Cultivo in vitro de explantes de Dipteryx alata

Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
10 a 12 de novembro de 2010
Cultivo in vitro de explantes de Dipteryx alata
Talita Cristina Mamedes¹; Saulo Araújo da Silva²
1
Graduanda do curso de Engenharia Florestal, da Universidade Estadual de Goiás,
Unidade Universitária de Ipameri (UEG UnU de Ipameri), CEP 75780-000, Brasil. Email: [email protected]
² Orientador, professor dos cursos de Agronomia e Engenharia Florestal da UEG
UnU de Ipameri. E-mail: [email protected]
PALAVRAS-CHAVE: baru; micropropagação; cultura de tecidos vegetais; espécie
nativa; espécie arbórea.
1 INTRODUÇÃO
Com o aumento da compreensão da função ecológica das florestas
para a sustentabilidade da vida no planeta e as consequências causadas pela
exploração indiscriminada, florestamentos e reflorestamentos encontram-se nas
agendas de diversas nações (Muralidharan; Kallarackal, 2004). No Brasil, muitos são
os produtos explorados de forma extrativista como borrachas, gomas não elásticas,
ceras, fibras, oleaginosas, tanantes, corantes, alimentícias, aromáticas, medicinais,
madeira, caça e pesca, entre outras. Para alguns destes produtos, evidencia-se o
esgotamento das reservas naturais existentes (HOMMA, 1993).
O Dipteryx alata Vogel, conhecido como baru, barujo, coco feijão, cumaru,
cumarurana, cumbaru, emburena brava, feijão coco, pau cumaru (Lorenzi, 1992 ;
Laca-Buendia, 1992), é de ocorrência no Cerrado e na floresta estacional
semidecídua, nos Estados de Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do
Sul e São Paulo (Lorenzi, 1992). O barueiro é uma leguminosa arbórea
(Papilionoideae) que ocorre em áreas férteis.
Esta espécie apresenta uma pluralidade de usos e, em muitas
propriedades tradicionais da região, essas árvores são mantidas nas pastagens.
Nestas, na época da seca, a polpa do fruto é consumida pelo gado (Almeida et al.,
1990). A árvore pode ser usada no paisagismo e a sua madeira, na construção
naval, civil (LORENZI, 1992) e para a confecção de papéis para rápida impressão,
papéis de embrulho e de embalagens (Andrade & Carvalho, 1996). A polpa e a
semente do baru são altamente energéticas, nutritivas e ricas em minerais,
principalmente em potássio. Cruas ou torradas, as amêndoas (sementes), com
sabor semelhante ao do amendoim, são bastante apreciadas pela população
regional (Carvalho, 1994) e também utilizadas, como anti reumáticas (Brandão,
1993).
A propagação
vegetativa
está
entre
os
principais
métodos
de
multiplicação de espécies florestais. É vantajosa quando comparada à reprodução
sexuada, pois permite reproduzir o elemento genético total, levando a maiores
ganhos em uma mesma geração (Assis & Teixeira, 1998).
Ao relacionar qualidade de propagação e tempo recorde, encontram-se as
técnicas de cultura de tecidos vegetais, as quais oferecem potencial para a rápida
multiplicação de linhagens elite em larga escala. Para espécies florestais, estas
tecnologias são essenciais frente aos longos períodos necessários à multiplicação e
à maturação das plantas (Jain, 1997).
Entre as aplicações da cultura de tecidos vegetais, a micropropagação é a
técnica de maior impacto e de resultados mais sólidos (Grattapaglia & Machado,
1990). É definida como um sistema de propagação vegetativa in vitro no qual, sob
condições ambientais controladas, que se cultivam geralmente ápices caulinares e
gemas axilares para obtenção de indivíduos selecionados geneticamente idênticos
ao original.
A organogênese ou cultura de orgãos ,são formas de organizadas de
crescimento organizadas que podem ser mantidas continuamente in vitro. Inclui o
isolamento asséptico de estruturas definidas como primórdios e segmentos foliares.
Para os propósitos da micropropagação, os mais importantes tipos são: Cultura de
meristemas, Cultura de ápices caulinares, Culturas de segmentos nodais Cultura (ou
resgate) de embriões, Cultura de raízes isoladas. (Guerra & Nodari, 2006).
Existem poucas informações a respeito da produção de mudas via
propagação vegetativa para Dipteryx alata Vogel .
Como fonte de explantes pode-se coletar ramos sadios de matrizes no
campo, ou utilizar plântulas provenientes de sementes germinadas in vitro. A
utilização de plântulas oriundas de sementes tem a vantagem de permitir um maior
controle sobre a assepsia do explante, em comparação a explantes obtidos no
campo.
Segundo Hartmann et al., (1990) a propagação de plantas in vitro é
constituída de quatro fases: estabelecimento dos explantes em ambiente asséptico;
multiplicação dos explantes;enraizamento das brotações e aclimatação de plantas.
A fase de estabelecimento dos explantes tem como objetivo a obtenção
de uma cultura isenta de patógenos. O explante para o estabelecimento in vitro deve
ser preferencialmente coletado a partir de brotações jovens durante a fase
crescimento ativa da planta, ou seja, após o final do período de dormência, durante
os meses mais quentes do ano.
A fase de multiplicação visa estimular a produção do maior número
possível de brotações. Para isso são utilizados reguladores de crescimento,
geralmente auxinas, citocininas e giberelinas (Martins et al., 2007).
O enraizamento é uma etapa que define o resultado final da
micropropagação, é a etapa onde ocorre a formação de raízes adventícias nas
partes aéreas. Pode ser dividido em indução, iniciação e alongamento das raízes
(Torres, 1998).
Auxinas como o ácido indolbutírico (AIB), ácido indolacético (AIA) e ácido
naftalenoacético (ANA) são os principais reguladores envolvidos no processo de
enraizamento in vitro. Em alguns casos, a concentração de auxina que promove
bom enraizamento não é a mesma que promove uma alta sobrevivência ex vitro. As
concentrações mais utilizadas para induzir rizogênese normalmente estão entre 1,0
mg.L-1 a 10,0 mg.L-1 para AIA, 0,05 mg.L-1 a 1,0 mg.L-1 para ANA e 0,5 mg.L-1 a 3,0
mg.L-1 para AIB (Soares et. al., 2001).
Dentro deste contexto este trabalho tem com objetivo estabelecer um
protocolo de micropropagação para D. alata a partir de seguimentos de plântulas
com acréscimo de reguladores de crescimento.
2 MATERIAL E METODOS
Para a realização deste trabalho foram utilizadas sementes de Baru
(D.alata ) coletados na região de Cocalzinho de Goiás-GO. O experimento foi
conduzido no laboratório de cultura de tecidos no Instituto de Ciências Biológicas da
UFG.
Houve uma primeira etapa do experimento realizou se a gerrminação in
vitro. As sementes, após serem lavadas abundantemente com água corrente, foram
desinfectadas em condições assépticas. A desinfestação das embriões/sementes
utilizando-se uma solução comercial de hipoclorito de sódio com 2% (v/v) de cloro
ativo por 20 minutos, acrescida de algumas gotas de tensoativo, e álcool 70% por 5
minutos.
(O meio de cultura utilizado no experimento foi o de Murashige & Skoog,
1962) MS completo até formação de uma plântula normal, seguindo um
procedimento padrão de assepsia álcool 70% por dois minutos e hipoclorito a +2,0%
por 5 minutos.
Na segunda etapa do experimento com utilizou-se como explantes todas
as partes da planta, tendo como meio nutritivo MS completo e MS modificado, sendo
este ¼ dos macronutrientes. Todos os meios de cultura foram acrescidos 2,0 mg.L -1
de auxina ANA (ácido naftalenoacetico) e 2,0 mg.L -1 de carvão ativado. O pH do
meio foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem. Os meios de cultura foram
distribuídos em frascos de vidros e fechados com tampas de polipropileno, sendo 20
mL por frasco. A autoclavagem foi realizada por 20 minutos a 1.1 kgf.cm -2, em
temperatura de 120ºC. Os explantes foram seccionados em seis partes: meristema
apical, meristema secundário, folhas, caule, colo e raiz, e inoculados nos frascos.
Logo apos foram inoculados nos frascos e ao final de todo o procedimento foram
levados para a sala de crescimento à temperatura de +16ºC com fotoperíodo de
16/8 horas.
O delineamento experimental foi 2 x 6 fatorial (o fator A se refere a meios
de cultura, fator
B partes da planta). Para análise dos dados foi utilizada, a
correlação linear simples, que significa associação entre duas variáveis aleatórias.
Foram sete repetições totalizando 84 unidades amostrais. As avaliações foram
efetuadas computando-se desenvolvimento de calo, emissão de raiz e parte aérea,
mortalidade do explante e contaminação.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos com o acido naftalenoacético demonstraram
diferença significativa nos meios MS e ¼ MS. No entanto, de maneira geral, o meio
¼ MS foi melhor que o MS para os explantes testados, provocando grande produção
de calos.
Os resultados demostraram que o MS completo proporcionou 90% de
indução a morfogense direta (emissão de raiz e parte aerea) para o segmento
folhas. Já o processo de diferenciação e formação de novos orgãos chegou proximo
a 74% quando utilizou-se ¼ MS.(figura 1)
Villa et al. (2009) em seu trabalho entitulado Cloreto de sódio e ácido
naftalenoacético no enraizamento de microestacas de amoreira-preta cv. Brazos in
vitro,e os melhores resultados para a micropropagação da cv. Brazos foram obtidos
com o meio MS acrescido de 50 a 75 mg L-1 de NaCl e 1,0 a 1,5 mg L-1 de ANA.
Para os segmentos meristema secundário, folhas, caule, colo e raiz
submetidos a MS completo e ¼ MS, todos apresentaram maiores valores para ¼
MS, demosntrando que restrição de macronutrientes aliado ao uso de ANA e carvão
ativado favoreceram o processo de organogenese.
O meio MS completo e ¼ MS apresentaram resultados semelhantes na
organogenese para o segmento raiz. Os hormônios ou reguladores de crescimento
vegetal atuam não apenas por meio da alteração de suas concentrações
endógenas, como também por mudanças na sensibilidade das células receptoras a
estes compostos (Trewavas & Cleland 1983).
Figura 1: Médias da percentagem de indução de morfogênese direta em meio MS e ¼ MS,
acrescido de 2,0 mg.L¹ de acido naftalenoacetico (ANA) e 2,0 mg.L¹ de carvão ativado.
A formação de calos nos explantes aconteceu 78% para o segmento
colo, 19% para gemas secundárias e 14% para gema e raiz. (figura 2)
Santos et al, (2005) observaram em explantes de salix, a utilização de
concentração individual de ácido naftalenoacético , além de induzir a calogênese
também foi capaz de promover rizogênese.
O colo apresentou maior formação de calos em relação aos demais
explantes, demonstrando uma área com grande concentração de células
totipotentes e resposta ao uso da auxina ANA. Grattapaglia & Machado (1990)
salientam que quantidades excessivas de auxina estimulam a produção de calo.
Embora o ácido naftalenoacético (ANA) possa induzir a formação de raízes, em
algumas espécies por vezes até melhor que o AIB, pode também provocar efeitos
indesejáveis por ser mais tóxico aos tecidos vegetais (Weaver, 1976). A
concentração adequada depende da espécie e do teor da auxina existente nela.
Figura 2: Médias da percentagem de indução de calo nos explantes em MS e
1/4MS,acrescidos 2,0 mg.L¹ de ácido naftalenoacético (ANA) e 2,0 mg.L¹ de carvão ativado.
O uso de MS e ¼MS acrescidos de ANA e carvão ativado favoreceu o
desenvolvimento in vitro de partes vegetativas do barueiro. Os meios das
formulações básicas diluídas para 25% têm possibilitado melhor indução a
morfogênese direta exceto para o explante folha com 73,81 % de indução (Tabela 1).
Por levar em consideração a totalidade dos valores da variável em
estudo, o desvio padrão é a medida de dispersão mais empregada, obtendo-se para
este estudo valores para MS completo e ¼MS 9,25 e 7,78, com variância de 85,60
e 60,46.
Tabela1: Valores médios de percentagem de morfogênese direta para explantes submetidos
ao meio MS com 2,0 mg.L¹ de ácido naftalenoacético (ANA) e 2,0 mg.L¹ de carvão ativado e
¼ MS com 2,0 mg.L¹ de ácido naftalenoacético (ANA) e 2,0 mg.L¹ de carvão ativado.
EXPLANTES
MS com ANA
¼ MS com ANA
Folha
Ápice
Gema secundaria
Caule
Colo
Raiz
MEDIA
DESVPAD
CV%
90.48
64,29
71.43
66.67
71.43
71.43
72,62
9,25
12,74056
73.81
90.48
90.48
90.48
88.10
76.19
84.92
7,78
9,156971
Na análise de correlação (Tabela 2) verificou-se que esta foi uma
correlação negativa (-1 < rXY < 0). O t. calculado foi menor que o t. tabelado, então
não se rejeita a hipótese H0.
A análise demonstrou que a correlação foi alta negativa (r = - 0.77218),
comprovada por uma dispersão inversa. Sendo que os maiores valores de
morfogênese em meio1/4MS correspondem a valores inferiores de morfogênese em
meio MS completo com adição de ANA. A correlação é considerada negativa quando
os valores crescentes da variável X estiverem associados a valores decrescentes da
variável Y, ou valores decrescentes de X associados a valores crescentes de Y.
Tabela 2 . Coeficiente de correlação, t. calculado e t. tabelado de morfogênese direta em
explantes em meio MS e ¼ MS com adição de ácido naftalenoacético (ANA).
Variáveis
Morfogênese direta em explantes em
r
-0.77218
t. calculado
-2.430582268
t. tabelado
2.776445*
meio MS e ¼ MS com ANA
* significativo a 5% de probabilidade
4 CONCLUSÃO
A redução dos macronutrientes é indicada associada ao uso de auxina e
carvão ativado induzindo a morfogênese e a diferenciação celular.
Dentre os segmentos utilizados para propagação vegetativa observou-se
que o uso do colo de plântulas de baru é o segmento que mais apresentou
morfogênese indireta.
Todos os segmentos apresentaram competência para morfogênese
direta.
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