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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE ANTÍGENOS DA FORMA AMASTIGOTA DE Leishmania chagasi IDENTIFICADOS POR DUPLA VARREDURA DA BIBLIOTECA DE cDNA. Daniella Regina Arantes Martins NATAL-RN 2006 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS ANTÍGENOS DA FORMA AMASTIGOTA DE Leishmania chagasi IDENTIFICADOS POR DUPLA VARREDURA DA BIBLIOTECA DE cDNA. Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde Orientadora: Selma M. B. Jerônimo Co-orientadora: Mary E.Wilson NATAL – RN 2006 Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Martins, Daniella Regina Arantes. Antígenos da forma amastigota de Leishmania chagasi identificados por dupla varredura da biblioteca de cDNA / Daniella Regina Arantes Martins. – Natal, RN, 2006. 93 f. Orientador : Selma M. B. Jerônimo. Co-Orientadora: Mary E. Wilson. Dissertação (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. 1. Leishmaniose Visceral – Dissertação. 2. Leishmania chagasi - Dissertação. 3. Antígeno recombinante - Dissertação. 4. Citocinas - Dissertação. I. Jerônimo, Selma M. B. II. Wilson, Mary E. III. Universidade Federal do rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BCZM CDU 616.993.161(043.3) DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS ANTÍGENOS DA FORMA AMASTIGOTA DE Leishmania chagasi IDENTIFICADOS POR DUPLA VARREDURA DA BIBLIOTECA DE cDNA. Presidente da Banca _________________________________________________________________________________ Selma Maria Bezerra Jerônimo - UFRN BANCA EXAMINADORA _________________________________________________________________________________ Prof. Dra.Selma Maria Bezerra Jerônimo - UFRN _________________________________________________________________________________ Dr. Lain Pontes Carvalho – FIOCRUZ-BA _________________________________________________________________________________ Dra. Margarida Maria de Lima Pompeu - UFC _________________________________________________________________________________ Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos - UFRN _________________________________________________________________________________ Prof. Dra. Regina de Fátima dos Santos Braz - UFRN NATAL/RN 2006 AGRADECIMENTOS Ao Karim, por estar sempre ao meu lado de forma tão carinhosa e companheira, me apoiando a cada nova etapa a ser cumprida. O meu imenso amor. Aos meus pais, Domingos e Lourdes, pelo apoio e aos incentivos constantes dados aos meus estudos. A minha orientadora Selma Jerônimo, a quem devoto minha mais sincera admiração. Sou inteiramente grata por mais uma orientação, pelas grandes oportunidades que tem me oferecido no decorrer de todos esses anos em seu laboratório e, principalmente por ter-me ensinado os caminhos a serem seguidos numa abordagem científica de forma simples e objetiva. Sua dedicação, sabedoria e dinamismo em muito tem contribuído para a minha formação acadêmica. A Dra. Mary Wilson, Professora Titular, Departamento de Medicina Interna e Microbiologia da Universidade de Iowa, EUA, minha imensa gratidão pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, pelo tempo dedicado, pela rica contribuição e aprendizado fornecidos durante a execução desse trabalho. Ao Dr John Donelson, professor do Departamento de Bioquímica da Universidade de Iowa, EUA, meus agradecimentos pela importante colaboração na área de biologia molecular e no desenvolvimento desse trabalho. A Dra Eliana Tomaz, professora do Departamento de Infectologia da UFRN, obrigada pela colaboração na execução desse trabalho e, principalmente por sua amizade e carinho para comigo. Aos colegas do Laboratório de Imunogenética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte Aos colegas do Laboratório da Dra. Mary Wilson do Departamento de Medicina Interna e Microbiologia da Universidade de Iowa. Ao Departamento de Bioquímica pelo apoio. Ao National Institutes of Health (NIH) pelo suporte financeiro AI32135 e AI059451 (J.E.D. e M.E.W), AI045540, AI048822, AI067874 e ao Tropical Medicine Research Center (TMRC) P50 AI30639 (M.E.W e S.M.B.J). RESUMO O controle da Leishmaniose Visceral em regiões endêmicas é em parte dificultado pela falta de conhecimento em relação ao papel dos reservatórios e vetores, não havendo ainda vacina disponível. Leishmania s.p são protozoários que expressam múltiplos antígenos reconhecidos pelo sistema imune dos hospedeiros. Devido à ausência de um epítopo imunodominante reconhecido pela maioria dos hospedeiros, estratégias para a identificação e seleção de novos antígenos para a prevenção e imunodiagnóstico. Nossa estratégia foi construir uma biblioteca de cDNA da forma amastigota da L. chagasi, com subseqüente realizadção de dupla varredura da biblioteca para sistematicamente identificar antígenos específicos de células T e B. A primeira etapa teve como objetivo a identificação do maior número de clones produtores de peptídeos através da utilização de um pool de soro de indivíduos com Leishmaniose Visceral. Os clones codificadores de proteínas de choque térmico foram removidos e os clones restantes foram submetidos à segunda etapa da varredura, que consistiu na avalição capacidade destes antígenos em induzir estimulação e proliferaçõa de linfócitos T de camundongos resistentes à infecção por L. chagasi. Seis clones foram selecionados após a segunda varredura. Os clones codificaram parte da seqüência da glutamina sintetase, ATPase do retículo endoplasmático, Fator de alongamento 1 γ, Kinesina K-39 proteína repetitiva A2, e proteína hipotética conservada. Indivíduos naturalmente infectados com L. chagasi desenvolveram respostas imunes celular e humoral frente a essas proteínas. Formulações contendo múltiplos antígenos podem servir como excelentes métodos para imunodiagnóstico e vacinação. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral; Leishmania chagasi; Antígeno recombinante; Citocinas. ABSTRACT Control of human visceral leishmaniasis in endemic regions is hampered in part by the lack of knowledge with respect of the role reservoirs and vector. In addition, there is not yet an understanding of how non-symptomatic subclinical infection might influence the maintenance of infection in a particular locality. Of worrisome is the limited accessibility to medical care in places with emerging drug resistance. There is still no available protective vaccine either for humans or other reservoirs. Leishmania species are protozoa that express multiple antigens which are recognized by the vertebrate immune system. Since there is not one immunodominant epitope recognized by most hosts, strategies must be developed to optimize selection of antigens for prevention and immunodiagnosis. For this reason, we generated a cDNA library from the intracellular amastigote form of Leishmania chagasi, the causative agent of South American visceral leishmaniasis. We employed a two-step expression screen of the library to systematically identify T and T-dependent B cell antigens. The first step was aimed at identifying the largest possible number of clones producing an epitope-containing polypeptide with a pool of sera from Brazilians with documented visceral leishmaniasis. After removal of clones encoding heat shock proteins, positive clones underwent a second step screen for their ability to cause proliferation and IFN-γ responses of T cells from immune mice. Six unique clones were selected from the second screen for further analysis. The clones encoded part of the coding sequence of glutamine synthetase, transitional endoplasmic reticulum ATPase, elongation factor 1γ, kinesin K-39, repetitive protein A2, and a hypothetical conserved protein. Humans naturally infected with L. chagasi mounted both cellular and antibody responses to these protein Preparations containing multiple antigens may be optimal for immunodiagnosis and protective vaccines against Leishmania. LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1 Perfil das respostas imunes inata e adquirida e a rede de citocinas 12 envolvidas no processo infeccioso.......................................................... FIGURA 2 Extração do RNA total de L. chagasi e obtenção do cDNA através da 37 enzima transcriptase reversa................................................... FIGURA 3 Dupla varreduras da bibloteca de cDNA de L. chagasi com pool de 40 soros de indivíduos com LV e células T decamundongosC3H/HeJ....... FIGURA 4 Imunoblot das proteínas de amastigotas e promastigotas de 46 Leishmania chagasi presentes nas bibliotecas de cDNA........................ FIGURA 5 Alinhamento entre as sequências cDNA 648 (A2) com seus 51 homólogos L. infantum A2 e L. infantum (Sanger Institute)................... FIGURA 6 Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos do clone de cDNA 52 425 de L. chagasi e o K-39 de L. chagasi............................................... FIGURA 7 Imonoblot de bactérias transformadas expressando antígenos de 53 Leishmania chagasi................................................................................. FIGURA 8 RNAm total extraído da forma promastigota selvagem de L. chagasi, 55 LcJ promastigota na forma de crescimento estacionária (E) e log (L), ou a forma LcJ amastigota (Am)............................................................. FIGURA 9 Níveis de anticorpo detectados contra antígenos recombinantes 314, 56 419, e 503 em 34 indivíduos com leishmaniose visceral........................ FIGURA 10 Imunoblot de proteínas recombinantes purificadas através da coluna de cromatografia de afinidade................................................................. 57 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Freqüência de proteínas de choque térmico HSP70, HSP83 e HSP90, encontrados na biblioteca de clones cDNA da forma amastigotas de L. chagasi identificados na primeira varredura utilizando-se o pool de soros humanos ...................................... 47 TABELA 2 Índice de proliferação gerado pelas proteínas recombinantes 314, 319, 419, 425, 503 e 648..................................................... 48 TABELA 3 Antígenos de Leishmania chagasi identificados com a técnica de dupla varrredura...................................................................... 50 TABELA 4 Nível de Interferon-γ (IFN-γ) em sobrenadante de cultura de células de indivíduos com teste de Montenegro positivo............ 58 SIGLAS E ABREVIATURAS ABTS- 2´2 Azino-di-(Ácido Sulfônico 3- Etilbenzenotiazolino). APCs- Células Apresentadoras de Antígenos (Antigen Presenting Cells). ATP- Adenosinatrifosfato CR1- Receptor de Complemento 1 CR2- Receptor de Complemento 2 DTH- Hipersensbilidade do Tipo Tardia (Delayed-type-hypersensitivity) ELISA- Técnica de Ensaio Imunoenzimático GMCSF- Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos e Macrófagos (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor) GP63- Glicoproteína de 63 KDa IFN-γ- Interferon-gama IgE- Imunoglobulina E IgG- Imunoglobulina G IgG1- Imunoglobulina G1 IgG2a- Imunoglobulina G2a IL-1- Interleucina-1 IL-10- Interleucina-10 IL-12- Interleucina 12 IL-13- Interleucina-13 IL-2- Interleucina-2 IL-4- Interleucina-4 IL-5- Interleucina-5 IL-6- Interleucina-6 iNOS- Óxido Nítrico Sintetase Induzida LC- Leishmaniose Cutânea LM- Leishmaniose Mucosa LV- Leishmaniose Visceral MHC- Complexo Maior de Histocompatibilidade B7.1 Moléculas Coestimuladoras Presentes nas Células Apresentadoras de Antígenos B7.2 Moléculas Coestimuladoras Presentes nas Células Apresentadoras de Antígenos NK- Células Matadoras Naturais (Natural Killer Cells) NO- Óxido Nítrico ORF Quadro Aberto de Leitura (Open reading frame) PBMCs- Células Mononucleares de Sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells) PCR- Reação de Polimerase em Cadeia PKDL- Leishmaniose Dérmica Pós-calazar rIL-12- Interleucina-12 Recombinante TCD4+- Células TCD4 Efetoras TCD8+- Linfócitos T Citotóxicos TGF-β- Fator de Transformação do Crescimento- beta (Transforming Growth Factor Beta) Th0- Linfócitos T helper naïve Th1- T Auxiliar 1(T helper 1) Th2- T Auxiliar 2 (T helper 2) TNF-α- Fator de Necrose Tumoral alfa TNF-β- Fator de Necrose Tumoral Beta SUMÁRIO Página Agradecimentos vi Lista de Figuras vii Lista de Tabelas viii Lista de Siglas e Abreviaturas ix Resumo xi I INTRODUÇÃO 1 1.1 Considerações gerais............................................................................ 1 1.2 Leishmaniose Visceral......................................................................... 3 1.3 Mecanismos de resposta imune às infecções....................................... 5 1.3.2 Resposta imune a Leishmania em camundongos................................. 9 1.3.3. Resposta imune a Leishmania em humanos........................................ 15 1.3.4. Resposta imune frente a outros microorganismos intracelulares 17 1.4 Diagnóstico........................................................................................... 21 1.5 Tratamento........................................................................................... 23 1.6 Desenvolvimento de vacinas................................................................ 24 2 OBJETIVOS....................................................................................... 33 2.1 ObjetivoGeral....................................................................................... 33 2.2 Objetivos específicos............................................................................ 33 II MÉTODOS......................................................................................... 34 2.1 Obtenção das formas amastigotas de L. chagasi.................................. 34 2.2 Extração do RNAm da forma amastigota de L.chagasi....................... 34 2.3 Manutenção de culturas de Leishmania chagasi em meio de cultura 35 2.4 Preparo da biblioteca de cDNA............................................................ 35 2.5 Identificação de pacientes com LV e preparo do pool de soros........... 37 2.6 Varredura da biblioteca de cDNA com pool de soro humano............. 37 2.7 Eliminação das proteínas de choque térmico (HSP) de L. chagasi...... 38 2.8 Preparo das proteínas recombinantes para o ensaio de células T......... 38 2.9 Varredura da biblioteca de cDNA para a identificação de antígenos 39 de L. chagasi capazes de estimular linfócitos T específicos................ 2.10 Clonagem das proteínas recombinantes em vetor de expressão pQE- 39 30 e E. coli............................................................................................ 2.11 Determinação dos níveis de IFN-γ em sobrenadantes de células 41 murinas e humanas............................................................................... 2.12 Determinação de anticorpo anti-leishmana no soro............................. 41 2.13 Ensaios com células mononucleares de sangue periférico humano..... 42 2.14 Identificação e alinhamento das seqüências de cDNA......................... 42 2.15 Imunoblots da forma promastigota na fase estacionária e 43 logarítimica e amastigota axênica........................................................ 2.16 Imunoblots de proteínas recombinantes purificadas............................ 43 2.17 Northern Blot........................................................................................ 44 III RESULTADOS 46 3.1 Primeira varredura da biblioteca de cDNA da forma amastigota de 46 Leishmania chagasi com pool de soros de indivíduos com LV........... 3.2 Segunda varredura da biblioteca de cDNA da forma amastigota de 47 Leishmania chagasi utilizando-se células T de camundongos C3H.HeJ............................................................................................... 3.3 Análises das seqüências dos insertos de cDNA................................... 48 3.4 Resposta imune frente às proteínas recombinantes de L. chagasi....... 56 IV DISCUSSÃO....................................................................................... 59 V CONCLUSÃO.................................................................................... 67 VI ABSTRACT........................................................................................ 68 VII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................. 69 VIII APÊNDICE ........................................................................................ AeB I. INTRODUÇÃO 1.1 Considerações gerais As leishmanioses são doenças causadas por protozoários intracelulares obrigatórios pertencentes ao gênero Leishmania. As principais formas clínicas de apresentação são as leishmanioses cutânea (LC), a leishmaniose mucosa (LM) e a leishmaniose visceral (LV). Menos freqüentes são relatadas as leishmanioses cutânea difusa (LCD) e disseminada. Estas formas clínicas de apresentação são causadas por espécies características, apesar de espécies de afecção cutânea poderem cursar com visceralização ou espécies visceralizantes evoluirem com envolvimento cutâneo (1-3). A LC caracteriza-se pela presença de ulcerações da pele no local da picada, geralmente com cura espontânea. O processo de cicatrização da lesão ulcerada tem início dentro de três a seis meses, após o surgimento da lesão primária. A LCD é uma forma rara e complicada da LC que cursa com nódulos cutâneos disseminados por toda a região corpórea. A LM, outra complicação da leishmaniose cutânea, pode surgir anos após a cicatrização da lesão inicial, resultando em ulcerações progressivas e desfigurantes na região nasal e/ou junções mucocutâneas. A LV é a forma mais grave da doença e, caso não tratada, pode levar ao óbito (4). Também conhecida como Kala-azar, na Ásia, a LV é caracterizada por febre prolongada, hepatoesplenomegalia, perda de peso, anemia, pancitopenia e hipergamaglobulinemia. Após tratamento, alguns pacientes (50% no Sudão e 5-10 % na Índia) desenvolvem leishmaniose dérmica pós-kalazar (PKDL) (5;6). A distribuição do flebotomíneo influencia na distribuição geográfica das leishmanioses, sendo estas doenças prevalentes em regiões tropicais e subtropicais de todos os continentes, com exceção da Antártida (7) Vários fatores, como desflorestamento, urbanização e a migração populacional da zona rural para a urbana têm contribuído para o aumento de áreas geográficas das leishmanioses, conforme pode ser observado nas Américas e na África (7). Existe registro de infecção em províncias do norte da Argentina, indicando a expansão significativa desta endemia (8). O número de casos de leishmanioses aumentou consideravelmente em todo o mundo, com cerca de 2 milhões de novos casos por ano, pondo em risco de infecção cerca de 350 milhões de pessoas. São registrados em torno de 500.000 novos casos de leishmaniose visceral, com cerca de 90% deles ocorrendo em Bangladesh, Índia, Brasil, Nepal e Sudão (7). A instabilidade política em algumas localidades como no Sudão resultou em processos migratórios imensos de populações para áreas endêmicas e levando a epidemias, com mais 300 mil casos por ano, acompanhado de um alto índice de mortalidade, decorrente principalmente do não acesso a terapia. Noventa por cento dos casos de leishmaniose mucocutânea ocorrem na Bolívia, Brasil e Peru. Na mesma dimensão, os casos de leishmaniose cutânea estão presentes no Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria, com cerca de 1-1.5 milhões de novos casos relatados anualmente (www.who.int/health-topics/leishmaniasis.htm). O surgimento da epidemia de HIV resultou em crescimento do número de casos de leishmanioses devido à co-infecção pelo vírus HIV, em diversas localidades, principalmente ao longo do Mar Mediterrâneo, área endêmica para Leishmania infantum, onde havia registros de casos esporádicos de leishmaniose visceral, em indivíduos imunocompetentes. São crescentes os casos de co-infecção HIV- Leishmania no sudeste da Europa, distribuídos entre Espanha, Itália, França e Portugal. Nas Américas, o maior relato de casos concentra-se no Brasil, onde a incidência do número de indivíduos HIV positivos tem aumentado significativamente de 0,8 casos/100,000 habitantes em 1986 para 10,5 casos/100,000 habitantes em 1997. Paralelamente a expansão da infecção por HIV, também ocorreu a expansão da infecção por Leishmania de áreas rurais para áreas periurbanas, especialmente no Nordeste do Brasil, aumentando, dessa forma, o risco de co-infecção (9), uma vez que a prevalência de HIV é maior em áreas urbanas. 1.2 Leishmaniose Visceral A LV humana apresenta-se amplamente distribuída por toda a América Latina. No Brasil, a LV está presente na maioria dos estados, com exceção do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, apesar de recentemente terem sido registrados casos de leishmaniose caninos em Santa Catarina e Paraná, demonstrando a franca expansão da endemia. No passado, a leishmaniose visceral estava distribuída em áreas rurais do Nordeste do Brasil e a transmissão ocorria principalmente em pés-de-serra e boqueirões, conforme descrito por Deane e Alencar (10). Nos últimos 20 anos, o perfil de distribuição da LV sofreu modificações consideráveis causadas por mudanças socioambientais e pelo processo migratório da população residente em áreas rurais, nas quais a doença era endêmica, para os grandes centros metropolitanos, como Natal, São Luiz, Teresina, Fortaleza, Aracaju, Rio de Janeiro e Belo Horizonte, onde surtos foram relatados nos últimos 20 anos, resultando em drástica mudança de áreas de risco para infecção por Leishmania chagasi (11-13). Estudos realizados no Nordeste do Brasil demonstraram que a LV causada por Leishmania. chagasi é uma doença de ocorrência na faixa etária infantil, como demonstrado em Jacobina, Bahia, revelando que, em 1986, a incidência anual era de 4,3 casos para cada 1000 crianças menores de 15 anos (14). Esse mesmo perfil foi observado no estado do Rio Grande do Norte onde 68 % dos casos da doença ocorreram na faixa etária abaixo dos 10 anos (15). A incidência da doença nas diversas áreas endêmicas é cíclica e não estão claros os determinantes deste padrão. Fatores abióticos de temperatura, umidade, velocidade do vento e chuva parecem estar relacionados (Ximenes e col., 2006) (16). Apesar de recente área de endemização, em Natal, cíclos de 7 anos parecem ocorrer. Lutzomyia longipalpis é o principal vetor transmissor da L. chagasi nas Américas Central e do Sul (17). No velho mundo o gênero principal é Phlebotomus (18). No Brasil, estudos iniciais demonstraram uma maior incidência do flebotomíneo em regiões do Nordeste brasileiro que apresentam ampla vegetação, ou em áreas submetidas a extenso desflorestamento. A densidade do L. longipalpis é diretamente influenciada por condições ambientais, de moradia e a presença de animais selvagens e domésticos em peridomicílios (19). Em meados dos anos 80, Lainson e col. investigaram o surto de LV ocorrido em localizações próximas a Santarém, Pará. O L. longipalpis foi a espécie de flebotomíneo encontrada na região onde os casos de infecção humana e canina eram mais freqüentes. Seguindo o mesmo estudo, Quinell e Dye, 1994 (20) observaram que na Ilha do Marajó, Pará, ao entardecer, os flebotomíneos aglomeravam-se fora dos domicílios e próximos a abrigos de animais. Isto parece explicar a maior incidência no número de casos de cães domésticos infectados, quando comparados à infecção em humanos, uma vez que os cães passavam a maior parte da noite ao lado de fora das casas (21). Fatores abióticos parecem estar diretamente relacionados com a variabilidade na densidade dos flebotomíneos. A estação chuvosa parece ser um fator crítico no aumento da densidade do L. longipalpis, conforme observado em Minas Gerais. A transmissão da Leishmania ao homem e a uma variedade de roedores e mamíferos incluindo os cães ocorre, através da picada do flebotomíneo fêmea L. longipalpis no momento do repasto sanguíneo. As leishmanias são espécies parasitárias dimórficas pertencentes à ordem kinetoplastida e família Tripanosomatidae. A forma extracelular promastigota apresenta um flagelo livre e longo. A forma promastigota está presente no tubo digestivo dos vetores invertebrados. A forma amastigota, oval ou esférica, encontra-se no interior de macrófagos dos hospedeiros vertebrados (4). As formas promastigotas metacíclicas são regurgitadas do intestino médio para a probóscida do inseto e introduzidas na pele do hospedeiro vertebrado. As moléculas de superfície do parasita, gp63 e LPG, interagem com receptores do complemento CR1 e CR2, respectivamente, presentes na superfície de macrófagos. Uma vez fagocitadas, as formas promastigotas sofrem modificações bioquímicas e metabólicas, perdem o seu flagelo e rapidamente transformam-se em amastigotas. Dentro dos macrófagos, as formas amastigotas multiplicam-se sucessivamente por divisão binária no interior de fagolisossomos. Com intensa carga parasitária, os macrófagos rompem-se liberando formas amastigotas que, por sua vez se aderem a novas células do hospedeiro. 1.3 Mecanismos de resposta imune às infecções Neutrófilos, macrófagos, moléculas co-estimulatórias e uma rede de citocinas formam a primeira linha de defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores, desempenhando papel importante na iniciação e posterior direcionamento da resposta imunológica. Microrganismos ligam-se a macrófagos via receptores de membrana permitindo o englobamento de microorganismos durante a fagocitose. Os receptores manosefucose, presentes na superfície do macrófago, associam-se à glicoconjugados e LPS presentes na parede de bactérias gram-negativas e os receptores CR1 e CR2 auxiliam no processo de fagocitose (22). Diferentes estímulos exercem fundamental importância na diferenciação das subpopulações de macrófagos ativados, através de alterações na expressão gênica. A primeira população de macrófagos (CaMø) é um importante componente da resposta imunológica do hospedeiro e também potente mediador do processo inflamatório. Os macrófagos (Ca-Mø) diferenciam-se em resposta ao efeito sinérgico das citocinas IFN-γ e TNF-α ou, qualquer outro estímulo capaz de induzir a produção de TNF-α. Essas células são capazes de destruir patógenos intracelulares, através da produção de metabólitos tóxicos de nitrogênio e oxigênio (23). A segunda população de macrófagos (AA-Mø) é formada em resposta à ativação das citocinas IL-4 e/ou IL13 do perfil de células Th2, não produzem NO, mas apresentam aumento na expressão de receptores de superfície manose, e estão associadas às doenças parasitárias (24). A última subpopulação (Mø-II) é formada pela presença de imunocomplexos associados aos receptores Fcγ expressos na superfície dos macrófagos. Essa interação permite a inibição da produção de IL-12 por tais células e o aumento da liberação de IL-10 (25). Estudos demonstraram a participação dos macrófagos Mø-II na exacerbação da LV, onde a presença de leishmanias cobertas por IgG parecem induzir a produção de IL-10 por essas células, permitindo a progressão da doença (26). Ainda, são células antiinflamatórias que ao serem utilizadas como APCs, quando em contado com células Th0, são capazes de estimular a produção de células do tipo Th2 produtoras de altos níveis de IL-4 (27). Estudos realizados por Edwards e col., em 2006 (28) demonstraram que as três subpopulações macrofágicas acima descritas apresentam diferenças bioquímicas e funcionais entre sí e são responsáveis pelo direcionamento da resposta imune. As células Mø-II não produzem arginase, sendo incapazes de produzirem uréia, através da utilização da L-arginina, expressam altos níveis de moléculas co-estimulatórias e são eficiente APCs. Ainda, a subpopulação Mø-II regula a expressão do marcador LIGHT, responsável pela transmissão de sinais, contribuindo para a ativação e proliferação das células T. Enquanto isto, células AAMø expressam FIZZ1 ou YM1, marcadores específicos característicos da ativação alternativa dos macrófagos pela IL-4 e/ou IL-13. Seja qual for a subpopulação celular ativada, macrófagos apresentam antígenos através do complexo de membrana formado entre peptídeos e proteínas MHC classe II em associação com moléculas CD28, B7.1, B7.2 que se ligam a receptores de células T (TCR) (29). Após contato com microorganismos, células do sistema imune produzem uma gama de citocinas envolvidas na regulação da resposta imunológica do hospedeiro. Macrófagos ativados produzem IL-12, citocina importante durante o processo infeccioso, determina a duração da resposta imune inata bem como o tipo e a duração da resposta imune adaptativa. O modelo murino de infecção por Leishmania major tem demonstrado a importância da IL-12 em controlar a infecção e a multiplicação parasitária. Camundongos geneticamente resistentes à infecção por L. major, mas deficientes em IL-12, desenvolvem lesões progressivas, com aumento da multiplicação de parasitos (30). Ainda, a IL-12 atua diretamente na ativação das células Natural killer (NK). As células NK são linfócitos citotóxicos que auxiliam macrófagos na primeira linha de defesa contra microorganismos. Desempenham papel importante na resposta imune inata frente a vírus, bactérias e parasitas com produção de IFN- γ, TNF-α, GM-CSF, IL-3 bem como IL-18 (31). A IL-18 produzida por macrófagos e células NK tem contribuído para o controle de infecções causadas por patógenos do tipo Micobacterium tuberculosis, Cryptococcus neoformans e Yersinia enterocolitica (3234). Nessas infecções, a IL-18 parece funcionar como mediadora entre as imunidades inata e adquirida, decorrentes tanto pela ativação de células NK, da proliferação de células Th1, bem como do aumento na produção de IFN-γ. Estudos conduzidos por Maxwell e col., em 2006, demonstraram que a IL-18 parece aumentar a expressão da molécula co-estimulatória CD134 na superfície das células T, permitindo, dessa maneira, a interligação das imunidades inata à imunidade adquirida. O bloqueio de CD134 inibe a expansão de células T efetoras, comprometendo assim a produção de IFN-γ (35). Diferentemente, na, infecção causada por Leishmania major, a IL-18 parece não desempenhar papel importante na formação de uma resposta do tipo Th1. No início da infecção, camundongos geneticamente resistentes, knockout para o gene da IL-18, desenvolvem lesões bem maiores, mas eventualmente conseguem resolver a infecção de forma semelhante aos camundongos controles. Ao término da 10ª semana de infecção, tanto camundongos knockout como controles são capazes de resolverem a infecção por L. major determinada pela presença de IL-12 e IFN-γ (36). Esses dados mostram que, apesar de a IL-18 ter certa influência no controle da lesão cutânea inicial, essa citocina parece não ser fundamental para o desenvolvimento da resposta imune protetora do tipo Th1 nem mesmo parece desempenhar papel chave no controle da infecção por L. major. O IFN-γ produzido pelas células NK parece ser o principal mediador entre as respostas imunes inata e adquirida. Estudos de infecção com Leishmania, em modelos experimentais e humanos, mostraram que o parasito é capaz de inibir a produção de IL-12 por macrófagos, comprometendo a ativação das células NK e,conseqüentemente, a produção de IFN- γ. A falta de IFN-γ liberado por células NK ativadas prejudica a diferenciação dos subtipos de linfócitos. A produção de IFN-γ pelas células NK no início da infecção por L. major é necessária para o controle do crescimento do parasito bem como a diferenciação dos linfócitos Th0 em Th1 (37). Recentemente descoberta, a IL-27 atua em conjunto com a IL-12 na diferenciação dos linfócitos do tipo Th1 (38). O mecanismo pelo qual a IL-27 atua na diferenciação das células Th1 parece depender diretamente do aumento na expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e via ativação do fator de transcrição STAT-1 (39). Como demonstrado anteriormente, a rede de citocinas produzidas em um processo infeccioso permite o elo entre as respostas imunes inatas e adaptativas. Os linfócitos T, B e plasmócitos fazem parte do sistema imune adaptativo e desempenham função imune celular e humoral contra microorganismos invasores. Linfócitos T naive ou Th0 podem diferenciar-se em dois subtipos celulares, Th1 ou Th2, de acordo com o perfil de citocinas presente no momento da infecção. Células de camundongos do tipo Th1 produzem IL-2, IFN-γ e linfotoxinas (LT), ao passo que as células do tipo Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Um padrão similar de citocinas pode ser observado em células humanas, muito embora, a síntese das citocinas IL2, IL-6, IL-10 e IL-13 não esteja diretamente relacionada a um subtipo de linfócitoT específico, como aquele determinado em células de camundongos (40). As células T ativadas por intermédio do ligante para CD40 em associação com citocinas permitem a diversidade da resposta imune humoral. Em células humanas e murinas, citocinas específicas determinam a mudança de classes e subtipos das imunoglobulinas (IgG). Células B humanas naive na presença de IL-4 e IL13 diferenciam-se em plasmócitos produtores de IgG4 e IgE (41) e, quando na presença de IL-10, diferenciam-se em plasmócitos das subclasses IgG1 e IgG3 (42). A IL-10 juntamente com o TGF-β também parecem cooperar na produção de IgA1 e IgA2 (43). 1.3.2. Resposta imune à Leishmania em camundongos Na fase inicial da infecção por Leishmania, macrófagos produzem íons superóxidos (O2-) por intermédio da NAPDH oxidase (44) em resposta à fagocitose do parasito (45). Na segunda fase, na qual a infecção já está estabelecida, macrófagos ativados liberam óxido nítrico (NO) originado da metabolização da arginina, catalizada pela óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (46). O NO é um fator importante na destruição das formas intracelulares presentes no interior dos macrófagos (47;48). Camundongos geneticamente modificados que apresentam rupturas no gene iNOS são mais susceptíveis à infecção por L. major quando comparados a camundongos naturalmente resistentes (49;50) Estudo semelhante demonstrou que camundongos knockout para o gene iNOS apresentavam doença mais severa, quando infectados com L. donovani (50-53). A infecção causada pela Leishmania requer a imunidade celular específica para o controle da infecção. Dependendo do padrão genético de camundongos infectados por Leishmania, a doença pode cursar em fatal/disseminada ou em localizada, com cura espontânea da infecção. Camundongos C57BL/6 resistentes à infecção por L. major produzem altos níveis de IFN-γ e outras citocinas do perfil de resposta Th1, ao passo que camundongos susceptíveis são incapazes de controlar a infecção, com ativação de células do tipo Th2 produtoras de IL-4. O estudo conduzido por Chatelain R. e col., em 1992, demonstrou o papel da IL-4 na condução da resposta imune em camundongos susceptíveis, após a adição de anticorpos monoclonais . A administração do anticorpo monoclonal anti-IL-4 a camundongos BALB/c, no primeiro dia de infecção por L. major, permitiu o desenvolvimento da resposta do tipo Th1, sugerindo que a IL-4 é fundamental para a diferenciação de células Th0 em células do tipo Th2, in vivo. A administração de anti IL-4 modificou o padrão de expressão de citocinas do perfil Th2 para Th1 em camundongos geneticamente susceptíveis (54). Resultado semelhante foi observado em camundongos resistentes C3H/HeN, que, após o tratamento com anticorpo anti-IFN-γ, não foram capazes de controlar a infecção por L. major, desenvolvendo lesões cutâneas com disseminação parasitária em direção ao baço e fígado. A produção de IFN-γ no momento inicial da interação parasita-célula hospedeira parece ser importante para o controle da infecção em camundongos C3H/HeN naturalmente resistentes (55). Além da importância das citocinas IFN-γ e IL-4 em modular a resposta imunológica no controle e exacerbação da infecção por L. major em modelo experimental, a atividade das citocinas TGF-β e IL-10 na inibição de algumas funções macrofágicas também têm sido documentadas (56-58). O TGF-β parece ser a citocina chave na replicação in vitro da Leishmania no interior de macrófagos. Em camundongos, tal citocina é um fator agravante na susceptibilidade à infecção pelo parasito. O tratamento de camundongos CB6F1, infectados por L. major com TGF-β recombinante, levou a um aumento da lesão, com maior número de parasitos presentes, quando comparados a camundongos não infectados, sem alteração no nível de IFN-γ, mas com aumento do nível de IL-4. Por outro lado, a administração de anticorpo anti-TGF-β sozinho ou combinado com rIL-12 permitiu a diminuição e cicatrização mais rápida da lesão (59). A infecção pela Leishmania é caracterizada pela persistência do parasito no interior da célula do hospedeiro, mesmo após a cura da infecção clínica, o que estabelece o risco à reinfecção. Estudos experimentais têm mostrado a implicação da IL-10 na persistência do parasito no interior dessas células. O requerimento da IL-10 em estabelecer latência associado à infecção natural foi confirmada em camundongos C57BL/6, deficientes em IL-10, e camundongos deficientes em IL-4/IL-10, seguido da infecção natural do flebotomíneo infectado. O equilíbrio mantido entre o parasito e o hospedeiro foi estabelecido por células TCD4+ e TCD8+, capazes de produzirem IL-10 e IFN-γ (60). Figura 1. IL-27 (?) TNF-α IFN-γ NK IL-18 IL-12 - Th1 Th1 Th0 - Mø TNF-α IFN-γ Mø Th3 ?? - TGF-β IL-4 Ativação (cura) Th0 Th2 IL-4 IL-10 IL-13 IL-6 Inibição (Doença) FIGURA 1: Perfil das respostas imunes inata e adquirida e a rede de citocinas envolvidas no processo infeccioso. A resposta imune inata representa a primeira linha de defesa do organismo, representada por macrófagos (Mø) e células NK. A resposta imune adquirida específica é representada por linfócitos Th0 e suas subpoplações Th1 e Th2. A resposta mediada por células Th1 é protetora na infecção por Leishmania chagasi, enquanto a resposta mediada por Th2 é exacerbadora da infecção e presente durante a fase sintomática. Adaptação da revisão dos seguintes autores: Wilhelm,P. et col., 2001 (61) ; Badaró.R. e col. 1985 (62); Heinzel, F.P. et col., 1991 (63); Wilson, M.E.,1998 (64); Mathews et col.,2001 (65) ; Badaró,R. et col. 1985 (62); Maxwell,J.R.e col., 2006 (66) e Pflanz,S. e col. 2002(38). Como visto acima, além das células TCD4+, células TCD8+ também parecem contribuir para a defesa do hospedeiro contra a Leishmania. Quando no interior do fagossomo do macrófago, a Leishmania é capaz de induzir a proliferação de células TCD8+ tanto in vitro quanto in vivo. A ativação das células TCD8+ é necessária para proteção frente a esse patógeno. Estudos têm demonstrado a participação das células TCD8+ na resposta imunológica de memória de camundongos resistentes à infecção por L. major e L.donovani. A transferência de células TCD8+ de camundongos resistentes, infectados por L. major, mostrou ser capaz de conferir resposta imune celular específica (DTH) contra antígenos de Leishmania a camundongos singênicos (67). Também, camundongos geneticamente resistentes, capazes de resolverem espontaneamente a infecção por Leishmania, desenvolvem lesões severas quando anticorpos anti-anti-CD8+ são administrados no momento da reinfecção (68). As células TCD8+ também desempenham função importante na resposta imunológica de memória de camundongos geneticamente resistentes CBA e camundongos BALB/c susceptíveis. Camundongos BALB/c tornam-se resistentes após administração anticorpos monoclonais anti-CD4, na fase inicial da primo-infecção (69). Nesses camundongos, as células TCD8+ são produtoras de altos níveis de IFN-γ em resposta à reinfecção por L. major. Em outro estudo, Belkaid e col., em 2002 (70), utilizando o modelo que mais se assemelha à infecção natural por flebotomíneos, descreveram a importância das células TCD8+ também no controle da primoinfecção e não somente na resposta imunológica de memória de camundongos C57BL/6 infectados por L. major. Nesse estudo, camundongos resistentes, mas deficientes em células TCD8+ não foram capazes de controlarem o crescimento do parasito no local do inóculo, quando infectados com baixas doses da forma promastigota metacíclica de Leishmania no início da infecção. A resolução da infecção em camundongos controle C57BL/6 estava associada ao alto número de células TCD8+ presentes na derme e a alta freqüência de células TCD8+ em linfonodos capazes de produzirem IFN-γ em resposta aos antígenos do parasito. Também, a transferência de células TCD8+ de camundongos resistentes para camundongos RAG, deficientes em células T e B foi capaz de conferir resistência à infecção por L. major nesses camundongos. Como descrito acima, estudos têm demonstrado não somente a presença das células TCD4+ na participação do processo infeccioso da Leishmaniose, mas também a função das células TCD8+. Por ser um parasito intracelular, antígenos processados de Leishmania devem ser apresentados às células TCD8+ em associação com o complexo MHC classe I. No mecanismo clássico de apresentação de antígenos endógenos em associação ao complexo MHC classe I, o antígeno é processado por digestão proteolítica no citosol, com a participação do complexo multiprotéico citoplasmático. Esse complexo é responsável pela degradação das proteínas citoplasmáticas ubiquitinadas, gerando grande parte dos peptídeos destinados à exibição pelas moléculas de classe I. Uma vez processados, os peptídeos antigênicos são transportados do citoplasma celular para o retículo endoplasmático (RE) pelas moléculas do TAP. No RE, os dímeros do complexo MHC classe I ligam-se aos peptídeos antigênicos liberados pelo complexo TAP. Essa associação estabiliza o complexo MHCI permitindo o seu deslocamento para fora do RE, passando pelo complexo de Golgi, migrando então para a superfície celular. Uma vez depositado na membrana plasmática da célula, o complexo MHC classe I/peptídeo é reconhecido pelos linfócitos T CD8+ (71). No entanto, para o processamento de antígenos de Leishmania, em associação com o complexo MHC classe I, o mecanismo clássico descrito acima, envolvendo o complexo de moléculas TAP, parece ser dispensável. O estudo realizado por Bertholet, S. e col., em 2006 (72), em camundongos C57BL/6, mostrou que, mesmo com células dendrídicas (DC) knockout para o complexo TAP, infectadas com a molécula L.major-nucleotidase-ovalbumina (OVA), a proliferação de células T de camundongos foi tão eficiente quanto aquela induzida por DCs controles. A proliferação celular também foi medida através da produção de IFN-γ pelas células T. Ainda, a apresentação do peptídeo SIINFEKL por DCs infctados pela molécula Lm NT-OVA também não foi afetada pela ausência do complexo TAP, in vitro, sugerindo que o mecanismo convencional de apresentação de antígenos associado ao complexo MHC classe I não é necessário e possivelmente não seja utilizado para apresentação desse antígeno em particular. Quando esse mesmo estudo foi realizado para a apresentação de antígeno de L.major por células TCD8+ ativadas, in vivo, a ausência do complexo TAP não interferiu na apresentação e processamento dos antígenos de L. major. Fato relevante, a função protetora das células TCD8+ responsáveis pela imunidade adquirida frente à infecção por L. major também não foi comprometida pela ausência desse mesmo complexo. Com isso, provavelmente, a apresentação de antígenos de Leishmania parece não seguir o caminho fagossomo-citosol como descrito por outros patógenos intracelulares, a exemplo do Toxoplasma gondi. O mecanismo de apresentação de OVA por DCs transfectadas com T. gondii é totalmente dependente do complexo enzimático TAP e de enzimas proteossomais, consistentes com os resultados obtidos por Gubbels et al, 2005 (73). A inibição do processamento e apresentação de antígenos dependente do complexo TAP, por antígenos seqüestrados para o fagossomo da Leishmania, apresenta-se como uma estratégia do parasito em determinar o recrutamento tardio das células TCD8+, como demonstrado por Belkaid e col., 2002, na infecção de camundongos por L. major. 1.3.3. Resposta imune à Leishmania em humanos Os estudos experimentais em camundongos infectados por L. major contribuíram para o delineamento e compreensão dos fatores envolvidos na imunologia da leishmaniose em seres humanos, apesar de existirem diferenças entre a evolução frente à infecção por Leishmania nestas espécies. Nas leishmanioses cutânea (LC) e mucosa (LM) causada pela L. braziliensis, a multiplicação parasitária é controlada pela resposta do tipo Th1 forte. A caracterização dessa resposta é decorrente da proliferação de células TCD4+ frente a estimulação por antígenos de leishmania, com produção de IFN-γ e TNF-α (74) . É importante salientar que indivíduos com LC, além de apresentarem altos níveis IFN-γ e TNF-α, também apresentam níveis detectáveis de IL-10 (75), sugerindo que a clínica da doença esteja relacionada ao controle dos mecanismos de eliminação do parasito, associada ao controle da resposta imune inflamatória exacerbada (76). Em indivíduos com LM, a resposta linfoproliferativa e os níveis de IFN-γ e TNF-α apresentam-se ainda mais acentuados frente à estimulação antigênica (77). Provavelmente, a exacerbação da resposta imunológica inflamatória nesses indivíduos seja decorrente do desequilíbrio na modulação da resposta imune. Estudos demonstraram que a destruição tecidual seria determinada pela alta produção das citocinas inflamatórias IFNγ, TNF-α, e IL-10. A adição de IL-10 em culturas in vitro permite a modulação das células de indivíduos com LC, mas não com LM. A não responsividade dos indivíduos com LM frente à adição de IL-10 seja talvez devido à exacerbação na produção de IFN-γ nesses indivíduos que modula negativamente a expressão do receptor de IL-10 nos linfócitos. Conseqüentemente, esses indivíduos apresentam pouca habilidade em produzir IL-10 em resposta à estimulação antigênica. A IL-10 e TGF-β são importante citocinas imunossupressoras dos linfócitos Th1 e, mesmo assim, não conseguem modular a forte resposta do tipo Th1 gerada nos indivíduos com LM (78). Indivíduos com LV podem apresentar manifestações clínicas variadas como resolução espontânea da infecção, com desenvolvimento de uma resposta imune celular do tipo tardia (DTH+), característica do perfil Th1, à leishmaniose visceral, evoluindo com ausência de uma resposta DTH e presença de níveis elevados de IL-10, séricos e celular. Células de sangue periférico de indivíduos que evoluem para leishmaniose visceral são caracterizadas pela ausência de proliferação celular contra antígenos de Leishmania e a incapacidade de produção de linfotoxinas. As células T desses indivíduos não estão totalmente suprimidas, pois proliferam frente ao estímulo com mitógenos estimuladores de células T, mas são não responsivas a antígenos específicos de Leishmania. Nos pacientes com LV, as células do tipo Th1 estão suprimidas, com conseqüente diminuição da produção de IL-2, IFN-γ e IL-12 (79). A restauração da resposta imune proliferativa nesses indivíduos, com aumento na proliferação de linfócitos, pode ser observada ao adicionar-se IFN-γ a cultura de células isoladas destes pacientes. O aumento das células T também pode ser detectado após adição de anticorpos monoclonais anti-IL-10 (80). Esses dados indicam que a restauração das células Th1 em pacientes com LV é possível, sendo, bloqueadas pelo efeito inibitório de citocinas do perfil de resposta Th2 presentes no momento da infecção. Como demonstrado acima por diferentes estudos, a importância das células TCD8+ em modelos experimentais e os dados observados durante o processo de infecção humana também confirmam a participação das células TCD8+ no controle da infecção causada pela Leishmania em humanos. Quando linfócitos TCD8 humanos são re-estimulados in vitro com antígenos de L. amazonensis, observa-se a produção de IFN-γ característico do perfil de resposta do tipo Th1 (81;82). Também, indivíduos que desenvolvem a forma mucocutânea da doença apresentam linfócitos T com alta atividade citolítica, in vitro, quando em contado com macrófagos infectados por Leishmania (83). Os resultados dos estudos tanto em modelos experimentais como em células humanas, in vitro, demonstram a importância dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e citocinas no processo de controle da infecção por Leishmania, através da indução de citocinas do perfil Th1. 1.3.4. Resposta imune frente a outros microorganismos intracelulares Assim como na imunidade frente à infecção por Leishmania, a resposta imunológica contra outros micoorganismos intracelulares é também controlada pela subpopulação de linfócitos efetores TCD4+ e TCD8+, responsáveis pela imunidade mediada por células. Vários estudos têm ressaltado a participação das células TCD8+ na imunidade celular contra patógenos intracelulares além da Leishmania. As células TCD8+ residentes em tecidos linfóides e sofrem diferenciação celular e mudanças fenotípicas que permitem a caracterização em dois subtipos celulares, as células TCD8+ de vida curta e as células TCD8+ efetoras (84;85). As células TCD8+ de vida curta predominam na maior parte da fase logarítmica de multiplicação celular, migrando para tecidos periféricos onde desempenham sua função efetora. As células de memória de vida longa desempenham funções distintas de acordo com o subtipo celular desenvolvido. As células TCD8+ efetoras, com limitada capacidade de expansão, migram para os tecidos periféricos atuando diretamente sob a célula-alvo, ao passo que as células TCD8+ de memória destinam-se aos órgãos linfóides, multiplicam-se rapidamente quando em contato pela segunda vez com o antígeno (86). O processamento e a apresentação de antígenos derivados da maioria dos patógenos intracelulares, em associação com o complexo MHC classe II, pelos linfócitos TCD8+, seguem o mecanismo clássico dependente do complexo de moléculas TAP. Partículas antigênicas derivadas de proteínas citosólicas são transportadas para superfície celular em associação com moléculas do complexo MHC classe I. Na infecção causada por vírus, a destruição da célula hospedeira infectada é realizada antes que a multiplicação viral seja completa, impedindo, assim, a infecção de novas células do hospedeiro. As células T citotóxicas induzem morte das células alvo infectadas, através da produção de INF- γ e TNF-α (87), ou pela liberação de grânulos de perforinas. Um outro processo de morte celular, por apoptose, ocorre através da estimulação de receptores faz, na superfície das células T, e sua interação com o seu ligante para Fas (88). A efetivação da resposta envolve a ativação de caspases, responsáveis pela degradação do DNA nuclear, levando à apoptose da célula infectada. Por outro lado, as células efetoras TCD4+ ligam-se a derivados antigênicos originados de vesículas no interior dos macrófagos associados a moléculas do complexo MHC classe II ou produtos internalizados por células fagocíticas ou células B. Após reconhecimento do antígeno, as células TCD4+ tornam-se ativadas, diferenciando-se nas subpopulações Th1 ou Th2, de acordo com o perfil de citocinas envolvido no momento da infecção (89). A interação entre as duas populações de linfócitos TCD4+ e TCD8+ no controle da infecção por Mycobacterium tuberculosis foi demonstrada em modelo murino, após a deleção de genes do complexo MHC classe II ou após a remoção do timo. A deleção do gene para a produção de IFN-γ permitiu multiplicação bacteriana em cultura de células de camundongos. Esse resultado foi decorrente da inibição da expansão policlonal de células TCD4+ e conseqüente produção de IFN-γ e conseqëentemente, a ativação dos linfócitos TCD8+ pelo IFN-γ foi impedida, ocasionando a ausência de atividade lítica contra as células infectadas (90). Através do uso de anticorpos monoclonais, foi possível avaliar também a função das células TCD8+ no controle e multiplicação do Plasmodium yoelli, em células de baço e fígado de camundongos infectados. A deleção das células TCD4+ não foi capaz de reduzir a imunidade contra o parasito; no entanto, a adição de anticorpo monoclonal anti-CD8+ aboliu completamente a imunidade protetora contra o plasmódio. Na infecção causada por Tripanossoma cruzi, as células TCD8+ parecem reconhecer antígenos em infiltrados inflamatórios de camundongos infectados. Igualmente, em indivíduos na fase crônica de infecção, observa-se a presença marcante das células TCD8+ decorrente da estimulação de antígenos isolados da superfície do T. cruzi (91) Em certos casos, como na miocardite, as células T podem auxiliar na exacerbação da resposta imunológica ocasionando lesões teciduais ou processos auto-imunes, como naquela observada na miocardite chagásica. Pesquisadores têm considerado a participação de um processo auto-imune na doença de Chagas crônica l. Quando observaram que as células TCD4+ cultivadas in vitro, extraídas do baço de camundongos com doença crônica reagiram fortemente com extratos de células cardíacas alogênicas e singênicas de camundongos. As células T reativas foram capazes de destruir mioblastos in vitro. Também foram capazes de induzir miocardite em camundongos atímicos sensíveis à infecção por T.cruzi, mesmo com a ausência completa do parasito (92). A imunidade celular é também responsável pelo controle da infecção causada pelo Toxoplasma gondii. No início da infecção, as células NK e Th1 produzem IFN-γ capazes de inibir a multiplicação do parasito no interior da célula do hospedeiro. Na fase crônica da doença, a grande produção de IFN-γ é decorrente da ativação das células Th1 antígeno específica contra o patógeno. O alto nível de IFN-γ celular nessa fase é importante para a inibição da reativação da forma cística infectante do T. gondii (93). A eficácia da resposta imune mediada por células TCD8 e TCD4 na infecção pelo T. gondii foi demonstrada também pelos estudos realizados por Dankers e Gazzinelli em 1998 (94). A deleção dos linfócitos TCD8+ de camundongos infectados com T. gondii aboliu parcialmente a resistência desses animais frente ao patógeno, ao passo que a eliminação das células TCD4+ parece não ter alterado a imunidade protetora frente a esse microorganismo. 1.4. Diagnóstico O quadro clínico da LV é caracterizado por febre prolongada, hepato-esplenomegalia, perda de peso, anemia, astenia, infecções secundárias por vírus, bactérias e fungos, diarréia, tosse e adinamia importante. Ocorrem alterações importantes na função medular óssea em virtude do intenso parasitismo, tendo como conseqüência leucopenia, anemia e plaquetopenia em graus variados ou mesmo pancitopenia. A velocidade de sedimentação das hemácias está elevada em virtude da alta quantidade de anticorpos presentes, observada pela inversão no padrão de albumina e globulinas plasmáticas. O diagnóstico padrão da LV é a identificação parasitológica em aspirados de tecidos, como a medula óssea e baço (11). Embora esse método apresente boa sensibilidade, 60-85% e 95%, respectivamente, são métodos invasivos e requerem pessoas capacitadas e treinadas para a execução. Com as limitações dos métodos acima, o avanço da biologia molecular tem permitido o desenvolvimento de técnicas que contribuem para o diagnóstico da LV, apesar de não serem métodos sistematicamente utilizados no diagnóstico da doença. Laboratórios de pesquisas têm trabalhado no desenvolvimento e padronização de novas técnicas e procedimentos que visam à rapidez e eficácia dos métodos diagnósticos empregados. A reação de polimerase em cadeia (PCR), como método de diagnóstico, tem demonstrado variações em relação à especificidade e sensibilidade (95;96). A técnica objetiva a detecção de seqüências conservadas do DNA de Leishmania. Com o desenho de primers específicos para tais seqüências, é possível detectar o DNA de minicírculo, kDNA, presente em várias cópias no cinetoplasto do parasito. Um estudo realizado no Sudão mostrou que a técnica de PCR foi o método mais sensível na detecção de Leishmania em culturas de linfonodos e aspirado de medula óssea. No entanto, a sensibilidade diminui quando amostras de sangue foram utilizadas (97). Por outro lado, outro estudo mostrou a eficácia da PCR em diagnosticar presença de Leishmania em sangue de indivíduos que apresentam lesão dérmica pós-calazar (PKDL) (98). Os métodos sorológicos têm sido amplamente utilizados no diagnóstico de doenças infecciosas. As técnicas são altamente sensíveis e específicas, dependendo do tipo de antígeno ou epitopo utilizado. Atualmente, o ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido o método proposto para o diagnóstico da LV. O sobrenadante da suspensão de antígenos de Leishmania da forma promastigota apresenta sensibilidade que varia de 80-100%. No entanto, reações cruzadas em soros de indivíduos com doença de Chagas, tuberculose e toxoplasmose têm sido documentadas (99). Por outro lado, a utilização do antígeno recombinante K39 (rK39), proteína especifica do complexo donovani, tem demonstrado alta especificidade e sensibilidade na detecção de anticorpos para o diagnóstico da LV pelo método do ELISA. Os níveis altos de anticorpos gerados contra o K39 correlacionam-se com a fase aguda da doença (100). A presença de anticorpo anti-k39 foi detectada em apenas 2,9% dos indivíduos assintomáticos com resposta imune celular positiva (DTH+), frente a antígenos de Leishmania (101). O resultado de reações sorológicas para diagnóstico de infecção por Leishmania deve ser interpretado com cuidado em pacientes co-infectados pelo vírus HIV, em virtude da intensa imunossupressão induzida pelo vírus, que pode repercutir na produção de anticorpos. A baixa detecção de anticorpos por métodos sorológicos em indivíduos co-infectados com HIV e VL é uma característica marcante, cerca de 43%-78% desses pacientes não apresentam atividade detectável de anticorpo anti-Leishmania (102). Estes resultados são contrários aos observados em indivíduos imunocompetentes com LV, nos quais os altos valores de anticorpos anti-Leishmania são característicos de fase aguda da LV. Os métodos sorológicos convencionais, o teste de imunofluorescência indireta (IFAT) e o ELISA utilizando-se a proteína rK39 apresentam baixa sensibilidade no diagnóstico da LV, em indivíduos coinfectados. Tais métodos também têm demonstrado limitada capacidade na detecção do estabelecimento e futura evolução da co-infecção por Leshmania em pacientes com o vírus HIV-1. Estudos realizados por Medrano e col., em 1998 (103) demonstraram que pela técnica IFAT, títulos significativos de anticorpos foram observados em apenas 11% dos indivíduos HIV-1 positivos co-infectados com Leishmania. O ELISA utilizando-se a proteína rK39 foi positivo em apenas 22% dos pacientes avaliados. 1.5. Tratamento O antimonial continua sendo o medicamento de escolha para o tratamento de pacientes com LV, apesar do aumento de notificação de casos de resistência à droga em muitas localidades. O antimonial pentavalente apresenta efeitos tóxicos para o paciente e requer longo período de tratamento. O tratamento é feito na dosagem de 20 mg/kg/dia, durante 20-30 dias (104). O mecanismo pelo qual o antimônio atua na regulação ou morte da leishmania é decorrente da redução da forma pentavalente, Sb (V) à forma trivalente ou enzimaticamente ou por grupamento tiol presente no interior de macrófagos do hospedeiro. Tal processo ocorre no interior do macrófago ou diretamente na Leishmania. (105;106). Em casos de resistência, a anfotericina B é a segunda droga de escolha no tratamento da Leishmaniose. Altamente eficaz, atua diretamente na síntese de esteróis presentes na membrana das diferentes espécies de leishmania (107). A anfotericina B também apresenta efeitos tóxicos, sendo necessário internamento do paciente e monitorização cuidadosa da função renal. A outra alternativa, anfotericina lipossomal B, consiste de um tratamento menos tóxico para o paciente e com alta eficácia. A dose de anfotericina lipossomal B tem variado de região para região. Na Índia, a dose de 3,5 mg/kg em cinco dias consecutivos, tem apresentado alta incidência de cura. Em outro estudo, a administração de uma dose única com 15 mg de anfotericina B lipossomal também apresentou cura satisfatória em indivíduos doentes (108). A forma lipossomal da anfotericina B é a droga de escolha para o tratamento de Leishmaniose nos Estados Unidos. No entanto, devido ao seu alto custo, seu uso sistemático, no Brasil e em outros países, é proibido. Recentemente, a miltefosine, primeira droga oral com atividade leishmanicida, foi demonstrada ser eficaz para o tratamento da LV em Bihar, Índia. Com a administração de 50-100mg/dia (2,5 mg/peso) por 4 semanas, a droga tem apresentado efeito satisfatório tanto em indivíduos refratários ou não ao antimonial. A miltefosine apresenta efeitos gastrointestinais brandos, como vômitos e diarréias (109). Ensaios clínicos de fase II com o uso da miltefosine estão em andamento em Minas Gerais e Teresina, Brasil, sob a coordenação do Dr. Reinaldo Dietze, do Espírito Santo. Ainda não há estudos conclusivos com relação à dose e terapêutica da droga em indivíduos com LV, de áreas endêmicas, no Brasil (110). Devido aos problemas de toxicidade, hospitalização dos pacientes, aumento no número de casos de resistência aos tratamentos disponíveis para a LV, é evidente a necessidade de um tratamento novo ou alguma outra estratégia que possa atuar em conjunto com os tratamentos e métodos disponíveis atualmente. 1.6. Desenvolvimento de Vacinas A maioria das doenças causadas por vírus e bactérias apresenta sucesso na vacinação decorrente da resposta imune humoral longa e duradoura caracterizada pela produção de anticorpos capazes de eliminarem o microorganismo. Na Leishmaniose, assim como em outras doenças causadas por patógenos intracelulares, a vacina ideal deve induzir uma resposta imune celular capaz de eliminar o parasito. A imunidade adaptativa mediada por células é responsável pela cura de doenças causadas por patógenos intracelulares como a Leishmania e Micobactéria. A persistência do patógeno no interior da célula hospedeira com concomitante resistência do hospedeiro a reinfecção é uma característica marcante (111). A resistência desses indivíduos no processo de reinfecção é determinada pela ativação de uma resposta imune celular de memória, específica contra o patógeno. Esse fato indica que o desenvolvimento de uma vacina contra essas doenças é possível. O desenvolvimento de vacinas contra esses patógenos tem sido difícil, em virtude da complexidade na identificação de antígenos específicos capazes de induzir resposta imune celular longa e duradoura. A resolução da infecção primária por Leishmania está associada à imunidade longa e duradoura das células TCD4+ frente ao processo de reinfecção. Provavelmente, devido ao pouco conhecimento dos mecanismos de manutenção dessas células TCD4+ de memória, ainda não há uma vacina eficaz contra a Leishmaniose. A resposta do hospedeiro frente à infecção por Leishamania é dependente do tipo celular e do perfil de citocinas produzidas. O modelo murino de infecção funciona como excelente ferramenta na compreensão da forma pela qual a resposta imune contra a Leishmania se desenvolve e como ela é regulada. Toda atenção tem sido dada em relação a ativação e diferenciação das células T, e o arsenal de citocinas envolvido no processo de resolução da infecção em camundongos (112). Camundongos C57BL/6 infectados com L. major são resistentes em virtude da presença da subpopulação de linfócitos T regulatórios CD4+CD25+. Durante a infecção, essas células acumulam-se na derme impedindo que as células T CD4+CD25- eliminem as Leishmanias no sítio da infecção. Tal atividade é mediada por mecanismos dependentes e independentes da IL-10. O balanço entre as células T efetoras e as células T regulatórias deve ser mantido como forma de manutenção, tanto da multiplicação parasitária, como das células do hospedeiro para controle da infecção. As células T regulatórias permitem a manutenção de uma carga parasitária baixa, mantendo o parasito no interior das células em estado de latência (113) Em humanos, tem-se observado também a correlação dos linfócitos T e o perfil de citocinas produzidos no momento da infecção, embora observe-se que não há um padrão bem definido entre a resistência/susceptibilidade à Leishmania com o perfil de citocinas produzido. Biópsias de lesões de indivíduos com LC localizada e reação positiva para o teste de Montenegro mostram a produção de RNAm para citocinas IFN-γ e IL-2, característicos do perfil de resposta Th1. Enquanto isso, forma crônica e desfigurante, a mucocutânea, encontra-se uma mistura de citocinas do perfil Th1 e Th2, com abundância de RNA mensageiro para IL-4 (114). Em áreas endêmicas para a LV, a maioria dos indivíduos infectados, residentes em áreas endêmicas, desenvolve cura espontânea da infecção, com desenvolvimento de reação de hipersensibilidade positiva (DTH+) para o teste de Montenegro (115) e produção de células do tipo Th1 produtoras de IFN-γ. Por outro lado, a minoria dos indivíduos infectados não é capaz de resolver a infecção, desenvolvendo a forma clássica da doença. As células T desses indivíduos não respondem a estímulos antigênicos, não sendo capazes de produzirem INF-γ contra antígenos de Leishmania. Esse dado tem sugerido que, no início da infecção, a ausência de INF-γ pode estar envolvida com a progressão da doença nesses indivíduos. No entanto, após a cura da doença, células de sangue periférico (PBMC) desses indivíduos respondem à estimulação com extrato bruto de Leishmania e produção de IFN-γ. Portanto, após a resolução da doença, há restauração da resposta do tipoTh1 com produção de IFN-γ nesses indivíduos (116). Ao avaliar o perfil de resposta imunológica em modelos experimentais e em indivíduos com variadas formas clínicas de Leishmaniose, observa-se que a maioria deles desenvolve cura espontânea da infecção. Até mesmo os indivíduos com LV conseguem reverter o perfil de resposta Th2 para Th1, após a cura da doença. Essa resposta é específica contra antígenos do parasito. Portanto, vários estudos têm dado atenção para essa imunidade celular protetora, com o intuito de se obter uma vacina eficaz e segura, através da identificação de antígenos de Leishmania capazes de induzir a resposta imune longa e duradoura, necessária para a proteção contra as Leishmanioses. A leishmanização compreendeu o primeiro processo para averiguação da resposta imune celular específica contra antígenos de Leishmania em humanos, como método de vacinação. Tal procedimento utilizava a inoculação, em indivíduos sadios, de cepas virulentas do parasito extraídas de lesões ativas de pele (117). Com a inoculação de formas promastigotas vivas de Leishmania, os indivíduos desenvolviam lesões cutâneas após a imunização (118). Apesar da formação de úlceras na pele, esse processo era capaz de induzir uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia nos indivíduos imunizados, mas não era eficaz contra subseqüente infecção natural pela Leishmania (119). O processo de Leishmanização resultava no desenvolvimento de lesões cutâneas extensas, exacerbação de psoríases, dentre outras doenças de pele, e até mesmo imunossupressão desses indivíduos. Decorrente desses agravantes, a utilização de Leishmanias originadas de lesões como método de vacinação foi interrompido e o interesse partiu para a utilização de parasitos mortos como forma de imunização (120). Um estudo duplo-cego realizado em crianças residentes no Equador demonstrou que a imunização com duas inoculações intradérmicas de um coquetel de promastigotas mortas juntamente com o bacilo Calmette-Guerin (BCG), como adjuvante, foram capazes de induzir a reação positiva para o teste de Montenegro, mostrando a eficácia da vacinação em torno 72,9% (121). Um outro estudo realizado no Irã verificou que uma mistura de L. major autoclavada em associação com BCG não apresentou a imunogenicidade eficaz esperada. Provavelmente, múltiplas doses de vacina ou até mesmo outros adjuvantes deveriam ser levados em consideração para um possível aumento na eficácia de proteção medida a partir do teste intradérmico positivo (122). Estudos realizados no Brasil avaliaram a eficácia e imunogenicidade da vacina contra a leishmaniose tegumentar, com preparações de formas autoclavadas e não autoclavadas, de promastigotas mortas de Leishmania amazonensis. Indivíduos com reação negativa no teste intradérmico, imunizados com formas não autoclavadas de L. amazonensis, apresentaram positividade no teste após imunização; no entanto, 40 dias após a imunização dos indivíduos, a produção de células TCD8+ reativas de memória em PBMC desses indivíduos não superou a quantidade de células observada em outros estudos (123). Após vários estudos utilizando-se formas de Leishmanias vivas ou mortas como método de vacinação contra as leishmanioses, fatores relevantes à imunogenicidade, eficácia, produção, distribuição e estabilidade dessas vacinas têm sido abordados. Muitas vacinas mantêm imunogenicidade somente por um ano quando mantidas a 4º C. A composição bioquímica das mesmas é alterada durante o período de estocagem, sugerindo a degradação de proteínas do parasita. A degradação protéica também ocorre nas vacinas submetidas à autoclavação, o que diminui a eficiência na conversão do teste intradérmico após, a vacinação (123). A manipulação genética do genoma de Leishmania possibilitou gerar microorganismos vivos e atenuados, através da deleção de genes fundamentais para multiplicação do parasita no interior da célula do hospedeiro, sem a capacidade de gerar doença, como é o caso do gene codificador da enzima dihidrofolato timidilato redutase sintetase (DHFR-TS). Estudos em camundongos infectados tanto por L. major quanto L. amazonensis geneticamente modificados, com ausência do gene DHFR-TS, apresentaram resultados satisfatórios contra a re-infecção por Leishmania (124;125). O estudo anterior demonstrou dados satisfatórios em relação ao uso de parasitas vivos atenuados em modelos experimentais como forma de imunização. Contudo, deve-se levar em consideração que para a utilização desse método de vacinação, cuidados extremos devem ser adotados em relação a estocagem, ao armazenamento e ao transporte das cepas produzidas para a imunização dos indivíduos em áreas endêmicas para a Leishmaniose. Ainda, embora haja a produção da vacina com microorganismos vivos e atenuados, a produção em larga escala poderia tornar-se inviável e ser de difícil aplicabilidade. As vacinas de segunda geração contra as leishmanioses contêm DNA de antígenos ou peptídeos de Leishmania associados a plasmídeos vetores. Alguns desses antígenos são específicos durante o ciclo de vida do parasito, mas outros são compartilhados entre as duas fases da Leishmania, as formas promastigota e amastigota. O processo de vacinação com DNA parece ativar citocinas pro-inflamatórias em resposta a seqüências imunoestimulatórias presentes no DNA dos plasmídeos. Gurunathan e col., em 1997 (126) utilizaram vacinas de DNA codificadoras do antígeno LACK (DNA-LACK). O antígeno LACK parece estar envolvido na ativação inicial da resposta imune, com a produção de células T específicas produtoras de IL-4 frente à infecção por Leishmania. A imunização de camundongos com a vacina DNA-LACK ou a proteína LACK purificada em associação com IL-12 foi capaz de conferir proteção satisfatória em camundongos frente à infecção por L. major. O controle da infecção foi associado à capacidade de redução da carga parasitária no sítio do inóculo, bem como a produção específica de IFN-γ por células Th1. Ainda, a depleção de células TCD8+ no momento da vacinação também diminuiu a eficácia da proteção observada após a infecção dos camundongos com L. major (126). A protease de membrana, gp63, foi o primeiro antígeno recombinante a ser utilizado como vacina. A gp63 é considerada um fator de virulência do parasito e atua como receptor de membrana, permitindo a internalização da Leishmania no interior do macrófago. O estudo realizado por Conell e col.,em 1993 (127) avaliou a resposta imune de camundongos BALB/c e CBA/J frente a este antígeno. O gene codificador da gp63 foi clonado e expresso como proteína citoplasmática em BCG recombinante. Os camundongos foram inoculados com uma única dose da vacina, seguida da infecção por L. major e L. mexicana. A resposta protetora do tipo Th1 foi observada nos camundongos infectados com as duas espécies de Leishmania, mas apenas em camundongos BALB/c o crescimento ou a multiplicação da L. major foi um pouco mais lento e controlado. Outros estudos em modelos experimentais demonstraram que a utilização da proteína gp63, recombinante ou somente a proteína purificada, induz uma resposta protetora mais eficaz contra a L. amazonensis do que contra a L. major, sugerindo a indução de resposta imune espécie específica (128). O gp46/M2 é expresso na superfície de membranas de todas as espécies de leishmania com exceção da L. braziliensis (129). Os produtos de expressão dos genes que codificam esse antígeno são distintos e expressos tanto na forma amastigota como promastigota da L. major e L. donovani, mas restrito apenas à forma promastigota da L. mexicana. A expressão desse antígeno na maioria das espécies e formas da Leishmania faz desse antígeno um forte candidato como subunidade de vacina contra as leishmanioses. Camundongos CBA imunizados com a glicoproteína M2 mais o adjuvante C. parvum desenvolveram proteção completa após infecção com L. amazonensis. Por outro lado, a proteção não foi observada em BALB/c após a imunização (130) Uma nova abordagem no desenvolvimento de vacinas contra patógenos intracelulares tem sido o uso de varredura de bibliotecas genômicas do parasito. Estudos com varredura de biblioteca de cDNA de Leishmania permitiu a identificação da proteína TSA de L. major, homóloga à proteína de eucarioto tiolantioxidante específica (131). Estudos de imunização em murinos e testes sorológicos humanos foram realizados para testar a eficácia da proteína TSA, como forte candidato à vacina contra a Leishmania. A proteína TSA, formulada juntamente com a IL-12, foi capaz de conferir imunidade em camundongos BALB/c após infecção com L. major (131). Em humanos, 50% dos indivíduos com LC e LV apresentavam anticorpos contra a proteína recombinante TSA. Quando estimulados in vitro com a proteína recombinante, PBMCs da maioria dos indivíduos com LM e LV apresentaram um alto índice de proliferação quando comparados aos ensaios contendo somente PBMCs e meio de cultura. Devido as células de sangue periférico de indivíduos doentes terem sido estimuladas quando em cultura com o antígeno TSA e, cerca de 50% desses pacientes apresentaram níveis elevados de anticorpo contra tal proteína, esses resultados demonstram que algum epitopo em comum desse antígeno possa ser compartilhado entre as espécies L. braziliensis, L.major e L. chagasi (131). O antígeno LMSTI1 foi também isolado através da varredura da biblioteca de cDNA da forma amastigota de L.major. Este antígeno foi capaz de induzir resposta proliferativa forte em células de linfonodos de camundongos BALB/c 10 e 28 dias após infecção por L. major (132). A proteína recombinante LeiF de L. braziliensis também foi testada em camundongos susceptíveis,antes da infecção por L. braziliensis, constatando-se a sua eficácia como potente indutor da resposta Th1 caracterizada pela presença das citocinas IL-12, IL-18 e IFN-γ (133). O estudo conduzido por Sheiky Y. e col.,em 2002 (134) demonstrou a eficácia da vacina poliproteica constituída pelos antígenos TSA, LMSTI1 e LeIF ( Leish-111f), juntamente com o adjuvante MPL-SE®. A imunidade de camundongos foi alcançada num período de 14 semanas após a infecção por L. major (135) Se bem que diversos trabalhos demonstrem a eficácia de certos antígenos frente à infecção por Leishmania, atualmente não há uma vacina segura e eficaz, que possa induzir imunidade longa e duradoura contra as leishmanioses em humanos e cães. Devido ao fato de a Leishmania ser um parasita complexo capaz de alterar suas características antigênicas tanto in vivo quanto in vitro (136), a vacina ideal para a prevenção e controle das leishmanioses deve conter uma mistura de antígenos de Leishmania que seja eficaz contra as diferentes formas de leishmanioses. Para o desenvolvimento clínico e profilático de uma vacina, deve-se levar em consideração a sua segurança e imunogenicidade quando administrada em voluntários sadios. Em virtude dos dados mostrados na literatura em relação a antígenos de Leishmania identificados como possíveis candidatos à vacina contra a leishmaniose, partimos para a estratégia de construirmos uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de L. chagasi, com o objetivo de isolarmos antígenos pelo método de dupla varredura. Inicialmente, utilizamos um pool de soros de indivíduos com LV seguido da utilização de células T de camundongos resistentes à infecção pela L.chagasi. 2.0 OBJETIVOS 2.1 - Objetivo Geral Identificar antígenos de L. chagasi com potencial para diagnóstico da leishmaniose e desenvolvimento de vacinas. 2.2 - Objetivos Específicos 1. Isolar e caracterizar clones de antígenos, através da varredura da biblioteca de cDNA da forma amastigota de L. chagasi. 2. Expressar antígenos de Leishmania chagasi em sistema de vetor de expressão pQE-30. 3. Purificar antígenos recombinantes de Leishmania chagasi. 4. Avaliar a resposta imune humoral e celular em indivíduos infectados por L. chagasi antígenos. frente a esses II. Método 2.1. Obtenção das formas amastigotas de Leishmania chagasi. A cepa de Leishmania chagasi (MHOM/BR/00/1669) foi mantida em Syrian Hamster através de injeções intracardíacas seriadas da forma amastigota do parasito. Onze animais foram inicialmente sacrificados em câmara de dióxido de carbono, com o restante dos procedimentos realizados em capela de fluxo laminar. O baço foi removido e colocado em homogeinizador de metal, com 6 mL de solução salina estéril e homogeneizado por cerca de 10 vezes. O homogeneizado foi transferido para um tubo cônico e lavado duas vezes com solução salina estéril. A suspensão foi então centrifugada a 250g por 20 minutos a 4º C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo cônico (sobrenadante 01). O precipitado foi ressuspenso em 10 mL de solução salina estéril, homogeneizado várias vezes por inversão do tubo e centrifugado a 250g por 20 minutos a 4º C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo cônico (sobrenadante 2). Os sobrenadantes 1 e 2 foram novamente centrifugados a 1500g por 12 minutos a 4º C, seguido da contagem de amastigotas no precipitado. Os amastigotas foram ressuspensos em 2-5x107/ ml em RPMI com 15% de DMSO (dimetil sufóxido) e suplementado com 20% de soro fetal bovino inativado e em seguidas congelados a -80º C por 16 horas e estocadas em nitrogênio líquido até realização dos experimentos subseqüentes. 2.2. Extração do RNAm da forma amastigota de L. chagasi O RNAm total de um “pool” de 1.2x109 amastigotas foi extraído com solução desnaturante guanidina tiocianato a 4 M. Para cada 100 mg de tecido foram adicionados 100 μl de solução acetato de sódio 2 M, pH 4, 1 mL de fenol, e 200μl da solução clorofórmio/álcool isoamil. Após constante agitação por 10 segundos, e banho de gelo por 15 minutos, a amostra foi centrifugada a 10.000g por 20 minutos a 4º C. A fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo e o RNA precipitado pela adição de 1mL de isopropanol 100%. A solução de RNA foi incubada a -20° por pelo menos 1 hora para precipitação do RNA. A amostra foi novamente centrifugada a 10.000g por 20 minutos a 4º C. Ao precipitado foram adicionados 300 μl de solução desnaturante e transferido para um tupo eppendorf. O RNA foi precipitado com 300 μl de isopropanol 100% por 1 hora. Após centrifugação por 10 minutos a 4º C, o RNA foi ressuspenso em etanol 75% com 15 minutos de incubação a temperatura ambiente. A solução de RNA foi centrifugada por 5 minutos a 10000g e o sobrenadante desprezado. O precipitado de RNA foi secado em sistema a vácuo por 15 minutos, seguido da adição de 50 µl de SDS 0,5% a 65ºC, por 10 minutos. 2.3. Manutenção de culturas de Leishmania chagasi em meio de cultura. As culturas foram repassadas semanalmente e mantidas em meio HOMEM (hemoflagellate modified minimal essential medium). A linha clonal da cepa de L. chagasi denominada LcJ, é uma cepa que permite a conversão da forma promastigota em amastigota em meio HOMEM bem como em meio específico para amastigotas como descrita para L. donovani (137). A cepa LcJ foi mantida entre as formas promastigota e amastigota a cada três semanas em cultura. 2.4. Preparo da biblioteca de cDNA A biblioteca de cDNA foi sintetizada de acordo com as instruções contidas no kit lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). Síntese da primeira fita da molécula de cDNA: para a síntese da primeira fita da molécula de cDNA, foram adicionados primers-oligo(dT) contendo 18 pares de bases e sítios de restrição para a Enzima Xho I, mais a adição de uma mistura de nucleotídeos dATP, dGTP e dTTP juntamente com 5-metil- dCTP e. O oligo(dT) liga-se a região 3´ da cauda poli A do RNAm de forma que a enzima STRATSCript RNaseH possa sintetizar a primeira fita da molécula de cDNA. TM livre de Síntese da segunda fita da molécula de cDNA: a fita complementar associada a primeira fita da molécula de cDNA foi digerida sob a ação da RNaseH produzindo múltiplos fragmentos que serviram de moldes para a DNA polymerase I sintetizar a segunda fita da molécula mais a suplementação com dCTP. Adaptadores contendo sítios de restrição para a enzima EcoRI com as seguintes seqüências 5´–OHAATTCGGCACGAGG- 3´e 3´- GCCGTGCTCCp-5´ foram adicionados as regiões terminais da dupla fita da molécula de cDNA. Após digestão com a enzima de restrição XhoI, o fragmento residual contendo a seqüência do adaptador da terminação 3´- foi separado em uma coluna de gel sepharose CL-2B, precipitado e ligado ao vetor ZAP Express. O vetor de expressão foi então utilizado para infectar E. coli da linhagem XL1-blue. Os clones foram selecionados de acordo com o sistema de coloração induzido pelo isopropil-1-tio-β-Dgalactopiranosídeo 6 e 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranosidase (X-gal) (Figura 2). Extração do RNA total de Leishmania chagasi Coluna Oligo -T Seleção do RNAm – poli A 5’ 3’ AAAAAA TTTTTTTGAGCTcDNA Transcriptase reversa cDNA Dupla fita DNA Vetor de expressão E.coli FIGURA 2: Extração de RNA total de L. chagasi e obtenção do cDNA através da enzima transcriptase reversa. 2.5. Identificação de pacientes com LV e preparo do pool de soros A biblioteca de cDNA foi submetida a primeira varredura com o pool de soro de 11 pacientes com leishmaniose visceral para a identificação de possíveis antígenos recombinantes de L. chagasi. Os pacientes com LV foram selecionados de acordo com as manifestações clínicas da doença, biópsia positiva de medula óssea e resposta terapêutica bem sucedida. 2.6. Varredura da biblioteca de cDNA com o “pool” de soros de indivíduos com LV Cinqüenta mil unidades formadoras de colônias (UFC) foram semeadas em placas contento 2 camadas, a inferior (15g de agar , 10g de peptona caseína, 5g de extrato de levedura e 5g de Nacl) e a superior ( 10g de peptona caseína, 10g de agar e 5g de Nacl). As placas foram incubadas a 37° C por cerca de 4-6 horas, seguido da incubação com membrana de nitrocelulose embebida com 10mM de isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside (IPTG), para indução da expressão das proteínas recombinantes. No dia seguinte, a membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5% e 0,005% de Tween-20 diluídos em tampão PBS. O “pool” de soro de indivíduos com LV foi adicionado e diluído a uma concentração final de 1:2,500 , seguido da adição do anticorpo secundário anti IgG peroxidase (1:20,000) por 30 minutos. Após o período de incubação, a membrana foi revelada utilizando-se a solução 4-Cl-naftol, imidazol, H2O2. As colônias positivas foram repicadas em novas placas por 3-4 vezes para obtenção de colônias purificadas. 2.7. Eliminação das proteínas de choque térmico (HSP) de Leishmania chagasi Em uma placa contendo 2 camadas, a inferior (15g de agar , 10g de peptona caseína, 5g de extrato de levedura e 5g de Nacl) e a superior ( 10g de peptona caseína, 10g de agar e 5g de Nacl), foram semeados 242 clones. Cada clone foi devidamente marcado na placa. As placas foram incubadas a 37° C por cerca de 4-6 horas seguido membrana de nitrocelulose embebida com 10mM de isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), para indução da expressão das proteínas recombinantes. No dia seguinte, a membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5% e 0,005% de Tween-20 diluídos em tampão PBS e hibridizada com sondas de DNA das proteínas de choque térmico de L. chagasi, HSP70, HSP83 e HSP90 marcadas com 32[P]. 2.8. Preparo das proteínas recombinantes para o ensaio de células T As proteínas recombinantes foram preparadas de acordo com o método descrito por Mustafae col., em 1998 (138). Os clones foram adicionados a uma placa de 96 poços juntamente com meio de cultura SM (1.9 g KH2PO4,1.3 g K2HPO4•3H2O, 1g MgSO4•7H2O, 10 g glucose, 10 g peptona de caseína, 1 g extrato de levedura). Em seguida, clones contendo E. coli XL1 Blue (Stratagene) foram transferidos a uma segunda placa. As culturas de bactéria foram transformadas a 37◦C e novamente transferidas para uma terceira placa contendo 0,7% de agar e 10mM IPTG. Em seguida, as bactérias foram transferidas para uma quarta placa contendo 1,5% de agar. Após 4 horas de incubação, a placa foi colocada a 37◦C por 16 horas permitindo a expressão dos antígenos recombinantes. Em seguida, foi adicionado a cada poço, RPMI contendo 100UI/ml de penicilina, 100μg/ml de streptomicina mais 10μg de polimixina B/ml. Em aproximadamente 1 hora, as proteínas recombinantes difundiram-se no meio de cultura. Com uma diluição final de 1/100, o sobrenadante das células foi preparado para o ensaio com células T de camundongos. 2.9. Varredura da biblioteca de cDNA para a identificação de antígenos de L.chagasi capazes de estimular celulas linfócitos T específicos Cinco camundongos C3H.HeJ foram infectados com 1x107 promastigotas de L. chagasi na cauda, intravenosamente. Após duas semanas de infecção, os baços foram removidos e deles feito uma única suspensão de células, que foi em seguida passada através de uma peneira de aço. Células B foram removidas pela adição de anti-imunoglobulinas e as células T dos camundongos foram adquiridas por seleção negativa através da passagem das células em coluna de nylon. Células de baço de camundongos C3H.HeJ não infectados, tratadas com mitomicina, foram utilizadas como células apresentadoras de antígenos (APCs). Em uma placa de 96 poços contendo agar, 2x105 células T purificadas mais 2x104 células de baço (APCs) foram adicionas, seguindo da incubação a 37ºC, 5% CO2. Os controles negativos continham sobrenadante sem colônias de bactérias ou sobrenadantes de poços que continhas clones mas não codificavam proteínas. Os controles positivos continham 1x106 promastigotas de L. chagasi/mL. Após 68-92 horas, aos poços foram adicionados 0,5µCi de timidina triciada [3H]/poço. Após 72 horas o sobrenadante da cultura foi coletado para a dosagem de IFN-γ. 2.10. Clonagem das proteínas recombinantes em vetor de expressão pQE-30 e E.coli Os genes contidos no vetor Lambda ZAP II foram retirados, após digestão com a enzima de restrição EcoRI, e subclonados no vetor de expressão de proteínas pQE-30 (Qiagen, Valencia, CA) na porção Nterminal, sendo inserido na seqüência de seis resíduos de histidina (His6 – tag) sob o controle do operon LacO. A expressão das proteínas foi visualizada em gel SDS, seguido da coloração de azul de coomassie. As proteínas foram então purificadas na coluna NTA- níquel (QIAexpress Type IV Kit) e eluídas com 200μl de tampão de eluição (50mM de NaH2PO4H20, 300mM Nacl, 250 mM de imidazol). Todo procedimento foi realizado de acordo com as recomendações do fabricante. A figura 3 mostra detalhadamente as duas varreduras da biblioteca de cDNA para obtenção de antígenos da forma amastigota de Leishmania chagasi. Biblioteca de cDNA de amastigotas de L. chagasi Primeira varredura Segunda varredura 100.000 clones Pool de soro de indivíduos com LV 118 clones restantes Células T de camundongos CH3/HeJ geneticamente resistentes 242 clones codificadores de proteínas 9 clones Eliminação de proteínas de choque térmico (HSP) 118 clones restantes Seqüenciados FIGURA 3: Dupla varredura da bibloteca de cDNA de L. chagasi com pool de soros de indivíduos com LV e células T de camundongos CH3/HeJ. 2.11. Determinação dos níveis de IFN-γ em sobrenadantes de células murinas e humanas Os níveis de IFN-γ em sobrenadante de culturas de células humanas e murinas foram medidos pelo método imunoenzimático (ELISA) sanduíche de acordo com instruções do fabricante (R&D systems, Mineapolis, MN). As placas de microaglutinação foram sensibilizadas com anticorpo policlonal, específico para IFN-γ. Cem microlitros da amostra padrão de IFN-γ e 500μl do sobrenadante de culturas de células foram adicionadas separadamente a cada poço e incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Após 4 lavagens, 200μl/poço de anticorpo policlonal anti-IFN-γ conjugado a peroxidase foram adicionados à placa e incubados por 2 horas a temperatura ambiente. Logo após o mesmo procedimento de lavagem de placas, 200μl/poço do substrato foram adicionados e a placa foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente e protegida da luz. 2.12. Determinação de anticorpo anti-leishmana no soro A detecção de anticorpos anti-leishmania foi determinada pelo método imunoenzimático (ELISA), utilizando antígenos recombinantes de L. chagasi e a proteína K-39 (Burns, et al, 1993). As placas de microaglutinação foram sensibilizadas com 500ng de antígenos recombinantes 314, 503, 419 e rK-39 por poço e ressuspensas em 100μl de tampão Bicarbonato-Carbonato (Na2CO3 15mM, NaHCO3 30,8mM, Timerosal 0,01%), pH 9,6, incubadas por 24 horas, a 4ºC. O excesso de antígeno foi removido e as placas foram bloqueadas com tampão PBS pH 7,4/Tween-20 a 1%, e mantidas por 1 hora, a temperatura ambiente. Em seguida as placas foram lavadas 4 vezes com PBS/tween 20 a 0,1% seguidas da adição de 100μl de soro, por poço na diluição de 1:500, incubadas por 1 hora, a temperatura ambiente. Após a remoção do soro, as placas foram lavadas como descrito acima e adicionados 100μl do conjugado anti-IgG peroxidase (1:4000) por poço, diluído em tampão PBS, e incubadas por 1 hora. O anticorpo secundário foi removido e as placas foram novamente lavadas, sendo adicionadas 100μl de solução reveladora contendo peróxido de hidrogênio na presença do cromógeno ABTS por 1 hora, a temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de 100μl de SDS 5%. A intensidade da cor desenvolvida no leitor de ELISA, 405nm, com posterior estabelecimento de um cut-off, corresponde a média das absorbâncias dos soros controles negativos (n=3) na diluição de 1/500 mais três desvios padrões para cada antígeno recombinante e K-39. 2.13. Ensaios com células mononucleares de sangue periférico humano Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humano foram isoladas de indivíduos DTH+ (n=6) e indivíduos controles não expostos (n=3). Cerca de 20 ml de sangue heparinizado (500UI/20ml sangue venoso) foram coletadas e homogeneizados com o mesmo volume de 0,9% de NaCl, seguindo a adição de Ficoll-Hypaque. As células mononucleares foram separadas por centrifugação a 900xg por 30 min. a temperatura ambiente. Após lavá-las três vezes com 0,9% de NaCl, as células foram resuspensas em meio de cultura RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro humano AB, 100UI /ml de penicilina e 100 μg/ml de streptomicina. Cem microlitros de células (2x106 células/ml) foram adicionadas a placa de 24 poços e estimulados com lisado de L. chagasi (5ug/ml), KMP11 (5ug/ml), 503 (5ug/ml) e 419 (5ug/ml). As células foram então incubadas por 72h a 37ºC com 5% de CO2. A camada contendo PBMC foi coletada e transferida para uma nova placa e armazenado a -70ºC. Os níveis de IFN-γ foram dosados pela técnica de ELISA sanduíche. 2.14. Identificação e alinhamento das seqüências de cDNA Os seis clones selecionados durante a varredura da biblioteca de cDNA foram extraídos do plasmídio pBluescript SK(+/-) após a digestão com a enzima de restrição EcoRI. Oligos específicos, T3 5'ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3 e T7 5'-TAA TACGACTCACTATAGGG-3', para a região promotora do plasmídio foram utilizados para o seqüenciamento dos clones através do processo automatizado de seqüenciamento realizado na Universidade de Iowa DNA core facility. As seqüências determinadas foram alinhadas com dois homólogos identificados por dois web sites distintos. O primeiro homólogo foi identificado através do GeneDB genomic database para Leishmania major e Leishamania infantum. O segundo, publicado no NCBI web site do GenBank. A comparação entre os cDNAs e seus respectivos homólogos foi realizada utilizando-se o programa Vector NTI Advance sequence analysis (Invitrogen, Bethesda, MD). 2.15. Imunoblots da forma promastigota nas fases estacionárias e logarítimica e amastigota axênica. As formas promastigotas LcJ na fase estacionária e logarítimica e a forma amastigota axênica LcJ foram centrifugadas a 1000xg por 20 minutos e ressuspensas em HBSS (Hank´s balanced salts solution). A concentração protéica das amostras foi determinada através do ensaio com ácido bicincrônico (Pierce BCA protein assay Kit). Em seguida, as proteínas foram desnaturadas em tampão redutor SDS e separadas em gel de poliacrilamida 7,5%, a 80V por 14 horas. As proteínas foram então transferidas para a membrana PVDF, coradas e descoradas com Ponceau S para averiguação de igualdade de aplicação das amostras. A membrana foi então bloqueada com leite em pó desnatado a 5% e 0,005% Tween -20 diluídos em tampão PBS. As membranas foram incubadas por 1 hora com pool de soros dos indivíduos com LV, na diluição de 1:2,500 seguindo da adição do anticorpo secundário anti-IgG peroxidase (1:20,000) por 30 minutos. Após o período de incubação com o anticorpo secundário, as membranas foram lavadas quatro vezes com tampão PBS e reveladas através do método de detecção enhanced chemluminescence (ECL, Amershan Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England). 2.16. Imunoblots de proteínas recombinantes purificadas. Cinqüenta microgramas de proteínas recombinantes purificadas 503, 314, 419 e extrato bruto de Leishmania chagasi foram desnaturadas em gel de poliacrilamida 12% por 2 horas a 80V. As proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose a 200mAmp por 1 hora. Após a transferência, a membrana foi corada e descorada com Ponceau S para averiguação de igualdade de aplicação das amostras. A reação foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5% e 0,005% Tween -20 diluídos em tampão PBS. O anticorpo primário, soro de 1 único indivíduo com LV, foi diluído a uma concentração final de 1/100 e adicionado à membrana por 1 hora, seguido de quatro lavagens e conseqüente adição do anticorpo secundário anti-IgG ligado a peroxidase (1:1,000) por 30 minutos. As proteínas foram reveladas utilizando-se uma solução DAB/NiCl (Nickel II chloride hexahydrate/3,3´-diaminobenzidine tetra-hydrocloride- Sigma). 2.17. Northern blot. Cinco microgramas de RNA de leishmania foram ressuspensos em água DEPC (isenta de RNAse) em um volume final de 10 μl. As amostras foram incubados a 65° C por 10 minutos seguido da adição de 50% de glicerol e 50% de formamida deionizada, seguido de mais 10 minutos de banho de gelo. Imediatamente, as amostras foram separadas em gel de formaldeído-agarose 1,2 % a 70V, 0,1 por 16 horas em tampão de corrida (Formaldeído, 1M NaPO4) e transferidas para a membrana de nitrocelulose por capilaridade em tampão de transferência 20X SSC (175.3g NaCl, 88.2g citrato de sódio, pH 7,0). O RNA foi então fixado na mebrana de nitrocelulose por cerca de 5 minutos em um transiluminador com luz UV. As membranas foram pré lavadas em 0.1x SSC/ 0.1% SDS por 1 hora a 65°C em forno de hibridização, seguida da incubação de 1 hora em 15 ml de solução de pré hibridização (formamida, Denhardt´s, SDS, ssDNA, 20x SSC, e 6,8 g de fosfato de sódio). Logo após, adicionou-se 9 μl da sonda específica de cada cDNA identificado na biblioteca ( 314, 503, 419, 648, 425 e 319) com 5μl de dATP, dGTP, dTTP e 5μl de dCTP (3000 ci/mmol de solução) mais 1μl da enzima Klenow. Após hibridizição, a membrana foi lavada novamente com tampão de lavagem. A membrana foi exposta ao filme de fotorevelação e mantida a -80°C por 16 horas, sendo em seguida revelado. III. RESULTADOS 3.1. Primeira varredura da biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi com pool de soros de indivíduos com LV. A construção da biblioteca de cDNA de L. chagasi foi realizada inicialmente através da extração do mRNA da forma amastigota do parasita, com subseqüente obtenção da molécula de cDNA. Essa estratégia possibilitou a identificação de um grande número de clones capazes de produzir proteínas recombinantes de L. chagasi. A biblioteca de cDNA da forma amastigota intracelular do parasita foi primeiramente varrida com um “pool” de soros de pacientes com leishmaniose visceral. Pacientes com LV produzem anticorpos contra diferentes antígenos do parasita decorrente da ativação policlonal de células B(139;140) Como esperado, o pool de soro utilizado para a primeira varredura da nossa biblioteca de cDNA reconheceu múltiplas proteínas do lisado das formas promastigota e amastigotas, como demonstrado na figura 4. A B Figura 4: Imunoblot das proteínas de amastigotas e promastigotas de Leishmania chagasi presentes nas bibliotecas de cDNA. As proteínas foram separadas em gel de SDSpoliacrilamida 7.5%. Linhas A representam réplicas de proteínas de amastigota. Linhas B representam réplicas de proteínas de promastigotas. Obtivemos, com a primeira varredura, cerca de 242 clones produtores de proteínas, os quais foram purificados nos passos subseqüentes através das duas verreduras seguintes. Observamos que 49% dos clones codificavam proteínas de choque térmico (HSP) quando comparados com a freqüência total dos clones identificados na biblioteca de cDNA. Após a eliminação das HSP, 5000 clones foram hibridizados novamente com sondas de HSP, e apenas 0,78% representavam clones codificadores das proteínas de choque térmico HSP70, HSP83 e HSP90. (tabela 1). Tabela 1: Freqüência de proteínas de choque térmico HSP70, HSP83 e HSP90, encontrados na biblioteca de clones cDNA da forma amastigotas de L. chagasi identificados na primeira varredura utilizando-se o pool de soros humanos . Varredura HSP70 HSP83 HSP90 96/242 (39.7%) 15/242 (6.2%) 7/242 (2.9%) 19/5000 (0.38%) 5/5000 (0.10%) Clones positivos Total/biblioteca cDNA de 14/5000 (0.28%) 3.2. Segunda varredura da biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi utilizandose células T de camundongos C3H.HeJ. Os 124 clones restantes foram submetidos a segunda etapa da varredura da biblioteca de cDNA utilizando-se células T de camundongos C3H.HeJ, resistentes a infecção por L. chagasi. Células T de camundongos C3H.HeJ não respondem a estímulos de lipopolissacarídio presentes em paredes de bactérias gram negativas decorrente da mutação no gene “toll like receptor 4” (TLR4) (141). Além de serem tolerantes aos estímulos mediados pelo LPS, esses camundongos são resistentes a infecção por espécies visceralizantes de leishmania, aumentando assim a possibilidade de identificação de antígenos protetores contra o parasita. Após quatro semanas de infecção por L. chagasi, período no qual o pico de parasitismo é intenso e antecede a resolução da infecção (142), as células T de baço desses camundongos foram extraídas, purificadas e estimuladas com proteínas recombinantes em 9 réplicas. Nove clones apresentaram índice de proliferação 2 vezes maior quando comparados aos clones controles. A tabela 2 monstra o índice de proliferação e os níveis de IFN-γ determinados com o sobrenadante da cultura de células T após o estímulo com seis clones estudados e um clone negativo não reconhecido pelo pool de soro utilizado na primeira etapa da varredura da biblioteca. A preparação de uma solução antigênica com promastigotas de L. chagasi foi utilizada como controle positivo. Tabela 2: Índice de proliferação gerado pelas proteínas recombinantes 314, 319, 419, 425, 503 e 648. Fagos recombinantes 319 419 425 503 648 Fago negativo b PM c 2.68 2.49 9.80 2.46 3.54 1.31 11.6 ±0.59 ±0.85 ±5.17 ±0.67 ±0.71 ±0.18 ±6.1 12.6 17.9 8.1 10.6 13.5 24.8 0 ± 2.0 44.2±3.9 ±8.0 ±6.6 ±3.2 ± 2.0 ± 4.0 ±8.0 314 Clone Índice de 2.96 estimulação a ±1.23 IFN-γ(pg/mL) Controles a Razão da incorporação de [3H] timidina em sobrenadante de cultura contendo proteína recombinante e sobrenadante de cultura controle. b Sobrenadante de um clone que não produziu nenhuma proteína detectável (controle negativo). c PM – Lisado total de promastigotas (controle positivo) 3.3. Análises das sequências dos insertos de cDNA. As extremidades 5´ e 3´ dos nove insertos de cDNA foram seqüenciadas. Um deles codificava a proteína ribossomal P0, sendo retirada desse estudo devido a possíveis reações cruzadas com proteínas ribossomais de mamíferos. Outros dois clones também foram retirados em virtude das curtas seqüências que codificavam, quando submetidos a análises com o programa de análises de seqüências Vector NTI advenced sequence analysis program (Invitrogen). Os seis clones restantes foram submetidos ao seqüenciamento completo. O quadro aberto de leitura (ORF) de cada inserto foi determinado por comparação com seqüências depositadas nos bancos de dados genômicos NCBI e o GeneDB database para Leishmania chagasi e Leishmania major (http://www.genedb.org/genedb/leish/index.jsp). A ORF de cada um desses seis clones de cDNA nomeados de acordo com a numeração 314, 319, 419, 425, 503 e 648, variou de 768 a 2355 pares de bases. As massas moleculares de cada proteína foram determinadas utilizando-se o website bioinformatics.org. A tabela 3 mostra as seis ORF das proteínas codificadas: ATPase do retículo endoplasmático de L. major, glutamina sintetase, uma proteína hipotética cuja função ainda não é estabelecida, proteína de L. chagasi K-39 (myosin-like), fator de alongamento- 1 γ (EF- 1γ) e a proteína repetitiva A2 de Leishmania. O peso molecular estimado e as características físicas esperadas e observadas de cada clone cDNA de L. chagasi são mostradas abaixo. O clone 648 apresenta 97% de identidade entre os resíduos de aminoácidos 44 e 297 da seqüência do gene A2 (AAB30592) relatada no banco de dados GeneDB. A seqüência protéica do clone 648 juntamente com a seqüência relatada no GeneDB são homólogas mas não idênticas ao primeiro gene A2 relatado no GeneDB. As principais diferenças observadas incluem o codon de iniciação presente na seqüência do gene A2 da L. infantum (NCBI) correspondendo a uma valina na posição 13 ou 56, respectivamente, da seqüência do cDNA 648 e a seqüência relatada no Sanger Institute. Ainda, o clone 648 e a seqüência de L. infantum relatada no Sanger Institute web site apresentam diferenças no primeiro resíduo de aminoácido (S) codificado na repetição em tandem quando comparado ao resíduo (A) presente na codificação do gene A2, alterando dessa forma a repetição de aminoácidos entre S/AVGPLSVGPQ, respectivamente (figura 5). Tabela 3: Antígenos de Leishmania chagasi identificados com a técnica de dupla varrredura. Clone Inserto ORF ORF Massa Proteica esperada Massa Proteica Homologos Observada (% identidade*) (Imunoblot) (bp) (bp) (aa) 314 3076 2355 bp 785 aa 86.8 kDa 98 kDa ATPase do retículo endoplasmático de L. major (99%) 319 1770 1140 bp 380 aa 42.4 kDa NV ** Glutamina de L. (100%) sintetase infantum 419 2073 1092 bp 442 aa 43.3 kDa 53 kDa Proteina hipotetica de L. infantum (100%) 425 1644 1344 bp 448 aa 49.7 kDa 60 kDa rK-39 de L. infantum (88%) 503 2009 1473 bp 491 aa 56.2 kDa 50 kDa EF-1γ de L. infantum (100%) 648 2886 768 bp 256 aa 23.9 kDa NV** Proteína A2 de L. infantum (97%) * Porcentagem de identidade com as sequências do GenBank ou do banco genômico de Leishmania major e L. infantum. ** NV – Bandas correspondentes às proteínas recombinantes não visualizadas no imunoblot Figura 5: Alinhamento entre as seqüências cDNA 648 (A2) com seus homólogos L. infantum A2 (NCBI)e L. infantum (Sanger Institute) . O clone de cDNA 648 foi alinhado com duas sequencias distintas do gene A2 de L. infantum, uma descrita no Sanger Institute web site e a outra encontrada no NCBI web site (Genbank). Hífens indicam resíduos idênticos entre as sequencias. Pontos indicam resíduos não presentes. * indica códon de terminação. 648 cDNA Li sequencia (Sanger) A2(NCBI) 01 ...........................................QAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGP 01 VGPLSVGPQSVGPLSVGPLSVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSVGPQAVGPL--G-QA-GP 01 MKIR--R-LV-LL 648 cDNA Li sequencia (Sanger) A2(NCBI) 15 LSVGPQAVGPLSVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSVGPLSVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSV 58 LS-GPQAVGPL-VGPQSVGPLS---Q----L----------S-------------------S-----03 VC-AAVLALSA-AEPHK.AAVD---L----Q----------A-------------------A------ 648 cDNA Li sequencia (Sanger) A2(NCBI) 72 GPQSVGPLSVGPQAVGPLSVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGPL 114 -----------PQA-----------------P-----------A-------------------A---59 -----------.....---------------S-----------S-------------------S---- 648 cDNA Li sequencia (Sanger) A2(NCBI) 129 SVGPQAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQAVGPLSVGPQSVG 170 ---------------A---------A-------P-A---------A---------A--------XA-111 ---------------S---------S-------S-S---------S---------S--------QS-- 648 cDNA Li sequencia (Sanger) A2(NCBI) 186 PLSVGPQSVGPLS VGLQAVDVSPVS* 226 ----D----------P-S-GPL.... 168 ----G----------P-S-DVSPVS- Ao compararmos a seqüência protéica do clone de cDNA 425 com seu homólogo K-39 de L. infantum, verificamos a ausência da região codificadora no sentido que 5´da seqüência do clone 425. Ainda, oito resíduos na porção N-terminal do cDNA 425 diferem do seu homólogo K-39. O restante da região codificadora no sentido C-terminal de ambas as proteínas foram idênticas. Essas diferenças são visualizadas no alinhamento entre os dois homólogos demonstrado pela figura 6. Figura 6: Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos do clone de cDNA 425 de L. chagasi e o K-39 de L. chagasi. L.infantum K-39 L.infantum K-39 L.infantum K-39 L.infantum K-39 L.infantum K-39 425 cDNA MCCESSAEQDRENTRAALEQRLRECEARAAELKAELESTAAAKTSAEQDRERMRVTL EERLRVAELRAAELAGVLEATAAAKTSAEQDRENTRAALEQRLRESEERAAELKAEL EATTAAKMSAEQDRENTRATLEQQLRESEERAAELNAELEAAAAAKSSAEQDRENTR AALEQRLRECEARAAELKAELESTAAAKTSAEQDRERMRVTLEERLRVSELRAAELA GVLEATAAAKTSAEQDRERTRTTLQEQLRESEARAAELKAELEATAAAKSSAEKDRE 01 ...................................---A-Q---S----T-V-Q--- 425 cDNA L.infantum K-39 23 RTRAALE.......ARVAELASKLESTAAAKALVEQDRESTRATLEERLRIAEARAA 391 N------EKLRGTE------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 73 ELAIELDATAAAKASMEHDRESTRATLEERLRIAEVRGAELASQLEATAAAKALLEQ --------------------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 130 DRERTRATLEQQLRESEERAAELKAELEATAAAKTSAEKDRENTRAALEEKLRGTEA --------------------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 187 RAAELAARLKAIAAMKASMVQERESARDALEEKLRGSEVRAAELAARLKAAVAAKSS --------------------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 244 AEQDRENTRATLEQRLRESEERAAELASQLEAAAAAKSSAEQDRENTRAALEEKLRG --------------------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 301 SEERAAELGTRVKASSAAKALAEQERDRIRAALEEKLRDSEARAAELTTKLEATVAA --------------------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 358 KSSAEQERENIKVALEEELVDARAKLAGMEASLKESKLEFEGRVGELEGECEKLRND --------------------------------------------------------- 425 cDNA L.infantum K-39 415 KVRYAKKVQSLEYQMRIDEARLKARRDAVHRKE* --------------------------------- Hífens representam resíduos idênticos entre as sequencias. Pontos representam resíduos não presentes. * representa códon de terminação. As regiões codificadoras de cada inserto de cDNA foram comparadas com o tamanho das proteínas observadas nos imunoblots de bactérias transformadas e induzidas com IPTG (isopropil-beta-D-thiogalactopiranosidio). O imunoblot foi incubado com o pool de soros de pacientes com leishmaniose visceral, o mesmo pool utilizado para a varredura da biblioteca. Como esperado, o soro humano reconheceu múltiplas bandas de E.coli, mas bandas únicas representativas da maioria dos clones também foram possíveis de serem distinguidas das bandas de E. coli. Não foi possível visualizar bandas específicas referentes aos clones de cDNA 319 e 648. Conforme mostra a figura 7, os tamanhos de cada inserto seqüenciado não correspondem exatamente ao tamanho das bandas observadas no imunoblot. Provavelmente tal dirferença seja decorrente do processo de conformação protéica ou até mesmo o processo pelo qual as bactérias expressam tais proteínas recombinantes. Figura 7: Imonoblot de bactérias transformadas com antígenos de Leishmania chagasi. O imunoblot foi realizado para a determinação do tamanho de cada proteína recombinante selecionada durante a varredura da biblioteca de cDNA. Linha A contém lisado de bactéria não transformada (controle), B e C contém os clones de 648 e 319 (ambos não visualizados), lihas D, E, F, e G representam os clones 425, 503, 314 e 419 respectivamente. O tamanho das proteínas é mostrado em kDa de acordo com o peso molecular do marcador. A B C D E F G 116.3 97.4 66.3 55.4 33.6 31 kDa Para eliminar a possibilidade de que os clones selecionados fossem oriundos de L. chagasi e não de hamsters, a expressão dos antígenos de L. chagasi foi verificada por Northern blot (figura 8), utilizando RNA isolado em em estágios diferentes de crescimento da forma promastigota (fases logarítimica e estacionária) e da forma amastigota. O nível de RNAm correspondente aos clones 319 (glutamina sintetase) e 425( K-39) foi expresso nas fases logarítimicas e estacionária da forma selvagem de L. chagasi. Nos clones 314 (ATPase do retículo endoplasmático), 419 (proteína hipotética) e 503 (Fator de alongamento 1-γ) observamos um maior nível de expressão do RNAm na fase logarítimicas e no clone 419, a expressão foi baixa na forma amastigota. Como esperado, o RNAm extraído do clone 648, correspondente a um dos genes A2 de L. chagasi, apresentou maior nível de expressão na forma amastigota quando comparado a forma promastigota. No entanto, podemos observar que todos os antígenos foram expressos na forma amastigota de L. chagasi. 3.4. Resposta imune humana frente às proteínas recombinantes de L. chagasi. Os antígenos recombinantes de L. chagasi, 314, 419 e 648 foram clonados em vetor de expressão pQE-30 e purificados.. As proteínas analisadas em gel SDS-PAGE que apresentaram o tamanho correto foram submetidas a ensaios imunológicos, mas nem todos os antígenos foram expressos em E. coli. Soros de indivíduos com LV que apresentavam anticorpos anti-rK39 foram testados com 3 proteínas recombinantes, 314, 419 e 503 com exceção do antígeno 425, o homólogo do K39. De acordo com os três antígenos testados, 21, 21 e 23 dos 34 soros reagiram positivamente frente aos antígenos 314, 503 e 419 respectivamente (figura 9). Dentre os 34 soros, 33 reagiram positivamente com pelo menos 1 dos antígenos e 26 foram positivos para 2 ou 3 dos antígenos recombinantes testados. O cut-off foi obtido com a média dos Figura 9: Níveis de anticorpo detectados contra antígenos recombinantes 314, 419, e 503 em 34 indivíduos com leishmaniose visceral. Os resultados foram comparados com os níveis de anticorpo detectados contra os antígenos K-39. O cut-off foi determinado de acordo com a média das O.D de 3 indivíduos não expostos (controles negativos) + 3x o desvio padrão. 4 Cut-off negativo 3 O.D 405nm 2 1 0 314 419 503 rK39 Antígenos As proteínas recombinantes também foram testadas em imunoblots utilizando-se soro de indivíduos infectados com leishmania (Figura 10). O soro de um indivíduo norte americano foi utilizado como controle negativo. Os antígenos recombinantes 503, 419 e 314 bem como o extrato bruto de L. chagasi foram reconhecidos pelos soros de 2 indivíduos distintos, infectados. Figura 10: Imunoblot de proteínas recombinantes purificadas através da coluna de cromatografia de afinidade. Painel A, B e C, contém bandas específicas dos antígenos 314, 503 e 419 reconhecidas por soro de um indivíduo em fase aguda da infecção. O extrato bruto de L. chagasi foi utilizado como controle. A. B. N.E , indivíduo de área não endêmica C. A tabela 4 mostra o resultado obtido com antígenos recombinantes, 419 e 503 testados com sangue periférico de indivíduos que apresentam teste de Montenegro positivo. Os achados mostraram que, dois dos seis indivíduos responderam ao estímulo do parasito com a produção de IFN-γ (64,2 ±10,4 pg/ml), dois dos seis indivíduos quando estimulados com o antígeno controle KMP11 (8,4±0,7 pg/ml), três dos seis indivíduos responderam ao estímulo do antígeno 419 (10,9±6,0 pg/ml), e apenas um indivíduo respondeu ao estímulo antigênico 503 com a produção de 16,8 pg/ml de IFN-γ. Tabela 4: Nível de Interferon-γ (IFN-γ) em sobrenadante de cultura de células de indivíduos com teste de Montenegro positivo. Estímulo Positivo (Número de indivíduos testados) IFN-γ (pg/mL) Antígenos Extrato bruto de L. chagasi 2(6) KMP11 419 503 2(6) 3(6) 1(6) 64,2 ±10,4 8,4±0,7 0,9±6,0 16,8 IV. DISCUSSÃO As leishmanioses são doenças negligenciadas, responsáveis por grandes impactos na saúde pública. O número de casos da doença continua aumentando em todo o mundo, sendo este número uma subestimativa em virtude de problemas de notificação da doença em países mais afetados. A distribuição mais ampla das leishmanioses é decorrente de novos casos relatados em áreas que previamente eram consideradas não endêmicas para a doença. Desmatamento, migração de pessoas não imunes para áreas onde a doença é endêmica, o processo de urbanização e, mais recentemente, casos de co-infecção Leishmania-HIV no sudeste da Europa têm contribuído para essa expansão geográfica. O processo de urbanização de cidades de países em desenvolvimento de forma rápida e não planejada, origina “megacidades” com condições de moradia e sanitárias precárias e inadequadas, propiciando oportunidades para a transmissão de várias doenças como a leishmaniose. O tratamento das leishmanioses com o glucantime é longo, com custo elevado, requer internamento do doente para administração intravenosa do medicamento, além de ser uma droga com efeitos tóxicos para o paciente. Ainda, o aumento do número de casos refratários ao tratamento convencional, principalmente em países como a Índia, onde a doença é endêmica, demonstra a urgência para o surgimento de novas opções terapêuticas. Vários esforços têm sido ministrados para elaboração de drogas mais eficazes, mais baratas e menos tóxicas para o tratamento da leishmaniose. A miltefosine (109) , primeira droga oral com atividade leishmanicida, tem mostrado resultado satisfatório em áreas endêmicas para a LV na Índia, muito embora, casos de resistência a essa droga também já tenham sido relatados nesse país. No Brasil, estudos em Fase II, ainda não concluídos, avaliam a eficácia dessa droga em pacientes doentes de áreas endêmicas para a LV (110). A meltifosine representa uma dentre outras, um grande passo na tentativa de aprimoramento de novas estratégias para o controle e prevenção das leishmanioses. O método padrão para o diagnóstico da LV através da demonstração de Leishmania em aspirados de medula óssea e baço, é invasivo e requer pessoas qualificadas para execução do procedimento. Os métodos sorológicos são altamente sensíveis, de mais fácil execução, mas ainda assim não existe um método imunológico adequado para uso no diagnóstico das leishmanioses. O teste de aglutinação direta (TAD) é sensível e específico, mas apresenta a limitação de não ter um antígeno padrão para a técnica. O ELISA é o método de escolha pela alta sensibilidade e especificidade, dependendo do antígeno utilizado. O antígeno rK-39 apresenta boa sensibilidade e especificidade (100,101,143), sendo considerado um potente marcador de doença aguda. Muito embora o Ministério da Saúde venha executando medidas para o controle das leishmanioses, ainda assim tais estratégias não têm apresentado resultados satisfatórios no combate à doença. Os casos de leishmanioses continuam aumentando. Com isso, novas medidas preventivas devem ser reconsideradas de forma a se obter o total controle na prevenção e surgimento de novos casos. Provavelmente, um método diagnóstico tão eficaz quanto, ou até mesmo superior aos já existentes, mas que possam emitir resultados mais rapidamente, serão de grande valia para áreas onde a doença é endêmica. Também, ainda não há uma vacina segura e eficaz, capaz de induzir uma resposta imunológica longa e duradoura contra a leishmaniose humana e canina. Sabe-se que em áreas endêmicas para a LV, apenas uma pequena porcentagem de indivíduos infectados desenvolve a doença. A maioria dos indivíduos não apresenta sintomas clínicos, desenvolvendo uma forte resposta Th1 específica a antígenos do parasito, a qual os protege contra uma subseqüente re-exposição à Leishmania. Esse fato demonstra que os indivíduos resistentes desenvolvem imunidade protetora antígeno específica, o que torna viável a elaboração de vacinas contra as leishmanioses. A dificuldade no desenvolvimento de vacinas contra as leishmanioses limita-se na complexidade de identificação de antígenos capazes de estimular essa resposta imunológica longa e duradoura. Novas estratégias de vacinação, muitas utilizando subunidades de vacinas, estão sendo investigadas, acreditando-se que a vacina eficaz contra as diferentes formas clínicas de leishmanioses provavelmente deverá conter um coquetel de antígenos em sua formulação. Estudos têm demonstrado diferentes antígenos como potentes candidatos à vacina contra a leishmaniose. Muitos desses antígenos foram identificados por clones de células T, varredura de pool de antígenos e de bibliotecas com soros de animais e humanos infectados. Para a obtenção de novos métodos tanto para uso diagnóstico como para a elaboração de vacina conta as leishmanioses, a nossa estratégia de trabalho foi identificar antígenos específicos de Leishmania chagasi capazes de estimular células Th1 e células B dependentes de células T, expressos na forma amastigota da Leishmania, por ser essa, a forma encontrada no interior de macrófagos de hospedeiros vertebrados. Sendo assim, construímos uma biblioteca de cDNA da forma amastigota de L. chagasi. Os antígenos foram identificados através da dupla varredura da biblioteca. Nós procedemos com a varredura da biblioteca em duas etapas, seguindo o método realizado por Mustafa et al (138). Como relatado na literatura, indivíduos com leishmaniose visceral produzem uma resposta policlonal do tipo B contra vários antígenos de Leishmania (151). Por essa razão, a nossa biblioteca foi primeiramente varrida com um pool de soros de indivíduos com leishmaniose visceral para que pudéssemos obter o maior número possível de clones que expressassem proteínas recombinantes do parasita. Com essa primeira etapa, 242 clones foram identificados. Dentre esses, 49% codificavam proteínas de choque térmico (HSP) da família HSP70, HSP86 e HSP90, representando 0,76% do total dos clones biblioteca. Devido ao fato de estarmos buscando potentes antígenos que possam fazer parte da subunidade de vacina, seria meio questionável que as HSP pudessem ser utilizadas, devido ao fato de possíveis reações cruzadas entre as HSP de leishmania com as de humanos. Com isso, utilizamos sondas de clones de HSP de L. chagasi previamente identificadas, para eliminarmos dentre os 242 clones, aqueles que possivelmente codificariam proteínas de choque térmico. Os 124 clones restantes foram sujeitos à segunda etapa da varredura da biblioteca. Selecionamos os clones que estimularam proliferação de células T de camundongos CH3/HeJ. Os camundongos CH3/HeJ são geneticamente modificados decorrente de uma mutação presente no gene TLR4 (141,144). Com tal modificação genética, macrófagos e linfócitos B desses animais não respondem aos estímulos causados por LPS proveniente da parede de bactérias gram negativas como a E. coli, responsável por provocar intensa resposta inflamatória no hospedeiro. A regulação dessa resposta inflamatória está associada ao lócus LPS no cromossomo 4 de camundongos (144). Evidentemente, as respostas imunes geradas por células humanas e murinas frente a variados estímulos são diferentes, no entanto, escolhemos selecionar os clones da biblioteca com células de camundongos pela disponibilidade dessa espécie, e também para eliminar a possibilidade do LPS em estimular a proliferação células T humanas bem como a produção de citocinas. Seis clones foram capazes de induzir a proliferação de células T de camundongos com a produção IFN-γ. A caracterização dos mesmos permitiu a obtenção de informações em relação ao quadro aberto de leitura, peso molecular e homologia das seqüências. As massas protéicas referentes aos clones 319 e 648 não foram visualizadas no imunoblot com o pool de soro dos indivíduos com LV (tabela 2). A caracterização dos mesmos permitiu a obtenção de informações em relação ao quadro aberto de leitura, peso molecular e homologia das seqüências. As massas protéicas referentes aos clones 319 e 648 não foram visualizadas no imunoblot com o pool de soro dos indivíduos com LV. Provavelmente essas proteínas recombinantes devam apresentar melhor expressão em células eucarióticas ao invés de procarióticas, decorrente da ausência de modificações pós-traducionais em E. coli.. Matlashewski e col., 1994 caracterizaram a expressão do gene A2 de L. donovoni, homólogo ao clone 648 de L. chagasi, também em E. coli e observaram que a família de proteínas A2 apresentam peso molecular variando de 45 a 100 kDa (145). Com exceção do clone 314, homólogo a ATPase do retículo endoplasmático de L. major, os demais clones de L. chagasi apresentaram maior homologia com L. infantum, provavelmente em virtude dessas duas espécies do complexo L. donovani serem geneticamente idênticas. Selecionamos os homólogos de dois antígenos de interesse relatados na literatura, o homólogo do antígeno K39 no qual induz a ativação de células B em pacientes durante a fase aguda da leishmaniose visceral (101,143) e o antígeno A2 que tem demonstrado induzir proteção em camundongos infectados com Leishmania (146), para servirem de controles positivos validando o processo de varredura da biblioteca de cDNA, na procura de antígenos de Leishmania chagasi da forma amastigota. A seleção de um dos genes A2 utilizando-se pool de soro de indivíduos com LV indica o potencial desse antígeno como forte candidato a subunidade de vacina ou até mesmo como marcador de doença aguda para a LV. Como relatado por Ghedin E. e col., 1997 (147) (Tabela 3). Vários antígenos relatados na literatura têm demonstrado a sua capacidade em induzir resposta Th1 contra parasitas responsáveis pela leishmaniose cutânea, como a L. major e L. amazonensis. A imunização de camundongos geneticamente susceptíveis com o antígeno de L. major, LACK (Leishmania homolog of mamalian RACKs receptor for activated C kinase) foi capaz de proteger os camundongos contra doença progressiva (148). O antígeno LeIF, homólogo da proteína ribossomal e IF4A de eucariotos, é um potente estimulador de células T a produzirem IFN-γ em linfonodos de camundongos BALB/c infectados com L. major. O coquetel de antígenos LeiF, LMSTI1 e TSA, elaborado como subunidade subunidade de vacina, induzem proteção tanto em camundongos como em primatas não humanos (149). Outras proteínas também relatadas na literatura como GP63(150), proteína WD (151), GP46 (PSA) (152), P4 (153), P8 (154), PSA-2 (155), são capazes de induzir reposta protetora do tipo Th1. A literatura também tem descrito antígenos de cepas visceralizantes do parasita, responsáveis pela leishmaniose visceral, capazes de induzirem imunidade parcial em camundongos infectados por leishmania. A imunização de camundongos com frações purificadas de proteínas de membranas (dp 72 e gp 70-2) de exrato bruto de Leishmania donovani (156), a proteína recombinante LCR1(157), Ldp23 (158), A2 (159), têm conferido proteção parcial aos camundongos após infecção pelo parasita. A proteína recombinante A2, também identificada na varredura da biblioteca, representa um grupo de proteínas expressas exclusivamente na forma amastigota com função ainda não determinada. A proteína A2 de L. infantum apresenta epítopos na seqüência que podem variar de 10-90 repetições de aminoácidos dependendo do gene A2 identificado (160), As cepas de L. major, L. tropica e L. braziliensis, responsáveis pela leishmaniose cutânea, contem homólogos da proteína A2, no entanto não apresentam tais seqüências repetitivas. A imunização com antígeno A2 confere proteção em camundongos infectados por L. donovani, mas não por L. major, ao passo que o antígeno LACK confere proteção contra infecção por L. major mas não por L. donovani (161). Portanto, A2 e LACK são antígenos espécie-específico que influenciam o desenvolvimento das leishmanioses visceral e cutânea, respectivamente, mas que, no entanto, podem não ser reconhecidos durante a resposta imune desenvolvida em resposta ao parasita causador da outra forma cínica da doença. Para validarmos o processo de seleção de antígenos em nossos estudos, oriundos de L. chagasi e não de hamsters, avaliamos a expressão do RNAm desses antígenos nas formas promastigotas e amastigotas axênicas, na fase logarítmica e estacionária (figura 8) . Dentre os seis antígenos de L. chagasi da forma amastigota identificados nesse estudo, o antígeno A2 foi único expresso exclusivamente na forma amastigota, e o RNAm das proteínas EF-1γ (162), ATPase de retículo endoplasmático, e proteína hipotética apresentaram uma maior expressão na forma promastigota e fase logarítmica quando comparado a fase estacionária. Devemos salientar que clone 503 (EF-1γ) identificados pelo nosso estudo não é o mesmo fator de alongamento EF-1α exportado do fagossomo do parasita para o citoplasma de macrófagos infectados (168). O RNAm do clone 425 (glutamina sintetase), homólogo ao K39 (143) foi expresso similarmente em ambas as fases e formas da leishmania. Decorrente das limitações, presença de LPS, pouco volume e concentração de proteínas expressas em E. coli, não obtivemos quantidade suficiente dos 6 antígenos de L. chagasi para a execução de todos os experimentos desse trabalho. Um dos objetivos do estudo foi identificar antígenos de L. chagasi que pudessem ser utilizados como marcadores de doença aguda. Soros de trinta e quatro indivíduos foram testados contra os antígenos de L. chagasi 314, 419, 503 e comparados com o antígeno rK39. Verificamos que indivíduos com LV, em fase aguda da doença, produziram anticorpos contra os antígenos testados. Muito embora a produção de anticorpos não tenha sido 100% em relação aos 3 antígenos, como observado em relação ao antígeno rK39, a grande maioria dos indivíduos foi capaz de reconhecer epítopos presentes na seqüência desses antígenos. Talvez, com a manipulação da seqüência de DNA desses antígenos para a identificação de epítopos mais específicos, que sejam reconhecidos por todos os indivíduos doentes, melhore a sensibilidade e especificidade do ELISA, possibilitando o uso desses antígenos como possíveis marcadores para o diagnóstico de indivíduos com LV. Atualmente, o antígeno rK39 tem sido utilizado em laboratórios de pesquisas como padrão para o diagnóstico da doença. Com o imunoblot das proteínas recombinantes purificadas, foi possível também verificar que o soro de um único indivíduo com LV, ao invés do pool de soro utilizado na varredura inicial da biblioteca, foi capaz de reconhecer os antígenos 314, 503 e 419 (figura 9). Os antígenos de leishmania reconhecidos por células T não necessariamente localizamse na superfície da forma promastigota do parasita ou são secretados. Certamente, os clone 319 (glutamina sintetase) e 503 (EF-1γ) localizam-se a nível do citoplasma, o clone 314 (ATPase do reticulo endoplasmático) deve localizar-se em organelas citoplasmáticas, e o clone 425 (K-39) deve ser encontrado a nível de citoplasma ou citoesqueleto. Possivelmente, uma pequena quantidade de glutamina sintetase pode ser expressa na superfície do parasita, bem como a proteína A2 possa ser secretada. A estratégia desse estudo com a construção da biblioteca de cDNA da forma amastigota de L. chagasi mostra a importância da seleção de novos antígenos como possíveis candidatos para auxílio do diagnóstico e possivelmente o desenvolvimento de vacinas contra a Leishmaniose. Os passos seguintes serão a padronização do método de purificação e expressão desses antígenos e a avaliação da capacidade protetora desses antígenos através da imunização de camundongos susceptíveis BALB/c frente à infecção por L. chagasi. V. CONCLUSÕES 1. Seis clones da forma amastigota de L. chagasi foram identificados e caracterizados: A. Clone 314, ATPase do retículo endoplasmático de L. major (99%), B. Clone 319, Glutamina sintetase de L. infantum (100%), C. Clone 419, Proteina hipotetica de L. infantum (100%), D. Clone 425, rK-39 de L. infantum (88%), E. Clone 503, EF-1γ de L. infantum (100%), F. Clone 648, Proteína A2 de L. infantum (97%). 2. Antígenos 314, 419 e 503 foram reconhecidos por soro imune humano; 3. Indivíduos com LV apresentam anticorpos contra os antígenos 314, 419 e 503; 4. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos DTH+, estimuladas com os antígenos de L. chagasi foram capazes de produzir INF-γ. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (1) Ponce C, Ponce E, Morrison A, Cruz A, Kreutzer R, Mahon-Pratt D, et al. Leishmania donovani chagasi: new clinical variant of cutaneous leishmaniasis in Honduras. Lancet 1991 Jan 12;337(8733):67-70. (2) Barral A, Pedral-Sampaio D, Grimaldi JG, Momen H, Mahon-Pratt D, Ribeiro de JA, et al. Leishmaniasis in Bahia, Brazil: evidence that Leishmania amazonensis produces a wide spectrum of clinical disease. Am J Trop Med Hyg 1991 May;44(5):536-46. (3) Aleixo JA, Nascimento ET, Monteiro GR, Fernandes MZ, Ramos AM, Wilson ME, et al. Atypical American visceral leishmaniasis caused by disseminated Leishmania amazonensis infection presenting with hepatitis and adenopathy. 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Marcador de proteínas, SDS-PAGE Standards, low range, 200 µl (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca, USA). Kit lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). Human IFN-gamma Quantikine SixPak Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Pierce BCA protein assay Kit (Pierce, Rochford, IL, USA). QIAexpress Type IV Kit, 5 ug, pQE-30, pQE-31, pQE-32 (N-terminal 6xHis); 10 ml NiNTA Agarose (Qiagen, Valencia, Ca, USA). Todos os demais reagentes e materiais utilizados foram da melhor qualidade comercial possível. 2.2 Equipamentos Leitor de ELISA (Titertec Instruments, Inc., Huntsville, AL, EUA). Centrífuga (Beckman Instrments, Inc., Fullerton, Califórnia, EUA). Espectrofotômetro (Hitachi, Japão). Fonte para eletroforese de Alta Voltagem modelo 200/2.0 ( Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). Cuba de eletroforese modelo Horizontal (Gibco BRL Laboratories Gaithersburg, MD, EUA). Capela de fluxo laminar Baker (B2 classe II, tipo A/B3, Sanford, Maine, EUA). Sistema de fotodocumentação GelDocTMXR, CHemiDocTMXRS (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Estufa BOD (Puffer Hubbard, Asheville, NC, USA). Estufa CO2 (Water-Jacketed CO2 incubator, USA). Termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc., Waltham, MAssachusets, USA). Seqüenciador Applied Biosystems Modelos 3730 e 3100 (New Jersey, USA).
