Coloração Gram

Curso de Tecnólogo em Radiologia
Disciplina: Microbiologia e Biossegurança
PROFª: Dra. Márcia Valéria
PRÁTICA 03: TÉCNICA DE COLORAÇÃO GRAM
1. INTRODUÇÃO
A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração
de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em
1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das
colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método
consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes
cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul
violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são
chamadas de Gram-negativas.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de
bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento
com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em
laboratórios de Microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a
caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das
bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Grampositivas ou Gram-negativas em fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a
infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por
lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de
forma permanente e preservadas como documentação.
O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em
meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um
fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira
idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um
complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um
solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas
das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células.
Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e
provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante
primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a
exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias,
podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente
das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura,
densidade, porosidade e integridade.
Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao
microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as Gram-negativas em
vermelho ou rosa.
2.





OBJETIVOS
Realizar procedimentos microbiológicos seguindo as regras de Biossegurança;
Confeccionar esfregaços e fixá-los a partir de uma amostra bacteriana;
Identificar e executar as etapas da técnica de coloração GRAM;
Reconhecer as principais formas e arranjos bacterianos;
Classificar as bactérias de acordo com a técnica de coloração GRAM.
3. METODOLOGIA
3.1 Materiais utilizados
Materiais
Microscópio óptico
Cultura bacteriana
Luvas
Papel absorvente
Kit de coloração GRAM (cristal violeta, lugol,
álcool absoluto e fuccina)
Alças de platina
Óleo de imersão
Lamparina
Fósforo
Lâminas limpas e secas
Água destilada em pissetas
3.1 Procedimentos experimentais
3.1.1 Confecção do esfregaço
1) Flambar a alça corretamente;
2) Esfriá-la nas paredes da placa de Petri;
4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca;
5) Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino e uniforme;
6) Secar a temperatura ambiente;
7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen (ou lamparina), passando a lâmina algumas
vezes pela chama;
* Observações importantes:
 Esperar o esfregaço ficar completamente seco para fixá-lo.
 Em casos de cultura bacteriana em meio sólido, antes de pescar a colônia com a alça estéril,
pingar uma gota de água ou solução salina estéril na lamina.
3.1.2 Técnica de Coloração:
1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO
COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!
2) Escorrer o cristal violeta.
3) Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto. Lavar a lâmina com água corrente.
4) Cobrir o esfregaço com álcool até que não haja desprendimento de corante primário.
Lavar em água corrente.
5) Cobrir o esfregaço com fuccina por 30 segundos. Escorrer a fuccina e lavar com água
corrente.
6) Secar a lâmina cuidadosamente com papel absorvente, TOMANDO O CUIDADO DE NÃO
REMOVER O ESFREGAÇO.
* Observações importantes:
 A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada, devendo ser filtrada para a
remoção de precipitados.
 A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada rapidamente.
Porém, não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada.
 Os esfregaços não devem ser muito espessos, pois são mais difíceis de descorar e de
permitir observações.
2
3.1.3 Observação microscópica
 Observar ao microscópio óptico (inicialmente focalize nas objetivas de menor aumento 4X,
10X, 40X e em seguida, coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e encaixe a
objetiva de 100X).
 Analisar a reação tintorial das bactérias, além da forma e arranjo das mesmas.
4. QUESTÕES PARA DISCUSSÃO
1) Faça um desenho esquemático das lâminas que foram visualizadas, descrevendo a forma
e/ou arranjos observados e classificação segundo a coloração de Gram.
Objetiva: _______Aumento:_______
2) Como é a parede celular das bactérias Gram + e das Gram -?
3) Com relação à coloração de Gram, como se diferencia a célula Gram + da Gram -?
4) Descreva as etapas da coloração de Gram. Qual a função de cada etapa?
5) Técnica de Ziehl-Neelsen é uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que
a técnica de Gram. Ela é usada em bactérias que coram mal com o Gram. Pesquise sobre
a coloração de Ziehl-Neelsen, e responda as seguintes questões:
a) Descreva as etapas da técnica de coloração de Ziehl-Neelsen.
b) Cite as principais bactérias que devem ser coradas por esse método?
3