Documento 69457

Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
1
USO DE ISÓTOPOS COMO TRAÇADORES EM
FERTILIDADE DO SOLO E NUTRIÇÃO DE PLANTAS
Antonio Enedi Boaretto, Paulo Cesar Ocheuze Trivelin, Takashi Muraoka
Centro de Energia Nuclear na Agricultura - USP, Av. Centenário, 303, 13.400-970 Piracicaba-SP, [email protected], [email protected], [email protected]
RESUMO
Os conhecimentos em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas tiveram grande
avanço a partir do segundo terço do século XX, devido, entre outros fatores, a utilização de
isótopos. A denominação de traçador advém do fato que isótopos radioativos artificiais, por
emitirem radiações (beta e gama) características de cada um, podem ser identificados e
quantificados nos lugares em que se encontram no sistema em estudo. Para se fazer uso de
radioisótopos artificiais de nutrientes, como por exemplo o P, é necessário juntar ao composto
que será fornecido com ao meio em estudo, uma quantidade do mesmo composto contendo o
radiotraçador, no caso o 32P. A quantidade de radioisótopo em relação ao nutriente natural, no
substrato ou produto, é dada pela atividade específica (Ci/g do elemento ou Bq/g do
elemento), sendo a atividade radioativa determinada em detectores / contadores por ionização
gasosa ou por cintilação. Além dos radioisótopos existem os isótopos estáveis ou naturais de
nutrientes vegetais (C, N, S, B além de outros). Por exemplo, o uso dos isótopos de
nitrogênio (14N e 15N) é baseado no fato que eles ocorrem naturalmente numa razão quase
constante de 273:1 (0,366% de átomos de 15N). A técnica de traçador para os isótopos
estáveis com compostos marcados consta em fornecer, como substrato ao meio em estudo,
composto com composição isotópica do elemento de interesse diferente daquela de ocorrência
natural. As determinações isotópicas para isótopos estáveis são realizadas principalmente por
espectrometria de massas. Após fornecer o traçador ao sistema, determina-se então em que
fração dos produtos se encontra o isótopo, radioativo ou os elementos com razão isotópica
alterada, podendo-se proceder as quantificações por meio do princípio de diluição isotópica.
A utilização de isótopos em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas apresenta como
vantagem, em relação aos métodos convencionais, a possibilidade de acompanhamento do
nutrientes nos diferentes compartimentos do sistema em estudo. Isto é possível porque os
isótopos possuem comportamento químico idêntico aos homólogos não radioativos e/ou
naturais, e as técnicas de detecção permitem determinações der quantidades inferiores aos
limites de detecção dos métodos tradicionais. A técnica do traçador isotópico tem sido muito
usada em estudos envolvendo, por exemplo: mecanismos de absorção de nutrientes;
quantificação da absorção radicular e foliar de nutrientes, aproveitamento de nutrientes de
diferentes fontes por culturas, relacionado à dose, época e local de aplicação; transformações
e movimento de nutrientes no solo e nas plantas; perdas de nutrientes do solo;
desenvolvimento do sistema radicular e localização da parte ativa do mesmo; matéria
orgânica do solo; aspectos relacionados ao ciclo do N, do S no sistema solo-planta-atmosfera;
entre muitos outros. A principal restrição na utilização da técnica isotópica está no custo de
compostos contendo isótopos e de equipamentos especiais, além de necessitar de pessoal
devidamente treinado que tomarão cuidados específicos quando se usa os radioisótopos.
Além disso a boa parte dos pesquisadores, evitam ler artigos científicos em que a mesma é
empregada, restringindo a divulgação de valiosos resultados.
Termos de Indexação: Radioisótopos, isótopos estáveis, traçadores isotópicos, diluição
isotópica.
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 2
FERTBIO 2004
USO DE ISÓTOPOS COMO TRAÇADORES EM
FERTILIDADE DO SOLO E NUTRIÇÃO DE PLANTAS
Antonio Enedi Boaretto, Paulo Cesar Ocheuze Trivelin, Takashi Muraoka
Centro de Energia Nuclear na Agricultura - USP, Av. Centenário, 303, 13.400-970 Piracicaba-SP, [email protected], [email protected], [email protected]
1. INTRODUÇÃO
Na natureza, a matéria é constituída de átomos dos elementos químicos que podem
estar arranjados de diferentes maneiras e proporções, formando os compostos ou substâncias,
podendo estas simples ou complexas. O átomo tem uma estrutura muito semelhante ao
sistema solar onde, no centro, localiza-se o núcleo, carregado positivamente e, em torno dele,
giram partículas de carga negativa (elétrons), como os planetas giram em órbitas ao redor do
sol. O próton é partícula constituinte do núcleo de todos os átomos, possuindo carga positiva
de mesma grandeza e massa 1.850 vezes maior que a do elétron. O número de elétrons nos
átomos é, portanto, igual ao número de prótons do núcleo. Fazem parte ainda do núcleo,
partículas sem carga elétrica e com massa pouco maior que a do próton, que são os nêutrons.
O número de prótons e nêutrons no núcleo define a massa dos átomos.
O número de elétrons e a distribuição destes nos orbitais dos átomos determinam as
propriedades químicas dos diferentes elementos. O número de prótons no núcleo que define o
número de elétrons do átomo é característico de cada elemento químico, embora átomos de
um mesmo elemento não obrigatoriamente devam ter o mesmo número de neutrons no
núcleo.
Os átomos dos elementos são caracterizados pela constituição de seu núcleo, ou seja,
pelo número de prótons e nêutrons. Átomos que possuem diferentes números e nêutrons no
núcleo, mas contém mesmo número de prótons, tratam-se do mesmo elemento e são
chamados de isótopos. A forma genérica de se representar os isótopos é dado a seguir:
A
Z
X
Exemplos:
14
7
N
31
15
39
19
P
K
Significando X o símbolo de um elemento qualquer (ex.: N - nitrogênio, P - fósforo, K potássio, etc.);
A
o número de prótons e de nêutrons do núcleo (ex.:
número de prótons.
14
N,
31
P,
39
K, etc.);
Z
o
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1.1 Isótopos
O termo isótopo significa o mesmo lugar na tabela periódica dos elementos, e como
visto, referem-se aos nuclídeos que possuem o mesmo número atômico e diferentes números
de massa (diferentes números de nêutrons no núcleo).
Os isótopos podem ser estáveis (exemplo para o elemento potássio que possui 19
prótons no núcleo:
39
K e 41K), e como tais não emitem radiações, ocorrendo na natureza em
proporção quase constante (39K = 93,1% e
41
K = 6,89%). Naturalmente, também podem
ocorrer radioisótopos em quantidades muito pequenas, como é o caso do
40
K (0,01% de
ocorrência), que assim existem por possuírem meia-vida muito longa (meia-vida de
40
K =
1,3.109 anos), ou por serem produtos de cadeias radioativas naturais, com meia-vida de média
a curta (ex.: 288Ra), ou ainda por serem produzidos na atmosfera por ação dos raios cósmicos
(ex.: 14C). A meia-vida (símbolo T) de uma espécie radioativa é definida como o tempo para
que metade dos átomos radioativos se desintegre, ou seja, emitam radiações.
Além dos isótopos estáveis e radioativos naturais podem ser obtidos os radioisótopos
artificiais, que são assim chamados por serem produzidos pelo homem em aparelhos especiais
(ciclotron, síncroton, reatores nucleares, etc.), onde a constituição dos núcleos dos átomos é
modificada, tornado-os instáveis. No caso do K, como por exemplo, são passíveis de serem
obtidos:
36
K,
37
Ke
38
K (emissores   , com meia vida de frações de segundo),
42
Ke
43
K
(emissores emitem   , com meia vida de 12,4 a 22 horas, respectivamente); e 44K, 45K, 42K,
46
K e 42K e 47K (emissores   , com meia vida de minutos a segundos).
1.2 Isótopos radioativos: atividade radioativa, atividade específica e técnicas de detecção
Os radioisótopos, por serem instáveis, sofrem desintegrações emitindo partículas: 2+
(alfa), - (beta negativo) e + (beta positivo), característica a cada radionuclídeo, podendo ou
não ocorrer após essas desintegrações, emissão de radiação gama de natureza eletromagnética.
O fenômeno é interpretado pela lei exponencial do decaimento radioativo:
A= A0 e-t
A = a atividade do material a um tempo qualquer, dada em unidades de desintegrações por
segundo (dps);
A0 = atividade em dps ao tempo inicial (t=0);
t (segundos) = tempo decorrido para que a atividade da amostra se reduza de A0 a A;
e  = constante de desintegração, característica de cada radionuclídeo.
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A meia vida (T) de cada espécie radioativa é relacionada à constante de desintegração () por
meio da expressão: T=0,693/.
A taxa de desintegração ou de decaimento radioativo (dps) de um radionuclídeo, dá a
quantidade de radioatividade emitida na forma de radiação característica da espécie, de onde
deriva a unidade de atividade radioativa, o Curie (símbolo Ci). O Ci é definido como a
atividade radioativa equivalente a 3,7 1010 dps. Em trabalhos experimentais é conveniente
utilizar-se dos sub-múltiplos mCi (10-3Ci), Ci (10-6Ci) e pCi (10-12Ci). Outra unidade de
atividade é o Becquerel (símbolo Bq), equivalente a 1 dps. As relações entre Curie e
Becquerel são dadas por: 1Ci = 3,7.1010Bq ou 1 Ci = 37kBq. São muito usados os múltiplos
do Becquerel como kBq (103Bq), MBq (106Bq) e GBq (109Bq).
Em trabalhos de pesquisa com radiotraçadores a atividade absoluta (dps) do material
não é medida diretamente, mas sim uma parte dessa que é registrada em unidades de
contagens por segundo (cps). Isto ocorre devido os métodos de detecção possuírem eficiência
de contagem inferiores a 100%. Dessa forma todos os materiais em estudos, deverão ser
analisados ou contados, sob a mesma condição de eficiência e relacionados a um padrão, de
atividade absoluta conhecida.
Em amostras contendo uma espécie particular de radionuclídeo, este normalmente
vem acompanhado do isótopo estável correspondente que é denominado de “carregador”.
Quando uma amostra de radiotraçador não contém o elemento estável, ela é chamada “livre
do carregador”.
Para se fazer uso da técnica de traçador com radioisótopos artificiais, é necessário
juntar ao composto que será fornecido como substrato ao meio em estudo, uma pequena
quantidade do mesmo composto contendo o radiotraçador. Normalmente esse último, é
fornecido pelos laboratórios produtores de radioisótopos “livre do carregador”. A atividade
específica do substrato e produtos é então definida como a atividade radioativa por unidade
peso ou volume do elemento ou nutriente total (Ci/g), Ci/g, Ci/mol, Ci/mL, com/mg, etc.
As técnicas com traçadores radioativos requerem a determinação da quantidade de
radioatividade ou da atividade da amostra, que está relacionada com a quantidade de isótopo
presente na amostra. O método a ser empregado será definido pelo isótopo que será utilizado
(tipo de radiação, energia de radiação, meia vida do radioisótopo, etc).
Os métodos de detecção de radiações são baseados na ionização causada em diferentes
meios ou outras propriedades de interação de partículas ou raios gamas com a matéria.
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Características físicas dos radioisótpos utilizados em pesquisas biológicas podem ser
encontradas em:
http://web.cena.usp.br/apostilas/Virgilio/cen-5705/APOSTILA_CARACTERISTICAS_FISICAS.doc
A ionização é a base da maioria dos instrumentos usados na detecção e radiações. Os
diferentes instrumentos diferem no material onde a ionização é produzida e a maneira como
ela é observada ou medida. Muitos instrumentos são baseados na produção de ionização num
gás quando uma radiação passa através dele, sendo necessário, nesses casos, separar e
recolher os íons positivos e negativos. Os aparelhos baseados nesse princípio são: câmara de
ionização, contador proporcional e contador Geiger-Muller. A ionização pode também ser
produzida em líquido ou cristal. Quando ela é produzida num gás super saturado com vapor
ou em emulsão fotográfica, as trajetórias das partículas podem se tornar visíveis.
Partículas radioativas incidindo sob certos materiais líquidos ou sólidos que possuem a
propriedade de luminescência, parte da energia das partículas usadas na excitação molecular
do material é reemitida como luz visível ou ultravioleta. Os detectores baseados nesse
princípio são chamados cintiladores, podendo ser do tipo sólido ou líquido.
Maior detalhamento sobre metodologia de uso de radioisótopos pode ser obtida em
Chase & Rabinowitz (1967), Vose (1980), Wang & Willis (1965) e nas apostilas a seguir
indicadas:
http://web.cena.usp.br/apostilas/Virgilio/cen-5705/APOSTILA_EFEITO_CERENKOV.doc
http://web.cena.usp.br/apostilas/Virgilio/cen-5705/APOSTILA_CINTILACAO_SOLIDA.doc
1.3 Isótopos estáveis: abundância isotópica e técnicas de detecção.
Os isótopos estáveis dos elementos encontrados nas plantas: 2H,
13
C,
15
N,
18
O,
34
S,
ocorrem na natureza em concentrações mais baixas que seus homólogos (1H, 12C, 14N, 16O e
32
S), e por possuírem maior massa (maior número de neutros no núcleo) são denominados de
isótopos pesados. A tabela 1 relaciona os isótopos estáveis de elementos leves e respectivas
abundâncias naturais (%). Por abundância natural ou relativa entende-se a porcentagem de
um isótopo em relação aos demais do mesmo elemento que ocorrem naturalmente.
Na tabela 1 foram listados somente os isótopos de elementos leves que são gases no
estado elementar ou formam compostos gasosos simples, como é o caso o carbono (CO2) e
enxofre (SO2) e também os isótopos de B.
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Tabela 1. Isótopos estáveis de nutrientes de plantas
Elemento
Isótopos Estáveis
Abundância Natural (%)
1
H
99,985
2
H
0,015
Hidrogênio
12
98,893
13
C
1,107
14
N
99,634
15
N
0,366
O
O
18
O
99,759
0,037
0,204
C
Carbono
Nitrogênio
16
Oxigênio
17
32
S
S
34
S
36
S
Enxofre
33
Boro
11
B
B
Fonte: HEAT (1973)
10
95,00
0,76
4,22
0,02
80,1
19,9
Os isótopos pesados ou de menor abundância, no caso de H, C, O, N e S, possuem
comportamento químico muito próximo àqueles de maior abundância natural e são usados
como traçadores, tanto com o uso de compostos contendo o elemento de interesse, com razão
isotópica diferente daquela de ocorrência natural (compostos enriquecidos ou empobrecidos
no isótopo pesado), como através do uso de variações na razão isotópica natural (2H/1H;
13
C/12C; 15N/14N; 18O/16O e 34S/32S), que são causadas nos sistemas, devido as leves diferenças
nas propriedades físicas dos isótopos (taxa de difusão ou reação), como conseqüência das
diferenças de massas nucleares.
A principal técnica de análise para isótopos estáveis é a espectrometria de massas que
se baseia no princípio de separação de moléculas gasosas ionizadas de acordo com suas
massas, quando essas atravessam num campo magnético. Por exemplo, quando uma amostra
de N2 é introduzida no aparelho, as espécies moleculares neutras
14
N14N (A=28),
14
N15N
(A=29) e 15N15N (A=30) são forçadas a perderem um elétron por impacto eletrônico na fonte
de ionização. A seguir, as espécies moleculares ionizadas (normalmente monoionizadas) são
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aceleradas e um feixe delas é introduzido perpendicularmente num campo magnético intenso,
onde ocorre a separação das diferentes massas, que a seguir são coletadas e suas intensidades
medidas (I). Com os valores decorrentes devido a intensidade das massas (I28, I29 e I30) é
possível determinar a porcentagem de
15
N de uma amostra. O termo átomo porcento em
excesso é muitas vezes usado para amostras enriquecidas num isótopo estável e representa a
abundância daquele acima do valor de ocorrência natural. Uma amostra com 5 átomos % de
15
N em excesso, significa que ela contém 5,366 átomos % de 15N (94,634 átomos % de 14N).
A nomenclatura utilizada universalmente para indicar valores de variações relativas, ao nível
de abundância para isótopo estáveis, é o (‰) (delta por mil), que é definido como:
(‰) = [RA-RS)/RS)].103
R = razão entre a concentração de um dos isótopos menos abundantes e a daquele mais
abundante (ex.
15
N/14N,
13
C/12C, etc) e A e S são índices que indicam amostra e padrão,
respectivamente.
Como exemplo de valores da abundância natural para isótopos estáveis pode ser citado
o caso do 13C. A variação da concentração de 13C na natureza é cerca de  30‰. A principal
causa dessa variação é a fotossíntese. Enquanto que para o CO2 do ar atmosférico o valor de
13C é de -8‰ em relação ao padrão internacional-PDB, o carbono fixado por planas do ciclo
fotossintético C-3 e C-4 tem esse valores ao redor de -28‰ e -12‰ respectivamente (Matsui,
1981).
Como a análise por espectrometria de massas de isótopos estáveis de elementos leves
normalmente requer o elemento numa forma gasosa, os métodos de preparo de amostras ("of
line" ou "in line"), convertem elemento do estado combinado para um gás. Para que isso seja
possível e também que contaminações de gases do ar atmosférico sejam mínimas, o preparo é
realizado sob alto vácuo.
Os isótopos de B são determinados em ICP-MS e os detalhes da metodologia podem
ser obtidos em BELLATO (1999).
Maiores informações sobre metodologia analítica para isótopos estáveis são dadas por
Hauck & Bremner (1976), Trivelin et al. (1973) e Vose (1980).
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2. O MÉTODO DO TRAÇADOR ISOTÓPICO: A DILUIÇÃO ISOTÓPICA
As propriedades químicas dos elementos são determinadas quase que exclusivamente
pelo número e arranjo dos elétrons atômicos. Este número e arranjo são, por sua vez,
determinados pela carga nuclear. Portanto, os isótopos de um mesmo elemento terão,
praticamente, propriedades químicas idênticas. Existem pequenas diferenças nas propriedades
químicas devidas às pequenas variações no tamanho nuclear e às pequenas diferenças de
massas entre diferentes isótopos, sendo essas diferenças suficientes para permitir a separação
de isótopos de um mesmo elemento. Entretanto para a maioria das finalidades as propriedades
químicas dos isótopos podem ser tomadas como iguais.
A grande importância do método do traçador é que os isótopos de um dado elemento,
quer seja radioativo ou estável, podem ser identificados numa mistura normal dos isótopos
deste elemento, conforme o mesmo é encontrado na natureza, possibilitando o
acompanhamento do elemento nos diferentes compartimentos do sistema em estudo
(qualitativa e quantitativa).
2.1 O método do traçador isotópico
O método do traçador isotópico, segundo Wolf (1969), é usado de três maneiras: (i)
para obter evidências da síntese (incorporação) e relações precursor - produto entre compostos
conhecidos; (ii) no isolamento, purificação e identificação de intermediários desconhecidos
numa cadeia de reações; (iii) como uma ferramenta analítica no acompanhamento do curso de
uma reação, de compostos conhecidos. Nessa classificação tem-se que (i) e (ii) referem-se ao
uso da técnica, mais sob o aspecto qualitativo e (iii) refere-se a técnica analítica por diluição
isotópica p.d., ou seja, de caráter quantitativo.
Um exemplo clássico que bem demonstra a utilidade do método com traçador
isotópico, sobre a evidência de relações precursor - produto, foi o estudo da origem do
oxigênio molecular na reação fotossintética:
luz
nCO2 + nH2O  O2 + (CH2O)n
Em 1941, a seguinte pergunta era feita: o oxigênio evoluído na reação fotossintética é
originário do dióxido de carbono, da água ou de ambos? O problema foi elucidado por Rubin
e colaboradores (Devlin & Barker 1971) fazendo crescer algas (Chlorella pyrenoidosa) em
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solução contendo KHCO3 em pH igual a10. Quando as algas cresceram em meio contendo
H218O, a razão 18O/16O do O2 evoluído (determinado por espectrometria de massas) foi igual a
da água marcada com 18O. Fazendo as algas crescerem em meio com água comum contendo
KHC18O2, o O2 evoluído não estava enriquecido em
18
O. Após este estudo ficou esclarecido
que o oxigênio da fotossíntese tinha como origem a água.
Outro exemplo clássico do uso da técnica de traçador na identificação de
intermediários desconhecidos em cadeias de reações, trata-se dos trabalhos de Calvin e
colaboradores em estudos da fixação do dióxido de carbono no processo da fotossíntese
(Devlin & Barker, 1971). O emprego do gás carbônico marcado com
14
C em experimentos
com plantas (algas) expostas à luz, permitiu a identificação dos compostos estáveis derivados
da assimilação do 14CO2, elucidando o ciclo da redução do carbono, que é chamado ciclo de
Calvin-Benson, sendo um dos mais bem estudados aspectos do processo fotossintético.
O método do traçador isotópico tem sido empregado associado à técnicas químicas e
bioquímicas: como a fotografia (autoradiografia) e cromatografia, entre outras. Em estudos
em que quantificações são necessárias, o princípio da diluição isotópica torna-se importante.
2.2 O método do traçador isotópico para nitrogênio
As aplicações do método de traçador com o isótopo estável
15
N permitem avaliar as
transformações individuais do N no solo, mesmo quando múltiplas transformações ocorrem
simultaneamente no meio. O método marca o caminho dos dois isótopos de N (15N e
14
N)
simultaneamente, fornecendo informações acerca do sistema e estimando as taxas de
transformação do N.
As técnicas de traçador com
15
N, que têm sido usadas em estudos dos processos de
transformação do N no solo, podem ser classificadas, de acordo com Hart & Myrold (1996),
como: (i) técnica do traçador
15
N - quando um substrato ou fonte é marcado com
15
N, e o
movimento do isótopo no sistema é monitorado no tempo, de forma qualitativa e/ou
quantitativa; (ii) técnica da diluição do isótopo
marcado com
15
15
N - quando um “pool” de N do solo é
N e a taxa na qual muda seu conteúdo e o seu enriquecimento de
15
N
(porcentagem de átomos) é monitorado, em vista da diluição pelo influxo de 14N; (iii) técnica
da abundância natural de
15
N - quando leves diferenças no enriquecimento de
15
N, como
resultado da discriminação biológica durante longo período, são usadas para avaliar as
relações substrato-produto a longo prazo; (iv) técnica da distribuição dos isótopos de N - é
uma nova variante da técnica de traçador para nitrogênio e aplica-se exclusivamente para a
reação de desnitrificação quando o N do 15NO3- da origem ao 15N2O e 15N2.
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O método do traçador 15N, de mais amplo uso em estudo das transformações de N no
solo, envolve a adição de um substrato-15N de um processo de interesse e observa-se a
acumulação do isótopo no produto. Os primeiros estudos das transformações no N no sistema
solo-planta com o traçador 15N foram realizados usando essa técnica.
Os trabalhos pioneiros empregaram esse traçador na avaliação qualitativa da
transformação do N. Alguns exemplos de descobertas que seriam difíceis de serem feitas sem
o uso do
15
N são: o uso preferencial de NH4+ comparado com o NO3- por microrganismos
heterotróficos (quimiorganotróficos) do solo; a competição dos microrganismos nitrificadores
autotróficos (quimiolitotróficos) com os quimiorganotróficos pelo NH4+ do solo, mesmo em
condições de elevada disponibilidade de matéria orgânica.
Nos últimos 35 anos, a técnica de traçador com o isótopo 15N contribuiu decisivamente
para aumentar o entendimento sobre as transformações do nitrogênio no sistema solo-planta.
O nitrogênio na planta derivado ou proveniente do fertilizante (Ndff, Nppf ou Npdf), obtido
por princípios de diluição isotópica, permite identificar num produto (na planta, por exemplo),
a contribuição da fonte de interesse aplicada ao solo, e que nesse tipo de estudo é marcada
com o isótopo estável 15N.
2.3 Aplicações do método do traçador com isótopos estáveis de elementos leves
As aplicações do método de traçador com isótopo estável de boro, carbono e enxofre,
como exemplos, podem ser feitas com compostos enriquecidos nos isótopos naturalmente
menos abundantes dos elementos:
10
B, 13C e 34S, respectivamente, ou, mesmo, com uso das
variações na razão isotópica natural (%o) no caso de carbono e enxofre.
Em nutrição animal a técnica do traçador é útil em estudos de seletividade de
pastagens por animais domésticos por meio de medidas de %o 13C nas fezes. Como exemplo,
tem-se a determinação da proporção de leguminosa (planta C3) e gramínea (C4) na dieta de
bovinos como realizada por Lourenço & Matsui (1981).
Na Ciência do Solo, valores %o
13
C tem sido usados na avaliação do ”turnover” da
matéria orgânica do solo (Boutton, 1996). No sistema solo-planta, a razão natural dos isótopos
de carbono (13C/12C) no carbono orgânico do solo, contém informações relativas à presença
ou ausência de plantas do ciclo fotossintético C3 (baixa razão
13
C/12C) e C4 (alta razão
13
C/12C) na comunidade de plantas do passado e a contribuição relativa da comunidade na
produtividade primária líquida, no tempo. Mudanças e alterações na produtividade relativa de
plantas C3 e C4 em um ecossistema, no tempo, é freqüentemente atribuída às mudanças ou
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distúrbios no regime ou clima. Medidas isotópicas do carbono da matéria orgânica do solo
também são usadas para documentar os efeitos das práticas de uso da terra e na estrutura do
ecossistema. Como exemplo tem-se a determinação da proporção do carbono da matéria
orgânica do solo (MOS) originário de um cultura recente de ciclo fotossintético C4 (cana-deaçúcar), implantada após predominância de cobertura vegetal de plantas C3 (floresta)
(Vitorello et al., 1989).
A técnica do traçador com medidas de %o
13
C também tem sido de grande utilidade
em avaliações de adulterações de alimentos (mel) e bebidas (vinho, conhaque, vinagre etc.).
Em hidrologia o método da diluição isotópica de valores de %o 2H e %o 18O da água
de rios tem sido de utilidade em avaliações das vazões relativas de tributários de um rio
principal (Matsui et al., 1972).
2.4 O principio da diluição isotópica em quantificações com o uso de radionuclídeos
artificiais (ex.: 32P, 35S, 45Ca, 65Zn, 54Mn, etc.)
Considerando que o produto final (P) contendo um elemento ou nutriente objeto de
estudo, será formado a partir de um substrato A (sA), em que o isótopo do elemento não está
presente, e também de outro, substrato B (sB), no qual adiciona-se o isótopo do elemento em
questão (ex.: fósforo na planta absorvido do solo - substrato A, e do fertilizante - substrato B),
como representado na Figura 1, a condição básica que deve ser satisfeita é representada pela
equação 1.
Figura 1. Diluição isotópica de radionuclídeos artificiais, num sistema substrato - produto,
sem marcação no substrato A (sA) e com marcação artificial no substrato B (sB).
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 12
FERTBIO 2004
QIP = (QIP)sB
(1)
onde: QIP significa a quantidade do isótopo no produto e (QIP)sB a quantidade do isótopo no
produto derivado do substrato B.
Por definição, a atividade específica de uma amostra devido às desintegrações
radioativas é dada na expressão 2.
AE = [ (QI) / (QN) ]
(2)
significando: AE - atividade específica; QI - quantidade do isótopo artificial do nutriente na
amostra; QN - quantidade total do elemento na amostra.
Portanto, as atividades especificas para amostras do substrato e do produto,
determinadas no mesmo aparelho detector de radioatividade, são expressas por:
(AE)P = [ (QIP) / (QNP)]
(3)
(AE)sB = [ (QI)sB / (QN)sB] = [ (QIP)sB / (QNP)sB ]
(4)
e
significando: QIP - quantidade do isótopo no produto; QNP - quantidade do elemento
(nutriente) no produto; (Ql)sB - quantidade do isótopo no substrato B; (QN)sB - quantidade
do elemento no substrato B; (QNP)sB- quantidade do nutriente no produto derivado do
substrato B; (QIP)sB - quantidade de isótopo no produto derivado do substrato B
A igualdade prevista na equação (4) é válida, considerado nulo o fracionamento entre I
e N. De (4) tem-se que a razão entre a quantidade do isótopo (I) e do elemento (N) no
substrato (sB) e a mesma daquela que irá fazer parte do produto, devendo ser iguais.
(QI)sB / (QN)sB = (QIP)sB / (QNP)sB
(5)
Das equações (3), (4) e (1), chega-se que:
ou
(AE)P . QNP = (AE)sB . (QNP)sB
(6)
(QNP)sB = [(AE)P / (AE)sB] . QNP
(7)
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
13
A equação (7), também chamada de equação de diluição isotópica direta, dá a
quantidade do elemento no produto derivado ou proveniente do substrato B. O valor de
(QNP)sA é obtido de (8) que é chamada de equação de diluição isotópica indireta.
(QNP)sA = QNP - (QNP)sB = QNP . { 1 – [(AE)P / (AE)sB]
(8)
2.5 O princípio da diluição isotópica em quantificações com uso de isótopos estáveis ( 10B,
15N
e 34S )
Quando um produto que contém o nutriente é formado do substrato A (sA), em que os
isótopos do elemento ocorrem naturalmente (abundância natural), e do substrato B (sB), que
contém os isótopos do nutriente em estudo (10B e
11
B;15N e
14
N;
32
S e
34
S) em proporção
diferente da natural (material marcado ou enriquecido), como ilustrado na Figura 2, o balanço
de massa e o balanço isotópico que devem ser satisfeitos estão representados pelas equações
(9) e (10).
Figura 2. Diluição isotópica em um sistema substrato-produto com marcação natural no
substrato A e artificial (marcado) no substrato B.
QNP = (QNP)sA + (QNP)Sb
(9)
QIP = (QIP)sA + (QIP)sB
(10)
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 14
FERTBIO 2004
significando QNP e QIP, respectivamente, o conteúdo, no produto, do elemento (B, N ou S) e
o do isótopo (10B,
15
N ou
34
S). Os subscritos sA e sB denotam o nutriente e o respectivo
isótopo derivado do substrato A e B respectivamente.
A abundância (Ab), expressa em % de átomos do isótopo pesado (ou o menos
abundante) em relação ao número total de átomos do elemento (ex.: % de átomos de 10B, 15N
ou
34
S), é obtida da determinação da razão isotópica por espectrometria de massas. Assim,
para os três compartimentos da Figura 2, têm-se as abundâncias (Ab), expressas em termos de
fração:
(Ab)P = (QIP) / (QNP)
(11)
(Ab)sA = (QI)sA / (QN)sA = (QIP)sA / (QNP)sA
(12)
(Ab)sB = (QI)sB / (QN)sB = (QIP)sB / (QNP)sB
(13)
significando, (QI)sA ou (QI)sB e (QN)sA ou (QN)sB, respectivamente, a quantidade do
isótopo e do elemento no substrato A ou B (sA ou sB). (QIP)sA ou (QIP)sB e (QNP)sA ou
(QNP)sB , respectivamente, a quantidade do isótopo e a do elemento no produto derivado do
substrato A ou B (sA ou sB). As igualdades previstas nas equações (12) e (13) são válidas,
considerado desprezível o fracionamento nos isótopos do elemento. Assim, das equações (10),
(11), (12) e (13), chega-se à (14) denominada de equação de diluição isotópica:
(Ab)P . QNP = (Ab)sA (QNP)sA + (Ab)sB . (QNP)sB
(14)
Da (9) e da (14), chega-se à (15):
(QNP)sB = Nppf = { [(Ab)P - (Ab)as] / [(Ab)sB - (Ab)sA)] } . QNP
(15)
significando Nppf o nutriente (B, N ou S) no produto derivado do substrato marcado (sB)
Como (Ab)sA representa a abundância natural de 10B, 15N ou 34S (19,78% de átomo de
10
B; 0,366% de átomos de 15N ou 4,21% de átomos de 34S), muitas vezes a (15) vem expressa
em termos de porcentagem de átomos em excesso, como indicado em (16).
(QNP)sB = Nppf = [(Ab excesso)p /(Ab excesso)sB ] . QNP
(16)
(Ab excesso)p = (Ab)P - (Ab)sA
(17)
onde:
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
15
e
(Ab excesso)sB = (Ab)P - (Ab)sB
(18)
Pode-se ainda calcular o teor (porcentagem) do nutriente no produto proveniente dos
substratos: %(NPP)sB e %(NPP)sA, independentemente das determinações de (QN)sA,
(QN)sB e QNP, por (19) e (20).
%(NPP)sB = [(Ab excesso)p / (Ab excesso )sB] . 100
(19)
%(NPP)sA = 100 - %(NPP)sB
(20)
A equação (15) expressa a recuperação quantitativa do nutriente do substrato B
(exemplos: B/N/S-fertilizante, B/N/S da matéria orgânica) no produto (exemplos: B/N/Splanta, B/N/S-solo, B/N/S-lixiviado).
O cálculo da recuperação porcentual no produto do nutriente do substrato B é
realizado pela equação (21).
%R = [(QNP)sB / (QN)sB] . 100 = [ Nppf / (QN)sB] . 100
(21)
sendo que (QNP)sB é a quantidade do nutriente no produto derivado do substrato B (por
exemplo: Boro ou N ou S na planta) e (QN)sB ou Nppf e a quantidade do nutriente no
substrato B ou o nutriente no produto derivado do substrato marcado (por exemplo a dose de
Boro ou N ou S aplicado ao solo como fertilizante).
As equações (7) e (15) são idênticas, em última análise, diferindo somente quando a
ocorrência ou não do isótopo naturalmente. Essas equações são apresentadas correntemente
na literatura na área de Ciência do Solo com diferentes notações e como exemplo pode-se
citar: Pdff ou Ppdf ("phosphorus in the plant derived from fertilizer" ou fósforo na planta
derivado do fertilizante respectivamente); Sdff (“sulfur in the plant derived from fertilizer”)
avaliado tanto com o radioisótopo
35
S como com o isótopo estável
34
S; Ndff ou Nppf/Npdf
("nitrogen in the plant derived from fertilizer" ou nitrogênio na planta proveniente/derivado
do fertilizante respectivamente); Bdff (“boron in the plant derived from fertilizer”).
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 16
FERTBIO 2004
3. USO DE ISÓTOPOS RADIOATIVOS
3.1 Visão geral
Encontra-se na Tabela 3 os isótopos radioativos já utilizados, em estudos de fertilidade
do solo e nutrição de plantas. São fornecidos também alguns itens estudados com os mesmos
que podem ser encontrados na literatura internacional. Dos citados, já foram utilizados no
Brasil: 14C, 32P, 35S, 45Cu, 54Mn, 59Fe, 65Zn, 86Rb, 137Cs, 63Ni e 109Cd.
Ressalta-se que para utilizar os isótopos radioativos é necessário ter treinamento
especial, para que os usuários se protejam usando corretamente os procedimentos indicados.
Não só quem utiliza deve se proteger de exposições à radiação acima da dose permitida, mas
toda a área experimental deve ter a devida proteção para que outras pessoas que passem pelo
local (laboratório, casa de vegetação, campo), não fiquem expostas a radiação.
Com a promulgação da lei no 9.605 de 12-2-1998, que dispõe sobre as sanções penais
e administrativas derivadas de condutas e atividades lesivas ao meio ambiente, a utilização de
radioisótopos em pesquisas passou a ter maior controle.
Hoje só pode utilizar os
radioisótopos em pesquisas os laboratórios e os pesquisadores devidamente credenciados
junta a Comissão Nacional de Energia Nuclear.
A meia vida de um isótopo radioativo limita o período de tempo que ele pode ser
detectado. A sensibilidade dos estudos com traçadores radioativos é muito alta porque cada
evento radioativo representa a desintegração de um átomo. Aproximadamente 100% das
desintegrações podem ser detectadas com os modernos aparelhos de contagem. Um exemplo
de sensibilidade pode ser dado para o
32
P que tem atividade específica do isótopo puro, ou
seja, livre de carregador, igual a 3x1011Ci.g-1. Tendo-se que 1 microcurie (Ci) de atividade
radioativa é definida como 2,2.106 desintegrações por minuto (dpm), portanto 1g de
32
P
promove 6,6x1017 dpm. Como no cintilador líquido ao redor de 1000cpm pode ser facilmente
detectada, é necessário então: 1,5x10-15g
32
P. Portanto, a quantidade de
32
P necessária na
amostra para que as contagens estejam dentro da faixa adequada do cintilador é bastante
pequena. Como no preparo do extrato que é levado para o cintilador se usa 1 g de amostra, o
32
P pode então estar diluído de aproximadamente 1015 vezes seu peso no material inerte, sem
prejuízo a sua determinação.
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
17
Tabela 3. Isótopos radioativos de interesse para nutrição de plantas e fertilidade do solo
(adaptado de L’Annunziata & Legg, 1984).
Radiação
1
Isótopo Meia vida Tipo Energia2
Aplicações
Fixação biológica de N
Desnitrificação
Estudo sobre a matéria orgânica
Movimento na planta
N
10,0 m
-
1,20(100)
14
C
28
Mg
5.730a
21,2 h
-
32
14,3 d
-
0,156(100)
0,46(100)
0,031(100)
0,400(37,8)
0,95(37,8)
1,35(56,8)
1,71(100)
33
24,4 d
-
0,248(100)
35
87,9 d
-
0,167(100)
36
3,08.105 a
+
-
0,714(98,1)
0,115(1,9)
1,314(89,3)
K trocável do solo
1,46(10,6 de EC
(10,6)
3,52(82)
K trocável do solo
1,97(18)
1,524(18)
Mecanismos de absorção iônica
1,82(1,3)
K trocável do solo
1,20(3,5)
0,83(87)
0,46(8)
0,373(85)
0,39(11)
0,59(13)
0,619(80)
0,252(100)
Ca trocável do solo
Auto-radiografia de raízes
Mecanismos de absorção iônica
Movimento em plantas
13
P
P
S
Cl
40
K
1,26.109 a

42
K
12,36 h
-
43
K
22,4 h

-

45
Ca
1
2
165 d
-
P trocável dos solos
P disponível de fertilizantes
Distribuição de raízes no solo
Efeito residual
Absorção foliar
Cinética de absorção
Autoradiografia de raízes
Difusão no solo
Absorção da atmosfera
Disponibilidade
Ciclagem no solo
Movimento de soluto no solo
m= minutos; d= dias; h= horas; a= anos
unidade de energia =milhão de elétron volts (MeV)
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 18
FERTBIO 2004
Tabela 3. Isótopos radioativos de interesse para nutrição de plantas e fertilidade do solo
(adaptado de L’Annunziata & Legg, 1984). (continuação)
Radiação
Isótopo
Meia
vida1
Tipo
Energia2
Aplicações
54
Mn
303 d

0,835(100)
59
Fe
45,6 d
-
0,475(51,2)
0,273(48,5)
1,095(56,5)
1,292(43,2)
0,573(39,6)
0,656(19,3)
1,34(0,6) de
EC(41,1)
0,327(1,46)
1,115(50,7) de
EC(98,5)
1,78(91,2)
0,71(8,8)
1,078(8,8)
0,514(100)
Disponibilidade no solo
Complexação na solução do solo
Perdas por erosão
Difusão no solo
Disponibilidade no solo

64
Cu
12,8 h
+

65
Zn
245 d
+

18,66 d
-
85
64,0


89
52,7 d
66,7 h
-
86
Rb
Sr
Sr
Mo
99

134
Cs
1,04 a
-
137
Cs
30,0 a
-
1
2
1,463(100)
1,23(82)
0,45(17)
0,041(1)
0,181(7)
0,366(1,8)
0,740(15)
0,780(4)
0,662(71)
0,089(28)
0,57(4)
0,605(98)
0,796(88)
1,038
1,168
1,365
`1,176(6)
0,514(94)
0,662(85)
Complexação na solução do solo
Disponibilidade do solo
Complexação na solução do solo
Mecanismos de absorção de íons
Traçador que substitui o K
Capacidade de troca de cátions
Mecanismos de absorção atômica
Traçador que substitui o Ca
Nutrição de Plantas
Erosão
Erosão
Absorção e transporte na planta
m= minutos; d= dias; h= horas; a= anos
unidade de energia =milhão de elétron volts (MeV)
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
19
3.2 Aplicações
Serão apresentados alguns exemplos de utilização dos isótopos radioativos tirados da
literatura brasileira.
3.2.1 Radioautografia
A radioautografia é geralmente utilizada quando se deseja conhecer a distribuição
qualitativa de um nutriente e foi empregada pela primeira vez em 1896 por Becquerel. Podese dizer que a radioautografia é a imagem de distribuição do radionuclídeo em um objeto, por
exemplo, uma planta.
O isótopo radioativo emite radiação que interage com o sal de prata da emulsão
fotográfica, provocando o escurecimento no filme fotográfico. As áreas enegrecidas dão o
“retrato” de onde o nutriente radioativo se encontra.
Por exemplo, para se conhecer a distribuição do
32
P absorvido pelas raízes de
tomateiro, coloca-se mudas de tomate em solução nutritiva a qual contém
P (H32PO 24  ;
32
H32PO 4 ; H32PO 34 ). O fósforo após ser absorvido distribui-se pela planta do tomateiro.
Depois de algum tempo, dependendo da atividade da solução nutritiva, retira-se a planta, lavase as raízes e seca-se como se fosse a planta para herbário. A seguir a planta é colocada em
contato com o filme fotográfico, ocorrendo a impressão da imagem da distribuição do
32
P na
planta.
Uma aplicação desta técnica foi empregada para demonstrar que o cálcio, na forma de
cloreto ou quelatizado, que é absorvido pelo caule quando se aplica o mesmo por adubação
foliar, permanece na casca da laranjeira e não atinge o cilindro central, como seria desejado.
Neste caso a técnica do traçador foi à única que poderia resolver o problema proposto. Para a
demonstração, pincelou-se o caule de mudas de laranjeira com
45
Ca nas formas de cloreto e
quelatizado. Depois de decorrido 1,5 e 10 dias da aplicação retiraram-se anéis dos caules
pincelados, e foram feitas radioautografias, as quais mostraram que o cálcio absorvido
encontrava-se somente na casca não atingindo o cilindro central (Figura 3, Alvarez, 1990).
Figura 3 - Autoradiografia de caule (1,2 cm de
diâmetro)
de
laranjeira
jovem.
A
enegrecida, causada pelas emissões de
corresponde à casca da laranjeira.
área
45
Ca,
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 20
FERTBIO 2004
Um outro exemplo que pode ser dado diz respeito a localização do Zn e do Mn
aplicado nas folhas de laranjeira (Figura 4 obtidas em Boaretto et al., 2000 e Boaretto et al.,
2002).
Através da autoradiografia verificou-se que só houve escurecimento do filme
fotográfico nas posições correspondentes às folhas onde a solução contendo 65Zn ou 54Mn foi
aplicada, indicando não haver ou ser incipiente a translocação destes nutrientes das folhas que
os recebem para as folhas que nasceram após a aplicação dos mesmos nas folhas.
a
b
c
1
3
2
54
Mn
--------- 65Zn -------
Figura 4. Radioautografia. A - Folhas 1, 2 e 3 receberam
65
54
Mn; b - Folhas que receberam
Zn e c - Ramo novo que desenvolveu depois que o 65Zn foi aplicado. O contorno das folhas
foi desenhado para localizar o ramo no filme radiográfico.
3.2.2 Disponibilidade e adsorção de nutrientes no solo
Segundo Neptune & Muraoka (1978a) foram McAuliffe e colaboradores em 1948 que
pela primeira vez determinaram o que foi chamado de “fósforo de superfície” ou “fósforo
isotopicamente trocável”, também conhecido como “Valor E”, tirada da primeira letra da
palavra “exchangeable”. Segundo os mesmos autores o “Valor E” , é de natureza físicoquímica e em 1952, Larsen introduziu o componente biológico na determinação e mudou o
nome para “Valor L”. Mais tarde Fried & Dean em 1952 desenvolveram o conceito de “Valor
A”, que tem por objetivo determinar a quantidade no solo de um nutriente em termos de uma
fonte deste mesmo nutriente como referência.
Os métodos de diluição isotópica para avaliar a disponibilidade de nutrientes do solo
estão descritos a seguir (Muraoka, 1991).
a) Valor E. É a medida de quantidade de um nutriente, na superfície e na solução do
solo, que é tocável com um íon quimicamente idêntico adicionado na solução. Note-se que
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
21
esta determinação, pela adição de íon quimicamente idêntico, só é possível com o uso de
isótopo radioativo ou estável.
Determina-se o valor E agitando-se porção de solo, exemplificando para o fósforo,
com uma solução de fósforo com determinada atividade específica de
32
P por um tempo (t),
ao final do qual analisando o P e 32P, tem-se:
Valor E  x(
So
 1)
Sf
onde x= quantidade de P adicionada; So= atividade específica inicial 32P/31P da solução, Sf=
atividade específica 32P/31P ao final do tempo t.
A grande vantagem desse método, em relação aos métodos com extratores químicos, é
a utilização do próprio elemento em estudo, no caso exemplificado o próprio fósforo, sem a
introdução de soluções salinas, complexantes ou ácidas.
b) Valor L. Define-se como a quantidade de determinado nutriente no solo e na
solução do solo que é trocável com íon quimicamente idêntico adicionado, medida através de
absorção deste nutriente por uma planta. A equação do valor L é idêntica a do valor E, sendo
a mesma equação básica da diluição isotópica.
Valor L  x (
So
1)
Sf
A única diferença seria a substituição da agitação do solo com solução radioativa por
desenvolvimento de uma planta teste e ao final a análise do P e 32P na planta. O Sf, portanto,
seria a atividade específica 32P/31P medida na planta.
Quando, porém, o valor E é medido usando-se uma espécie vegetal que tenha semente
grande, deve-se descontar a contribuição do P da semente na planta. A equação, então, seria:
Valor L 
L ( x t  Z)
x
Yt
onde, o Y = atividade de 32P adicionada; Yt= atividade de 32P na planta; x a quantidade de 31P
adicionada; xt= quantidade de 31P na planta e Z = é a quantidade do P da semente que migrou
para a planta.
c)Valor A. É a quantidade de um determinado nutriente disponível do solo medida
através da adição de um fertilizante marcado e expressa em termo de quantidade do
fertilizante utilizado. Assim, por exemplo, se o valor A é determinado usando-se superfosfato
triplo marcado com 32P, tem-se:
ValorA  B
(1  Y)
Y
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 22
FERTBIO 2004
onde A= valor A, cuja unidade seria (mg P/g de solo na forma de superfosfato triplo) B=
quantidade de P adicionada (mg P/g solo) e Y= proporção do nutriente na planta proveniente
do fertilizante. O Y (P na planta proveniente do fertilizante) é determinado pela equação:
Y
Atividade específica 32 P / 31 P da planta
x 100
Atividade específica 32 P / 31 P do fertilizan te
A partir dos estudos pioneiros citados por Muraoka (1981) e do primeiro estudo feito
no Brasil por Neptune (1964) vários trabalhos se seguiram sob a orientação deste último autor
(Morales Morales, 1981; Carmello, 1980), demonstrando-se haver inúmeras complicações nas
determinações dos valores “E”, “L” e “A”.
A técnica do valor A permite também a avaliação de fontes de fertilizantes menos
solúveis, como fosfatos naturais, que não permitem a sua marcação com 32P, através do uso de
uma fonte solúvel, como superfosfato triplo marcado. Luca (1997), Luca et al. (2002) e
Alvarez (2004) observaram que cultivares de eucalipto ou eucalipto em relação ao arroz
apresentaram diferenças quanto à capacidade de absorção do fósforo de fosfatos mono, bi e
tricálcico.
Uma grande utilidade dos radioisótopos é na avaliação dos extratores de nutrientes do
solo. Muraoka (1981) introduziu o uso da razão entre a atividade específica do
65
Zn e 54Mn
na planta e das soluções extratoras, possibilitando estabelecer aquele que melhor avaliava a
disponibilidade destes micronutrientes para o feijoeiro. Assim, o DTPA e o EDTA + CaCl2,
ambos modificados quanto ao pH da solução, foram os melhores para a avaliação da
disponibilidade de zinco para o feijoeiro e o CaCl2 0,5 mol/L foi o que melhor estimou a
disponibilidade de Mn, sendo que o DTPA não deu resultado satisfatório em alguns solos.
A técnica isotópica para estudar os mecanismos envolvidos na adsorção e liberação do
sulfato em solos de São Paulo foi empregada por Aloisi (1976). Num desses estudos foram
determinados isotermas de adsorção de sulfato pelos solos, empregando na solução de
equilíbrio
35
S-SO4. Entretanto, a solução marcada com
35
S em contato com as partículas do
solo, os íons SO 24  foram adsorvidos e como conseqüência houve diminuição da atividade
específica da solução, que foi proporcional a quantidade do ânion adsorvido. As contagens
foram então transformadas em g S adsorvido/g de solo, como apresentado na Figura 4.
Roque (2003) utilizou a técnica isotópica para estudar a adsorção de 137Cs em solos de
regiões tropicais.
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
Figura
4.
Isotermas
23
de
Langmuir de absorção de
enxofre nos vários solos.
3.2.3 Recuperação pelas culturas de nutrientes aplicados como fertilizantes
Apesar de haver na literatura internacional muitos trabalhos de recuperação pelas
culturas de nutrientes aplicados no solo como fertilizantes, empregando-se isótopos
radioativos, na literatura nacional são pouquíssimos. A técnica tradicional empregada é o
método da diferença, ou seja, a quantidade do nutriente proveniente do fertilizante aplicado é
determinada pela diferença entre as parcelas que receberam o fertilizante contendo o nutriente
em estudo e a parcela testemunha. Entretanto se sabe que quando o fertilizante é aplicado no
solo há maior ou menor absorção de nutriente nativo do solo, já que pode haver maior ou
menor desenvolvimento radicular que explora maior ou menor volume de solo.
Consequentemente o método da diferença sub ou superestima a quantidade recuperada do
nutriente na planta que veio do fertilizante.
Para exemplificar é dado um exemplo tirado de Boaretto et al. (1985). Neste estudo,
entre outros objetivos, procurava-se determinar a influência das fontes de nitrogênio e modo
de aplicação do adubo fosfatado sobre a utilização do fósforo do superfosfato simples (SS)
pelo trigo. Para tanto os autores aplicaram SS marcado com
32
P em uma linha da parcela
experimental. Os tratamentos utilizados encontram-se na Tabela 4.
Pelos resultados
apresentados na Tabela 5 verifica-se que o método da diferença superestima a contribuição do
solo em fornecer fósforo e consequentemente dá resultado inferior ao método isotópico
tomado com referência. Trabalho semelhante foi realizado por Muraoka (1983) obtendo
valores de recuperação do
aplicado.
32
P do superfosfato triplo pelo trigo na faixa de 3 a 4% do total
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 24
FERTBIO 2004
Tabela 4. Fósforo total na parte aérea do trigo e matéria seca produzida (Boaretto et al., 1985).
Tratamentos
Fontes de N
Modo de Aplicação*
(1)
(2)
120 kg N ha-1
32
Nitrato de amônio
Uréia
Sulfato de amônio
Uréia
Uréia
30
30
30
-
P total parte aérea
P, kg ha-1 **
30
-
Matéria seca
%
g/0,60m2
0,14
0,27
0,25
0,25
0,25
187
180
154
216
118
*(1) o 32P na forma de superfosfato simples foi aplicado juntamente com o N do plantio, ou
seja, 5 cm ao lado e 2 cm abaixo da semente; (2) o 32P foi aplicado juntamente com a semente
** corresponde a 1800 mg P/0,60m2
Tabela 5. Recuperação do fósforo do superfosfato simples pelo trigo (Boaretto et al., 1985).
Tratamento
32
P
P-total
32
P
Pppf *
UP**
1
%
1
2
3
4
5
0,12
0,14
0,15
0,16
-
P, mg/0,60m2
452
459
380
539
295
2
------------------%----------------217
254
232
348
-
50
53
62
65
-
9
10
5
14
-
12
14
13
19
-
* Fósforo na planta proveniente do fertilizante
** Utilização do fósforo do fertilizante 1= Método da diferença; 2= empregando-se a técnica
isotópica
3.2.4. Localização do adubo
O primeiro experimento de localização de adubo realizado no Brasil, empregando-se
isótopos radioativos foi feito por Malavolta & Neptune (1959).
Estudaram os autores
diferentes localizações de Ca(H232PO4)2 em cafeeiro de 1,5 anos de idade, plantado em
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
25
“Terra roxa misturada”, pois desejavam saber qual era a melhor localização ou método de
aplicação do adubo fosfatado que possibilitava a maior recuperação de fósforo pelo cafeeiro.
Os tratamentos encontram-se na Tabela 6. Um mês após a aplicação do fertilizante, colheram
o primeiro e o segundo pares de folhas do segundo ramo (a contar da ponta), que eram folhas
formadas após a aplicação do adubo. Estas foram secas, incineradas e a seguir determinou-se
P-total pelo método do vanadato e em alíquotas determinaram-se às contagens. Os resultados
estão na Tabela 6, os quais não seriam possíveis sem o uso da técnica isotópica.
Tabela 6. Efeito dos modos de aplicação do superfosfato na absorção de fósforo pelo cafeeiro
(Malavolta e Neptune, 1959).
Tratamentos*
cpm/mg P
% Pfpf**
Cobertura
488
10,2
Coroa
465
2,4
83
1,7
1813
38,8
Semicírculo
Pulverização foliar
*Cobertura= em faixa circular e superficial com 25 cm de largura e cuja margem externa
passava 5 cm da copa.
Coroa= em volta do “pé de café”, a coroa tinha 17,5 cm de largura e 15 cm de
profundidade.
Semicírculo= em sulco semicircular com as características semelhantes às da coroa.
Pulverização foliar= foram feitas três pulverizações usando-se cada uma 50 g de
superfosfato marcado, dissolvido em dois litros de água
**%Pfpf= Percentagem do fósforo na folha amostrada proveniente do fertilizante
3.2.5 Absorção de nutrientes pelas raízes
Outro aspecto de nutrição mineral de plantas na qual a técnica isotópica pode ser
empregada é o estudo da absorção de nutrientes pelas raízes e os fatores que a influencia. Por
exemplo no trabalho de Arzolla et al. (1962) objetivava-se verificar se havia influência de
outros micronutrientes sobre a absorção de zinco por raízes de cafeeiro. Como as quantidades
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 26
FERTBIO 2004
de zinco a serem determinadas eram muito pequenas, os autores empregaram o
65
Zn. O
nutriente radioativo foi aplicado em solução nutritiva, onde se cultivaram mudas de café. As
soluções nutritivas continham concentrações diferentes dos micronutrientes Fe, Mn, Cu e Mo,
como pode ser visto na Tabela 7.A percentagem de contagens recuperada (%com recuperada)
corresponde à quantidade de zinco absorvido da solução nutritiva pelo cafeeiro.
A técnica isotópica foi usada também para demonstrar ao efeito de inibição
competitiva entre Mg e Zn e entre Mg e o Mn na absorção por raízes de soja dos
macronutrientes citados (Moreira, 1999).
Outros exemplos semelhantes podem ser obtidos em Crocomo e Malavolta (1964) que
empregaram 32P e Castellane (1985) empregando o 45Ca.
Tabela 7. Efeito do Fe, Mn, Cu e Mo, na solução nutritiva sobre a absorção de
65
Zn (Arzolla
et al., 1962).
Tratamentos
% cpm raiz
Recuperação (65Zn) parte aérea
Testemunha(1)
4,40
0,63
-Fe
5,10
0,53
+ 10 ppm Fe
4,10
0,36
-Mn
4,50
0,70
+ 10 ppm Mn
2,10
1,20
-Cu
5,80
1,06
+ 10 ppm Cu
1,50
0,60
-Mo
4,20
0,76
+ 10 ppm Mo
1,30
1,60
(1) Todos os macronutrientes +0,05 ppm Zn + 1 ppm Fe + 0,5 ppm Mn + 0,02 ppm
Cu + 0,01 ppm Mo.
3.2.6 Translocação de nutrientes na planta
Um exemplo bastante interessante de utilização de isótopos em estudos de
translocação de nutrientes foi feito por Dias et al (1987). Os autores desejavam saber como se
dava a translocação de fósforo absorvido pelas raízes, ou seja, para que parte da planta iria o
fósforo absorvido da solução nutritiva. Para atingir o objetivo necessitaram usar o
32
P para
distinguir o fósforo absorvido do fósforo já existente na planta, inicialmente cultivaram
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
27
mudas de cafeeiro em solução nutritiva completa, até eu estas tivessem de 8 a 11 pares e
folhas. Em vasos geminados, conforme figura 4, partes das raízes foram colocadas numa
solução que continha Na2H32PO4 com atividade específica conhecida e parte do sistema
radicular em solução contendo Na2HPO4. Após um período determinado (36 horas) as plantas
foram colhidas e as folhas foram separadas, de acordo com a filotaxia do cafeeiro, em quatro
posições básicas (Figura 4). A seguir as diferentes folhas e o restante da parte aérea e as
raízes foram secas e montadas sobre uma placa de isopor. Por meio de um contador GM,
foram efetuadas contagens da atividade radioativa. Os resultados foram a seguir tabulados
(Tabela 8) e pode-se constatar uma alternância de folhas com maior atividade, o que indica
nítida compartimentalização do fósforo absorvido.
Outros exemplos de estudos de absorção e translocação de nutrientes na planta,
empregando-se os isótopos radioativos podem ser encontrados em Muraoka (1981) para 65Zn
e 54Mn; Suhet (1976) para 59Fe e 65Zn, além de outros.
3.2.7 Estudos de adubação foliar
Em revisão bibliográfica Muraoka & Boaretto (1989) levantaram os aspectos de
adubação foliar que podem ser estudados através do uso de isótopos. Entre estes os mais
estudados, empregando-se a citada metodologia, estão a eficiência do adubo aplicado via
foliar, translocação dos nutrientes aplicados via foliar, fontes de nutrientes e época de
aplicação do adubo foliar.
São dados a seguir alguns exemplos de trabalhos desenvolvidos no Brasil nesta área.
Assim Sarruge et al. (1966) demonstraram que o fósforo aplicado nas folhas do cafeeiro (0,1
Ci/planta) é rapidamente absorvido (35% do fósforo aplicado é absorvido duas horas após a
aplicação) e a sua translocação para as outras partes da planta se inicia rapidamente após
absorção (Figura 5).
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 28
FERTBIO 2004
Figura 4. Esquema de uma planta de café
padrão, usada no experimento, destacando-se
as diferentes posições de cada folha. (Dias et
al., 1987).
32
P
Tabela 8. Atividade radioisotópica (cpm cm-2) observada nas folhas de diferentes posições da
planta nde cafeeiro (Dias et al., 1987).
FOLHAS
No
A
B
C
D
1
37
-
34
-
2
-
27
-
113
3
60
-
31
-
4
-
28
-
61
5
210
-
45
-
6
-
27
-
175
7
619
-
44
-
8
-
318
-
815
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
29
Figura 5. Absorção e translocação do
32
P aplicado nas folhas do cafeeiro
(Sarruge et al., 1966).
Outro exemplo foi relatado em Boaretto & Muraoka (1987) que empregaram o 32P em
adubação foliar de cana de açúcar. Neste caso o uso da técnica isotópica foi necessário
porque a quantidade de fósforo aplicada em relação à quantidade de fósforo já existente na
planta era muito pequena, sendo praticamente impossível detectar pela análise química
convencional. Aplicaram uma dose correspondente a 50 litros/ha da fórmula líquida 22-11-0
(N-P2O5-K2O) contendo 20% de melaço de cana e desejava-se saber se o fósforo era
absorvido pelas folhas e se translocava para as outras partes da planta. As alíquotas da
fórmula que foi preparada com H332PO4 e que continham 5 Ci/ml, foram pinceladas nas
folhas de cana de açúcar. Estas foram colhidas em intervalos de tempo, separadas em várias
partes que foram em seguida secas. Seguiram-se as análises convencionais de laboratório para
determinar o P-total e alíquotas dos extratos foram analisadas por cintilação líquida para se
determinar à atividade, possibilitando assim separar do P total o 32P proveniente do adubo. Os
resultados mostraram que dois dias após a aplicação o adubo nas folhas, mais de 50%do
fósforo aplicado havia sido absorvido e a translocação do P das folhas que receberam o
adubo para as outras partes da planta chegou a ser 50% da quantidade absorvida aos 30 dias.
Outros exemplos destes estudos podem ser vistos em Boaretto et al (1986) para o 32P e
35
S, Crocomo & Neptune (1961) para o 35S, além de outros.
Em fruteiras a técnica isotópica também tem sido usada para verificar a absorção foliar
e a translocação na planta, como os resultados tirado de Natale (1999). O fósforo foi aplicado
nas folhas de goiabeira na forma de monoamônio fosfato a 2% (p/v), com atividade específica
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 30
FERTBIO 2004
de 0,15 Ci ml-1, com o objetivo de acompanhar a absorção foliar e a translocação deste
nutriente. As folhas que receberam a adubação foliar foram lavadas com água destilada para
retirar todo o fósforo que não tinha sido absorvido e permanecia na superfície das folhas. Pela
análise do teor foliar de P total não foi possível constatar variações nos diferentes órgãos da
planta, num período de 30 dias. Pela técnica isotópica constatou-se que o fósforo é pouco
absorvido pelas folhas, chegando a um máximo ao redor de 10% após 15 dias da aplicação. A
translocação do fósforo absorvido é muito pequena, pois aproximadamente 90% do mesmo
permaneceu nas folhas que receberam a adubação foliar.
A metodologia isotópica foi usada também para esclarecer uma polêmica existente
sobre a absorção e translocação do cálcio aplicado via foliar. Ficou esclarecido que o cálcio é
rapidamente absorvido pelas folhas, mas não se transloca, conforme resultados apresentados
na Figura 6, tirada de Boaretto et al. (1983).
Também Cruz (1973) empregando
45
Ca demonstrou que as presenças de cloreto de
potássio e ácido bórico em baixas concentrações (10-4M e 5 . 10-3M respectivamente) na
solução aplicada nas folhas estimularam a absorção de 45Ca pelas folhas e que a presença de
cloreto de magnésio (5.10-3M) na solução inibiu a absorção foliar do nutriente estudado.
Estudos bastante interessantes foram feitos por Malavolta et al. (1959) e Crocomo
(1959) empregando uréia marcada com 14C para se saber o destino da uréia após ser absorvida
pela folha. Para tanto pincelou-se folhas de cafeeiro com uma solução contendo 3% de
14
CO(NH2)2, aplicando-se a atividade de 9,5.106 cpm/planta. Colheram-se folhas do cafeeiro e
procedeu-se a separação dos aminoácidos e açúcares por metodologia apropriada. Alíquotas
de soluções contendo essas substâncias isoladas foram usadas para se determinar à radiação
emitida pelo
14
C. Entre outras conclusões verificaram os autores que 40% do
14
C original
perdeu-se na forma de CO2 e que os aminoácidos marcados com 14C foram: ácido glutâmico,
serina, treonina, lisina, alanina, citrolina, além de outros aminoácidos. Verificaram ainda que
a translocação do
planta.
14
C da uréia é bastante limitada e é dirigida para as partes mas novas da
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
31
Figura 6. Curvas de absorção de 45Ca pela folha em função do tempo (Boaretto et al., 1983).
Há também na literatura vários estudos de adubação foliar empregando-se isótopos de
micronutrientes, como por exemplo Malavolta et al. (1959) empregando o 65Zn. Entretanto, é
tomado aqui como exemplo o trabalho de Blanco (1970), que tinha como objetivo estudar os
fatores que influem na absorção foliar do Zn. Com o uso de 65Zn foi possível determinar que
a absorção do nutriente pela folha do cafeeiro é bastante rápida e é influenciada pela luz, por
inibidores do processo respiratório, pela temperatura, pelo pH da solução aplicada sobre as
folhas, pela presença de B, Cu e de compostos orgânicos na solução pulverizada. A Figura 7
mostra parte dos resultados de Blanco (1970).
3.2.8 Estudos do sistema radicular
Em estudos de nutrição mineral, fertilidade do solo e fertilizantes é necessário, muitas
vezes, ter informações sobre o desenvolvimento e distribuição do sistema radicular dos
vegetais, pois as quantidades de nutrientes e água absorvidos pelas raízes estão na
dependência da sua extensão, distribuição e atividade das mesmas, que sofrem influências das
condições físicas e químicas do solo. Entre os métodos de estudo do sistema radicular estão: a
colheita de amostras do solo e raízes por meio de sondas, a colheita de monólitos cm as raízes
e também o emprego de radioisótopos.
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 32
FERTBIO 2004
1
2
3
4
Figura 7. Absorção de Zn em
presença de compostos orgânicos.
Os pontos são médias de três
repetições. (Blanco, 1970).
Um dos aspectos desses métodos que não o isotópico, é o trabalho necessário para a
coleta e separação das raízes das amostras, mas tem como vantagem, possibilitar o
levantamento de todo o sistema radicular, num volume de solo. Quando se emprega o método
isotópico, usando principalmente o
32
P, o que se obtém é um resultado relativo da atividade
das raízes. A título de exemplo cita-se o trabalho de Avilan Rovira (1975) que realizou um
estudo sobre a influência da adubação no desenvolvimento e distribuição do sistema radicular
do cafeeiro, utilizando e comparando os três métodos acima citados. Foram retirados 320
monolitos de 10 cm de largura por 15 cm de comprimento, e a altura em função dos
horizontes do perfil. As raízes do solo foram separadas com auxílio de jatos de água, e
posteriormente secas e pesadas. Como resultado o autor obteve o peso de raízes em cada
volume de solo. No método da sonda o solo foi amostrado a diferentes profundidades e
distâncias da planta, sendo feita em seguida à separação das raízes do solo com jatos de água.
O resultado obtido forneceu o peso de raízes nos diferentes volumes de solo. No emprego do
método isotópico foram feitos furos no solo a diferentes distâncias das plantas e para cada
distância fez-se o furo a diferentes profundidades, e nestes furos foi aplicada a solução
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
contendo
33
32
P. Após transcorrer certo tempo procedeu-se a coleta da parte aérea do feijoeiro
que foi seca e preparada para a determinação da atividade radioativa (contagem) por
cintilação líquida. A distância do tronco e a profundidade da amostra que possibilitou maiores
contagens na parte aérea da planta corresponde ao local de maior concentração de raízes
ativas. Entretanto, há inúmeras complicações no uso da técnica isotópica em estudo de
sistema radicular devendo ainda a metodologia ser melhor pesquisada, para depois ser
empregada.
3.2.9 Estudos de adubação verde e restos de cultivo com fonte de nutrientes
O uso de técnica da diluição isotópica através de marcação de plantas que servirão de
adubos verdes com isótopos dos nutrientes de interesse, permite uma clara visão da dinâmica
desses nutrientes no sistema adubo verde (ou restos culturais) – solo-cultura subseqüente,
fornecendo informações como capacidade de fornecimento de nutrientes, taxa de
mineralização, dinâmica dos nutrientes dos adubos verdes e restos culturais no solo, etc.
A maioria dos trabalhos, nesta área tem sido realizados em 15N (isótopo estável) e 35S,
isótopo radioativo de enxofre, que apresenta característica bastante adequada para o tipo de
estudo (meia vida de 87 dias e emissão - de baixa energia).
Abreu Jr (1993) marcou plantas de arroz, soja, feijão e milho com
35
S para estudar a
dinâmica do enxofre após a incorporação desses materiais vegetais no solo por períodos de até
196 dias e a sua utilização por feijoeiro usado como planta teste plantado a seguir. O enxofre
proveniente da mineralização do material vegetal de feijoeiro incorporado contribui com 12 a
25% do S total absorvido pela planta teste, o arroz com 12 a 22%; a soja com 11 a 18% e o
milho, 7 a 11%. Em termo de aproveitamento do S dos materiais vegetais, para as plantas de
feijão foi de 10 a 21%; 7 a 16% para o arroz; 6 a 13% para a soja e 3 a 7% para o milho.
Ribeiro (1996) estudando os adubos verdes mucuna preta e pueraria (Pueraria
phaseoloides) como fonte de S para a cultura de arroz em solos da Amazônia, observou que a
contribuição dos adubos verdes não passou de 8%.
Scivittaro (1998) também observou que a contribuição da mucuna preta com fonte de
enxofre em milho era pequena, não passando de 7% do nutriente acumulado na parte aérea,
tendo o aproveitamento sido baixo, não ultrapassando 6% do total do S contido no material
incorporado. Ela atribuiu esse baixo aproveitamento pelo elevado conteúdo do S disponível
no solo (147 mg kg-1), além das prováveis perdas.
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 34
FERTBIO 2004
Tziboy (1998) comparando três espécies de leguminosas para adubação verde como
fonte de enxofre, usando
35
S observou que maiores quantidades de S da planta de arroz era
proveniente de sesbania em relação a crotalaria e mucuna preta.
Recentemente Marsola (2003) realizou um trabalho inédito com
32
P, demonstrando
que a incubação prolongada de “adubo verde” acaba disponibilizando menos fósforo. O arroz
pode usar mais fósforo da crotalaria incubado entre 15 e 30 dias do que por 60 dias.
3.2.10 Avaliação quanto a eficiência das plantas em absorver nutrientes menos
disponíveis do solo.
A grande vantagem da técnica isotópica na avaliação da capacidade de espécies
vegetais ou na comparação de genótipos de uma cultura quanto à absorção de nutrientes na
forma menos disponível do solo é a necessidade de curto espaço de tempo necessário.
A técnica consiste em marcar o solo, por exemplo com o
32
P, e cultivar espécies
vegetais ou genótipos de uma determinada cultura, determinando a atividade específica
32
P/31P após um período de cerca de um mês de desenvolvimento. Assim, espécies (ou
genótipos) com maior atividade específica absorvem mais P proveniente da fonte disponível,
sendo portanto menos eficiente e vice versa.
Fernandes & Muraoka (2002) avaliaram 30 híbridos de milho com essa técnica,
separando-as quanto à capacidade de absorção de P. Da mesma forma, Raposo(2003) avaliou
diversos cultivares de soja.
3.2.11 Estudos de contaminação por metais pesados
Atualmente, com a preocupação com o meio ambiente, percebe-se um aumento das
pesquisas de contaminação do ambiente por metais pesados contidos em adubos e outros
materiais que são reciclados pela aplicação em solos agrícolas. A técnica isotópica, neste
caso, pode ser vantajosa porque exige a aplicação de pequenas quantidade do metal pesado,
não alterando de modo significativo a concentração do metal pesado no ambiente. No Centro
de Energia Nuclear na Agricultura está em andamento projetos em que a contaminação
ambiental por metais pesados é preocupante, usando-se nestes estudos os seguintes
radionuclídeos: 109Cd, 210Pb,
65
Zn, e 63Ni. Um exemplo de trabalhos nesta linha pode ser
visto em Trevizam et al. (2004).
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
35
4. USO DE ISÓTOPOS ESTÁVEIS
4.1 Visão Geral
A descoberta dos isótopos estáveis e as primeiras determinações de suas concentrações
na natureza ocorreram durante o primeiro terço do século XX, mas somente nos últimos 50
anos, após a segunda guerra mundial, é que a utilização destes em pesquisas aplicadas tornouse mais efetiva. As primeiras linhas de pesquisa com aplicações de isótopos estáveis foram
relacionados com os fracionamentos isotópicos que ocorrem a natureza, principalmente com
isótopos de H e O, definindo-se dois campos em que a aplicação da técnica com variações
naturais de isótopos estáveis eram favoráveis: hidrogeologia e geoquímica. Paulatinamente a
utilização dos isótopos estáveis foi difundido a outros campos de pesquisa, como a
agronômica, fazendo-se uso principalmente de compostos enriquecidos (Matsui, 1981).
O uso de isótopos estáveis em pesquisa foi influenciado pelo desenvolvimento de
técnicas de medidas para isótopos estáveis, principalmente a espectrometria de massas,
associado a oferta de variedade de compostos químicos marcados com isótopos pesados,
decorrentes dos avanços conseguidos com métodos de enriquecimento isotópico
(fracionamento isotópico) principalmente para os elementos H, C, N e O.
A grande vantagem dos isótopos estáveis reside no fato de tratarem-se de traçadores
não radioativos e por essa razão os experimentos não são limitados pelo tempo por não haver
decaimento radioativo; o material em estudo não é exposto à radiação; nenhuma medida de
segurança contra radiações é necessário, e consequentemente não há contaminação do
material em estudo. Por outro lado, comparado os radiotraçadores, os isótopos estáveis,
apresentam como desvantagens: o custo de compostos marcados em relação àqueles com
radioisótopos, além das técnicas analíticas para radioisótopo possuirem maior sensibilidade,
ou seja, menores quantidades podem ser detectadas com radioisótopos (Hauck e Bremner,
1976). Dos isótopos estáveis nutrientes de plantas relacionados na Tabela 1, o 15N é o que tem
sido mais utilizado em estudos agronômicos.
O Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA-USP), em Piracicaba, Estado de
São Paulo, vem desenvolvendo há quarenta anos, estudos em Ciência do Solo com isótopos
estáveis de elementos leves, em especial com os isótopos estáveis de nitrogênio (15N e
14
N).
No início, para a realização de pesquisas com o isótopo pesado de nitrogênio, surgiram
dificuldades com a aquisição de compostos marcados no isótopo, os quais só podiam ser
adquiridos no exterior e a preços elevados. No princípio dos anos setentas, o CENA já
dispunha de espectrômetro de massas para realizar as determinações da razão isotópica de
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 36
FERTBIO 2004
nitrogênio (15N /14N), e seus pesquisadores tinham o domínio das técnicas de preparo de
amostras para análise de
15
N (Trivelin et al., 1973). Nessa época, deu-se início ao
desenvolvimento de métodos para obtenção de compostos enriquecidos no isótopo pesado de
nitrogênio. Na segunda metade dos anos setentas, o CENA já dispunha de tecnologia para
produzir pequenas quantidades do composto sulfato de amônio marcado com 5% em átomos
de 15N, por cromatografia de troca iônica em colunas de resina (Trivelin, 1976, Trivelin et al.,
1979a,b). Atualmente, o CENA é detentor de tecnologias para produzir altos enriquecimentos
no isótopo
15
N (Máximo, 1998); tecnologia de enriquecimento por cromatografia de troca
aniônica de 10B (Carneiro Júnior et al., 1994) e de
34
S (Bendassolli, 1994; Bendassolli et al.,
1997; Máximo, 2002); tecnologias de síntese de compostos, como: amônia anidra-15N
(Bendassolli et al., 1988a; Bendassolli et al., 2002), uréia-15N (Bendassolli et al., 1988b),
solução nitrogenada uran-15N (Bendassolli et al., 1989); aquamônia-15N (Bendassolli &
Trivelin, 1991; Bendassolli et al., 2002), sulfato de amônio-15N (Bendassolli et al., 1992;
Máximo, 1998), sulfato de amônio, duplamente marcado com
15
Ne
34
S (Máximo, 2002) e
sulfato de cálcio-34S (Ressette, 2002) para uso em pesquisas. O processo de obtenção de altos
enriquecimentos de sais de amônio com
15
N foi patenteado em 2002: PI 0201577-3:
J.A.Bendassolli; E. Máximo; P.C.O.Trivelin. A marcação com
15
N, assim como com
34
S, de
material de interesse na pesquisa agronômica, como a vinhaça-15N (Lara Cabezas, 1991; Lara
Cabezas et al., 1991) e leguminosas adubos verdes-15N (Ambrosano et al., 1997 e Ambrosano
et al., 2003) continua sendo objeto de desenvolvimento no CENA/USP.
4.2 Uso do 15N
Dos isótopos conhecidos de nitrogênio somente os de número de massas 14 e 15 são
estáveis e os demais de ocorrência natural (Tabela 9). O isótopo de massa 13, que possui meia
vida mais longa (aproximadamente 10 minutos) entre os demais radioisótopos, tem sua
utilização como traçador limitada a ensaios de curta duração, além da necessidade para sua
produção como um ciclotron e sofisticados aparelhos para purificação e detecção.
Os
isótopos estáveis de nitrogênio tem sido utilizados, quase que exclusivamente como
traçadores há mais de 50 anos em estudos dos diferentes aspectos do ciclo do nitrogênio. O
uso dos isótopos estáveis de N como traçador é baseado no fato que
14
N e
15
N ocorrem
naturalmente numa razão quase constante de 273:1 átomos (0,3663 % em átomos de
3,663 ppm de
15
N).
15
N ou
Compostos nitrogenados com proporções diferentes daquela de
ocorrência natural podem ser usados como traçadores.
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
37
Tabela 9. Isótopos de nitrogênio
Isótopo
Abundância
Tipo de desintegração
Meia vida
+
+
estável
estável
-
0,011s
9,97 m
12
N
N
14
N
15
N
16
N
17
N
18
N
19
N
13
99,634
0,366
7,13 s
4,17 s
0,02 s
0,32 s
Fonte: Heat (1973)
O método do traçador isotópico para N possibilita quantificar as taxas de transferência
do nutriente nos diferentes compartimentos do sistema, podendo ser empregado em estudos
em que as técnicas clássicas não são insuficientes para o perfeito entendimento e
quantificação de processos no ciclo do N. Seu uso em diferentes áreas da ciência, em especial
na Agronomia, em Ciência do Solo, tem aumentado de modo marcante em todo o mundo. Em
nosso país, o uso do 15N como traçador ainda está restrito a algumas instituições de pesquisa,
em vista do custo analítico, de dificuldades instrumentais para análise de
15
N, do preço de
compostos contendo o isótopo e, até mesmo, da falta de pessoal especializado na elaboração
projetos e interpretação de resultados de experimentos com o uso do isótopo estável.
O uso da técnica de traçador para nitrogênio na área agronômica tem aumentado
significativamente não só no exterior como também no Brasil. Até 1970, Hauck e Bystron
(1970) selecionaram mais de 1000 trabalhos sobre o uso de
15
N, até então publicados na
Europa e América do Norte, grande parte relacionados à pesquisa agronômica. Faust (1981)
relacionou mais de 10.000 trabalhos publicados em todo o mundo fazendo uso de
15
N, entre
1978 a 1980, já aparecendo muitos trabalhos realizados no CENA/Piracicaba-SP, Brasil.
Atualmente, diversas instituições e órgãos de pesquisa do país fazem uso da técnica isotópica
para nitrogênio, em várias áreas do conhecimento.
A seguir são apresentados tópicos de estudos com uso do traçador isotópico para
nitrogênio, com ênfase às pesquisas desenvolvidas no país e no CENA-USP.
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 38
FERTBIO 2004
4.2.1 Aproveitamento do nitrogênio de fertilizantes
A avaliação do aproveitamento pelas culturas do N aplicado como fertilizante revestese, de grande importância, uma vez que é reconhecida a necessidade de aumentar a
produtividade agrícola, sem encarecer o produto, com o uso de adubos e outras práticas. A
técnica com o isótopo
15
N tem se mostrado muito útil em estudos que visam procurar
alternativas para aumentar a eficiência do uso de fertilizantes nitrogenados.
Estudos de avaliação do aproveitamento por culturas de N-fertilizantes são realizados
comparando-se os rendimentos obtidos de colheitas em diferentes condições de fertilização.
Por esse método nenhuma informação é obtida da quantidade de nutriente absorvido pela
cultura.
Outro método é o da diferença que relaciona as quantidades de nutrientes
acumulados pela cultura com e sem fertilização (testemunha). Os métodos acima citados
estão sujeitos a erros e normalmente superestimam a utilização de fertilizantes, por não
considerar as reações de imobilização e mineralização do nitrogênio que ocorrem no solo e o
efeito de maior desenvolvimento do sistema radicular da cultura, explorando maior volume de
solo nos tratamentos com adição de N-mineral (Jansson e Persson, 1982). O método da
diferença apresenta como condição básica que a quantidade de nutriente absorvido pelo
tratamento testemunha representa aquela absorvida do N-nativo do solo por tratamentos com
fertilizante nitrogenado.
A técnica isotópica constitui outra forma de avaliação do aproveitamento por culturas
de nutrientes aplicados no solo, mediante o uso de fertilizantes isotopicamente marcados. Ela
consiste na quantificação direta do aproveitamento por culturas do nutriente aplicado ao solo,
sem a necessidade de tratamento testemunha. A grande vantagem do uso da técnica de
15
N
reside na possibilidade de se determinar a utilização antes de se obter os dados de produção,
ou mesmo quanto na há diferença nas produções entre os tratamentos. Para se determinar a
quantidade do N na planta proveniente do fertilizante (NPPF) e do N nativo do solo (NPPS),
utilizam-se das equações 15 e 20, apresentadas anteriormente.
A eficiência de uso do fertilizante (EUF) pela cultura, hoje melhor denominada de
aproveitamento pela cultura ou recuperação percentual do N do fertilizante (R), é calculada
pela equação 21, também apresentada anteriormente
No Brasil, a técnica com 15N foi utilizada na determinação do aproveitamento do N de
fertilizantes de culturas de interesse, destacando-se: arroz (Aquino, 1984; Colaço, 1988; Fiore,
1989); cana de açúcar (Ruschel, et al., 1977; Sampaio et al., 1984; Trivelin et al., 1985;
Bittencourt et al, 1986; Trivelin et al., 1986; Sampaio et al., 1987; Trivelin et al., 1987a;
Trivelin et al., 1987b; Sampaio et al., 1988; Trivelin et al., 1988; Carnaúba, 1989; Camargo,
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
39
1990; Oliveira, 1999; Trivelin et al., 1995; Trivelin et al. 1996; Trivelin et al., 2002b, entre
outros); feijoeiro (Neptune e Muraoka 1978a; Libardi & Reichardt, 1978; Meirelles et al.,
1980; Libardi et al., 1982; Ruschel et al., 1982; Hungria et al., 1985; Daghlian, 1986 entre
outros); milho (Neptune, 1977; Reichardt et al., 1979; Calvache et al., 1982; Libardi, 1984;
Flores, 1986; Coelho, 1978; Villas Boas, 1995; Lara Cabezas et al., 2000; Scivittarro et al.,
2000 entre outros); soja (Ruschel et al, 1979b; Santiago, 1989; Mascarenhas et al., 2000);
trigo (Muraoka, 1973; Spolidorio, 1999 entre outros); laranjeira (Boaretto et al., 1999ab;
Fenilli, 2002 e Mattos et al., 2003).
Para exemplificar a utilidade da técnica de traçador com
15
N em estudos de
aproveitamento por culturas do nitrogênio, a seguir, serão discutidos trabalhos de fertilização
nitrogenada com as culturas cana-de-açúcar, milho em semeadura direta e em laranjeira.
Procurar-se-á demonstrar como o uso do
15
N vem tornando mais claro o entendimento da
dinâmica do nutriente em diferentes agrossistemas, possibilitando a adoção de tecnologias
alternativas, ou mesmo, modificando a forma de manejo.
4.2.1.1 Aproveitamento do N-fertilizante pela cana-de-açúcar
O principal interesse no uso da adubação nitrogenada por via foliar na cultura de cana
de açúcar está na impraticabilidade de se efetuar aplicações terrestres depois que a cana fecha,
e em estádios da cultura que requerem suplementos de N. Com esse objetivo a adubação
foliar com solução de uréia (10 a 15 kg/ha de N) vem sendo aplicada por avião com sucesso
em algumas usinas produtoras de cana do Estado de São Paulo.
Trivelin et al. (1985)
considerando que essas pulverizações eram feitas em épocas de elevada pluviosidade,
quantificaram a absorção e perdas de uréia aplicada por via foliar utilizando a técnica
isotópica em
15
N, quando após a adubação ocorriam chuvas em diferentes intervalos de
tempo. Os resultados experimentais mostraram que o N-total na cana de açúcar não forneceu
evidências da absorção e perdas da uréia aplicada. A técnica isotópica com
15
N pôs em
evidência a absorção foliar do N da uréia, sendo que no dia da aplicação, 50% do Nfertilizante foi absorvido na primeira hora após a adubação. Esta conclusão veio melhor
definir as informações até então existentes na literatura que davam conta que para a absorção
de 50% de N-uréia aplicado em pulverizações foliares na cana de açúcar, o tempo requerido
seria menor que 24 horas. Finalmente, concluíram os autores que a ocorrência de chuvas no
dia da aplicação, após uma hora da fertilização foliar, provocaram perdas devido a lavagem
das folhas de 50% do fertilizante aplicado. Em continuação a esse trabalho, Trivelin et al.
(1988) confirmaram em outro experimento que 50% do N-uréia aplicado em solução por via
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 40
FERTBIO 2004
foliar em cana de açúcar foi absorvido no dia da adubação (tempo de 6 horas), não sendo
observada absorção significativa nos dias subseqüentes ao da fertilização. Em adendo
verificaram também com uso da técnica do 15N que do N-uréia absorvido, 5% foi translocado
às raízes após 96 horas da adubação.
Com o emprego de fertilizantes fluidos introduzidos na lavoura canavieira do estado
de São Paulo há pouco mais de 20 anos, foram encontradas vantagens técnico-econômicas
nessa forma de adubação no solo em relação a aplicação de adubos sólidos. Tal alternativa
fundamentava-se no fato que em trabalhos realizados em outros países mostraram, para
diversas culturas, a mesma eficiência de aproveitamento do nitrogênio para ambas as formas
de fertilizantes.
Nesse sentido estudos deveriam ser levados a efeito comparando a
produtividade, aproveitamento do nitrogênio, bem como toda a dinâmica do
N dos
fertilizantes (fluido e sólido) em diferentes condições de cultivo, com cana planta ou soqueira,
em nosso meio. Os resultados experimentais de trabalho de pesquisa de Trivelin et al. (1995),
não encontraram diferenças significativas nas produções finais de cana industrial, massa verde
e massa seca da parte aérea, quantidade total de N extraído e do N dos fertilizantes: uréia e
aquamônia, contido na parte aérea de soqueira de cana-de-açúcar, SP70-1143, de segundo
corte, para a condição de soqueira de final de safra. Notaram uma tendência constante do
tratamento com adubo fluido (aquamônia) apresentar resultados médios sempre maiores que
no tratamento com uréia, durante todo o desenvolvimento da soca e na colheita final. Dos 90
kg/ha de N incorporados ao solo, 35 kg/ha foram recuperados na parte aérea da soca
(determinação realizada pela técnica isotópica com
15
N). O efeito residual do nitrogênio das
mesmas fontes determinados na ressoca (Trivelin et al., 1987a), foi de 3 kg/ha de N. Esse
valor representou uma eficiência de 3% com relação aos 90 kg/ha de N aplicados em
setembro de 1984, totalizando a eficiência total de utilização dos fertilizantes de 42%,
determinados na parte aérea da cultura para as safras 84/85 e 85/86.
Para a condição de soqueira de início de safra, Trivelin et al. (1996) verificaram que o
aproveitamento do nitrogênio dos adubos uréia e aquamônia (100 kg/ha de N) pela soca de
cana-de-açúcar SP70-1143, também não foi significativamente diferente e correspondeu a
eficiência de utilização média (%EUF) de 13,7%, determinada na colheita final para a parte
aérea da soqueira (metodologia isotópica com
15
N). Nesse mesmo trabalho foi abordado o
fato que, o valor da recuperação na parte aérea da soqueira na colheita final, poderia estar
subestimando a utilização real do N dos fertilizantes por todo o período de crescimento da
soca, uma vez que não havia sido determinada a quantidade de N-fertilizante no sistema
radicular da cana. Tal fato foi levantado da análise dos resultados de N-total extraído pela
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
41
parte aérea durante o desenvolvimento da soca, que revelaram uma redução consistente de
cerca de 25 kg/ha de N na parte aérea, no período compreendido entre o 6o (dezembro/86) e o
9o mês (março/87), reforçado ainda pelos resultados de nitrogênio derivado dos fertilizantes
na parte aérea da soqueira (metodologia isotópica com
15
N), que mostraram redução de
aproximadamente 10 kg/ha de N, no mesmo período. Esse N-fertilizante do sistema radicular,
assim como a mineralização do N-fertilizante imobilizado no solo por ação microbiológica,
poderiam vir a contribuir com parte significativa do N total na ressoca.
4.2.1.2 Aproveitamento do N-fertilizante pela cultura do milho em semeadura direta
A cultura do milho é uma importante alternativa no planejamento do sistema de
rotação da propriedade agrícola quando se fala em sistema de semeadura direta (SSD). Na
região do Cerrado, a dificuldade de formar cobertura sobre o solo (palha) é uma realidade,
devido aos fatores climáticos que vigoram na região. Estudos como o de Lange et al. (2003)
demonstram que a cultura do milho pode produzir até 9 t/ha de palha residual, sendo
importante para proteção física do solo e para a ciclagem de nutrientes. Para alcançar altas
produtividades, a cultura do milho exige elevadas doses de nitrogênio e, portanto, entender a
dinâmica deste nutriente no SSD é fundamental para se ter êxito no manejo da adubação, em
função das transformações que o N pode sofrer no solo. Nesta situação, a semeadura direta
tem trazido uma série de dúvidas com relação às formas em que este N pode se apresentar
após sua aplicação, em função dos fatores edafoclimáticos vigentes. Sá (1996) recomendou a
aplicação de N em pré-semeadura na cultura do milho em SSD com o objetivo de reduzir a
carência no pós-semeadura, devido à imobilização no solo. Entretanto, Basso & Ceretta
(2000) também estudaram a possibilidade da antecipação da adubação nitrogenada e
observaram que esta, seguida de um período de precipitação intensa, pode ter sua eficiência
reduzida, causando queda na produtividade da cultura. Entretanto, estes autores não utilizaram
traçadores isotópicos em seus estudos, o que poderia facilitar o entendimento e discussão dos
resultados obtidos. Nesse contexto, alguns estudos tem sido conduzidos em campo, utilizando
traçadores isotópicos (15N), com o objetivo de melhor entender o destino do nutriente quando
aplicado ao solo na cultura do milho. Lara Cabezas (2001) acompanhou o processo de
imobilização da uréia (N-U) e do sulfato de amônio (N-SA) enriquecidos em 15N, na cultura
do milho, quando aplicados em pré-semeadura e cobertura em SSD. O autor observou que o
processo de imobilização foi mais intenso quando as fontes foram aplicadas na présemeadura, sendo que o N-U foi imobilizado nas duas épocas de aplicação e o N-SA somente
quando aplicados na pré-semeadura. Os resultados de produtividade sugeriram a aplicação do
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 42
FERTBIO 2004
N-SA em pré-semeadura e para N-U os efeitos seriam variáveis (pré-semeadura ou cobertura),
em função, principalmente, da pluviosidade e a uma conseqüente mudança do pH, que pode
afetar diretamente a biomassa imobilizadora do solo e a subseqüente disponibilidade para a
cultura. Lara Cabezas & Lange (2003) observaram que uma maior massa de palha de
cobertura do solo promoveu maior recuperação de N-U e N-SA na planta, 66,2 e 76,5% do
N-aplicado, respectivamente, em relação a uma menor massa, quando a aplicação foi feita em
pré-semeadura. A maior massa de palha de cobertura pode ter estimulado a imobilização,
aumentando assim a disponibilidade de nutrientes. No SSD, a técnica de traçador também
possibilitou estimar expressivas perdas de N proveniente da uréia quando aplicada em
superfície (Lara Cabezas et al., 2000), sendo recomendada sua incorporação. Couto (2003)
noutro estudo com fontes de N na cultura do milho em SSD, observou maior recuperação e
maiores produtividades quando utilizou N-SA em relação à aplicação de N-U, utilizando
fontes marcadas em 15N.
Gava (2003) avaliou a eficiência da adubação de cobertura na cultura do milho para
preparo convencional e SSD, em sua implantação no Estado de São Paulo com uso da técnica
isotópica (15N). O uso de 100 kg/ha de N-U não apresentou diferenças significativas na
eficiência de utilização do fertilizante nitrogenado para os dois sistemas. Segundo o autor, não
foi verificado o aumento na demanda de N pela cultura, devido à possível imobilização no
solo, na implantação da semeadura direta. Isto ocorreu, provavelmente, porque a dose de N
(100 kg ha-1) satisfez as necessidades da cultura.
4.2.1.3 Aproveitamento e distribuição de nitrogênio em laranjeira
Na literatura são escassos os trabalhos em que a técnica isotópica foi empregada para
quantificar a absorção e a distribuição do nitrogênio em laranjeiras (Boaretto et al., 1999ab).
Os trabalhos existentes na literatura a respeito do assunto estão resumidos a seguir.
Legaz et al. (1981, 1982) conduziram, por 4 anos, estudos realizados com plantas da
variedade Valência adubando-as com
15
N, ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento.
Durante o período de dormência (baixas temperaturas), houve uma baixa absorção de
15
N,
enquanto que durante o florescimento e formação dos frutos (temperaturas maiores), houve
um acréscimo de absorção.
Outro dado de bastante interesse foi relato por Lea-Cox et al. (2001), conduzindo um
experimento com pomelo desenvolvido em lisímetros instalados no campo e diferentes portaenxertos e doses de 15N. Os autores relataram que as brotações novas e os frutos em formação
representaram a parte predominante de alocação do N aplicado. Entretanto, Wallace et al.
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
(1954) mostraram que por meio da mesma técnica do
15
43
N, apenas 15% do nitrogênio das
folhas novas provinham do solo e a maior parte era obtida das reservas da planta.
Legaz & Primo-Millo (1984) cultivaram plantas da variedade Valência, em vasos com
solução nutritiva. No 4o ano de idade, forneceram
15
N à solução nutritiva e estudaram sua
absorção e distribuição nos períodos do ano. As raízes, tronco e folhas representaram 35, 42 e
23% do peso total de matéria seca da planta respectivamente, porém, as folhas possuíam
maior quantidade de nitrogênio, seguidas pelas raízes e tronco. Dados semelhantes foram
obtidos por Carranca et al. (2001), cultivando plantas jovens da variedade “Lane Late”, em
vasos, fertirrigada com
15
N, obtiveram acúmulo da ordem de 32,6, 19,8 e 15g N kg-1 nas
folhas, raízes e tronco, respectivamente.
Feigenbaum et al. (1987) estudando o comportamento do
15
N em plantas com
histórico de altas doses de N aplicadas e plantas com “fome” de N, verificaram uma maior
recuperação do nitrogênio no perfil do solo pelas plantas “famintas”. Porém, plantas supridas
com nitrogênio obtiveram maior rendimento e maior concentração de nitrogênio nos frutos.
Além destes trabalhos, dois outros vieram a luz recentemente: Martinéz et al. (2000) e
Mattos et al. (2003). O primeiro desenvolvido na Espanha, estudou a distribuição no
15
N-
sulfato de amônio em laranjeira 'Valência" enxertada em Citrus sinenses x Poncirus trifoliata.
O 15N foi aplicado no início da brotação da primavera em diferentes estádios fenológicos. A
maior porcentagem do N aplicado em relação ao total aplicado foi encontrado nos órgãos
novos (principalmente nas folhas do novo fluxo de brotação), seguido pelos órgãos velhos e
raízes. No total, a laranjeira absorveu 35% e foi recuperado no solo aproximadamente 20%
do total aplicado. O segundo experimento foi desenvolvido na Flórida e estudou a
recuperação pela laranjeira 'Hamlin' enxertada em citrumelo 'Swingle'. A recuperação pela
laranjeira do N aplicado foi de 25,5% (15N-uréia) e 39,5% (15N-nitrato de amônio)
determinado 280 dias após a adubação.
Aproximadamente metade do
15
N aplicado foi
encontrado nos frutos (10,2% para uréia e 18,5% para o nitrato de amônio) e as folhas (novas
e velhas) acumularam 6,7% do
15
N aplicado. A acumulação de
15
N nas partes lenhosas foi
muito baixa.
No Brasil, foram publicado poucos trabalhos em que a técnica isotópica para
nitrogênio foi utilizada para acompanhar a absorção de
15
N, o transporte e a distribuição em
laranjeiras. Boaretto et al. (1999ab) conduziram trabalhos em vasos, no primeiro ano após o
transplante das mudas. Ao final de cada período de adubação foi constatado que 40, 61, 46 e
33% do N aplicado aos 45, 75, 120, 130 dias após o transplantio, respectivamente, foi
absorvido pela laranjeira. Parte do N aplicado foi considerado perdido por volatilização de
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 44
FERTBIO 2004
amônia, já que não houve perdas por lixiviação, pois a irrigação dos vasos foi controlada.
Mais recentemente, Fenilli (2002) mostrou com a técnica isotópica que o N absorvido pelas
raízes, na primavera e no verão, são transportados para as partes jovens, mas no outono e
inverno o N absorvido é armazenado nos órgãos velhos. Também foi possível demonstrar
pela técnica isotópica que parte do N contido na laranjeira é redistribuído durante o ciclo
anual da cultura.
4.2.2 Fixação biológica de nitrogênio (FBN)
O primeiro relato do uso de traçador isotópico em estudos de fixação biológica devese a Ruben et al. (1940), que obtiveram evidências de fixação em folhas de cevada fazendo
uso do radioisótopo 13N. Dentre os radioisótopos de nitrogênio o
13
N é aquele que apresenta
meia vida mais longa (10 minutos), possuindo os demais meia vida de segundos ou frações
do segundo (Tabela 9).
Sendo assim, o
13
N é o único radioisótopo de nitrogênio com
possibilidade de ser empregado como traçador em pesquisas biológicas, em estudos em que
sua meia vida não represente um fator limitante. Trabalhos apresentados por Nicholas et al.
(1961) e Campbell et al. (1967) relatam a utilização do 13N2 em estudos da fixação biológica
do N2 e alguns detalhes da produção do radioisótopo. O
13
N, embora se apresente como um
radioisótopo de meia vida curta, trata-se de importante traçador em estudos com
microrganismos que apresentam baixa taxa de fixação do nitrogênio, devido a elevada
sensibilidade das técnicas de detecção para radioisótopo (Hauck e Bremner, 1976; Meeks,
1993).
Após a verificação da ocorrência natural e da baixa abundância do isótopo estável 15N
e a obtenção de compostos químicos enriquecidos nesse isótopo, Burris e Miller (1941) foram
os primeiros a indicarem a utilização do 15N como traçador em estudos da fixação biológica
de N2 atmosférico. Segundo esses autores o emprego do 15N2 viria confirmar e possibilitar a
descoberta de muitos organismos fixadores, alem de viabilizar a medida direta da fixação do
N2 atmosferico, por microrganismos associados às plantas ou em culturas puras. Burris et al.
(1943) utilizaram o 15N2 para demonstrar que a fixação em leguminosas dava-se nas estruturas
nodulares das raízes, e o nitrogênio fixado era translocado para a parte aérea.
4.2.2.1. Quantificação da fixação biológica do nitrogênio (FBN) com atmosferas
enriquecidas em 15N2 (método direto)
O uso de atmosferas enriquecidas em
15
N2, segundo Burris (1974), deve ser
considerado o método padrão na avaliação de métodos não isotópicos (ex. redução de
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
45
acetileno, etc) de quantificação da fixação biológica do N2, por se constituir em método
absoluto não sujeito a fatores de correção e com sensibilidade relativamente alta.
Burris & Wilson (1957) e Burris (1972 e 1974) forneceram detalhes do preparo de
atmosferas enriquecidas em 15N2 e seu uso em estudos da fixação do N2 atmosférico.
Em princípio, o método consiste em expor os sistemas fixadores à atmosfera
enriquecida em 15N2 , por um período de tempo determinado. Tratando-se de plantas onde os
sítios fixadores são os nódulos radiculares, somente as raízes podem ser expostas ao
15
N2
(Hauck e Bremner, 1976).
A percentagem do nitrogênio da planta proveniente da fixação é determinada com
atmosfera enriquecida em 15N por meio da equação 22.
N  fixado (%) 
átomos % 15N excesso na planta fixadora
x 100
átomos % 15N excesso no gás N 2
O método com atmosferas enriquecidas em
15
(22)
N2 vem sendo empregado no estudo da
fixação biológica do nitrogênio a partir dos trabalhos pioneiros de Burris e colaboradores,
como um método de medida do N-fixado, fornecendo provas definitivas da fixação em
diferentes sistemas.
No país, destacam-se os trabalhos pioneiros desenvolvidos por Victoria (1975), que
utilizou de atmosferas contendo
15
N2 com baixo enriquecimento, em testes de fixação
simbiótica com feijoeiro; Ruschell (1975) e Ruschel et al. (1975) forneceram evidências da
fixação do dinitrogênio associada a cana de açúcar; determinações da fixação do N2
atmosférico em gramíneas tropicais foram apresentadas por De-Polli (1975) e De-Polli et al.
(1977); Saito (1978) e Saito et al. (1980) desenvolveram estudos em que foram relacionados
a fixação do 15N2, a evolução de H2 e a redução de C2H2 em feijoeiro; Ruschel et al. (1979a)
estudaram o enriquecimento do nitrogênio do solo e da planta, na simbiose Rhizobium
phaseoli – Phaseoluss vulgaris, utilizando atmosferas enriquecidas em
(1981) demonstraram ocorrer enriquecimento de
15
15
N2; e Matsui et al.
N na rizosfera da cana de açúcar, em
determinação realizada no campo, utilizando 15N2.
A desvantagem que se apresenta como fator limitante no uso de atmosferas
enriquecidas em 15N2 na medida da fixação biológica do nitrogênio, é o custo do isótopo, pois
geralmente trabalha-se com altos enriquecimentos de 15N, além de não poder ser utilizado em
escala de campo. Hauck e Bremner (1976) sugerem que atmosferas contendo 10 a 30% de N2
seriam suficientes para saturar a nitrogenase, reduzindo os custos com o isótopo 15N. Victoria
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 46
FERTBIO 2004
(1975) obteve bons resultados de fixação do N2 em feijoeiro, utilizando baixas concentrações
de
15
N em experimentos desenvolvidos sob condições controladas de laboratório e em
pequena escala.
Witty e Day (1978) descrevem o método de avaliação da fixação do
dinitrogênio, em sistemas assimbióticos, por exposição ao
solo com
15
15
N2. A marcação da atmosfera do
N2 em estudos da fixação do dinitrogênio em leguminosas foi realizada por
Montange et al. (1981), que obtiveram medidas da fixação em feijoeiro e trevo, mantendo o
sistema radicular das plantas confinado em atmosferas enriquecidas a 10 e 5 átomos % em
15
N, por sete horas.
As duas maiores limitações o uso de atmosferas com
15
N2 em estudos da fixação do
dinitrogênio, de acordo com Vose et al. (1981), residem na utilização de poucas plantas em
sistemas controlados, reduzido tempo de exposição das plantas ao
15
N2 e a problemas
relativos ao emprego dessa técnica em condições de campo. Trivelin (1982) desenvolveu
experimentos em vasos onde medidas integradas da fixação simbiótica do nitrogênio em
feijoeiro e soja, foram realizadas por praticamente todo o ciclo das culturas, marcando-se a
atmosfera do solo com
15
N2 a baixo enriquecimento isotópico. Trivelin et al (1984)
desenvolveram trabalhos em condições de campo marcando a atmosfera do solo com 15N2 , na
determinação direta da fixação simbiótica do nitrogênio em feijoeiro. O trabalho foi
desenvolvido utilizando de câmara instalada no centro de parcela experimental.
4.2.2.2. Quantificação da fixação biológica de nitrogênio (FBN) marcando-se o
nitrogênio do solo com 15N (método indireto)
As dificuldades na utilização de atmosferas marcadas com 15N2 em estudos da fixação
do dinitrogênio, principalmente em condições de campo, fizeram com que outros métodos
fossem propostos empregando a técnica com
15
N. Vallis et al (1967) citados por Vose et al.
(1981) sugeriram que a diluição isotópica do nitrogênio, absorvido do solo por plantas
fixadoras, poderia fornecer um meio de quantificar a fixação do dinitrogênio.
A marcação do nitrogênio do solo com 15N foi realizada por Legg e Sloger (1975) que
aplicaram o principio de diluição isotopica na medida da fixação do dinitrogenio em soja. Foi
considerado pelos autores que as plantas dispunham de duas fontes de nitrogênio: o solo e a
atmosfera, e dessa forma, a fixação do N2 foi calculada pela equação 23, tomando-se como
planta controle, uma isolinea não nodulante de soja.
 (átomos % 15N excesso) cultura fixadora 
% N  fixado  1 
 .100
(átomos % 15N excesso) controle


(23)
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
47
No país foram desenvolvidos diversos trabalhos de avaliação da FBN marcando-se o
solo com
15
N, podendo-se destacar: Freitas et al. (1984) que estimaram a FBN em cana de
açúcar e soja; Boddey e Victoria (1986) estimaram a FBN em Brachiaria e Papalum,
Uruquiaga et al. (1987) e Urquiaga et al. (1992) contabilizaram a contribuição da FBN em
diferentes variedades de cana de açúcar.
Fried e Middelboe (1977) apresentaram que quantificações da fixação do N2 em
leguminosas poderiam ser feitas pela expressão 23 quando a mesma taxa de fertilizante
nitrogenado e com mesma marcação em
15
N, fosse aplicada nas culturas fixadora e controle.
Uma única condição deveria ser satisfeita, segundo os autores, que as culturas (fixadora e
controle) absorvessem quantidades de nitrogênio do solo e fertilizante-15N em mesma
proporção, ou seja: (NPPS/NPPF)leguminosa = (NPPS/NPPF)controle.
O método de quantificação da fixação do N2 atmosferico em leguminosas, usando
fertilizante marcado com 15N foi discutido quanto as suas vantagens e limitações por Rennie
et al. (1978), Vose et al. (1978), Rennie (1979), Vose et al. (1981), Vose & Victoria (1986),
Urquiaga & Boddey (1987) entre outros.
Ruschel et al. (1982) estimaram a fixação em condições de campo de cinco cultivares
de feijão, usando o método de Fried e Middelboe (1977). Como planta controle foi utilizado o
trigo anão. Segundo esses autores, o principal fator, que deve ser considerado como fonte de
erro em experimentos que utilizam uma outra espécie como planta controle, refere-se as
diferenças na exploração de volume do solo pelas culturas. Trivelin (1982) verificou que a
condição básica do método foi satisfeita em experimentos de vasos com feijoeiro (arroz como
planta controle) e soja (isolinea não nodulante como controle). Lima et al (1987) e Urquiaga
et al (1987) utilizaram o método na avaliação da contribuição da FBN na nutrição nitrogenada
da cultura da cana de açúcar.
Estudos em condições de campo usando o método de Fried e Middelboe (1977) na
quantificação da FBN, apresentados na literatura, na maioria das vezes mostram resultados
sub ou superestimativos, aparecendo em alguns trabalhos valores negativos, em virtude de
não ser satisfeita a condição básica do método. Mesmo com limitações o método tem se
prestado em estudos comparando a FBN de diferentes estirpes de Rhizobium, diferentes
variedades de plantas ou, mesmo de uma mesma variedade em diferentes condições de
cultivo.
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 48
FERTBIO 2004
4.2.2.3 Quantificação da fixação biológica de nitrogênio (FBN) com uso de variação
natural de 15N (método indireto)
Estimativas da fixação do N2 atmosférico, tanto em leguminosas como em não
leguminosas, com uso de variação natural de
na abundância de
15
15
N requer que haja uma diferença mensurável
N entre as duas maiores fontes de N para a planta fixadora (planta
associada a microrganismos fixadores: leguminosa ou não leguminosa), ou seja, entre o N do
solo e da atmosfera. Quando do uso desse método deve-se obrigatoriamente considerar o
fracionamento isotópico que existe, especialmente, na fixação do N2 atmosférico. A literatura
contém muitos valores de 15N(%o) = - 0,0 a - 4 %o para o N-fixado em leguminosas
crescidas em meio livre de N (a única fonte é o N-atmosférico) (Shearer & Kohl, 1993).
No cálculo da fixação biológica por esse método são usadas as expressões contendo a
notação 15N ( equações 24 e 25).
 15N (%o) = [(Ramostra/Rpadrão) - 1] .103
%N-fixado =
( 15N%o) teste - ( 15N%o) Nds
___________________________________________
15
( N%o) N2
significando: R = (15N/14N); (
. 100
(25)
15
-
( N%o) Nds
15
N%o)
teste
= o valor 
15
N na planta teste (leguminosa); (
= o valor  15N do N derivado do solo na planta teste e ( 15N%o)
15
N%o)
15
N do N derivado do N2 na planta teste.
Nds
(24)
N2
= o valor 
O valor de ( 15N%o)solo representa o N-solo absorvido pela planta fixadora. Dispondose de uma planta controle, como no método por diluição do 15N (marcação do solo com 15N),
pode-se determinar esse valor. Os requerimentos para a planta controle são os mesmos feitos
para o método com adubação do
15
N, ou seja, ela não deverá fixar o N2 atmosférico; deverá
explorar o mesmo volume de solo da fixadora e possuir um padrão (marcha) de absorção do
N-solo semelhante a leguminosa. Sendo atendidas essas condições:
( 15N%o) Nds = ( 15N%o) controle
O valor de ( 15N%o)N2 atmosférico por definição é igual a zero. Como sabe-se que o N na
fixadora derivado da atmosfera é descriminado isotopicamente, tornando-se mais pobre no
isótopo pesado, esse valor (equação 25) deverá ser aquele que represente esse fracionamento,
por exemplo ( 15N%o) N2 = - 1,5 a - 2 o/oo que é determinado em plantas crescidas em meio
livre de N-mineral. Assim (25) passa a ser escrita como (26):
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
( 15N%o) controle
%N-fixado =
15
- ( N%o) teste
____________________________________________________
49
15
( N%o) controle
-
. 100
(26)
15
( N%o) teste.-“N min.”
Esse método, como o da diluição do isótopo
15
N (marcando-se o solo com
15
N) tem
possibilidade de ser usado em campo em estimativas de quantificação da FBN em culturas de
plantas leguminosas e de não leguminosas. Boddey et al. (2000) e Boddey et al. (2001)
apresentaram considerações aprofundadas a respeito do método e de possibilidades de uso em
campo, na quantificação da fixação de N2, respectivamente, em espécies perenes e em canade-açúcar ou outras gramíneas.
4.2.3 Transformações, movimentação e lixiviação de nitrogênio no solo
A técnica isotópica com
15
N tem se mostrado muito útil em estudos das
transformações de diferentes formas nitrogenadas no solo, sendo a única capaz de quantificar
taxas liquidas de transformação de um determinado composto em outro. No sentido de
ilustrar a utilidade da técnica, a seguir são apresentados dois trabalhos desenvolvidos no
CENA-USP, Piracicaba, SP.
Carnaúba et al. (1989) estudaram as transformações no solo do nitrogênio do sulfato
de amônio (15N) aplicado em complementação à vinhaça, obtendo informações a respeito da
influência da matéria orgânica do resíduo sobre a imobilização do nutriente aplicado como
fertilizante. O estudo foi conduzido em colunas de solo e dos resultados obtidos (Tabela 10),
foi verificado que a imobilização do N-sulfato de amônio foi mais acentuado para o solo
tratado com vinhaça. A recuperação do N aplicado, dada na Tabela 11 evidenciou para os
tratamentos, que nas condições experimentais ocorreram perdas de N para a atmosfera.
Fiore et al. (1990) estudaram a mineralização do N da azola marcada com 15N em solo
(glei pouco húmido) cultivado com arroz e não cultivado (sem histórico de cultivo anterior),
verificando a contribuição da azola no aumento do N-mineral desses solos (Tabela 12).
Verificaram os autores que o N-azola foi mineralizado logo após incorporação ao solo, sendo
que a forma nítrica foi predominante no solo cultivado, enquanto a forma amoniacal foi
observada, principalmente, no solo não cultivado. O N-azola representou aproximadamente
30% do N-mineral de ambos os solos. O maior acúmulo de N  NH 4 no solo não cultivado
evidenciou que havia baixa população de bactérias nitrificadoras, uma vez que o N-azola é
liberado na forma amônio durante a decomposição da planta, enquanto no solo cultivado isso
não ocorreu, devido provavelmente a maior população dessas bactérias. Os resultados obtidos
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 50
FERTBIO 2004
com a incorporação da azola nos solos, comparado aos de controles sem adição da azola,
evidenciaram a contribuição desse material orgânico para aumentar a mineralização do
nitrogênio da matéria orgânica nativa dos mesmos, sendo esse aumento conhecido como
efeito “priming” (Jansson & Persson, 1982) (Figura 8). Esse efeito, calculado no solo não
cultivado através da concentração de íons amônio, aumentou em aproximadamente 90% a
taxa de mineralização da matéria orgânica nativa do solo no período de 30 dias, enquanto que
no solo cultivado, esse efeito calculado pelo íon nitrato foi bem menor (9,5%).
Tabela 10. Nitrogênio derivado do fertilizante [(15NH4)2SO4] (dose equivalente a 100 kg/ha)
em colunas de solo, sob o efeito de dois tratamentos (com e sem vinhaça) em
diferentes períodos de incubação (Carnauba et al., 1989)
Épocas
(d.a.i.)***
N proveniente do fertilizante (mg)
Fração orgânica
I**
Fração mineral
II
I
II
Total (o.+m.)
I
II
8
A*
3,99 ab
0,88 bB
A
7,05 ab
A*
3,99 ab
16
2,68 cA
0,58 bB
8,66 aA
14,29 aB 11,34 aA
B
14,87 ab
32
A
3,93 ab
1,12 bB
5,26 bcA
A
11,41 bB 9,19 ab
B
12,53 bc
48
2,80 cA
0,90 bB
3,65 cdA
10,91 bB 6,45 cA
11,81 cB
71
2,25 cA
0,96 bB
2,35 dA
5,76 cB
4,60 cA
6,72 dB
92
3,11 bcA
1,20 bB
1,99 dA
2,47 dA
5,10 cA
3,67 eB
108
4,83 aA
2,39 aB
2,21 dA
3,84 cdB
7,04 bcA
B
6,23 de
16,44 aA
17,33 aB
* Letras maiúsculas indicam análise estatística entre os tratamentos I e II (teste
“F”) e minúsculas, entre épocas (teste de Tukey). Letras iguais na mesma linha
indicam igualdade estatística, ao nível de 95% de probabilidade.
** Os algarismos I e II representam, respectivamente, os tratamentos com
vinhaça (dosagem equivalente a 120 m3/há) e sem vinhaça.
*** d.a.i. = significa dias após incubação.
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
51
Tabela 11. Recuperação do N aplicado via fertilizante em colunas de solo, em função do
tratamento e do período de incubação (Carnaúba et al., 1989).
Épocas (d.a.i.*)
Recuperação do N aplicado no solo
Com vinhaça (120m2/ha)
Sem vinhaça
___________________________
%
____________________________
8
51,6
80,9
16
53,0
69,4
32
42,9
58,5
48
30,1
55,2
71
21,5
31,4
92
23,8
27,1
108
32,9
29,1
*d.a.i. = dias de incubação
Tabela 12. Quantidade de íons amônio e nitrato (N-mineral) provenientes da mineralização da
Azola nos solos não cultivados e cultivados (Fiore et al., 1990).
Dias
Solo não cultivado
N-NH 4
N-NO 3
_______________________________
5
10
15
20
25
30
2,49
2,41
2,00
1,93
1,84
1,73
0,87
0,39
0,43
0,51
0,67
0,77
Solo cultivado
N-NH 4
mg/vaso
N-NO 3
_____________________________
--------0,02
0,03
--- : não determinado pela pequena quantidade de íons produzidos
1,67
2,81
2,21
--3,04
2,49
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 52
FERTBIO 2004
Figura 8. Quantidade de nitrogênio mineralizado da matéria orgânica do solo (efeito
“priming”) em conseqüência da adição de Azolla caroliniana (a) solo não
cultivado, (b) solo cultivado (Fiore et al., 1990).
Diversos trabalhos foram desenvolvidos no país utilizando a técnica com
15
N em
estudos de transformações do N no solo, podendo-se citar os de: Freitas (1984), Coelho
(1987), Colaço (1988), Lara Cabezas (1991), Tzi-Tziboi (1993) entre outros.
Resíduos culturais marcados com
15
N, como subprodutos de pesquisas com
fertilizantes-15N, possibilitaram o desenvolvimento de estudos das transformações do N
desses resíduos orgânicos no sistema solo-planta, como foi o caso de palhada-15N ( ponteiro e
folhas secas) em cultivo de cana-de-açúcar sem queima prévia (Gava, 1999; Gava et al., 2003;
Vitti, 2003); e resíduos da cultura de milho-15N em cultivos de feijoeiro e arroz (Tzi-Tziboy,
1993).
As transformações do N de adubos verdes: Crotalária juncea-15N; Mucuna-Preta-15N,
incorporados ao solo nas culturas de milho e arroz foram estudadas por Ambrosano (1995)
Ambrosano et al. (2003), Muraoka et al. (2002), Scivittaro (1998), Scivittaro et al. (2003) e
Silva (1991).
Estudos sobre a movimentação e lixiviação do N no solo, podem ser desenvolvidos a
partir da adição de uma fonte orgânica ou mineral marcado com o isótopo
15
N, analisando-se
o N-total ou as formas minerais de N em amostras de solo, coletadas em diferentes distâncias
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
53
e profundidades com relação ao local de aplicação da fonte, em tempos distintos, como
empregado por Libardi (1984); Coelho (1987), Camargo (1990), Lara Cabezas et al. (2000),
entre outros; ou analisando-se as formas minerais do N na solução do solo, em diferentes
tempos, locais e profundidades, fazendo-se uso da técnica com extratores de solução do solo
associada a tensiometria, para medida do fluxo de água, como realizado por Libardi e
Reichardt (1978); Meirelles et al. (1980); Libardi (1984); Urquiaga et al (1986), Camargo
(1990), Spolidório (1999) e Gava (2003) entre outros.
4.2.4. Balanço de nitrogênio no sistema solo-planta-atmosfera
O resultado liquido da somatória dos processos de ganhos e perdas de nitrogênio no
sistema solo-planta é chamado de balanço de nitrogênio nesse sistema. Em sistemas naturais
(ecossistemas) as perdas ou saídas (ex.: lixiviação, perdas gasosas, etc.) são compensadas
pelos ganhos ou entradas de N (ex.: FBN, nitrogênio na água de chuva etc.) e diz-se que o
mesmo encontrava-se em “stead state”. Num agrossistema as perdas ou saídas, incluindo a
exportação de N pela produção de culturas, podem superar as entradas ou ganhos, causando
decréscimo no estado de N do solo. Esse decréscimo, resultara em ultima análise ao longo do
tempo, em solos agrícolas antieconômicos, ressaltando a necessidade de estabelecer-se
balanços de N em diferentes agrossistemas (Colaço, 1988).
Em estudos de balanço do nitrogênio, dois métodos gerais são normalmente
empregados. Um deles, método da diferença, ou indireto, envolve o balanço de nitrogênio
total no sistema e documenta as apropriadas entradas e saídas, sem o uso de traçador. No
outro, o método por diluição isotópica ou do traçador, uma fonte nitrogenada marcada com
15
N (fertilizante, matéria orgânica etc.) é adicionada ao sistema e calcula-se o balanço do N
derivado da fonte (Legg e Meisinger, 1982).
A Tabela 11 de Carnaúba et al. (1989), ilustra o método isotópico de balanço do
15
N-
fertilizante adicionado ao solo, com e sem adição de vinhaça. Outro exemplo bem ilustrativo
é dado na Tabela 13 (Coelho, 1987) a respeito do balanço de N da uréia (60 kg/ha) no sistema
solo-cultura de milho, em latossolo vermelho-escuro, fase cerrado, utilizando o método
isotópico. Outros estudos envolvendo o balanço de N (15N) foram desenvolvidos por
Spolidorio (1999), Oliveira (1999), Gava (1999) e Gava (2003).
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 54
FERTBIO 2004
Tabela 13. Balanço de N da uréia (60 kg/ha), no sistema solo-planta da cultura de milho em
latossolo vermelho escuro, fase cerrado (Coelho, 1987).
Destino do N-fertilizante
Recuperação do nitrogênio da uréia
Aplicada em superfície
Incorporada (7,5 cm)
kg/ha
%
kg/ha
%
Removido nos grãos
26,30
43,83
24,00
39,82
Removido no sabugo
1,53
2,54
1,44
2,40
Removido na folha+palha
5,48
9,12
4,64
7,73
Removido no colmo+pendão
1,98
3,29
1,87
3,12
Total removido na planta
35,29
58,78
31,95
53,07
Retido no solo (0-90cm)
13,96
23,23
13,87
23,07
Total recuperado planta+solo
49,25
82,01
45,82
76,77
Perdas por lixiviação
2,21
3,70
2,39
4,01
Estimativa de erro
3,23
5,60
3,23
5,60
Déficit
5,81
8,70
8,56
14,40
O balanço de
15
N tem sido usado em estudos de perdas de N por volatilização de
amônia de fontes adicionadas ao solo (Lara Cabezas, 1987; Lara Cabezas, 1991, Trivelin et
al., 2002a) ou desnitrificação (Colaço, 1988). Esse método foi usado por Lara Cabezas (1987)
e Lara Cabezas et al. (1999) na calibração de coletores semi-aberto estáticos usados em
quantificações, sem o uso do traçador, de perdas reais de amônia do solo (Lara Cabezas et al.,
2000; Gava et al., 2001; Spolidório, 1999).
4.2.5 Outras aplicações da técnica isotópica com 15N
O
15
N tem sido muito pouco usado no país em estudos de metabolismo nitrogenado
em plantas e animais, muito embora importantes avanços no exterior são registrados com o
uso da técnica. A título de ilustrar o uso do 15N em estudos dessa natureza realizados no país,
pode-se mencionar o trabalho de Carneiro et al. (1995) a respeito da contribuição da reserva
de nitrogênio do tolete de plantio, marcado com
15
N, na acumulação e crescimento de
perfilhos de cana de açúcar, verificando os autores que até 40 dias após a germinação, a planta
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
55
utiliza 60% da reserva para o seu desenvolvimento, que representou no período, a mesma
quantidade de nutriente absorvido do solo.
Lara et al. (1990) desenvolveram um estudo sobre o metabolismo de N (15N-sulfato de
amônio) pela levedura na fermentação etanólica. Os resultados experimentais mostraram que
81,8% do N adicionado foi recuperado após o processo fermentativo, sendo que 77,9% foi
encontrado no lêvedo, imobilizado em maior parte na fração N-insolúvel (92%). Nos
compostos orgânicos do vinho delevurado e vinhaça, produtos da metabolização da levedura,
o N adicionado foi recuperado em maior proporção na fração de N-solúvel.
O efeito da infecção de nematoide em plantas de soja na absorção e transporte de N
(15N) foi desenvolvido por Carneiro et al. (2002).
Pesquisas de cinética de absorção radicular de formas minerais de N tem sido pouco
exploradas em todo o mundo. Em estudos dessa natureza com outros nutrientes, são usados
radioisótopos, devido a grande sensibilidade de detecção, o que não é possível no caso do N.
No Brasil o único trabalho desenvolvido nesse sentido foi o de Anti et al. (2001) que
avaliaram o mecanismo de absorção de nitrato, uréia e amônio em plantas inteiras de arroz.
4.3 Uso do 13C
Estudos da matéria orgânica do solo são baseados na determinação do C e N total e
suas distribuições numa seqüência de frações separadas por métodos convencionais.
A
metodologia isotópica tem contribuído em estudos dessa natureza, sendo um dos métodos
baseado na abundância natural de 13C da matéria orgânica. Com esse objetivo Vitorello et al
(1989) avaliaram a distribuição e origem da matéria orgânica de oxisol sob floresta
(predominância da cobertura vegetal de plantas de ciclo fotossintético C-3, com valor 13C de
-31‰) e desbravado e cultivado com cana de açúcar (planta do ciclo fotossintético C-4, com
valor 13C de -13‰) por 12 e 50 anos. A porcentagem de carbono, nas diferentes frações do
solo, derivada da cana de açúcar (PCdfc) foi calculada pela equação 27. A tabela 14 ilustra os
resultados obtidos por Vitorello et al. (1989).
PCdfc = [( - o)/( c-o)] . 100
(27)
onde:  = valor de 13C‰ da amostra de solo cultivado; o = valor de 13C‰ da amostra do
solo de floresta; c = valor médio de 13C de resíduos da cultura da cana de açúcar (-13%)
A. E. Boaretto - P. C. O. Trivelin - T. Muraoka (CENA - USP) 56
FERTBIO 2004
Tabela 14. Valores de 13C‰ e proporções (%) do carbono total derivado da cana-de-açúcar
(PCdfc) nas frações de camadas de solo de 0,10 a 0,20m, nos três solos (Vitorello
et al., 1989)
13C
PCdfc
Frações
Solo
floresta
Solo de
cana, 12
anos
________________
Solo total
‰
Solo de
cana, 50
anos
________________
Solo de
floresta
Solo de
cana, 12
anos
__________________
Solo de cana, 50
anos
%
__________________
-25,1 0,25# -23,0 0,18
-20,2 0,11
0
17,3 3,2
40,5 2,2
-28,2 0,33
-29,0 0,99
-28,2 0,72
-24,5 0,16
-24,4 0,27
-18,70,45
-21,3
-23,1
-23,2 0,64
-22,8 0,84
-18,7 0,25
-21,5 0,91
-20,8
-20,9 0,52
-20,00,56
0
0
0
0
0
67,03,7
47,8 3,3
33,43,2
11,2 6,8
13,8 9,4
62,5 2,5
46,3 9,0
48,6 2,5
31,2 5,5
30,5 6,5
-26,5
-26,3
-26,9*
-24,6
-24,6
-24,1
-20,3
-19,8
-21,4
0
0
0
14,1
12,8
20,1
45,9
48,9
39,6
Frações
Areia grossa
Areia média
Areia fina
Silte+arg.grossa
Argila fina
Extrato alcalino
Total
Moléc.grandes
Moléc.pequenas
#
O desvio padrão é indicado quando duas ou mais repetições foram usadas
*Valores calculados por diferença das duas linhas acima
4.4 Uso do 10B
Nos composto naturais o B é encontrado sob forma de dois isótopos, com as
abundâncias:
11
B= 80,15% e
10
B= 19,85%, na seguinte proporção:
metodologias disponíveis para enriquecer em
11
B:10B= 4,044.
Há
10
B compostos que podem ser encontrados no
comércio, como por exemplo o ácido bórico enriquecido em
entre
11
10
B, com a seguinte proporção
B:10B= 0,080. O 10B tem sido pouco utilizado como traçador em estudos com vegetais
(Hanson, 1991; Shu et al., 1989 e Shu et al., 1994). A espectrometria de massas com fonte de
plasma foi estudada no Brasil por Bellato (1999), para determinação isotópica e elementar de
B em amostras vegetais.
No Brasil a técnica isotópica foi usada por Leite (2002) para estudar a absorção de B
pelas folhas de cafeeiro e sua translocação para os frutos. A mesma técnica foi empregada
para estudar a absorção radicular e foliar de B, o seu transporte e sua distribuição em
laranjeiras (Boaretto et al., 2003; Boaretto et al., 2004a e Boaretto et al., 2004b).
Uso de Isótopos como Traçadores em Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
FERTBIO 2004
57
4.5 Uso do 34S
No Brasil, como em todo o mundo, ainda são escassos os estudos com
34
S. Os
trabalhos realizados no pais, em experimento em vasos e em condições de casa de vegetação,
procuraram avaliar a utilização do enxofre adicionado ao solo na forma de
34
SO4, pelas
culturas de arroz, Crotalária júncea, milho, soja e alfafa. Os resultados das pesquisas
mostraram elevada absorção de enxofre (34SO4-2) por todas as culturas, com valores de
porcentagem de enxofre na planta derivado do fertilizante (%Sdff) variando de 40 a 90%.
(Trivelin et al., 2002; Teixeira et al., 2002; Teixeira, 2004).
5. CONCLUSÕES
A técnica isotópica é uma ferramenta ainda atual e muito valiosa, sendo que o seu uso
tende a crescer nos estudos de fertilidade do solo e nutrição de plantas. Entretanto, com o
aumento da preocupação com uso da energia nuclear e o relacionamento desta com o uso de
isótopos radioativos, e a necessidade de treinamento dos usuários para que se protejam e
preservem o ambiente, a tendência natural, no futuro, será o uso de isótopos estáveis dos
nutrientes de interesse, a medida que se desenvolvam novos métodos de análise.
6. REFERÊNCIAS
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