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos baseados em características de solubilidade solubilidade determinada pela sequência de aminoácidos condiciona tamanho, forma, hidrofobicidade e carga eléctrica proteínas solubilizadas ou precipitadas selectivamente por alteração de: pH força iónica constante dielétrica temperatura usados quando grandes quantidades de amostra disponíveis rápidos baratos não influenciáveis por outros componentes dos alimentos frequentemente usados como 1º passo em processos de separação 29 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Salting out proteínas, em solução aquosa, precipitadas quando concentração salina excede um valor crítico água “liga-se” ao sal, deixando de estar disponível para hidratar as proteínas (NH4)2SO4, NaCl, KCl procedimento: sal adicionado, em concentração ligeiramente inferior à necessária para precipitar a proteína de interesse solução centrifugada remoção de proteínas menos solúveis adição de sal em concentração ligeiramente superior à necessária para precipitar a proteína proteína precipita separada por centrifugação Análise de Proteínas e Azoto não proteico Salting out concentrações elevadas de sal contaminam a solução remoção por diálise ou ultrafiltração 30 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Precipitação isoeléctrica proteínas têm carga 0 no ponto isoeléctrico (pI) proteínas agregam e precipitam devido à não existência de repulsão electrostática diferentes sequências de aminoácidos originam diferentes pI ajuste do pH da solução permite separar proteínas por precipitação selectiva Análise de Proteínas e Azoto não proteico Fraccionamento por solvente solubilidade de proteínas depende da constante dielétrica do solvente a pH e força iónica constantes diferentes interacções electrostáticas entre grupos carregados quando constante dieléctrica diminui, aumentam interacções electrostáticas entre grupos carregados solubilidade das proteínas diminui constante dieléctrica de soluções aquosas diminui quando se adicionam solventes orgânicos EtOH, acetona diferentes proteínas requerem diferentes quantidades de solvente orgânico separação proteica 31 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Fraccionamento por solvente trabalhar a ≤ 0 ºC para impedir desnaturação proteica aumento de temperatura quando se misturam solventes orgânicos com água Análise de Proteínas e Azoto não proteico Desnaturação de proteínas contaminantes proteínas desnaturam e precipitam quando: temperatura muito elevada pH muito ácido ou muito básico separação baseada na resistência de proteínas a condições extremadas 32 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos baseados em características de adsorção cromatografia de afinidade ou de permuta iónica proteínas possuem diferentes afinidades para fase estacionária ou eluente coluna aberta ou HPLC métodos comuns em laboratório para separar proteínas e aminoácidos pouco comuns a nível comercial caros e não permitem separação rápida de grandes quantidades Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de permuta iónica mais usada adsorção reversível das proteínas carregadas a um suporte sólido carregado para proteínas usam-se mais resinas aniónicas condições (pH e força iónica) ajustadas para favorecer ligação da proteína de interesse outras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais rapidamente proteína de interesse eluída com outra solução tampão diferente pH ou força iónica 33 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de permuta iónica aplicações: separação de proteínas no laboratório quantificação de aminoácidos Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de afinidade fase estacionária consiste numa molécula ligada covalentemente a um suporte sólido ligando possui afinidade específica e reversível para uma dada proteína condições tampão que favorecem afinidade outras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais rapidamente proteína de interesse eluída com outra solução técnica mais eficaz para separar proteínas cara, devido a necessidade de colunas com ligandos específicos optimização do método requer ajuste de muitas variáveis 34 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de afinidade aplicações: aplicações laboratoriais purificação de glicoproteínas utilização de lectinas como ligantes Análise de Proteínas e Azoto não proteico Métodos baseados em diferença de tamanho PM de proteínas variam entre 104 – 106 D separação não depende do PM mas do raio de Stokes raio médio de uma proteína em solução depende da estrutura tridimensional para proteínas com mesmo PM, raio de Stokes: proteína globular compacta < proteína enrolada flexível < proteína rígida separação por: diálise ultrafiltração cromatografia de exclusão molecular 35 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Diálise utiliza membranas semi-permeáveis permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa dimensão solução de proteínas colocada num tubo de diálise selado tubo colocado num grande volume de água ou tampão lentamente agitado solutos de baixo PM saem do tubo; restantes ficam método lento (até 12 h) mais usado em laboratório frequentemente usado para remoção de sais de soluções usadas em salting-out também usada em permuta de tampões Análise de Proteínas e Azoto não proteico Diálise 36 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Ultrafiltração utiliza membranas semi-permeáveis sob pressão permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa dimensão solução de proteínas colocada numa célula contendo a membrana aplica-se pressão solutos de baixo PM atravessam membrana; restantes ficam diversas membranas disponíveis mais rápido que diálise usada em laboratório e em escala comercial utilizada para concentrar soluções de proteínas, remover sais, trocar tampões ou fraccionar proteínas nanofiltração pode ser usada para mesmos fins Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de exclusão molecular separa proteínas por PM solução de proteína atravessa coluna empacotada com material polimérico poroso dextrano, agarose moléculas maiores que os poros excluídas atravessam rapidamente a coluna restantes moléculas retardadas moléculas eluídas por ordem decrescente de tamanho existem diversos empacotamentos, para separar proteínas com diferentes PM 37 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de exclusão molecular usada para: remoção de sais trocar tampões fraccionar proteínas cálculo do PM Análise de Proteínas e Azoto não proteico Cromatografia de exclusão molecular PM de proteínas desconhecidas determinadas por comparação dos seus volumes de eluição com os de proteínas de PM conhecido gráfico de volume de eluição vs. log(PM) dará uma recta PM não está directamente relacionado com raio de Stokes 38 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Separação por electroforese separação baseada no tamanho, forma e carga migração de moléculas carregadas através de um campo eléctrico electroforese de zona é a mais usada com proteínas proteínas de uma mistura separadas por migração num gel gel de poliacrilamida mais comum alternativas – amido e agarose Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese não desnaturante solução tamponizada de proteínas colocada num gel poroso poliacrilamida, amido, agarose voltagem aplicada ao gel proteínas deslocam-se no gel numa direcção que depende do sinal da sua carga e a uma velocidade que é função da grandeza da carga deslocamento também depende da fricção relação entre tamanho da molécula e tamanho dos poros do gel mobilidade = voltagem aplicada x carga molecular fricção molecular 39 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese não desnaturante quanto mais alta a voltagem ou a carga da proteína, mais esta se move quanto mais pequena a molécula ou maior o tamanho dos poros do gel, mais rapidamente ela se move separação baseada numa combinação da carga, tamanho e forma da proteína Análise de Proteínas e Azoto não proteico Java applet Electroforese desnaturante (SDS-PAGE) sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis proteínas separadas segundo PM proteínas desnaturadas antes da análise misturadas com mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS) mercaptoetanol quebra ligações bisulfito SDS forma ligações hidrofóbicas com proteínas desdobramento da estrutura, devido a repulsão entre grupos com carga negativa do SDS cada proteína liga-se aproximadamente à mesma quantidade de SDS por unidade de comprimento carga por unidade de comprimento e conformação idêntica em todas as proteínas 40 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese desnaturante movimento no gel depende do tamanho da proteína proteínas mais pequenas movem-se mais rapidamente adiciona-se um corante à solução da proteína azul de bromofenol, … pequena molécula crregada que migra à frente das proteínas no fim da electroforese, gel tratado com corante permite visualizar proteínas mobilidade relativa = distância percorrida pela proteína distância percorrida pelo corante Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese desnaturante mobilidade relativa comparada com curva de calibração gráfico log(PM) vs. mobilidade relativa é linear 41 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese aplicações: parte do processo de purificação caracterização proteica equipamentos comerciais permitem purificar grandes quantidades de proteína determinação da composição proteica de um alimento Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese de focagem isoeléctrica um dos métodos de separação de proteínas com melhor resolução modificação da electroforese proteínas separadas segundo carga, num gel com um gradiente de pH proteínas migram para o local em que pH = pI 42 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese de focagem isoeléctrica gradiente de pH gerado por anfólitos pequenos polímeros contendo simultaneamente grupos carregados positiva e negativamente mistura de anfólitos tem milhares de polímeros com gama variada de valores de pH anfólitos adicionados ao gel antes da polimerização após formação do gel, aplica-se uma voltagem e anfólitos migram segundo o seu pH gradiente de pH Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese bidimensional utilização conjunta de focagem isoeléctrica e SDS-PAGE melhora resolução de misturas complexas de proteínas capaz de separar >1000 proteínas proteínas separadas numa direcção segundo carga focagem isoeléctrica depois separadas na direcção perpendicular segundo tamanho SDS-PAGE 43 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar utilização de um tubo capilar em vez de um gel fluxo electroosmótico no tubo influencia separação de proteínas Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar procedimento: amostra introduzida no recipiente de entrada aplica-se baixa pressão ou voltagem através do capilar carregar o volume pretendido de amostra na coluna bandas de proteínas detectadas por detectores semelhantes aos usados em HPLC UV-Vis, fluorescência, condutividade 44 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar 1. pre-albumin 2. Albumin 3. alpha 1-Acid-Glycoprotein 4. alpha 1-Antitrrypsin 5. Haptoglobin 6. alpha2 macroglobulin 7. Hemopexin 8. Transferrin 9. Complement 10. Gamma Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar utilização obretudo laboratorial 3 variantes usadas em separação de proteínas: electroforese de zona capilar electroforese capilar em gel focagem isoeléctrica capilar 45 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar electroforese de zona capilar semelhante a PAGE proteínas separadas em solução no interior do capilar cheio com um tampão do pH pretendido uma única “corrida” capaz de separar moléculas carregadas e não carregadas alterando pH ou força iónica do tampão varia fluxo electroosmótico variação da velocidade de migração das proteínas Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar electroforese capilar em gel proteínas separadas por tamanho proteínas desnaturadas e dissociadas na presença de SDS e agente redutor separação em capilares cheios com gel de poro específico 46 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico Electroforese capilar focagem isoeléctrica capilar anfólitos formam gradiente de pH no capilar proteínas separadas com base no pI Análise de Proteínas e Azoto não proteico determinação da composição em aminoácidos das proteínas hidrólise da amostra com ácido forte libertação dos aminoácidos aminoácidos separados por métodos cromatográficos permuta iónica cromatografia de afinidade cromatografia de absorção 47 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico hidrólise HCl 6N, 24 h diferente comportamento dos aminoácidos durante hidrólise triptofano destruído metionina, cisteína, treonina e serina progressivamente degradados duração da hidrólise influencia resultados asparagina e glutamina convertidos em ácidos aspártico e glutâmico não se conseguem quantificar isoleucina e valina hidrolisadas mais lentamente que restantes aminoácidos tirosina e metionina podem ser oxidados procedimentos especiais de hidrólise necessários para evitar erros Análise de Proteínas e Azoto não proteico hidrólise percas de treonina e serina calculadas por hidrólise da amostra em 3 períodos de tempo 24, 48, 72 h compensação para degradação de aminoácidos extrapolação para tempo zero, assumindo cinética de 1ª ordem valina e isoleucina calculadas a partir de um hidrolisado de 72 h cisteína e cistina convertidos em ácido cístico mais estável triptofano sofre hidrólise alcalina depois cromatografado 48 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico hidrólise hidrólise de peptídeos e proteínas origina normalmente 16 a. a. fosfoaminoácidos requerem processos especiais análise semi-quantitativa de PSer, PThr e PTyr HCl 6N; 1-4 h; 110 ºC derivatização pré ou pós-coluna análise lenta e resultados frequentemente maus não é uma análise de rotina Análise de Proteínas e Azoto não proteico hidrólise HCl em fase de vapor amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaio tubo colocado num frasco com 200 L HCl 6N e um cristal de fenol tapar frasco com válvula desarejar 3 vezes com Ar fechar válvula aquecer frasco 1 h a 150 ºC finda a hidrólise, abrir válvula transferir tubos com amostra para outro recipiente secar sob vácuo guardar a -20 ºC, sob Ar, até análise 49 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico hidrólise HCl em fase líquida amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaio adicionar 100 L HCl 6N, contendo 4% ácido tioglicólico desarejar sob vácuo e selar à chama aquecer 22 h a 110 ºC arrefecer o tubo abrir, secar sob vácuo e analizar Análise de Proteínas e Azoto não proteico separação por permuta iónica eluição com gradiente tampões com aumento gradual de pH e força iónica derivatização pós-coluna após eluição, a. a. quantificados por reacção com nihidrina nihidrina reage com grupo amina primária dos a. a. produto de cor púrpura medição espectrofotométrica a 570 nm prolina a 440 nm método automatizado e adaptado para utilização com HPLC 50 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico separação por permuta iónica Análise de Proteínas e Azoto não proteico separação por RP-HPLC a. a. hidrolisados e derivatizados antes da cromatografia derivatização com feniltiocarbamil, ... quantificação por espectroscopia UV detecção de quantidades picomolares de a. a. tempo de análise ≤ 30 min 51 3/7/2007 Análise de Proteínas e Azoto não proteico quantificação utilização de padrão interno a. a. não existente nos alimentos norleucina resultados expressos em % moles resíduos por 100 resíduos dividir nº moles de cada resíduo pela soma de todos e multiplicar por 100 Análise de Proteínas e Azoto não proteico utilização: quantificar peptídeos e proteínas determinação da qualidade nutricional de uma proteína caracterizar ou identificar novas proteínas e peptídeos sintéticos detectar a. a. não comuns delinear estratégias de fragmentação calcular PM de uma proteína determinar volume parcial específico de uma proteína 52
