Proteção de fármacos oxidáveis: formulação e processo Engenharia

Proteção de fármacos oxidáveis: formulação e processo
Joana Carreira Bicho
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Farmacêutica
Orientadores: Professora Doutora Helena Margarida Ribeiro
Professora Maria Matilde Soares Duarte Marques
Júri
Presidente: Professor Doutor José Monteiro Cardoso de Menezes
Orientador: Professora Doutora Helena Margarida Ribeiro
Vogais: Professora Doutora Isabel Filipa Martins de Almeida,
Doutora Sara Raposo
Novembro 2015
Agradecimentos
À Professora Doutora Helena Margarida Ribeiro, minha orientadora científica, agradeço a amizade,
disponibilidade, paciência, ensinamento, colaboração, incentivo e o positivismo transmitidos ao longo
deste trabalho, essenciais para a elaboração deste projeto.
À Doutora Sara Raposo, minha coorientadora, agradeço o apoio, disponibilidade, paciência,
orientação e ensinamento prestados ao longo deste projeto.
Ao Laboratório Edol, Produtos Farmacêuticos S.A, agradeço o acolhimento e disponibilização de
todos os recursos necessários para a realização deste trabalho.
À Mestre Ana Salgado, pela amizade, todo o apoio e disponibilidade prestados ao longo destes
meses, bem como a ajuda prestada na elaboração de metodologias realizadas ao longo do trabalho
prático.
À Mestre Integrada Joana Marto, agradeço a amizade, apoio, ensinamento, disponibilidade e ajuda
prestadas na elaboração de trabalhos práticos realizados ao longo do projeto.
À Doutora Sandra Simões, por todo o conhecimento científico prestado, disponibilidade e ajuda na
realização de alguns trabalhos práticos laboratoriais.
Agradeço a todos os funcionários do Controlo de Qualidade, do Laboratório Edol, Produtos
Farmacêuticos S.A., pelo apoio e disponibilidade na elaboração dos trabalhos práticos laboratoriais
realizados na empresa.
À técnica Carla Eleuterio e à auxiliar Fernanda Carvalho, por todo o apoio e disponibilidade
prestados.
Agradeço aos meus colegas de laboratório, principalmente à Diana Gaspar e Bárbara Gregorí, pela
amizade e apoio prestado, ao longo deste projeto.
Aos meus pais e irmã, agradeço o apoio, amor e ensinamento, motivação e dedicação que
ofereceram e continuam a presentear, ao longo da minha vida. Por todo o esforço realizado ao longo
destes anos para me proporcionarem condições para um futuro melhor a nível profissional e pessoal.
A eles devo-lhes quem sou, muito obrigada.
Aos diretores de curso, Professor José Cardoso de Menezes e Professor António Almeida, todo o
apoio prestado ao longo destes dois anos.
A todos aqueles que, diretamente ou indiretamente, cooperaram para a finalização desta etapa
importante na minha vida.
II
Resumo
O presente trabalho centrou-se na melhoria e desenvolvimento de preparações tópicas contendo
um antifúngico. Um dos objetivos foi a reformulação de uma preparação tópica contendo 2% de
cetoconazol de forma a melhorar a estabilidade físico-química e microbiológica de um produto já
existente. O outro objetivo foi o desenvolvimento de sistemas inovadores aplicando nanotecnologia e
micro encapsulação.
Foram estudadas três formulações distintas, para a sua caracterização foram realizados diversos
ensaios como: ensaios físico-químicos, avaliação in vitro da cedência, permeação e retenção do
cetoconazol e estudo microbiológico da eficácia das formulações.
Na reformulação da preparação tópica foram utilizados diversos tipos de conservantes,
antioxidantes e um quelante. BHT e EDTA originaram resultados favoráveis na estabilidade do
cetoconazol e a estabilidade microbiológica da reformulação foi conseguida com o conservante
imidazolidinil ureia. Os resultados obtidos nos ensaios in vitro da cedência e permeação do cetoconazol
foram promissores.
As formulações inovadoras desenvolvidas, emulsão e lipossomas, apresentaram resultados
promissores na avaliação in vitro e na eficácia microbiológica apesar do teor de cetoconazol
incorporado ter sido bastante baixo (0,13% e 0,09% para a emulsão e lipossomas) quando comparado
com formulações convencionais. Estes resultados provavelmente estão associados à dissolução do
cetoconazol e à presença do promotor cutâneo, etoxidiglicol. Os lipossomas foram excluídos devido à
permeação do cetoconazol para além do EC.
Os estudos da eficácia antifúngica das formulações, em C.albicans, revelaram que a melhor
formulação foi a emulsão, apesar de apresentar o menor halo de inibição o teor de cetoconazol é muito
menor em comparação com a formulação convencional.
Palavras-chave: cetoconazol, preparações tópicas, infeções fúngicas da pele, emulsões e lipossomas.
III
Abstract
This study was focused on the improvement and development of topical preparations containing an
antifungal drug. One of the objectives was reformulation of a topical preparation containing 2% of
ketoconazole in order to improve the physical-chemical and microbiological stability of an existing
product. The other objective was to develop innovative systems applying nanotechnology and micro
encapsulation.
Three different formulations were developed, for their characterization were carried out several tests
such as: physical-chemical tests, in vitro evaluation of the release, permeation and retention of
ketoconazole and the microbiological efficacy study of the formulations.
Several types of preservatives, antioxidants and a chelant were used in the reformulation of topical
preparation. BHT and EDTA originated favorable results concerning ketoconazole stability, moreover
imidazolidinyl urea presented promising results in terms of microbiological stability. Based on the results
of in vitro assays the release and permeation of ketoconazole were promising.
The developed innovative formulations, emulsion and liposomes, showed promising results in in
vitro studies and microbiological efficacy although the percentage of ketoconazole incorporation
achieved has been quite low (0.13% and 0.09% for emulsion and liposomes) when compared with
traditional formulations. These results are likely associated with dissolution of ketoconazole and the
presence of cutaneous promoter, ethoxydiglycol. Liposomes were excluded due to permeation of
ketoconazole in the deeper layers of the skin.
The studies of the efficacy of antifungal formulations, in C.albicans, revealed that best formulation
was the emulsion, although it has lowest inhibition halo the amount of ketoconazole is much smaller
compared to the traditional formulation.
Keywords: ketoconazole, topical preparation, fungal skin infections, emulsions, liposomes.
IV
Índice
Agradecimentos ..................................................................................................................................II
Resumo .............................................................................................................................................III
Abstract ............................................................................................................................................ IV
Índice................................................................................................................................................. V
Índice de Figuras ............................................................................................................................. VII
Índice de Tabelas............................................................................................................................ VIII
Lista de Abreviaturas ......................................................................................................................... X
Capítulo 1 - Introdução........................................................................................................................1
1.1.
A Pele .................................................................................................................................1
1.2.
Infeções fúngicas da pele ....................................................................................................2
1.2.1.
1.2.1.1.
Dermatofitoses .....................................................................................................3
1.2.1.2.
Infeções por Malassezia spp ................................................................................4
1.2.1.3.
Candidíases .........................................................................................................5
1.2.2.
1.3.
Tratamento das infeções fúngicas superficiais..............................................................5
Azóis ...................................................................................................................................5
1.3.1.
1.4.
Micoses cutâneas ........................................................................................................3
Cetoconazol .................................................................................................................6
1.3.1.1.
Ação antifúngica do cetoconazol ..........................................................................7
1.3.1.2.
Mercado Nacional ................................................................................................7
Formas Farmacêuticas ........................................................................................................8
1.4.1.
Emulsões .....................................................................................................................8
1.4.2.
Microemulsões e Nanoemulsões ..................................................................................9
1.4.3.
Lipossomas................................................................................................................ 11
1.5.
Objetivos da tese ............................................................................................................... 13
1.6.
Formulação convencional - Pesquisa ................................................................................. 13
1.6.1.
Seleção do conservante ............................................................................................. 15
1.6.2.
Seleção do antioxidante ............................................................................................. 16
1.7.
Formulação Inovadora - Pesquisa...................................................................................... 17
Capítulo 2 - Reformulações............................................................................................................... 20
2.1.
Matérias-primas ................................................................................................................. 20
2.2.
Equipamentos utilizados para a preparação das reformulações ......................................... 20
2.3.
Métodos ............................................................................................................................ 21
2.4.
Desenvolvimento galénico - Ensaios preliminares .............................................................. 24
2.4.1.
Lotes laboratoriais...................................................................................................... 28
2.4.2.
Formulações finais ..................................................................................................... 29
2.4.3.
Eficácia dos conservantes .......................................................................................... 34
2.4.3.1.
2.5.
Resultados ......................................................................................................... 35
Discussão dos resultados .................................................................................................. 36
V
Capítulo 3 - Formulações inovadoras ................................................................................................ 38
3.1.
Emulsões .......................................................................................................................... 38
3.1.1.
Matérias-primas ......................................................................................................... 38
3.1.2.
Equipamentos utilizados para a preparação da formulação ........................................ 38
3.1.3.
Métodos ..................................................................................................................... 39
3.1.4.
Desenvolvimento galénico - Ensaios preliminares ...................................................... 41
3.1.5.
Discussão dos resultados .......................................................................................... 52
3.2.
Lipossomas ....................................................................................................................... 54
3.2.1.
Matérias-primas ......................................................................................................... 54
3.2.2.
Equipamentos utilizados para a preparação da formulação ........................................ 55
3.2.3.
Métodos ..................................................................................................................... 55
3.2.4.
Desenvolvimento galénico - Ensaios preliminares ...................................................... 56
3.2.5.
Discussão dos Resultados ......................................................................................... 73
Capitulo 4 - Eficácia das formulações................................................................................................ 75
4.1.
Método .......................................................................................................................... 75
4.2.
Resultados..................................................................................................................... 75
4.3.
Discussão dos resultados .............................................................................................. 77
Capítulo 5 - Conclusão ...................................................................................................................... 79
Referências Bibliográficas ................................................................................................................. 81
Anexos ............................................................................................................................................. 87
VI
Índice de Figuras
Figura 1 - Pele e estruturas anexas [1]. ..............................................................................................1
Figura 2 - Camadas da epiderme [1]. .................................................................................................2
Figura 3 - Estrutura química da substância ativa cetoconazol [25]. .....................................................6
Figura 4 - Representação esquemática da estrutura do lipossoma demonstrando os fosfolípidos, a
sua organização, as bicamadas lipídica e a estrutura tridimensional, adaptado de Bruschi (2015) [39].
......................................................................................................................................................... 11
Figura 5 - Os quatro mecanismos de ação de sistema de libertação do fármaco através de
lipossomas na pele, adaptado de Guo, et al. (2015) [52]. .................................................................. 13
Figura 6 - Processo de fabrico das reformulações (F1 a F9). ............................................................ 25
Figura 7 - Representação gráfica do tamanho de gotícula. a) reformulações finais com cetoconazol e
produtos de referência no mercado. b) reformulações finais placebo................................................. 29
Figura 8- Perfil reológico das reformulações F2, F7 e F8. ................................................................. 32
Figura 9 - Perfis de cedência de cetoconazol das reformulações finais e dos cremes comerciais
(média ± DP, n=6). ............................................................................................................................ 32
Figura 10 – Permeação in vitro através da pele de cetoconazol das reformulações finais e dos
cremes comerciais em percentagem de cetoconazol (média ± DP, n=6)............................................ 34
Figura 11 - Método de produção das formulações emul líquida 1, 2, 3 e 4. ....................................... 42
Figura 12 - Representação gráfica do tamanho de gotícula da formulação emul líquida 2 no tempo
zero e após 5 dias. ............................................................................................................................ 42
Figura 13 - a) Processo de fabrico melhorado da formulação emul líquida 2. b) Processo de fabrico
da formulação emul líquida 2A. ......................................................................................................... 43
Figura 14 - Método de fabrico para a formação do creme O/A. ......................................................... 44
Figura 15 - Processo de fabrico das formulações emul creme 5 e 6.................................................. 46
Figura 16 - Tamanho de gotícula da formulação emul líquida 9. ....................................................... 47
Figura 17 - Imagem da formulação 9 com 0,13 % de cetoconazol (esquerda) e o respetivo placebo
(direita). ............................................................................................................................................ 48
Figura 18 - Representação da distribuição de tamanhos de gotícula da formulação final com
cetoconazol. ..................................................................................................................................... 49
Figura 19 - Perfil de cedência in vitro de cetoconazol da formulação emul 9 gel e creme comercial
(média ± DP, n=3). a) Quantidade de cetoconazol (µg/cm2) cedido. b) Percentagem de cetoconazol
cedido. .............................................................................................................................................. 50
Figura 20 - Permeação da pele in vitro de cetoconazol da formulação emul 9 gel e creme comercial
(média ± DP, n=6). a) Quantidade de cetoconazol (µg/cm2) permeado. b) Percentagem de
cetoconazol permeado. ..................................................................................................................... 51
Figura 21 - Quantidade (esquerda) e percentagem (direita) de cetoconazol retido no EC e camadas
viáveis da pele, da formulação emul 9 gel e de um creme comercial (média ± DP, n=3). ................... 52
Figura 22 - Esquema representativo da formação dos lipossomas instantâneos [84]. ....................... 57
Figura 23 - Representação do processo de fabrico de lipossomas instantâneos para substâncias
ativas hidrossolúveis e lipossolúveis [84]........................................................................................... 57
Figura 24 - Processo de Fabrico do placebo (formulação lipo 1). ...................................................... 58
Figura 25 - Processo de produção da formulação lipo 2 e 3. ............................................................. 59
Figura 26 - Processo de fabrico utilizado para a formulação lipo 4, 5, 6, 7 e 9. ................................. 61
Figura 27 - Processo de fabrico usado nas formulações lipo 9(a) e 10. ............................................. 61
Figura 28 - Fotografia das quatro formulações lipo 4, 5, 6 e 7. .......................................................... 62
Figura 29 - Representação gráfica da distribuição do tamanho das partículas das formulações lipo 4 e
6, n=3. .............................................................................................................................................. 63
Figura 30 - Processo de fabrico utilizado nas formulações lipo 8, 9.1 e 9.2. ...................................... 64
Figura 31 - Processo de fabrico usado nas formulações lipo 8.1, 9.1.1, 9.2.1, 10.1, 10.2 e 11. ......... 64
Figura 32 - Representação gráfica do tamanho de partícula das formulações lipo representadas na
Tabela 41, n=3. ................................................................................................................................. 66
Figura 33 - Processo de fabrico do placebo da formulação lipo 11. ................................................... 68
Figura 34 - Representação gráfica da formulação lipo 11 e respetivo placebo, n=3. ......................... 69
Figura 35 - Imagem da formulação lipo 11 e respetivo placebo. ........................................................ 69
VII
Figura 36 - Ilustração da morfologia dos lipossomas. A: Formulação lipo 11 com 0,094 %
cetoconazol. B: Formulação placebo. ................................................................................................ 70
Figura 37 - Morfologia dos lipossomas da formulação placebo. ........................................................ 70
Figura 38 - Permeação da pele in vitro de cetoconazol da formulação lipo 11 (a) e creme comercial
(b) em percentagem de cetoconazol (média ± DP, n=6). ................................................................... 71
Figura 39 - Permeação da pele in vitro de cetoconazol da formulação lipo 11 (a) e creme comercial
(b) em quantidade de cetoconazol (média ± DP, n=6). ...................................................................... 71
Figura 40 - Quantidade (esquerda) e percentagem (direita) retida de cetoconazol na EC e camadas
viáveis da pele da formulação lipo 11 e creme comercial (média ± DP, n=3). .................................... 72
Figura 41 - CMI obtida através do método Etest®. ............................................................................ 75
Figura 42 - Resultados obtidos do método Kirby-Bauer para os discos de papel (a) e de pele (b). .... 76
Figura 43 - Cromatograma da formulação F8 placebo. ..................................................................... 88
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Medicamentos comercializados em Portugal [31]. ..............................................................8
Tabela 2 - Classificação morfológica e tamanho dos lipossomas, adaptado de Bruschi (2015) [39]. .. 12
Tabela 3 - Vantagens e desvantagens de alguns conservantes [55], [56], [57]. ................................. 15
Tabela 4 - Vantagens e desvantagens de dois antioxidantes [55]...................................................... 16
Tabela 5 - Características gerais de matérias-primas usadas no desenvolvimento galénico [55], [69].
......................................................................................................................................................... 20
Tabela 6 - Constituição de cada reformulação (%, m/m). .................................................................. 24
Tabela 7 - Características das reformulações desenvolvidas. ........................................................... 26
Tabela 8 - Resultados da estabilidade das reformulações à temperatura ambiente (25 ± 2°C). ......... 27
Tabela 9 - Resultados da estabilidade das reformulações sujeitas à temperatura de 40 ± 2°C e a 75 ±
2 % HR. ............................................................................................................................................ 27
Tabela 10 - Composição da reformulação F10 (%, m/m). .................................................................. 28
Tabela 11 - Características organoléticas das reformulações finais. .................................................. 29
Tabela 12 - Tamanho de gotículas e o respetivo span, das reformulações finais com cetoconazol e
placebo e de dois cremes comerciais (média ± DP, n=5). .................................................................. 29
Tabela 13 - Resultado do pH das reformulações finais e das formulações de referência. .................. 30
Tabela 14 - Percentagem de recuperação de cetoconazol das reformulações finais e nos produtos
comerciais (média ± DP, n=2). .......................................................................................................... 30
Tabela 15 - Resultado do ensaio separação de fases, para as reformulações finais e cremes
comerciais. ....................................................................................................................................... 31
Tabela 16 - Viscosidade aparente da reformulação F2, F7, F8, creme comercial 1 e 2. ..................... 31
Tabela 17 - Parâmetros cinéticos obtidos no modelo de Ordem Zero e no modelo de Higuchi para as
reformulações finais e de referência (média ± DP, n=6)..................................................................... 33
Tabela 18 - Parâmetros da permeação cutânea das reformulações finais e das formulações de
referência (média ± DP, n=6). ........................................................................................................... 34
Tabela 19 - Critérios de aceitação [24]. ............................................................................................. 35
Tabela 20 - Ensaio da eficácia dos conservantes da reformulação F8, em redução logarítmica. ....... 35
Tabela 21 - Características gerais de matérias-primas usadas no desenvolvimento galénico [55], [78].
......................................................................................................................................................... 38
Tabela 22 - Constituição da formulação emul líquida 1 (%, m/m). ..................................................... 41
Tabela 23 - Composição das formulações emul líquida 2, 3 e 4 (%, m/m). ........................................ 41
Tabela 24 - Tamanho de gotícula da formulação emul líquida 2 e 2A a tempos de homogeneização
diferentes (média ± DP, n=5)............................................................................................................. 43
Tabela 25 - Composição da formulação emul creme 2A (%, m/m). ................................................... 44
Tabela 26 - Composição da formulação emul creme 5 e 6 (%, m/m). ................................................ 45
Tabela 27 - Resultado da análise do tamanho de gotícula das formulações emul creme 5 e 6 (média ±
DP, n=5). .......................................................................................................................................... 46
Tabela 28 - Composição da formulação emul líquida 7, 8, 9 e 10 (%, m/m). ...................................... 47
Tabela 29 - Características da formulação emul líquida 7, 8, 9 e 10. ................................................. 47
VIII
Tabela 30 - Resultados das características físico-químicas da formulação final com cetoconazol e
respetivo placebo. ............................................................................................................................. 49
Tabela 31 - Parâmetros cinéticos obtidos no modelo de Ordem Zero e no modelo de Higuchi para a
formulação final e de referência (média ± DP, n=3). .......................................................................... 50
Tabela 32 - Parâmetros da permeação cutânea da formulação final e do creme comercial (média ±
DP, n=6). .......................................................................................................................................... 51
Tabela 33 - Características gerais das matérias-primas utilizadas no desenvolvimento galénico das
formulações lipossomais [55], [83], [84]. ............................................................................................ 55
Tabela 34 - Composição da formulação lipo 2 e 3 (%, m/m). ............................................................. 58
Tabela 35 – Ensaio de dispersão do cetoconazol.............................................................................. 60
Tabela 36 - Constituição da formulação lipo 4 e 5 (%, m/m). ............................................................. 60
Tabela 37 - Eficiência de Incorporação (EI) de cetoconazol nas formulações lipo 4 e 6. .................... 62
Tabela 38 - Tamanho de partícula das formulações lipo 4 e 6 (média ± DP, n=3).............................. 62
Tabela 39 - Constituição da formulação lipo 8 e 8.1 (%, m/m). .......................................................... 63
Tabela 40 - Composição da formulação lipo 9, 9.1 e 9.2 (%, m/m). ................................................... 65
Tabela 41 - Constituição das formulações lipo 9(a), 9.1.1 e 9.2.1 (%, m/m). ...................................... 65
Tabela 42 - Eficiência de incorporação (EI) e tamanho de partícula das formulações lipo 9(a), 9.1.1 e
9.2.1 (média ± DP, n=3). ................................................................................................................... 66
Tabela 43 - Composição das formulações lipo 10, 10.1 e 10.2 (%, m/m). .......................................... 66
Tabela 44 - Eficiência de Incorporação (EI) da formulação lipo 10, 10.1 e 10.2 (média ± DP, n=3). ... 67
Tabela 45 - Constituição da formulação lipo 11 e respetivo placebo (%, m/m). .................................. 67
Tabela 46 – A Eficiência de Incorporação (EI) e o tamanho de partícula da formulação lipo 11 e
respetivo placebo (média ± DP, n=3)................................................................................................. 68
Tabela 47 - Resultado do doseamento de cetoconazol e do pH da formulação lipo 11 e respetivo
placebo (média ± DP, n=3)................................................................................................................ 70
Tabela 48 - Parâmetros da permeação cutânea da formulação lipo 11 e do creme comercial (média ±
DP, n=6). .......................................................................................................................................... 72
Tabela 49 - Fases recetoras estudadas para os ensaios in vitro........................................................ 87
IX
Lista de Abreviaturas
A/O - Água em Óleo
b - Interceção
BHT - Butil-hidroxitolueno
CDs - Ciclodextrina
EC - Estrato Córneo
E.H.L - Equilíbrio Hidrofilo-Lipofilo
EI - Eficiência de Incorporação
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês High-performance liquid chromatography
HPMC - Hidroxipropilmetilcelulose
HR - Humidade Relativa
k - Taxa de libertação constante
kp - Coeficiente de permeabilidade
lag time - Tempo de latência
CMI - Concentração mínima inibitória
NLC - Vetores lipídicos nanoestruturados, do inglês Nanostructured Lipid Carriers
O/A - Óleo em Água
PdI - Índice de polidispersão, do inglês Polydispersity Index
q.b - Quanto baste
R2 - Coeficiente de determinação
SDA - Agar Sabouraud Dextrose, do inglês Sabouraud Dextrose Agar
SLN - Nanopartículas lipídicas sólidas, do inglês Solid Lipid Nanoparticles
Span - Medida da distribuição
TSA - Agar Triptona de Soja, do inglês Tryptic Soy Agar
UV - Ultravioleta
VML - Vesículas Multilamelares
VUG - Vesículas Unilamelares Grandes
VUL - Vesículas Unilamelares
VUP - vesículas Unilamelares Pequenas
X
Capítulo 1 - Introdução
1.1. A Pele
O sistema tegumentar constitui a fronteira entre o corpo e o meio exterior. É composto pela pele e
por todas as estruturas anexas a esta. As principais funções deste sistema são: proteção, sensação,
regulação de temperatura, produção de vitamina D e excreção [1]. A Figura 1 ilustra a pele e as
estruturas anexas, como o pêlo e as glândulas.
Figura 1 - Pele e estruturas anexas [1].
A pele é composta por três camadas, a hipoderme, a derme e a epiderme. A hipoderme é por vezes
designada por tecido celular subcutâneo ou fáscia superficial. É esta camada que une as outras duas
camadas da pele aos ossos e músculos subjacentes e lhes fornece vasos sanguíneos e nervos. Na
hipoderme encontra-se cerca de metade da gordura armazenada no corpo, que funciona como
acolchoado e isolante. A derme é a camada que está unida à hipoderme. É uma camada de tecido
conjuntivo responsável pela maior parte da resistência estrutural da pele. A epiderme é uma camada
de tecido epitelial e assenta na derme. Esta camada não é tão espessa como a derme e é avascular.
A maior parte das células da epiderme são designadas por queratinócitos, as restantes são os
melanócitos, as células de Langerhans e as células de Merkel. Os queratinócitos produzem uma
mistura proteica denominada queratina. As camadas de células da epiderme são divididas em cinco
estratos/camadas: camada basal, espinhosa, granulosa, translúcida e córnea. Na camada basal as
células dividem-se por mitose e algumas destas células recém-formadas incorporam-se nas camadas
mais superficiais, onde serão queratinizadas. A camada espinhosa é constituída por 8 a 10 camadas
de células e à medida que estas células vão ascendendo para a superfície vão-se achatando. Neste
estrato há acumulação de fibras de queratina e formação de corpos lamelares dentro dos
queratinócitos. Na camada granulosa forma-se a queratohialina e um invólucro de queratina dura. Nas
células mais superficiais deste estrato, o núcleo e outros organelos degeneram e a célula morre, no
entanto, as fibras de queratina e os grânulos de queratohialina não degeneram. A camada translúcida
1
é constituída por células mortas que contêm a queratohialina dispersa em torno das fibras de queratina.
O estrato córneo (EC) sofre descamação pela sua localização mais superficial, onde as células
queratinizadas mortas são eliminas continuamente à medida que a roupa fricciona o corpo ou quando
a pele é lavada. Esta camada é constituída por células queratinizadas mortas rodeadas por um
invólucro proteico duro e preenchidas com queratina. A queratina é uma mistura de fibras de queratina
e queratohialina. O tipo de queratina que se encontra na pele é a queratina mole, o outro tipo é a
queratina dura encontrada nas unhas e porções exteriores dos pêlos. Em torno destas células
queratinizadas encontram-se lípidos, libertados pelos corpos lamelares, que são responsáveis pela
coesão destas células [1]. A Figura 2 representa as cinco camadas da epiderme.
Camada córnea
Camada translúcida
Camada granulosa
Camada espinhosa
Camada basal
Figura 2 - Camadas da epiderme [1].
1.2. Infeções fúngicas da pele
A partir de 1840, a micologia médica humana começou a surgir com observações feitas por parte
de Schoenlein, Langenbeck e Grub sobre micoses superficiais, exibindo pela primeira vez que fungos
podem causar doença [2],[3]. No final do século XIX, as causas das infeções fúngicas foram
descobertas e foram realizadas várias pesquisas, tendo sido Saboraud um dos micologistas mais
importantes da micologia dermatológica. Apesar do começo precoce da micologia médica, o
desenvolvimento terapêutico de antifúngicos evoluiu lentamente [2].
Os fungos são células eucariotas, desprovidas de clorofila e reproduzem-se por esporos. Estes
microrganismos apresentam-se de forma e dimensões muito variadas e são conhecidos como
leveduras, bolores, mofo, morrão e cogumelos. Os fungos leveduriformes são unicelulares e os
restantes são fungos filamentosos ou pluricelulares [4]. Este microrganismo não precisa de parasitar o
homem para sobreviver, apenas poucas espécies atacam casualmente o organismo humano
causando, em geral, micoses, intoxicações ou envenenamentos.
2
As micoses são infeções provocadas por fungos e a sua classificação em humanos depende da
localização da infeção. Estas infeções fúngicas são classificadas como: micoses superficiais ou
cutâneas e mucocutâneas, subcutâneas e sistémicas ou profundas [4],[5].
As micoses superficiais são infeções limitadas à camada superficial da pele (epiderme), unhas,
cabelo e membranas mucosas. As micoses subcutâneas são infeções que envolvem a derme, tecidos
subcutâneos e osso adjacente [4], [6]. Estas ocorrem, em resultado da implantação traumática de
fungos que crescem no solo e em vegetação em decomposição. As micoses sistémicas podem ocorrer
em pacientes comprometidos. Infeções oportunistas e confinadas a áreas endémicas específicas,
micoses endémicas ou respiratórias. Estas podem infetar qualquer pessoa independentemente de
alguma doença implícita. Estas infeções ocorrem devido à disseminação do fungo pelos pulmões,
depois da sua inalação da natureza [7],[5].
1.2.1. Micoses cutâneas
As micoses cutâneas estão entre as doenças de maior prevalência. Afetam cerca de 20 - 25 % da
população mundial e a sua ocorrência continua a aumentar [2], [8], [9]. Estas infeções variam com a
idade, o sexo, a etnia e os hábitos socioculturais. Como micoses superficiais consideram-se as
dermatofitoses, doenças causadas por dermatófitos, as candidíases e as infeções fúngicas causadas
por Malassezia spp [4], [10].
1.2.1.1.
Dermatofitoses
As dermatofitoses são infeções provocadas por um grupo definido de fungos, os dermatófitos.
Estes são fungos filamentosos septados que consoante as caraterísticas dos seus macroconídios são
classificados em três grupos: Trichophyton spp, Microsporum spp e Epidermophyton spp [4],[10].
Estes tipos de fungos podem ser classificados como antropofílicos, zoofílicos e geofílicos de acordo
com o seu habitat natural [4], [9]. As características deles são:
-
Antropofílicos: têm como único hospedeiro o Homem e provocam dermatofitoses de
atividade inflamatória baixa devido ao seu habitat natural. Exemplos: Epidermophyton
floccosum, Microsporum audouinii, Trichophyton tonsurans [4], [9].
-
Zoofílicos: vivem normalmente em animais, mas podem parasitar também o Homem,
causam infeções muito inflamatórias e muito contagiosas. Exemplos: Microsporum canis,
Trichophyton equinum [4], [9].
-
Geofílicos: fungos usualmente isolados do solo, ocasionalmente são patogénicos para o
Homem ou animais e provocam infeções que podem ter atividade inflamatória baixa ou
alta. Exemplos: Microsporum gypseum, Microsporum fulvum, Trichophyton simii [4],[9].
3
A dermatofitose é uma infeção da pele e das estruturas que apresentam queratina na sua
constituição, como o cabelo/pêlo e as unhas [10]. Ao contrário das leveduras e dos fungos patogénicos
não dermatófitos, estas infeções não se propagam sistemicamente, portanto não são letais [9].
A transmissão dos dermatófitos pode ser indireta através de escamas da epiderme e do couro
cabeludo parasitado, ou de objetos contaminados. O contágio também pode ser direto, por contacto
com a área afetada, mas é uma forma de transmissão rara [4], [10].
Os dermatófitos provocam infeções comummente designadas por tinhas, esta lesão caracteriza-se
pelo seu aspeto circular, bordos irregulares e inflamatórios, designada impigem [4]. Existem vários tipos
de tinhas que correspondem à localização das lesões no corpo, como: tinha dos pés (tinea pedis,
também conhecida por pé-de-atleta), tinha das unhas (tinea unguium), tinha corporal (tinea corporis),
tinha genital (tinea cruris) e tinha do couro cabeludo (tinea capitis) [9].
A infeção dá-se, normalmente, pelo contato de um artrósporo com a queratina da pele de um
hospedeiro vulnerável. Após a incubação, o esporo germina e desenvolve-se na camada córnea, dando
origem às impigens [4].
Para além das tinhas, os dermatófitos podem infetar as unhas, originando as onicomicoses
dermatofíticas. Esta infeção deve-se à existência de lesões em áreas próximas que atuam como fonte
de infeção [4].
1.2.1.2.
Infeções por Malassezia spp
Malassezia spp é uma levedura lipofílica que pertence à flora normal da pele, sobretudo nas zonas
mais oleosas [10]. Está associada a doenças como a pitiríase versicolor e a dermatite seborreica [10].
Pitiríase versicolor é considerada a dermatomicose mais disseminada em todo o mundo,
particularmente em climas tropicais e subtropicais. Em climas temperados, como Portugal, é no verão
que se verifica a maior prevalência [4]. É uma doença causada pelo excessivo crescimento da
Malassezia furtur, também conhecida como Pityrosporum orbiculare, este excesso é devido a fatores
como temperaturas quentes e humidade elevada, imunossupressão, desnutrição, elevada secreção de
sebo e uso de corticoides [11], [9]. Esta levedura provoca manchas descamativas na pele, de contornos
bem delimitados e de tamanho e formas variáveis, que podem apresentar tonalidades de coloração
variadas, indo da hipopigmentação à hiperpigmentação [4], [9]. Aparece habitualmente no tronco, mas
com o avança da infeção pode afetar o pescoço, axilas, braços e abdómen [4].
A dermatite seborreica é uma doença inflamatória superficial que afeta cerca de 2 - 5 % da
população mundial. Esta micose afeta regiões da pele com uma elevada densidade de glândulas
sebáceas, como a face, couro cabeludo e tranco superior. Os sintomas desenvolvem-se gradualmente
e a dermatite provoca uma descamação seca ou gordurosa do couro cabeludo, conhecida como caspa,
com prurido variável associado, mas sem queda de cabelo. Num estadio mais avançado, ocorre o
aparecimento de pápulas amarelas/avermelhadas ao longo do risco penteado no cabelo, atrás das
orelhas, ouvido externo, sobrancelhas, axilas, na cana do nariz e peito [12], [13].
4
1.2.1.3.
Candidíases
A candidíase é uma infeção causada pelas espécies de Candida spp. Este género pertence à flora
normal do corpo humano, mas são patogénicos oportunistas [9]. A Candida albicans faz parte da flora
normal da boca, vagina e trato gastrointestinal de indivíduos saudáveis [14]. Esta infeta tipicamente a
pele, unhas, mucosas e o trato gastrointestinal [9]. Existem três tipos de candidíase superficial, a
orofaríngea, a vaginal e a da pele [14]. Em populações normais, estas infeções ocorrem devido a uma
deficiência da barreira da pele e à acumulação da levedura endógena [9].
1.2.2. Tratamento das infeções fúngicas superficiais
O tratamento de infeções fúngicas superficiais pode ser executado através de administração tópica
ou oral de fármacos antifúngicos [6]. A seleção da terapia é feita de acordo com extensão da infeção,
entre outros fatores.
O tratamento com um antifúngico oral, em termos de segurança de terapia, está associada a
desvantagens como a toxicidade hepática grave e a possível interação com outros fármacos [6].
As formas galénicas de apresentação dos antifúngicos tópicos são cremes, pomadas, loções ou
“sprays”, que se aplicam na camada córnea para matar os fungos (fungicidas) ou pelo menos torná-los
incapazes de se dividirem ou crescerem (fungistáticos). Posto isto, as terapias tópicas demostraram
eficácia para eliminar da pele os fungos e as leveduras tópicas [6].
A aplicação do antifúngico localmente tem grandes vantagens como sejam: a exposição do fármaco
na pele é limitada à zona afetada, a absorção sistémica do fármaco é impedida ou minimizada, o que
faz com que os efeitos colaterais do fármaco sejam evitados [6], [15]. Para além do que foi referido,
este tipo de tratamento tem maior aceitação por parte dos pacientes [15]. Relativamente às
desvantagens, esta terapia pode levar a uma reação da pele no local da aplicação e é muito demorada
[9].
Neste tipo de infeções, em que o microrganismo patogénico atua sobre ou dentro da camada mais
externa da pele, o antifúngico deve atingir o EC em concentrações suficientes para inibir o crescimento
do agente patogénico [16].
Existem diversos antifúngicos tópicos que têm sido utilizados no tratamento de infeções da pele.
As principais classes destes fármacos são polienos, azóis e alilamina/benzilaminas [15].
1.3. Azóis
Foi na década de 60 que surgiram os primeiros derivados de azóis. Estes derivados apresentam
um largo espectro de ação, sendo ativos contra fungos filamentosos, dimorfos e leveduras [17], [18].
Os azóis dividem-se em imidazóis e triazóis. Pertencem aos derivados de imidazóis os antifúngicos
cetoconazol, miconazol e clotrimazol. No caso do grupo dos triazóis, os mais antigos são o fluconazol
5
e o itraconazol e os derivados mais recentes são o voriconazol, o ravuconazol, o posaconazol e o
albaconazol [18], [19].
Os antifúngicos azóis são utilizados para tratar os vários tipos de micoses como espécies de
candida, micoses endémicas, dermatófitos e infeções fúngicas caudadas por Malassezia spp [20].
Este grupo de antifúngicos baseiam-se na inibição da via de biossíntese do ergosterol, sendo este
o principal componente da membrana celular dos fungos. O principal mecanismo de ação dos azóis, é
a inibição das enzimas oxidativas associadas ao Citocromo P450, como lanosterol 14-α-desmetilase,
o que origina o bloqueio da conversão de lanosterol em ergosterol, levando à morte do fungo [18], [21].
Para ocorrer uma ação fúngica é necessária uma quantidade determinada de fármaco que depende
da sua CMI, podendo ocorrer recaídas caso a dose terapêutica não seja aplicada durante tempo
suficiente. Existem diversos tipos de formas galénicas com este tipo de antifúngicos como, pós,
comprimidos e cápsulas, injetáveis, soluções, cremes e pomadas [20].
1.3.1. Cetoconazol
Cetoconazol é um antifúngico de largo espectro e é um derivado do imidazol [22], [23].
Quimicamente é designado por 1-Acetil-4-[4[[(2RS,4SR)-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-imidazol-1-ilmetil)-1,3dioxolan-4-il]-metoxi]fenil]piperazina, apresenta a fórmula química C26H28CI2N4O4 e a sua massa
molecular é de 531,43092 g/mol [24],[25]. A Figura 3 representa a estrutura química do composto [25].
Figura 3 - Estrutura química da substância ativa
cetoconazol [25].
O cetoconazol é um fármaco quiral clinicamente utilizado como uma mistura racémica na
configuração cis [26]. Existem quatro impurezas deste composto, de acordo com a Farmacopeia
Europeia:
-
Impureza I: trans-cetoconazol;
-
Impureza II: 1-acetyl-4-[4-[[(2R,4R)- 2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H-imidazol-1-ylmethyl)-1,3dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]1,2,3,4-tetrahydropiperazine;
6
-
Impureza III: 1-acetyl-4-[4-[[(2R,4R)-2-(2,4-dichlorophenyl)-2- (1H-imidazol-1-ylmethyl)1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]-3[4-(4-acetylpiperazin-1-yl)phenoxy]phenyl]piperazine;
-
Impureza
IV:
1-[4-[[(2R,4S)-2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H-imidazol-
1-ylmethyl)-1,3-
dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazine) [26].
Cetoconazol é uma base fraca com dois pKa 6,51 e 2,94 e apresenta um log P de 4,34. Este
composto pode sofrer degradação, incluindo oxidação e hidrólise, especialmente em meios aquosos,
caso não seja devidamente formulado [22], [25].
A substância ativa em estudo é um pó branco ou quase branco. Em termos de solubilidade é
praticamente insolúvel em água, facilmente solúvel em cloreto de metileno, solúvel em metanol e
ligeiramente solúvel em etanol a 96 % [24].
1.3.1.1.
Ação antifúngica do cetoconazol
Foi no início dos anos 80 que o cetoconazol foi comercializado e utilizado para o tratamento de
infeções fúngicas sistémicas, por administração oral, onde se obtiveram resultados positivos. Este
imidazol é considerado um antifúngico de segunda linha, porque quando comparado com os triazóis
exibem um espectro de atividade mais restrito e um perfil de reações adversas menos favoráveis [20].
O cetoconazol pode ser administrado por via oral ou por via tópica. Por via oral é utilizado para o
tratamento de candidíase mucocutânea crónica, infeções fúngicas do trato gastrointestinal, infeções
sistémicas como blastomicose, candidíase, coccidioidomicose, histoplasmose e paracoccidioidomicose
[27], [28]. Também é utilizado em dermatofitoses e infeções nas unhas quando a administração tópica
não é suficiente [27], [28]. No caso da administração tópica o imidazol é usado para dermatofitoses,
pitiríase versicolor, dermatite seborreica e candidíase cutânea [2], [6], [20], [29], [30].
Em adultos, quando o derivado imidazol é administrado por via oral deve ser em doses de 200 mg
de 24 em 24 horas durante 14 dias, no caso de candidíase vaginal resistente a dose deve ser de 400
mg por dia durante 5 dias. Alguns dos efeitos adversos aquando da utilização de comprimidos são
disfunção hepática grave, náuseas, vómitos e erupções cutâneas [20].
Existem no mercado várias formas farmacêuticas tópicas como champô, creme e solução,
normalmente com 20 mg/g e 20 mg/ml por dose, que devem ser aplicados 2/3 vezes por dia,
continuando mais 14 dias após a cura das lesões. Apenas poderá ocorrer irritação dérmica ocasional
ou sensibilidade [20].
1.3.1.2.
Mercado Nacional
Na Tabela 1 estão indicados os medicamentos com a substância ativa cetoconazol atualmente
autorizados em Portugal [31].
7
Tabela 1 - Medicamentos comercializados em Portugal [31].
Nome do
medicamento
Forma
Farmacêutica
Dosagem
Titular da AIM
Genérico
Champô
20 mg/g
Actavis A/S Sucursal
Sim
Champô
20 mg/g
Generis Farmacêutica, S.A.
Sim
Comprimido
200 mg
Laboratoire HRA Pharma
Não
Nizoral®
Champô
20 mg/g
Johnson & Johnson, Lda.
Não
Nizoral®
Creme
20 mg/g
Johnson & Johnson, Lda.
Não
Tedol®
Champô
20 mg/g
Tedol®
Creme
20 mg/g
Tedol®
Líquido cutâneo
20 mg/ml
Cetoconazol
Actavis
Cetoconazol
Generis
Ketoconazole
HRA
Laboratório Edol - Produtos
Farmacêuticos, S.A.
Laboratório Edol - Produtos
Farmacêuticos, S.A.
Laboratório Edol - Produtos
Farmacêuticos, S.A.
Não
Não
Não
Observa-se que a maior parte dos medicamentos com cetoconazol comercializados em Portugal
são formas farmacêuticas tópicas, como champô, creme e líquido cutâneo.
1.4. Formas Farmacêuticas
1.4.1. Emulsões
As emulsões são sistemas heterogéneos constituídos pelo menos por dois líquidos imiscíveis, água
e óleo, onde uma das fases é geralmente dispersa uniformemente como gotículas finas na outra fase
líquida por um processo de agitação mecânica. Estes sistemas apresentam duas fases distintas, as
gotículas que se designam por fase dispersa ou interna e o líquido que as rodeia por fase contínua ou
externa. Existem dois tipos de emulsões dependendo se é a fase aquosa ou oleosa predominante na
fase dispersa. Se as gotículas de óleo estão dispersas numa fase contínua, estamos perante uma
emulsão O/A, se pelo contrário o óleo é a fase contínua a emulsão designa-se de A/O [32], [33], [34].
As emulsões são sistemas termodinamicamente instáveis, devido à existência de uma elevada
energia livre à superfície das gotículas. Por norma as gotículas tendem a combater este fenómeno
formando agregados para diminuir a área interfacial que leva assim à diminuição da energia livre. A
adição de um agente emulsionante atenua a instabilidade das emulsões, uma vez que forma um filme
ao redor das gotículas, levando à diminuição da energia interfacial entre a fase dispersa e contínua
[32],[33].
Os tipos de emulsões podem ser dependentes do tensioativo adicionado à emulsão. A tendência
de um agente emulsionante ser mais hidrofílico e lipofílico forma emulsões O/A e A/O, respetivamente.
Através da escala criada por Griffin, que se baseia no equilíbrio hidrofílico e lipofílico (E.H.L.), é possível
escolher um ou mais tensioativos para formar o tipo de emulsão pretendido. Esta escala indica que
8
tensioativos hidrofílico têm um E.H.L. de 8 - 16 e os tensioativos lipofílico apresentam um valor de E.H.L
de 3 - 8 [32], [35].
A instabilidade das emulsões pode ser evidenciada pela cremagem, floculação e / ou coalescência.
A cremagem ocorre quando as partículas suspensas ou as gotículas tendem a sobrenadar ou
sedimentar, dependendo das diferenças de densidades entre as duas fases, sob influência da
gravidade. A agregação reversível das gotículas da fase interna designa-se de floculação, e está
relacionada com as forças de atração e repulsão. A coalescência está diretamente relacionada com a
junção das gotículas da fase interna, que leva à separação de fases da emulsão [32].
As emulsões podem ser classificadas de acordo com o local de administração, isto é, oral,
parentéricas e tópicas. Os cremes O/A são facilmente laváveis e não deixam uma película gordurosa
na pele, sendo uma das caraterísticas desejadas por parte dos doentes [32].
Os cremes são sistemas semi-sólidos emulsionados de aparência branca. Podem ser emulsões
O/A ou A/O [32].
1.4.2. Microemulsões e Nanoemulsões
Tem sido dada bastante importância aos sistemas micro e nanoestruturados com tensioativo, pela
sua capacidade de aumentar a eficácia terapêutica de fármacos, permitindo reduzir a dose administrada
e diminuir os efeitos adversos de fármacos [36] Estes sistemas têm capacidade de incorporar
substâncias ativas nas gotículas presentes na fase interna, induzindo modificações nas propriedades
biológicas dos fármacos incorporados. Além do mencionado, melhoram a solubilização de fármacos
lipofílicos em água e protegem-nos contra hidrólise enzimática, para além de aumentar a permeação
cutânea devido à presença do tensioativo [36].
A microemulsão é constituída por dois líquidos imiscíveis, óleo e água, e um tensioativo, que na
maioria dos casos pode ser complementado por um co-tensioativo, a fim de estabilizar a interface [37],
[38]. A junção destes constituintes, independentemente da ordem de adição, origina um sistema líquido
de forma espontânea, termodinamicamente estável, transparente e de baixa viscosidade [39]. Em
relação ao tamanho de gotícula, este tipo de sistema é caracterizado por ter gotículas de 100 a 200 nm
[33].
Este sistema pode ser de três tipos, O/A, onde a água é a fase dispersante; A/O, onde o óleo é a
fase dispersante e microemulsão bicontínua, onde a água e o óleo apresentam quantidades quase
iguais [40]. A orientação do tensioativo na interface é diferente, depende do tipo de microemulsão, isto
é depende das propriedades físico-químicas do tensioativo e do óleo, bem como das proporções
água/óleo [36], [40]. A razão entre o grupo hidrófilo e hidrófobo das moléculas de tensioativo, que é o
seu equilíbrio hidrófilo-lipófilo, também é importante na determinação da película interfacial e,
consequentemente, na estrutura da microemulsão [40].
As microemulsões são formadas por emulsificação espontânea que normalmente requerem pouca
energia [41].
9
As microemulsões têm sido amplamente exploradas para a entrega de fármacos através de várias
vias, como a dérmica, transdérmica, ocular, nasal, vaginal, rectal, bucal, periodontal, e parentérica [41].
No caso da via tópica, este sistema coloidal, apresenta vantagens na administração de fármacos
com fraca solubilidade em água pois, melhora a solubilização de fármacos e consequentemente a
permeação na pele para além da estabilidade a longo prazo. Para além do mencionado, este sistema
pode ter a capacidade de reduzir a irritação da pele [37], [42].
As nanoemulsões podem ser consideradas emulsões convencionais que contêm gotículas muito
pequenas. As nanoemulsões também são designadas de mini-emulsões, emulsões ultrafinas ou
emulsões submicrons. Tal como no caso das macroemulsões e microemulsões, podem considerar-se
dois tipos de nanoemulsões, as do tipo O/A e A/O. Os excipientes utilizados para a formação desta
forma farmacêutica não diferem dos constituintes usados nas emulsões convencionais.
Em comparação com as microemulsões, as nanoemulsões são cineticamente estáveis,
termodinâmicamente instáveis e a sua formação depende da temperatura, da pressão, da composição
e dos procedimentos experimentais. Este sistema pode ser preparado envolvendo o fornecimento de
energia, por ação de dispositivos mecânicos, ou mediante a ação do potencial químico dos seus
componentes. Em ambos aos métodos é possível obter uma formulação com tamanho de gotículas
uniformes e de escala nanométrica [39], [43].
As nanoemulsões, dependendo do tamanho de gotícula, dividem-se em dois grupos: as
transparentes/ translúcidas e as de cor branca, designada de leitosas. O primeiro grupo enquadra-se
na gama de tamanho de gotícula de 50 - 200 nm e o segundo até aos 500 nm [43].
As nanoemulsões apresentam propriedades superiores comparativamente com as macroemulsões
como: pequeno tamanho de gotícula permite uma distribuição uniforme sobre a pele, elevada área de
superfície, melhor oclusividade, sensação agradável quando aplicado topicamente [43].
A utilização de nanoemulsões como transportadores coloidais está documentada, para a
administração tópica de fármacos e em cosmética [44], [45], como sistemas de libertação ocular [46],
para a administração oral de fármacos pouco hidrossolúveis e/ou aumento da absorção gastrintestinal,
que está relacionada com o tamanho de gotícula [47], para alimentação parenteral, pelo facto de serem
necessárias gotículas de tamanho nanométrico e de permitir administrar nutrientes lipófilos por via
endovenosa [48].
As nanoemulsões são utilizadas em produtos dermocosméticos e cosméticos para aplicação na
pele e nos cabelos. Estas formulações apresentam tamanho de gotícula reduzido e permitem obter
preparações que fluem facilmente sobre pele, separando-se nos seus constituintes após aplicação.
Assim, não se espera toxicidade associada a estes sistemas, os quais beneficiam ainda da redução da
quantidade do tensioativo quando comparadas com as microemulsões [49].
10
1.4.3. Lipossomas
Os lipossomas são vesículas constituídas por bicamadas compostas por fosfolípidos. Estes
sistemas são constituídos por duas regiões distintas: um espaço interno aquoso rodeado por uma ou
mais bicamadas dispostas concentricamente (Figura 4). O diâmetro dos lipossomas pode variar entre
alguns nanómetros e alguns micrómetros [39]. As bicamadas podem ser compostas por moléculas
lipídicas sintéticas ou naturais. No entanto, os fosfolípidos geralmente utilizados para preparar os
lipossomas são considerados matérias-primas “geralmente reconhecido como seguros” (GRASGenerally Recognized As Safe) e, consequentemente, minimizam potenciais efeitos adversos da sua
utilização [39], [50].
Fosfolípidos
Cabeça polar
Cauda hidrofóbica
Organização
Bicamada lipídica
Espaço interno aquoso
Região hidrofóbica
Lipossoma
Figura 4 - Representação esquemática da estrutura do lipossoma
demonstrando os fosfolípidos, a sua organização, as bicamadas
lipídica e a estrutura tridimensional, adaptado de Bruschi (2015) [39].
Os lipossomas são classificados de acordo com a sua dimensão e número de bicamadas,
unilamelares ou multilamelares, característica muito importante no controlo do sistema de libertação do
fármaco. As vesículas unilamelares (VUL) podem ser classificadas em vesículas unilamelares
pequenas (VUP) e vesículas unilamelares grandes (VUG) [39], [50]. As vesículas multilamelares são
designadas por VML. A classificação dos lipossomas está demostrado na Tabela 2 [39].
11
Tabela 2 - Classificação morfológica e tamanho dos lipossomas, adaptado de Bruschi (2015) [39].
Classificação
Morfologia
Diâmetro (nm)
Estrutura
VML
100 – 5000
Número variado de bicamadas
VUP
< 100
Vesículas unilamelares pequenas
preenchidas com solução aquosa
VUG
100 – 2000
Vesículas unilamelares grandes
preenchidas com solução aquosa
Geralmente a preparação dos lipossomas envolve a dispersão de fosfolípidos e outros
componentes num solvente, que posteriormente é removido. A evaporação deste solvente leva à
formação de uma película fina de lípidos, agarrada às paredes do recipiente. A adição de uma solução
aquosa e da substância ativa (no caso de ser hidrófilica) ao recipiente leva ao deslocamento da película
lipídica, formando esferas ou cilindros, aprisionando a solução aquosa no interior [39]. A incorporação
de uma substância ativa lipofílica faz-se, geralmente, por solubilização conjunta com os fosfolípidos.
Os lipossomas são capazes de incorporar nas bicamadas concêntricas substâncias ativas
hidrofílicas e lipofílicas. Os fármacos hidrofílicos são geralmente retidos no espaço interno aquoso, e
as moléculas lipofílicas são incorporadas nas bicamadas lipídicas [39], [51].
Este tipo de vesículas têm sido estudadas com o propósito de modificar e controlar a libertação de
fármacos a ser administrados numa ampla gama de vias, por exemplo parentérica, tópica e por
inalação. Os fármacos incorporados nos lipossomas são protegidos do ambiente externo, além de que
a estrutura única destes veículos permite incorporar os dois tipos de fármacos, hidrófobos e hidrofílicos,
sem modificação química [39], [50].
Os lipossomas poderão ser utilizados como veículos para libertar os fármacos na pele. Estes atuam
como potenciadores de permeação por causa dos fosfolípidos que penetram no EC e alteram as
camadas da pele. Estas vesículas são conhecidas por favorecerem a deposição do fármaco na pele,
reduzirem potenciais irritações locais causadas pelo fármaco e melhorarem a estabilidade do fármaco
[51].
Existem diferentes mecanismos de ação dos lipossomas que permitem a penetração do fármaco
através da pele, como ilustrado na Figura 5. No primeiro mecanismo, (a), ocorre a alteração da
bicamada lipossomal e a interação com os lípidos da pele levando a um aumento da fluidez. Em
segundo lugar, (b), sucede a adsorção e /ou fusão da vesícula com o EC, onde o fármaco é transferido
diretamente para a pele, ou as vesículas podem fundir-se e misturar-se com os lípidos do EC. No
mecanismo (C), ocorre a penetração da vesícula intacta na pele, ou seja, a elevada deformabilidade
destas vesículas invade e percorre profundamente a pele. O último mecanismo, (d), mostra a
penetração da vesícula no folículo piloso, no entanto, tem sido demostrado que este mecanismo não
tem um papel importante na libertação de vesículas na pele [52].
12
Lipossoma
Cetoconazol
EC
Epiderme
viável
Derme
Figura 5 - Os quatro mecanismos de ação de
sistema de libertação do fármaco através de
lipossomas na pele, adaptado de Guo, et al.
(2015) [52].
1.5. Objetivos da tese
O presente trabalho centrou-se no desenvolvimento e melhoria de formas farmacêuticas tópicas
convencionais e no desenvolvimento de novos sistemas de veiculação de fármacos, contendo um
antifúngico.
Os principais objetivos do atual trabalho consistiram em:
-
Reformular uma preparação tópica contendo cetoconazol por forma a melhorar a
estabilidade físico-química e microbiológica do produto;
-
Desenvolver formulações inovadoras aplicando nanotecnologias e micro encapsulação do
antifúngico em estudo.
1.6. Formulação convencional - Pesquisa
Como mencionado anteriormente, pretendeu-se reformular uma formulação tópica convencional
contendo cetoconazol, com o intuito de solucionar as questões da estabilidade físico-química e
microbiológica.
O problema associado à estabilidade físico-química prende-se na alteração das características
organoléticas, concretamente na alteração da cor inicial, branca, para rosa. Atualmente sabe-se que o
aparecimento da cor rosa se deve à degradação do cetoconazol e que esta deterioração está
relacionada com a presença de alguns conservantes. Para além da instabilidade físico-química, existe
a questão dos conservantes presentes no produto não serem eficazes durante a validade do produto.
Assim sendo, foi necessário encontrar soluções para aumentar a estabilidade do produto, a
13
incorporação de antioxidantes e estabilizantes de fármaco, e conservantes que sejam eficazes durante
todo o prazo de validade do produto.
Os conservantes presentes na formulação convencional são: o metilparabeno sódico e o
propilparabeno sódico. Em estudos anteriores foram estudados outros conservantes na tentativa de
ultrapassar o aumento da contaminação microbiana como: metilpropanodiol, caprililglicol, fenilpropanol;
imidazolidinil ureia e o sulfito de sódio. As formulações que apresentaram resultados conformes, de
acordo com as especificações da Farmacopeia Portuguesa (FP) em vigor, foram:
-
Metilparabeno sódico (0,18 %) e o propilparabeno sódico (0,02 %) + metilpropanodiol,
caprililglicol, fenilpropanol (2,00 % ou 3,00 %);
-
Metilparabeno sódico (0,18 %) e o propilparabeno sódico (0,02 %) + imidazolidinil ureia
(0,28 %);
-
Metilpropanodiol, caprililglicol, fenilpropanol (2,00 % e 3,00 %);
-
Imidazolidinil ureia (0,30 % e 0,60 %);
-
Sulfito de sódio (0,10 %).
Apesar destes conservantes apresentarem resultados conformes com os requisitos da eficácia
microbiana para as formulações tópicas [24], a utilização do metilpropanodiol, caprililglicol,
fenilpropanol alterou a viscosidade das formulações, mostrando que este não era ideal. Para além do
referido, à exceção da formulação com 0,10 % de sulfito de sódio, as restantes formulações
apresentaram coloração rosa ao fim de um tempo relativamente curto (< a 6 meses).
Peraro (2011) estudou a estabilidade física de formulações farmacêuticas tópicas com o princípio
ativo cetoconazol. Neste estudo, foram feitas várias formulações com conservantes distintos e com o
antioxidante BHT [53]. As formulações que tinham na sua constituição os conservantes metilparabeno
sódico e propilparabeno sódico apresentaram coloração rosa, até mesmo as formulações que para
além destes continham na sua composição o antioxidante BHT. Os autores verificaram que a coloração
rosa podia estar relacionada com a interação do cetoconazol com os conservantes referidos a altas
temperaturas [53]. Foram produzidas outras formulações com a mesma percentagem de antioxidante
mas com conservantes distintos, como: imidazolidinil ureia, diazolidinil ureia e mistura de
isotiazolinonas. Estas formulações foram submetidas à temperatura de 50C e mantidas à temperatura
ambiente, durante 1 mês. Os autores observaram que as formulações não sofreram alteração de cor
durante o ensaio de estabilidade [53]. Ainda é referido que nas formulações estudadas o pH foi de 5,6
e a concentração de BHT foi de 0,05 %, onde também se utilizou o conservante imidazolidinil ureia e o
quelante EDTA. Estes podem aumentar a estabilidade química e microbiológica da formulação [53].
Wiechers, et al. (2012) quando usaram o cetoconazol nas formulações adicionaram um
antioxidante, sulfito de sódio ou dl--tocoferol, para evitar a descoloração rápida [54].
Skiba, et al. (2000) estudaram os efeitos de fatores como o pH e as quantidades de antioxidante
(BHT) na estabilidade do cetoconazol em meio aquoso. Os resultados mostraram que a quantidade de
cetoconazol na formulação aquosa diminuiu de forma mais rápida à medida que o pH diminuiu. Deste
14
estudo foi concluído que o aumento do antioxidante, 0,05 - 0,40 %, teve efeito na estabilidade da
substância ativa particularmente a pH 1,0. Também foi concluído que a formulação final desenvolvida,
a pH 7,0 e com 0,10 % de BHT, mostrou ser estável, com uma vida útil de cerca de 15 meses [22].
1.6.1. Seleção do conservante
A existência de excipientes contribuem para o crescimento de uma variedade de microrganismos,
mesmo na ausência deste tipo de excipientes a presença de lípidos e água em contacto íntimo permite
o desenvolvimento de microrganismos. Como consequência a adição de um conservante na
formulação é um fator importante para garantir a estabilidade das preparações farmacêuticas. Um ou
mais conservantes devem proteger o produto contra todas as possíveis contaminações, desde as
matérias-primas até à duração da aplicação do produto farmacêutico [32].
Na Tabela 3 estão indicadas algumas vantagens e desvantagens dos conservantes, anteriormente
referidos.
Tabela 3 - Vantagens e desvantagens de alguns conservantes [55], [56], [57].
Conservante
Metilparabeno
sódico
Propilparabeno
sódico
Metilpropanodiol
, caprililglicol,
fenilpropanol
Sulfito de Sódio
Vantagens
Utilizados como conservantes antimicrobianos em
cosméticos e formulações farmacêuticas orais e
tópicas;
Preparação Tópica: 0,02–0,30 %;
Atividade antimicrobiana a pH 4-8;
Mais ativos contra leveduras e bolores do que contra
bactérias;
A atividade pode ser aumentada usando
combinações de parabenos com outros conservantes
antimicrobianos, como a imidureia;
Solubilidade: 1 em 50 de etanol (95 %); 1 em 2 de
água.
Usado como um conservante antimicrobiano ou
antifúngico, em medicamentos orais e em produtos
cosméticos à base de água.
É geralmente utilizado com outros ésteres de
parabeno;
Solubilidade: 1 em 1 de água, 1 em 2 de etanol (50
%) e 1 em 50 de etanol (95 %).
Combinação de álcoois;
Regula a viscosidade de produtos transparentes;
pH de estabilidade indefinido;
Espectro antimicrobiano;
Dosagem recomendada: 2,5 - 4,0 %.
Conservante antimicrobiano e antioxidante.
Usado em produtos cosméticos, produtos alimentares
e aplicações farmacêuticas, como formulações
parentéricas, para inalação, formulações orais e
preparações tópicas.
Eficaz especialmente contra fungos, a pH baixo;
Usado em aplicações alimentares e farmacêuticas
como antioxidante;
É geralmente considerado como relativamente não
tóxico e não irritante quando utilizado como um
excipiente;
Solubilidade: 1 em 3,2 de água, solúvel em glicerina.
Desvantagens
Eficácia conservante diminui
com o aumento de pH;
É o menos ativo dos
parabenos;
São mais ativos contra as
bactérias Gram-positivas do
que contra Gram-negativas;
Absorção de metilparabeno
por plásticos, a quantidade
absorvida depende do tipo de
plástico e do veículo;
Solubilidade: praticamente
insolúvel em óleos fixos.
Decompõe-se quando
aquecido;
Solubilidade: praticamente
insolúvel em óleos fixos.
---
Incompatível com ácidos;
Solubilidade: praticamente
insolúvel em etanol.
15
Tabela 3 - Vantagens e desvantagens de alguns conservantes [55], [56], [57] (continuação).
Conservante
Imidazolidinil
ureia
Vantagens
Conservante antimicrobiano de largo espectro;
Utilizado em formulações cosméticas e farmacêuticas
para aplicação tópica;
Concentrações típicas: 0,03-0,50 % m/m;
Eficaz entre pH 3-9;
Atividade conservante é consideravelmente
melhorada, particularmente contra fungos, quando
usados em combinação com parabenos.
Solubilidade: 1 em 0,5 de água, 1 em 1 de glicerina.
Desvantagens
Diazolidinil ureia
Semelhante a imidureia;
É o mais ativo da família de conservante
imidazolidinil;
Usado em concentrações: 0,1-0,5 % m/m, a pH 3-9;
Tem propriedades predominantemente
antibacterianas;
Solubilidade: muito solúvel em água.
Solubilidade: insolúvel em
gorduras.
Mistura de
isotiazolinonas
Proteção de largo espectro em baixas concentrações;
Eficaz contra bactérias Gram-positivas e Gramnegativas, fungos e leveduras;
Ampla gama de pH;
---
É compatível com outros
conservantes que incluem o
ácido sórbico e compostos de
amónio quaternário.
Solubilidade: muito pouco
solúvel em etanol e óleo de
sésamo, praticamente insolúvel
em óleo mineral e propan-2-ol.
1.6.2. Seleção do antioxidante
Alguns compostos estão sujeitos a auto-oxidação quando expostos ao ar. A auto-oxidação pode
ser inibida pela ausência de oxigénio por substâncias que inibam a formação de radicais livres ou por
um agente redutor. Os antioxidantes são capazes de atuar contra a auto-oxidação de matérias-primas
[32]. Na Tabela 4 estão representadas algumas vantagens e desvantagens de dois antioxidantes.
Tabela 4 - Vantagens e desvantagens de dois antioxidantes [55].
Antioxidante
B.H.T.
(Butilhidroxitolueno)
dl--tocoferol
Vantagens
Usado como um antioxidante em cosméticos,
alimentos e produtos farmacêuticos;
Utilizado para assegurar a estabilidade de cor,
em concentrações 0,5-1,0 % m/m;
Considerado como não irritante e não
sensibilizante, nos níveis utilizados como
antioxidante;
Solubilidade: Livremente solúvel em acetona,
benzeno, etanol (95 %), éter, metanol, tolueno,
óleos fixos, e óleo mineral. Mais solúvel do que
hidroxianisole butilado em óleos e gorduras
alimentares.
Reconhecido primeiramente como uma fonte de
vitamina E;
Apresenta propriedades antioxidantes;
Composto altamente lipofílico;
Excelente solvente para muitas drogas
fracamente solúveis;
São de valor em produtos farmacêuticos à base
de óleo ou de gordura;
Concentração: 0,001-0,050 % v/v;
Praticamente insolúvel em água; solúvel em
etanol (95 %). Miscível com acetona,
clorofórmio, éter e óleos vegetais.
Desvantagens
A exposição à luz, a humidade e
o calor provocam a
descoloração e a perda de
atividade;
Solubilidade: Praticamente
insolúvel em água, glicerina,
propileno-glicol, soluções de
hidróxidos de metais alcalinos, e
ácidos minerais diluídos
aquosos.
Tocoferóis são oxidados
lentamente pelo oxigénio
atmosférico.
16
Os antioxidantes BHT e tocoferol são utilizados para evitar a auto-oxidação de lípidos. Ambos são
considerados antioxidantes primários. No entanto, o BHT é um antioxidante sintético e o tocoferol um
antioxidante natural. Os antioxidantes primários são compostos fenólicos que promovem a remoção ou
inativação dos radicais livres formados durante o processo de auto-oxidação, na etapa de iniciação ou
propagação da reação, através da doação de átomos de hidrogénio interrompendo a reação em cadeia.
O átomo de hidrogénio ativo do antioxidante é doado aos radicais livres, assim, formam-se espécies
inativas para a reação em cadeia e um radical inerte, procedente do antioxidante [58].
1.7. Formulação Inovadora - Pesquisa
A eficácia de um antifúngico, aplicado topicamente, é influenciada pelas suas propriedades
antifúngicas e pela sua capacidade de penetrar o tecido queratinizado [6]. Para a inibição eficaz do
crescimento dos patogénicos, causadores de infeções superficiais da pele localizadas principalmente
na camada epiderme, as formulações tópicas devem libertar a quantidade adequada de fármaco no
local da infeção em concentrações terapeuticamente eficazes [6]. O tipo de formulação bem como as
propriedades físico-químicas do fármaco são parâmetros que influenciam o sistema de libertação do
fármaco por via tópica [15]. A administração de antifúngicos por outras vias, que não as já existentes
no mercado, têm sido utilizados na tentativa de proporcionar uma terapia dirigida, reduzir efeitos
adversos e melhorar a penetração do fármaco nos locais de infeção [59]. É necessário que as
formulações e a substância ativa sejam adaptadas da melhor forma para poderem percorrer uma
determinada barreira biológica. Portanto, é vital desenvolver um sistema de formulação que garanta os
níveis terapêuticos do fármaco no local de infeção [6].
O desenvolvimento de abordagens alternativas para o tratamento de infeções fúngicas da pele por
tratamento tópico engloba novos sistemas de transporte para os antifúngicos como sistemas coloidais,
transportadores vesiculares e nanopartículas [15]. Como muitos dos antifúngicos da classe dos azóis
são pouco solúveis em água, os produtos atualmente comercializados podem não ser o ideal para o
sucesso da terapia. Assim, novas formulações têm sido estudadas para otimizar a entrega tópica e por
sua vez os efeitos antifúngicos. O objetivo dos novos produtos tópicos é possuírem uma boa adesão,
o que proporciona o encurtamento do período de tratamento, alta penetração do fármaco na camada
córnea, cabelo e unhas e elevada afinidade para as células, a fim de manter uma concentração elevada
do fármaco na zona afetada [6].
O antifúngico de interesse, o cetoconazol, tem sido estudado em alguns dos novos sistemas de
transporte para tratamento de infeções da pele. Um desses sistemas são os veículos coloidais que têm
chamado à atenção porque são sistemas promissores para o efeito localizado. Estes acumulam-se na
camada córnea, não trespassando para a pele viável. As microemulsões, um tipo de sistemas coloidais,
oferecem várias vantagens para o uso farmacêutico devido às suas caraterísticas especiais, como a
facilidade de preparação, estabilidade a longo prazo, alta capacidade de solubilização para fármacos
lipofílicos e hidrofílicos e melhoria no sistema de libertação do fármaco [60]. Patel, et al. (2011)
desenvolveram microemulsões de óleo em água (O/A) com 2 % de cetoconazol. Foi demonstrado que
a eficiência do sistema de libertação do fármaco topicamente é dependente do conteúdo de água e
17
álcool laurílico (fase oleosa) e da relação entre mistura Labrasol®/etanol. Os autores concluíram que a
microemulsão com cetoconazol não é tóxica quando aplicada na pele nem quando o contato é
prolongado, para além disto, mostrou atividade antifúngica para a candidíase. Dos ensaios de
estabilidade feitos durante três meses, os autores indicaram que a formulação não mostrou nenhuma
evidência de separação de fases, precipitação ou floculação. Os investigadores referiram a
necessidade de estudar os mecanismos de sistema de libertação do fármaco na pele por este veículo
[60].
Os lipossomas também têm sido utilizados como veículos de fármacos para o tratamento tópico de
doenças dermatológicas. Os lipossomas podem incorporar substâncias ativas hidrófilas ou hidrófobas,
que permitem uma libertação sustentada e/ou controlada, bem como elevada acumulação do fármaco
na pele. A incorporação do cetoconazol neste veículo pode gerar uma entrega prolongada do fármaco
e minimizar os efeitos colaterais [61]. Patel, et al. (2009) estudaram várias formulações que pretendiam
a incorporação de 2 % de cetoconazol em lipossomas. Os autores concluíram que a eficiência máxima
de cetoconazol incorporado nos lipossomas foi, aproximadamente, de 54 % e a mínima de 28 %. Foi
demostrada a estabilidade das formulações a temperaturas diferentes e foi concluído que a retenção
máxima de cetoconazol estava presente nas formulações testadas à temperatura de refrigeração [62].
Niossomas são outro veículo onde o cetoconazol foi incorporado [63]. É um veículo que possui
ação controlada e direciona o fármaco. As suas principais vantagens são a estabilidade química, pureza
elevada, uniformidade do conteúdo, baixo custo, armazenamento de tensioativos não-iónicos e
possibilidade de utilizar vários tensioativos [63]. A incorporação da substância ativa em niossomas pode
minimizar a degradação do fármaco e a inativação após administração, impedir efeitos secundários,
aumentar a biodisponibilidade do fármaco e ação direcionada ao local da zona afetada [63]. Shirsand,
et al. (2012) desenvolveram e caraterizaram uma formulação gel niossomal com 1 % de cetoconazol.
De acordo com a constituição das formulações foi demonstrada uma eficácia de incorporação do
fármaco entre 55 % e 78 %. No perfil de libertação in vitro de fármaco, após 24 horas a percentagem
máxima de fármaco libertado foi de 72 %. De acordo com os autores, na formulação em gel os
niossomas atuam como veículos no sistema de libertação do fármaco no local de ação e o cetoconazol
incorporado desempenha atividade antifúngica. O estudo demostrou, ainda, que esta formulação tem
ação prolongada em relação às formulações de fármaco na forma livre [63].
As nanopartículas lipídicas dividem-se em dois tipos, as nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) e
vetores lipídicos nanoestruturados (NLC). São sistemas de interesse para a libertação controlada, por
forma a originar a libertação do fármaco a longo prazo e podem promover a difusão do fármaco na pele
devido ao seu efeito oclusivo [64], [65]. Estas nanopartículas são diferentes, as SLN possuem apenas
um lípido sólido na sua composição, enquanto que as NLC caracterizam-se por apresentarem uma
matriz constituída por uma mistura de lípidos sólidos e lípidos líquidos, aumentando assim a
incorporação do fármaco e impedindo a sua expulsão. São produzidas pela técnica de homogeneização
a alta pressão [64]. Estes dois tipos de nanopartículas lipídicas podem aumentar a estabilidade do
fármaco quando incorporados nestes veículos e podem diminuir a irritação da pele e reações alérgicas,
uma vez que são lípidos naturais [65]. As SLN e as NLC podem ser introduzidas em formas
18
farmacêuticas tópicas convencionais, como cremes, loções ou hidrogéis. Podem ser adicionadas
durante o processo de produção das formas farmacêuticas convencionais, ou simplesmente misturadas
com as formulações [65]. Souto e Müller (2006) elaboraram um estudo sobre a incorporação de alguns
imidazóis em transportadores NLC e SLN para aplicação tópica. Concluíram que as nanopartículas
lipídicas são adequadas para antifúngicos imidazóis. No entanto, a retenção do fármaco cetoconazol
nas nanopartículas após um ano foi muito baixo. À temperatura ambiente, os autores observaram 15
% de cetoconazol na SLN e 22 % na NLC, à temperatura de refrigeração (4C) as SLN apresentavam
44 % e as NLC 54 % de cetoconazol, sendo a concentração inicial de fármaco de 0,75 %. Souto e
Müller (2006) destacaram o efeito da natureza do lípido bem como do fármaco na estabilidade do
sistema. Referindo ainda a conhecida instabilidade do cetoconazol [65]. Outro estudo feito pelos
mesmos autores, demonstrou a instabilidade química do cetoconazol em nanopartículas SLN, uma vez
que neste veículo ocorreu alteração de cor para roxo. Nas nanopartículas NLC, o cetoconazol
demonstrou estabilidade química, no entanto, ocorreu um aumento significativo do tamanho das
partículas durante o tempo de armazenamento (90 dias) [64].
As ciclodextrinas são outro veículo onde o cetoconazol tem vindo a ser estudado. As ciclodextrinas
(CDs) são oligossacáridos cíclicos que compreendem 6, 7 e 8 moléculas de glicose, designadas por CD, -CD e -CD, respetivamente. As ciclodextrinas apresentam um ambiente hidrófobo no seu interior
e a superfície externa é hidrófila. As principais vantagens deste veículo na área farmacêutica são:
melhorar a solubilidade, a estabilidade e a biodisponibilidade de fármacos [66]. Estes veículos têm
recebido uma atenção acrescida devido à capacidade de formar complexos de inclusão com vários
fármacos lipofílicos [67]. As ciclodextrinas atuam como verdadeiros veículos mantendo as moléculas
hidrofóbicas em solução, não tendo a capacidade de modificar a permeabilidade de barreiras biológicas
[68]. A complexação entre os derivados do imidazol e as ciclodextrinas já foi estudada e a atividade
antifúngica destes complexos foi superior à atividade do fármaco sem complexo [67]. Devido à fraca
solubilidade do cetoconazol em água é necessária a utilização de um veículo para que o cetoconazol
se torne solúvel em solução, sendo as ciclodextrinas apropriadas para tal. [68]. Esclusa-Diaz, et al.
(1996) fizeram um estudo para investigar a termodinâmica da complexação do cetoconazol com dois
tipos de ciclodextrinas. Os autores concluíram que a hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-B-CD) apresenta
uma maior solubilidade e taxa de dissolução em relação aos complexos β-ciclodextrinas (BCD), apesar
de a estabilidade ser maior em BCD [67]. Zhang, et al. (2008) compararam a utilização de cetoconazol
(KET) para aplicação ocular, em ciclodextrina HP--CD (KET-CD) e em suspensão (KET-SP). O estudo
demonstrou que a preparação KET-CD é a mais adequada porque apresentou níveis muito mais
elevados de cetoconazol na camada córnea e no humor aquoso do que a formulação KET-SP. Assim,
os autores concluíram que a formulação de gotas oculares de cetoconazol complexado com a HP-CD é a formulação mais adequada para o tratamento ocular [68].
19
Capítulo 2 - Reformulações
Neste capítulo, foi retratada a reformulação de uma formulação convencional com 2 % de
cetoconazol para aplicação tópica. Procedeu-se ao desenvolvimento galénico de formulações com o
intuito de prevenir a degradação do fármaco e originar preparações farmacêuticas eficazes contra
contaminação microbiana, tendo em conta os resultados obtidos na pesquisa realizada anteriormente
(alínea 1.5 - Capítulo 1). As reformulações desenvolvidas foram avaliadas em relação às suas
propriedades físico-químicas, assim como a sua estabilidade físico-química e microbiológica. Também
foram realizados ensaios in vitro utilizando como referência dois cremes comerciais, o creme comercial
1 e o creme comercial 2.
2.1. Matérias-primas
As matérias-primas usadas no desenvolvimento das reformulações estão indicadas na Tabela 5.
Tabela 5 - Características gerais de matérias-primas usadas no desenvolvimento galénico [55], [69].
Matéria-prima
Cetoconazol
Álcool cetílico
Monoestearato
glicerilo
Álcool ceto estearílico
etoxilado 20 eo
Octildodecanol
BHT
Sulfito de sódio
Imidazolidinil ureia
EDTA
Undecilenoil glicina
Capriloil glicina
Ácido Láctico
Hidróxido de sódio
INCI name
Ketoconazole
Cetyl Alcohol
Função
Antifúngico
Tensioativo
Glyceryl Stearate
Tensioativo
Ceteareth-20
Tensioativo
Octyldodecanol
Butylated
hydroxytoluene
sodium sulfite
Imidazolidinyl urea
EDTA
Undecylenoyl glycine
Capryloyl Glycine
Lactic Acid
Sodium hydroxide
Emoliente
Antioxidante
Conservante
Conservante
Quelante
Tensioativo
Tensioativo
Tampão
Tampão
2.2. Equipamentos utilizados para a preparação das reformulações
Os equipamentos utilizados para o desenvolvimento galénico foram:
-
Balanças Analíticas: modelo AE260 Delta Range® - Mettler Tolero®; modelo PB303 Delta
Range® - Mettler Toledo®; modelo AG204, Mettler Tolero®;
-
Banho-maria termostatizado: GERHARTT;
-
Banho de Ultra-sons: modelo Bransonic® Ultrasonic cleaner B-5200 E1-Sotel;
-
Placa de agitação magnética: Variomag Telesystem, Thermo scientific;
-
Câmara de fluxo laminar: SterilGard®, Baker, US;
20
2.3. Métodos
Distribuição do tamanho de gotícula
A distribuição de tamanho foi medida por difração laser utilizando o equipamento Malvern
Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK) em conjunto com o acessório Hydro
2000 S. A difração laser mede as distribuições de tamanho das gotículas por medição da variação
angular na intensidade da luz difundida à medida que um feixe de laser interage com as partículas
dispersas da amostra. Os parâmetros utilizados para a análise das amostras foram: uma gama de
obscuração de 10 - 20 %, água como dispersante, agitação de 750 rpm sem ultra-sons. A quantidade
de amostra utilizada foi a suficiente para obter uma obscuração dentro da gama selecionada. Cada
amostra foi lida 5 vezes. Os dados são expressos em termos de distribuição relativa de volume de
partículas na gama de classe de tamanhos (média ± DP, n=5). A estatística de distribuição utilizada ao
longo do trabalho foi representada pelo percentil padrão d(0,9), onde 90 % da amostra apresenta um
tamanho de partícula inferior a esse valor. Também foi expresso o valor Span, que representa a medida
da largura da distribuição, quanto mais pequeno for este valor mais homogénea será a amostra. O
Span é calculado da seguinte forma:
𝑆𝑝𝑎𝑛 =
𝑑(0,9)−𝑑(0,1)
𝑑(0,5)
(Eq. 1)
Doseamento substância ativa
Para o doseamento de cetoconazol foi utilizado o equipamento HPLC (Hitachi Elite Lachrom
Organizer (VWR, EUA): Detetor UV: L-2400; Forno de coluna: L-2300; Injetor automático: L-2200;
Bomba: L-2130). A coluna utilizada foi Lichrospher 100 RP-18 5 micra (250 milímetros x 4mm). Para
este método, a fase móvel foi constituída por 55 % (v / v) de acetonitrilo e 45 % (v / v) de tampão fosfato.
Uma taxa de fluxo de 1,5 ml/minuto foi usada com um volume de injeção de 20 µL. Foi utilizado um
comprimento de onda de 254 nm. O tempo de execução foi de 6 minutos para cada injeção. Na
preparação das amostras foi utilizado como solvente, o metanol.
Determinação da viscosidade e do perfil reológico
A viscosidade aparente, das reformulações iniciais desenvolvidas da F1 à F8, foi determinada com
recurso ao viscosímetro LVDV-E (Brookfield® Engeneering Laboratories, EUA), na velocidade de corte
de 14,64 s-1 e 24,47 s-1 e com a agulha 64, após um tempo de estabilização de 30 segundos, à
temperatura ambiente (25 ± 2°C).
Nas reformulações finais (F2, F7 e F8) e os dois cremes comerciais, a viscosidade aparente foi
determinada com o auxílio do viscosímetro RVTDV-II (Brookfield® Engeneering Laboratories, EUA), na
velocidade de corte de 61,18 s-1 para as formulações finais, de 12,24 s-1 para o creme comercial 1 e de
24,47 s-1 para o creme comercial 2, com a agulha 7 para todas as formulações, após um tempo de
estabilização de 30 segundos, à temperatura ambiente (25 ± 2°C).
O perfil reológico das reformulações finais foi determinado com o viscosímetro RVTDV-II
(Brookfield® Engeneering Laboratories, EUA). Todas as leituras foram efetuados com o auxílio da
21
agulha 7, em rampa crescente e descendente de velocidades de corte, ao fim de 30 segundos, à
temperatura ambiente (25 ± 2°C).
Determinação do pH
O pH foi determinado, para todas as formulações desenvolvidas, por leitura direta, com recurso a
um potenciómetro (modelo Mettler Tolero®: Elétrodo: InLab® Expert Pro pH, Mettler Toledo®), à
temperatura ambiente (25 ± 2°C).
Determinação da estabilidade física- separação de fases
À centrífuga (Medifuge, Heraeus Spatech) foram adicionados tubos adequados com as amostras
das reformulações finais e dos cremes comerciais. Procedeu-se à centrifugação das amostras a 4000
rpm durante 30 minutos, faseados em três períodos de 10 minutos, à temperatura ambiente (25 ± 2°C).
A cada 10 minutos as amostras foram observadas por forma a detetar alterações de separação de
fases.
Avaliação in vitro da cedência de cetoconazol
O perfil de cedência de cetoconazol foi realizado em células de difusão de Franz de 1 cm2. A
membrana sintética utilizada foi a membrana polissulfona hidrofílica de 0,45 µm (Tuffryn®) da Pall
Corporation (EUA). A fase recetora usada foi constituída por propilenoglicol / etanol 96 % (1:1) (AnexoI). Esta fase recetora foi colocada no compartimento recetor por forma a ficar em contacto com a
membrana sintética. As amostras das formulações em estudo (0,2 - 0,4 g) foram aplicadas na superfície
da membrana sintética no compartimento dador, após a adição da amostra o compartimento dador foi
selado com Parafilm ®. As células de Franz foram imersas num sistema de banho a 32 ± 2°C sob
agitação (200 rpm). Foram recolhidas amostras (200 µl) a partir do fluido recetor em tempos prédeterminados: 1, 2, 3, 4, 5, 6 horas; de seguida foi reposta a mesma quantidade em fase recetora
fresca. O teor de cetoconazol nas amostras recolhidas foi analisado pelo método de HPLC (Sistema
Beckman: Detetor: 166 Detectro, System Gold®; Bomba: 126 Solvent Module, System Gold®; Injetor
automático: MIDAS, Holland Spark). Para cada formulação foram realizadas seis réplicas.
Os dados obtidos neste estudo foram ajustados a dois modelos cinéticos diferentes:
-
Ordem Zero
𝑄𝑡 = 𝑄0 + 𝐾0 𝑡
(Eq. 2)
onde 𝑄𝑡 é a quantidade de fármaco dissolvido no tempo 𝑡 e 𝐾0 é a constante de libertação de
ordem zero.
-
Modelo Higuchi
𝑄𝑡 = 𝑘 √𝑡
(Eq. 3)
onde 𝑄𝑡 é a quantidade de fármaco libertada no tempo 𝑡 e 𝑘 a constante de libertação.
22
O coeficiente de determinação (R2) foi determinado para cada modelo, uma vez que é um indicador
da adequação de cada modelo a um dado conjunto de dados.
Avaliação in vitro da permeação de cetoconazol
A permeação através da pele de formulações tópicas com cetoconazol foi realizado em células de
difusão de Franz de 1 cm2. A membrana utilizada foi pele de porco recém-nascido, obtida a partir de
um matadouro. A pele inteira foi cortada em segmentos por forma a revestir a zona de permeação. A
fase recetora usada foi constituída por propilenoglicol / etanol 96 % (1:1) (Anexo-I). Esta fase recetora
foi colocada no compartimento recetor por forma a ficar em contacto com a membrana biológica. As
amostras das formulações em estudo (0,2 - 0,4 g) foram aplicadas na superfície da pele, no
compartimento dador, após a adição da amostra o compartimento dador foi selado com Parafilm®. As
células de Franz foram imersas num sistema de banho a 32 ± 2°C sob agitação (200 rpm). Foram
recolhidas amostras (200 µl) a partir do fluido recetor em tempos pré-determinados: 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24
horas; de seguida foi reposta a mesma quantidade em fase recetora fresca. O teor de cetoconazol nas
amostras recolhidas foi analisado pelo método de HPLC (Sistema Beckman: Detetor: 166 Detectro,
System Gold®; Bomba: 126 Solvent Module, System Gold®; Injetor automático: MIDAS, Holland Spark).
Para cada formulação foram realizadas seis réplicas.
A quantidade cumulativa de cetoconazol permeada (𝑄𝑡 ) através da pele de porco recém-nascido
foi representada graficamente em função do tempo e determinada pela seguinte equação:
𝑄𝑡 =
𝑉𝑟×𝐶𝑡 +∑𝑡−1
𝑡=0 𝑉𝑠×𝐶𝑖
𝑆
(Eq. 4)
onde 𝑄𝑡 é a concentração de fármaco da solução recetora em cada tempo de amostragem, 𝐶𝑖
a concentração da amostra de cetoconazol aplicada na compartimento dador, e 𝑉𝑟 e 𝑉𝑠 os volumes da
solução recetora e da amostra, respetivamente. S representa a área de superfície da pele (1 cm 2).
Análise estatística
Os dados foram expressos como média e desvio padrão (média ± DP). A avaliação estatística dos
dados foi realizada por meio da análise de uma via de variância (ANOVA), p <0,05 foi considerado
como sendo estatisticamente significativo.
Eficácia dos conservantes
Este método foi realizado de acordo com o descrito na FP em vigor - 5.1.3 - Eficácia dos
conservantes antimicrobianos. Cada formulação foi inoculada com 4 microrganismos estabelecidos (P.
aeruginosa, S. aureus, C. albicans e A. niger), com um inóculo de 105 a 106 µg/ml, e incubadas à
temperatura de 20°C a 25°C durante a durabilidade do ensaio (28 dias). Tratando-se de uma
formulação tópica, os tempos estabelecidos são 2, 7, 14, 28 dias, para cada dia estão determinados os
microrganismos inoculados que têm que ser analisados. Assim, de uma forma geral, foi retirada 1 g de
amostra, da preparação inoculada, que foi adicionada a 9 ml de meio de cultura LTB (Letheen Broth
Base Modified) + 5,0 % Tween 80, procedeu-se de seguida à realização de diluições decimais
sucessivas com o mesmo meio de cultura, até à diluição 10-6. Procedeu-se à sementeira, pelo método
23
em profundidade, com contagem em placas, descrito pela FP em vigor na seção 2.6.12. As diluições
foram semeadas em duplicado com o meio de cultura TSA (bactérias) e SDA (fungos e leveduras) e
incubadas a 32,5 ± 2,5°C (Incudigit, JP Selectra S.A) e 22,5 ± 2,5°C (240 KB, Binder), respetivamente.
Para este ensaio foi efetuada a neutralização da formulação, onde se utilizou um desactivador (LTB +
5,0 % Tween 80), que tem de ter a capacidade de permitir o crescimento dos microrganismos utilizados
no ensaio. Os critérios de aceitação estão descritos na secção 5.1.3 da FP em vigor.
2.4. Desenvolvimento galénico - Ensaios preliminares
Foram efetuadas reformulações de acordo com a pesquisa realizada, estas preparações
encontram-se na Tabela 6. Para impedir a degradação do fármaco foi introduzido o antioxidante BHT
em algumas formulações, uma vez que a adição deste excipiente originou resultados favoráveis numa
formulação idêntica. De acordo com a pesquisa realizada, os conservantes que foram utilizados para a
reformulação foram o sulfito de sódio e a imidazolidinil ureia, também foi utilizada a junção de dois
conservantes, que nunca foram testados para esta formulação, o undecilenoil glicina mais o capriloil
glicina. Para a preparação das reformulações foi tido em conta os limites máximos permitidos [70].
Tabela 6 - Constituição de cada reformulação (%, m/m).
Matérias-primas
F1
F2
F3
F4
F5
Fase Oleosa
F6
F7
F8
F9
Álcool cetílico
Monoestearato
glicerilo
Álcool ceto
estearílico
etoxilado 20 eo
Octildodecanol
BHT
Fase Aquosa
Sulfito de sódio
Imidazolidinil
ureia
EDTA
Undecilenoil
glicina
Capriloil glicina
Água purificada
Substância Ativa
Cetoconazol
Acerto pH
Ácido láctico /
NAOH
Para além dos excipientes, foi tido em conta o pH das reformulações, isto é, para averiguar a
influência do pH na estabilidade do cetoconazol foram preparadas as reformulações a diferentes pH.
O processo de fabrico utilizado para a preparação das reformulações indicadas na Tabela 6,
encontra-se esquematizado na Figura 6.
24
Excipientes da
fase oleosa
Excipientes da
fase aquosa
Aqueceu-se até aos
70°C, em banho
termostatizado
Aqueceu-se até aos
70°C, em banho
termostatizado
Fase Oleosa
Adicionou-se a
fase oleosa à
fase aquosa
Fase Aquosa
Agitou-se vigorosamente
até completa
homogeneização
Emulsão O/A
Arrefeceu-se a emulsão até
aos 40°C, sob agitação
vigorosa.
Cetoconazol
Adicionou-se o
cetoconazol à
emulsão
Emulsão O/A
Agitou-se até
homogeneização da emulsão
Emulsão O/A
Acertou-se o pH com
ácido láctico/ NaOH
Acondicionamento
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 6 - Processo de fabrico das reformulações (F1 a F9).
A reformulação F9 foi excluída porque apresentou consistência mais fluida que o esperado, em
comparação com as restantes reformulações. Foram determinados alguns parâmetros para as 8
reformulações em estudo, apresentados na Tabela 7.
25
Tabela 7 - Características das reformulações desenvolvidas.
Características
organoléticas
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Cor branca, aspeto
brilhante e homogéneo
Viscosidade
Aparente
(Pa.s)
Parâmetro tamanho de gotícula
Tamanho das
Span
gotículas d(0,9) (µm)
(média ± DP, n=5)
(média ± DP, n=5)
14,3
20,3 ± 0,7
1,8 ± 0,0
25,3
20,3 ± 0,7
1,8 ± 0,0
22,1
27,3 ± 1,1
2,0 ± 0,0
14,7
27,3 ± 1,1
2,0 ± 0,0
24,3
23,8 ± 0,6
2,0 ± 0,0
21,2
23,8 ± 0,6
2,0 ± 0,0
14,9
27,0 ± 0,9
2,1 ± 0,1
15,9
32,3 ± 1,5
2,2 ± 0,0
As reformulações foram expostas à temperatura ambiente (25 ± 2°C) e colocadas numa estufa
(Votsch industrietechnik, VC2033) a 40 ± 2°C e a 75 ± 2 % de HR, em frascos de vidro incolor. Os
resultados estão expressos na Tabela 8 e Tabela 9, respetivamente.
É notório, analisando a Tabela 8, que as reformulações com pH 5,5 foram as primeiras a sofrer
degradação do fármaco, alteração de cor de branca para rosa, em comparação com o seu par com pH
7,0. No caso do par F5 e F6, à temperatura de 40 ± 2°C não foi possível afirmar qual iniciou primeiro a
degradação do fármaco. No entanto, à temperatura ambiente (25 ± 2°C) foi a reformulação com pH 5,5,
F5, que iniciou primeiro o processo de deterioração.
As reformulações F1, F2, F5 e F6, contêm a mesma quantidade de sulfito de sódio. No entanto, as
formulações F5 e F6 possuem mais um conservante, a imidazolidinil ureia. A degradação do
cetoconazol provavelmente foi mais acentuado nas reformulações F5 e F6 devido à presença de
imidazolidinil ureia, porque a reformulação F2 não sofreu alteração de cor para rosa. A reformulação
F5, como mencionado anteriormente, foi a que sofreu alteração de cor mais rapidamente porque, para
além da imidazolidinil ureia, apresenta pH 5,5 igual à reformulação F1, que apresentou indícios de
degradação um pouco mais tarde.
26
Tabela 8 - Resultados da estabilidade das reformulações à temperatura ambiente (25 ± 2°C).
F1
F2
F3
F4
18/2 a
22/2
Branca
Branca
Branca
Branca
23/2 a
1/03
Branca
Branca
Branca
Branca
2/3 a
8/3
Branca
Branca
Branca
Branca
Ligeira
mente
Rosa
9/3 a
15/3
Branca
Branca
Branca
Branca
Ligeira
mente
Rosa
F5
Branca
Branca
F6
Branca
Branca
Branca
Branca
F7
F8
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Semanas
16/3 a 23/3 a
22/3
29/3
Branca Branca
Branca Branca
Branca Branca
Branca Branca
30/3 a
5/4
Bege
Branca
Bege
Bege
6/4 a
12/4
Bege
Bege
Bege
Bege
Bege
Bege
Bege
Bege
31/8
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Manch
as
rosas
Branca
Branca
Manch
as
rosas
Branca
Branca
Manch
as
rosas
Branca
Branca
Manch
as
rosas
Branca
Branca
Rosa c/
manchas
rosa
Branca
Branca
Tabela 9 - Resultados da estabilidade das reformulações sujeitas à temperatura de 40 ± 2°C e a 75 ±
2 % HR.
Semanas
6/3 a 9/3
9/3 a
15/3
F1
Branca
Branca
F2
Branca
Branca
F3
Branca
Branca
F4
Branca
Branca
Branca
Rosa
Rosa
Rosa
Branca
Branca
F5
F6
F7
F8
Ligeiramente
Rosa
Ligeiramente
Rosa
Branca
Branca
30/3 a
5/4
6/4 a
12/4
18/6
Rosa
Rosa
Rosa
Bege
Bege
Bege
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Rosa
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
16/3 a 22/3
23/3 a 29/3
Ligeiramente
Rosa
Branca
Ligeiramente
Rosa
Ligeiramente
Rosa
Branca
Ligeiramente
Rosa
Ligeiramente
Rosa
As reformulações F3 e F4 diferem das reformulações F1 e F2 apenas na quantidade de sulfito de
sódio, que é ligeiramente superior. As reformulações F3 e F1 apresentam o mesmo pH (5,5) e os sinais
de degradação começaram na mesma altura. No entanto, a ligeira diferença na quantidade de
conservante provavelmente influenciou a degradação do fármaco, uma vez que as reformulações F4 e
F2 apresentam o mesmo pH (7,0) e a reformulação com maior quantidade de sulfito de sódio
apresentou sinais de degradação de cetoconazol.
A reformulação F7 apenas difere da reformulação F2 no acréscimo de um antioxidante, BHT.
Ambas as reformulações não sofreram degradação do fármaco, porém, a reformulação F2 apresentou
cor bege com o passar do tempo à temperatura de 40 ± 2°C. Podemos concluir que a adição de um
antioxidante ajuda a manter a estabilidade da reformulação.
27
A reformulação F8 apresentou melhores resultados, uma vez que não se verificou alteração de cor.
A maior percentagem de conservante (0,50 % de imidazolidinil ureia) e a adição do antioxidante (BHT)
e do quelante (EDTA) podem explicar estes resultados.
Sendo a F8 uma das reformulações promissoras, decidiu-se alterar o conservante desta formulação
para sulfito de sódio. A nova reformulação (F10) encontra-se na Tabela 10.
Tabela 10 - Composição da reformulação F10 (%, m/m).
Matérias-primas
Fase Aquosa
Álcool cetílico
Monoestearato glicerilo
Álcool ceto estearílico etoxilado 20 eo
Octildodecanol
BHT
Fase Oleosa
Sulfito de sódio
EDTA
Água purificada
Substância Ativa
Cetoconazol
Acerto de pH
Ácido láctico/NaOH
F10
A reformulação F10 apresentou cor branca e aspeto brilhante e homogéneo. Porém, ao fim de um
mês a reformulação apresentou degradação do fármaco, à temperatura ambiente (25 ± 2°C). Assim, o
BHT e EDTA nesta reformulação não foram eficazes na estabilização do cetoconazol. Para tal não
suceder, é de fato necessário ter 0,10 % de BHT e pH 7,0, como acontece na reformulação promissora
com o mesmo conservante, F7.
As reformulações promissoras obtidas nos estudos preliminares foram a F2, a F7 e a F8. Foram
estas que ao longo de três meses a 40 ± 2°C não sofreram alteração de cor para rosa, logo não ocorreu
degradação do fármaco.
2.4.1. Lotes laboratoriais
Foram realizados lotes de 1500 g para as reformulações finais, F2, F7 e F8. As preparações tópicas
foram fabricadas num misturador planetário (Miniplant Reactor System, IKA® LR 2 ST) com capacidade
máxima de 3 kg. Durante o processo de fabrico foi necessária a introdução de um homogeneizador,
Ultra-turrax® T25 (IKA®, Deutschland,Germany: Haste: S25N – 25F) a 15000 rpm, para homogeneizar
a preparação, de forma a obter a consistência de um creme, e suspender o cetoconazol de forma
homogénea (Figura 6).
Na indústria farmacêutica, o produto estudado é produzido num misturador planetário com
homogeneizador e sistema de vácuo, permitindo a emulsificação e a suspensão do fármaco
adequadamente.
28
2.4.2. Formulações finais
As reformulações finais foram avaliadas em relação às propriedades físico-químicas e
microbiológicas e também foram realizados ensaios in vitro.
Características químicas e físicas
Características organoléticas
As características organoléticas estão indicadas na Tabela 11.
Tabela 11 - Características organoléticas das reformulações finais.
F2
F7
F8
Cor
Branca
Branca
Branca
Aspeto
Brilhante e homogéneo
Brilhante e homogéneo
Brilhante e homogéneo
Odor
Inodoro
Inodoro
Inodoro
As três reformulações apresentam macroscopicamente as características pretendidas. Apesar do
cetoconazol estar disperso no creme, as reformulações apresentaram um aspeto homogéneo.
Distribuição do tamanho de gotícula
O resultado do tamanho de gotícula das reformulações em estudo, incluindo os placebos e as
formulações de referência estão expressos na Tabela 12 e na Figura 7.
Tabela 12 - Tamanho de gotículas e o respetivo span, das reformulações finais com cetoconazol e
placebo e de dois cremes comerciais (média ± DP, n=5).
Tamanho de gotícula d (0,9) (µm)
60,4 ± 0,9
59,6 ± 2,1
85,0 ± 3,4
102,0 ± 1,5
114,1 ± 3,1
104,8 ± 1,3
122,6 ± 22,6
24,2 ± 0,8
F2
F7
F8
Placebo F2
Placebo F7
Placebo F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
10
a
Volume (%)
Volume (%)
10
5
0
0
1
100
10000
Tamanho de partícula (µm)
F7
F2
Creme comercial 1
F8
Creme comercial 2
Span
4,0 ± 0,1
2,5 ± 0,1
4,2 ± 0,1
3,5 ± 0,0
3,6 ± 0,1
3,3 ± 0,0
2,3 ± 0,1
2,4 ± 0,1
b
5
0
0
1
100
10000
Tamanho de partícula (µm)
Placebo_F2
Placebo_F7
Placebo_F8
Figura 7 - Representação gráfica do tamanho de gotícula. a) reformulações finais com
cetoconazol e produtos de referência no mercado. b) reformulações finais placebo.
29
Através da Tabela 12, é notória a discrepância das reformulações com fármaco e os respetivos
placebos. Estes resultados poderão estar relacionados com o tipo de agitação durante a fase de
emulsificação, as reformulações placebo sofreram apenas agitação manual enquanto que nas
reformulações com fármaco foi utilizado um homogeneizador após a adição da fase oleosa à aquosa.
Uma agitação mais vigorosa forma gotículas mais pequenas.
Há uma diferença significativa no tamanho de gotícula do creme comercial 1. Este creme em termos
de características organoléticas é diferente das restantes formulações, apresentando um aspeto
granuloso e mais consistente.
Determinação do pH
A Tabela 13 mostra o pH de cada formulação. Os pH das reformulações finais são os esperados,
como é indicado na Tabela 6.
Tabela 13 - Resultado do pH das reformulações finais e das formulações de referência.
F2
F7
F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
pH
7,2
6,9
5,7
7,6
5,5
Temperatura (°C)
27,6
26,3
27,5
24,0
24,5
Doseamento Substância Ativa
Na Tabela 14, estão indicados os resultados obtidos no doseamento de cetoconazol tanto para as
reformulações laboratoriais como para os produtos de referência. No Anexo-II, está representado o
cromatograma do placebo da reformulação F8 a título de exemplo.
Tabela 14 - Percentagem de recuperação de cetoconazol das reformulações finais e nos
produtos comerciais (média ± DP, n=2).
F2
F7
F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
% Recuperação
99,37 ± 0,53
105,44 ± 1,04
106,23 ± 2,11
100,75 ± 1,27
98,14 ± 1,29
As formulações de referência não ultrapassam os 100 %, no entanto, a reformulação F7 e F8
ultrapassam este valor. Porém, à que ter em conta que os cremes comerciais foram feitos numa escala
industrial, em equipamentos fechados onde as perdas são menores, ao passo que as reformulações 2,
7 e 8 em escala laboratorial. Apesar disto, os valores médios do teor de cetoconazol das reformulações
estudadas, à exceção da reformulação F8, estão dentro do limite especificado, 95-100 % [71].
30
Estabilidade física - separação de fases
As condições de stress a que estas formulações foram sujeitas permitiram verificar a sua
estabilidade do ponto de vista físico, originando ou não a separação de fases.
A tabela seguinte (Tabela 15) mostra que não houve separação de fases em nenhum dos cremes
estudados. O que é um bom indicador da estabilidade das reformulações, sendo menos provável a
separação de fases durante os estudos de estabilidade a longo termo.
Tabela 15 - Resultado do ensaio separação de fases, para as reformulações finais e cremes
comerciais.
F2
F7
F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
10 minutos
SSF
SSF
SSF
SSF
SSF
20 minutos
SSF
SSF
SSF
SSF
SSF
30 minutos
SSF
SSF
SSF
SSF
SSF
SSF- Sem Separação de Fases
Determinação da viscosidade aparente
A Tabela 16 apresenta a viscosidade das reformulações finais e das duas formulações de
referência.
Tabela 16 - Viscosidade aparente da reformulação F2, F7, F8, creme comercial 1 e 2.
F2
F7
F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
Viscosidade Aparente (Pa.s)
14,4
10,1
13,0
49,6
21,4
As reformulações F2, F7 e F8 foram as que apresentaram menor viscosidade. O creme comercial
1 foi a formulação que apresentou maior viscosidade aparente o que era de esperar, porque, como
mencionado anteriormente, visualmente é a formulação mais consistente comparativamente às
restantes formulações estudadas.
Perfil Reológico
Foi efetuado o perfil reológico nas três reformulações finais, F2, F7 e F8, exposto na Figura 8.
31
Tensão de corte (Pa)
1400
1200
1000
800
F2
600
F7
400
F8
200
0
0
50
100
Velocidade de corte (1/s)
150
Figura 8- Perfil reológico das reformulações F2, F7 e F8.
As três reformulações apresentam a mesma estrutura de gráfico, o que indica que estamos perante
o mesmo perfil reológico. Ao observar os três perfis foi notório que as reformulações são fluidos não
newtonianos de comportamento reofluidificante (pseudoplástico), o que é o ideal para aplicações
tópicas.
Avaliação in vitro da cedência de cetoconazol
Este ensaio foi realizado de acordo com o descrito no método presente neste capítulo. Todas as
formulações foram analisadas n=6 vezes. Os resultados da percentagem de cetoconazol cedido de
cada formulação estão presentes na Figura 9 e os parâmetros cinéticos de cada creme estão indicados
Cetoconazol cedido (%)
na Tabela 17.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tempo (h)
F2
F7
F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
Figura 9 - Perfis de cedência de cetoconazol das reformulações finais e dos cremes
comerciais (média ± DP, n=6).
32
Tabela 17 - Parâmetros cinéticos obtidos no modelo de Ordem Zero e no modelo de Higuchi para as
reformulações finais e de referência (média ± DP, n=6).
F2
F7
F8
Creme
comercial 1
Creme
comercial 2
Modelo Ordem Zero
k
b
R2
412,30
208,88
0,93 ± 0,04
± 162,19
± 225,45
526,04
182,08
0,84 ± 0,10
± 183,38
± 610,13
565,48
-173,05
0,90 ± 0,10
± 178,39
± 516,49
374,10
-163,29
0,88 ± 0,09
± 166,08
± 398,25
531,36
-18,97
0,91 ± 0,04
± 181,38
± 402,00
k
1427,76
± 540,47
1813,17
± 608,05
1948,10
± 609,52
1260,46
± 540,09
1834,03
± 613,27
Modelo Higuchi
b
R2
-925,57±
0,93± 0,07
567,54
-1250,15
0,84 ± 0,12
± 1034,10
-1710,55 ±
0,88 ± 0,10
968,41
-1129,43
0,84 ± 0,12
± 790,49
-1470,20
0,90 ± 0,08
± 745,78
Ao fim de 6 horas (Figura 9), verificou-se que a formulação que apresentou menor percentagem de
cetoconazol libertado foi o creme comercial 1. Nas restantes formulações ocorreu maior libertação de
fármaco, destas foi a F7 que apresentou maior percentagem de cetoconazol libertado. O creme
comercial 1 libertou 39,0 ± 15,8 %, o creme comercial 2 libertou 60,7 ± 23,4 % e as reformulações F2,
F7, e F8 libertaram 55,6 ± 23,1 %, 67,8 ± 13,4 % e 57,5 ± 10,5 % respetivamente de cetoconazol.
A partir da análise estatística ANOVA, verificou-se que não houve diferenças significativas entre as
formulações estudadas (p > 0,05).
O modelo cinético de ordem zero, representa a dissolução de fármacos a partir de formas
farmacêuticas que não desagregam e que libertam o fármaco lentamente. As formas farmacêuticas que
seguem este perfil libertam a mesma quantidade de fármaco por unidade de tempo, sendo um modelo
ideal para formas farmacêuticas de libertação prolongada [72]. Em relação ao outro modelo, Higuchi
desenvolveu vários modelos teóricos para estudar a libertação de fármacos solúveis e pouco solúveis
em água incorporados em matrizes semi-sólidas e sólidas. Este modelo pode ser utilizado para
descrever a dissolução de fármacos a partir de formas farmacêuticas de liberação modificada como,
alguns sistemas transdérmicos, e comprimidos matriciais com fármacos hidrossolúveis. Higuchi
descreve a libertação de fármaco como um processo de difusão baseado na lei de Fick [72].
Através da Tabela 17, observou-se que o modelo ordem zero descreve estatisticamente melhor o
mecanismo de libertação do fármaco, uma vez que apresentou o melhor valor de R2 para todas as
formulações.
Avaliação in vitro da permeação de cetoconazol
O ensaio foi executado com pele de porco recém-nascido, de acordo com o descrito no método
presente neste capítulo. Todas as formulações foram analisadas em n=6 vezes. Os resultados da
permeação de cetoconazol de cada formulação estão presentes na Figura 10 e os parâmetros da
permeação estão indicados na Tabela 18.
33
Cetoconazol permeado (%)
0,30
0,20
0,10
0,00
0
5
F2
10
F7
F8
15
Tempo (h)
Creme comercial 1
20
25
30
Creme comercial 2
Figura 10 – Permeação in vitro através da pele de cetoconazol das reformulações finais e
dos cremes comerciais em percentagem de cetoconazol (média ± DP, n=6).
Tabela 18 - Parâmetros da permeação cutânea das reformulações finais e das formulações de
referência (média ± DP, n=6).
F2
F7
F8
Creme comercial 1
Creme comercial 2
Fluxo (µg/cm2/h)
0,09 ± 0,09
0,00 ± 0,00
0,09 ± 0,17
0,05 ± 0,02
0,57 ± 0,18
Kp (cm/h)
4,45x10-6 ± 4,3x10-6
8,7x10-9 ± 2,1 x10-8
4,2x10-6 ± 8,3x10-6
2,3x10-6 ± 9,0x10-7
2,9x10-5 ± 8,9 x10-6
Lag time
0,58 ± 0,32
0,01 ± 0,01
0,11 ± 0,13
0,28 ± 0,02
1,55 ± 0,71
Após 24 horas (Figura 10), observou-se que foi o creme comercial 2 que obteve a maior permeação
de fármaco, sendo a percentagem de cetoconazol permeado de 0,19 ± 0,07 %. A formulação onde não
se obteve fármaco na fase recetora foi a F7 (0,00 ± 0,00 %). A formulação F2, F8 e creme comercial 1
apresentaram uma permeação de cetoconazol de 0,03 ± 0,03 %, 0,03 ± 0,06 % e 0,01 ± 0,01 %
respetivamente.
Em relação aos parâmetros de permeação cutânea, o creme comercial 2 apresentou o valor mais
elevado de fluxo, enquanto a reformulação F7 não apresentou fluxo. No parâmetro lag time, o creme
comercial 2 apresentou o maior valor e a reformulação F7 o menor.
Na análise estatística ANOVA, verificou-se que houve diferenças significativas entre as
formulações finais e as de referência (p < 0,05).
2.4.3. Eficácia dos conservantes
Durante o desenvolvimento de uma formulação é necessário verificar a atividade antimicrobiana
própria da preparação, ou demonstrar-se que, se necessário, quando adicionado um ou mais
conservantes apropriados, esta assegura uma proteção adequada contra os efeitos nocivos que podem
surgir da contaminação ou da proliferação microbiana durante o período de conservação e de
administração [24].
34
A atividade antimicrobiana dos conservantes é testada contaminando artificialmente a formulação,
através da inoculação de microrganismos apropriados, e conservando a preparação semeada a uma
temperatura adequada. Os microrganismos estudados são: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027;
NCIMB 8626; CIP 82.118), Staphylococcus aureus (ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518; CIP 4.83),
Candida albicans (ATCC 10231; NCPF 3 179; IP 48.72) e Aspergillus niger (ATCC 16404; IMI 149007;
IP 1431.83) Para além destes microrganismos especificados também podem ser analisados outros
microrganismos que sejam relevantes para a formulação. A duração do ensaio e os critérios de
aceitação, em termos de diminuição do número de microrganismos em função do tempo, variam para
as diversas categorias de preparações farmacêuticas de acordo com o grau de proteção pretendido.
No caso das reformulações estudadas, os critérios e os tempos de análise têm que ser os descritos
para as preparações tópicas e locais, Tabela 19. Os critérios de aceitação para a avaliação da atividade
antimicrobiana expõe-se na Tabela 19 em termos de redução logarítmica do número de microrganismos
viáveis relativamente ao valor obtido no inóculo [24].
Tabela 19 - Critérios de aceitação [24].
Bactérias
Fungos
A
B
A
B
2 dias
2
----
Redução logarítmica
7 dias
14 dias
3
--3
-2
-1
28 dias
SA
SA
SA
SA
SA - Sem Aumento
2.4.3.1.
Resultados
Os estudos de eficácia dos sistemas conservantes foram realizados nas reformulações finais, F2,
F7 e F8. Os conservantes destas formulações são o sulfito de sódio e a imidazolidinil ureia.
A reformulação F2, ao segundo dia apresentou resultado positivo no controlo da amostra, ou seja,
a formulação apresentou contaminação. O mesmo sucedeu com a reformulação F7 ao sétimo dia.
Como o controlo da amostra apresentou contaminação o ensaio da eficácia dos conservantes foi
interrompido. Estes resultados indicam que o sulfito de sódio introduzido nestas duas reformulações
não foi suficientemente eficaz para evitar ou limitar a proliferação microbiana.
No caso da reformulação com imidazolidinil ureia, F8, os resultados estão demonstrados na Tabela
20.
Tabela 20 - Ensaio da eficácia dos conservantes da reformulação F8, em redução logarítmica.
Estirpes em Ensaio
P. aeruginosa
S. aureus
C. albicans
A. niger
Inóculo (ufc/ml)
6,7x105
1,0x106
6,5x105
1,8x106
2 dias
4,13
4,30
-----
7 dias
4,13
4,30
-----
14 dias
----2,23
4,56
28 dias
4,13
4,30
4,11
4,56
35
Para que o conservante seja considerado eficaz é necessário que ocorra redução logarítmica em
3 e 2 potências dependendo do dia de análise e dos microrganismos estudados (Tabela 19). De acordo
com a Tabela 20, a reformulação F8 revelou uma atividade microbiana que se encontra conforme com
os critérios de aceitação de eficácia microbiana para as formulações tópicas indicadas na FP em vigor.
2.5. Discussão dos resultados
As características organoléticas observadas para as reformulações finais, nomeadamente a cor
pode significar que não houve sinais de degradação (oxidação) do cetoconazol. Assim um dos objetivos
do presente trabalho foi concretizado, pelo menos até à data de conclusão do estudo. No entanto,
deverão ser efetuados estudos de estabilidade de acordo com as normas ICH (International Conference
on Harmonisation (ICH) of Stability testing of new drug subtances and products Q1A (R2), (ICH), 2003).
As reformulações finais, F2, F7 e F8, foram sujeitas a uma condição de stress, neste caso
centrifugação, para avaliar a estabilidade física de cada emulsão. A centrifugação, quando utilizada
cuidadosamente, torna-se numa ferramenta útil para a avaliação e previsão da estabilidade de
emulsões. A exposição de uma emulsão à centrifugação pode levar à separação da fase dispersa
devido à cremagem ou coalescência. Esta separação de fases só ocorre quando a força de
centrifugação é suficientemente elevada para levar à rutura da camada de emulgente absorvido que
rodeia cada gotícula [32]. Nas condições utilizadas, para este ensaio, não ocorreu separação de fases
em nenhuma das três reformulações, sendo um bom indicador de estabilidade das referidas emulsões.
Também foi realizado este ensaio para os dois cremes comerciais, onde também não ocorreu
separação de fases.
O perfil reológico, determinado para as reformulações finais, foi de um fluido não newtoniano com
comportamento reofluidificante (pseudoplástico). Ao analisar o gráfico é notória a existência de
diferenças entre as reformulações, principalmente na F8. Esta disparidade poderá estar relacionada
com a presença do excipiente quelante, presente apenas nesta reformulação. No entanto, aquando da
análise da viscosidade aparente, a reformulação 8 não foi das reformulações finais mais viscosas.
Porém, á que ter em conta que o procedimento de fabrico dos lotes laboratoriais não foi sempre o
mesmo pois ocorreu manipulação pelo operador, o que poderá ter influenciado os resultados obtidos
para os ensaios de reologia.
Para os dois ensaios in vitro, foram utilizados dois cremes de referência, designados por creme
comercial 1 e creme comercial 2, ambos com o mesmo teor em cetoconazol das reformulações finais
desenvolvidas. No ensaio de cedência houve apenas um creme (creme comercial 1) que libertou
metade da concentração inicial de fármaco. As restantes formulações apresentaram resultados de
percentagem cedida muito próximos umas das outras, sendo que a reformulação F7 libertou 67,8 % de
cetoconazol. O creme comercial 2 libertou 60,7 %. Podemos concluir que o creme comercial 1 não é o
melhor veículo para a libertação do fármaco. No entanto, a reformulação F7 apresentou resultados
bastantes favoráveis o que indica ser um veículo promissor. As outras formulações estão muito
próximas pois neste estudo, não houve diferenças estatisticamente significativas entre as formulações,
36
o que poderá indicar que as diferenças na composição nestas formulações não influenciaram estes
resultados. No ensaio de libertação de fármaco ocorreu a passagem de uma pequena quantidade de
fase recetora para o compartimento dador, tendo assim ultrapassado a membrana sintética. A fase
recetora é apenas constituída por propanediol e etanol, uma vez que durante o desenvolvimento desta
fase observou-se que o cetoconazol precipitava na presença de água (Anexo-I).
Os resultados obtidos no ensaio da permeação cutânea estão concordantes com os obtidos nos
ensaios de cedência. Assim, no creme comercial 2, observou-se uma maior libertação de cetoconazol.
Nas restantes formulações a percentagem de fármaco permeado foi muito reduzida, tendo-se obtido
no máximo 0,03 % de cetoconazol na fase recetora. Tendo em conta que o objetivo nestas formulações
é a ação no EC, o fármaco não deverá ultrapassar esta camada. Porém, apesar do creme comercial 2
ter permeado para além do EC, a concentração do fármaco foi residual, 0,19 %. Ainda que tenha
ocorrido uma maior permeação de cetoconazol no creme comercial 2, o parâmetro cinético lag time foi
maior para este creme, indicando uma retenção de cetoconazol mais acentuada no veículo, durante
um período de tempo mais alargado.
Relacionando o tamanho de gotícula com os resultados obtidos nos ensaios in vitro, verificou-se
que as formulações com menor tamanho de gotícula foram as que obtiveram resultados melhores nos
ensaios de libertação e de permeação na pele. Portanto, o tamanho de gotícula e a quantidade de
fármaco cedido/permeado têm uma ligação direta.
O ensaio da eficácia de conservantes revelou que a reformulação F8 com 0,5 % de imidazolidinil
ureia assegura uma proteção microbiológica adequada contra os efeitos nocivos que podem surgir da
contaminação ou da proliferação microbiana durante o período de conservação e de administração.
Este conservante, imidazolidinil ureia, liberta formaldeído que é um agente irritante para a pele quando
está livre. No entanto, este conservante pode ser utilizado quando a concentração de formaldeído livre
não excede os 0,2 % [73], [74], [75], [76]. Uma formulação com 0,6 % de imidazolidinil ureia corresponde
a 0,186 % de formaldeído livre, assim, a reformulação F8 não atinge a concentração máxima de
formaldeído livre permitida [77].
37
Capítulo 3 - Formulações inovadoras
Neste capítulo, encontra-se descrito o desenvolvimento de duas formulações inovadoras aplicando
tecnologias de produção de nano e microssistemas, de acordo com a pesquisa realizada (alínea 1.7Capítulo 1). O objetivo da encapsulação do cetoconazol nestes sistemas inovadores foi prevenir a sua
degradação e permitir uma predisposição maior de cetoconazol no local de ação.
Na escolha das formas farmacêuticas inovadoras foram tidos em consideração dois critérios:
-
A possível capacidade em obter um resultado mais favorável em comparação com as
formas farmacêuticas convencionais;
-
As formulações serem facilmente transponíveis na indústria farmacêutica.
As formulações desenvolvidas foram avaliadas em relação às suas propriedades físico-químicas.
Também foram realizados ensaios in vitro e determinada a eficácia das formulações.
3.1. Emulsões
A escolha de uma emulsão estável incidiu principalmente no seu processo de fabrico, pois é
idêntico ao da formulação convencional. Para além disto, este veículo deveria ter o menor tamanho de
gotícula possível e o cetoconazol tinha que estar dissolvido.
3.1.1. Matérias-primas
As matérias-primas usadas para a preparação da formulação da emulsão estão representadas na
Tabela 21.
Tabela 21 - Características gerais de matérias-primas usadas no desenvolvimento galénico [55], [78].
Matéria-prima
Cetoconazol
Estearato de sucrose
Distearato de sucrose
Parafina Líquida
Octildodecanol
Etoxidiglicol
Álcool cetílico
Monoestearato glicerilo
HPMC
INCI name
Ketoconazole
Sucrose Stearate
Sucrose Distearate
Paraffin oil
Octyldodecano
Ethoxydiglycol
Cetyl Alcohol
Glyceryl stearate
Hidroxipropilmetilcelulose
Função
Antifúngico
Tensioativo
Tensioativo
Solvente
Solvente
Solvente
Tensioativo
Tensioativo
Controlador viscosidade
3.1.2. Equipamentos utilizados para a preparação da formulação
Os equipamentos utilizadas para a execução da formulação e dos ensaios são:
-
Balanças Analíticas: modelo AE260 Delta Range® - Mettler Tolero®; modelo PB303 Delta
Range® - Mettler Toledo®;
38
-
Banho-maria termostatizado: GERHARTT;
-
Banho de Ultra-sons: modelo Bransonic® Ultrasonic cleaner B-5200 E1-Sotel;
-
Placa de agitação magnética: Variomag Telesystem, Thermo scientific;
-
Dispersor: Ultra-turrax® T25 e Ultra-turrax® Basic 10, IKA®, Deutschland, Germany: Haste:
S25N – 25G, S25N – 25F, S10N – 5G;
3.1.3. Métodos
Distribuição do tamanho de gotícula
A distribuição de tamanho foi medida por espalhamento e luz dinâmica utilizando o equipamento
Zetasizer Nano S (Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK). Este equipamento apresenta uma
faixa de medição de 3 nm a 10 µm de diâmetro. O líquido utilizado para a dispersão das partículas foi
a água em célula apropriada. A amostra (20 µl) foi diluída em 2 ml de água. Cada amostra foi lida 3
vezes. Os resultados obtidos foram apresentados na forma (média ± DP, n=3). O equipamento permite
ainda determinar o índice de polidispersão (PdI) que fornece informações sobre a homogeneidade da
distribuição dos tamanhos.
Para esta forma farmacêutica também se realizaram leituras no equipamento Malvern Mastersizer
2000 (Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK) em conjunto com o acessório Hydro 2000 S. O
método está descrito no capítulo 2 - Reformulações.
Doseamento substância ativa
Para o doseamento de cetoconazol, utilizou-se o método HPLC (Sistema Beckman: Detetor: 166
Detectro, System Gold®; Bomba: 126 Solvent Module, System Gold®; Injetor automático: MIDAS,
Holland Spark). A coluna utilizada foi Lichrospher 100 RP-18 5 micra (250 milímetros x 4mm). Para este
método, a fase móvel foi constituída por 55 % (v / v) de acetonitrilo e 45 % (v / v) de tampão fosfato.
Uma taxa de fluxo de 1,5 ml / minuto foi usada com um volume de injeção de 20 µL. Foi utilizado um
comprimento de onda de 254 nm. O tempo de execução foi de 6 minutos para cada injeção. Na
preparação das amostras foi utilizado como solvente metanol.
Determinação da viscosidade aparente
A viscosidade aparente foi determinada com recurso ao viscosímetro LVDV-E (Brookfield®
Engeneering Laboratories, EUA), na velocidade de corte de 61,18 s-1 e com a agulha 64, após um
tempo de estabilização de 30 segundos, à temperatura ambiente (25 ± 2°C).
Determinação do pH
Método descrito no capítulo 2 - Reformulações
39
Avaliação in vitro da libertação do gel de cetoconazol
O perfil de libertação de cetoconazol foi realizado em células de difusão de Franz de 2,5 cm2. A
membrana sintética utilizada foi a membrana de nitrato de celulose de 0,45 µm. A fase recetora usada
foi constituída por propilenoglicol / etanol 96 % (1:1) (Anexo-I). A fase recetora foi colocada no
compartimento recetor por forma a esta ficar em contacto com a membrana sintética. As amostras das
formulações em estudo (aproximadamente 2 g) foram aplicadas na superfície da membrana sintética
no compartimento dador, após a adição da amostra o compartimento dador foi selado com Parafilm ®.
As células de Franz foram imersas num sistema de banho a 32 ± 2°C sob agitação. Foram recolhidas
amostras (2 ml) a partir do fluido recetor em tempos pré-determinados: 0,5, 1, 2, 3, 5, 6 horas; e de
seguida foi reposta a mesma quantidade em fase recetora fresca. O teor de cetoconazol nas amostras
recolhidas foi analisado pelo método de espectrofotometria UV (U-2001 spectrophotometer, Hitachi) a
242,6 nm e foi utilizado como solvente o metanol. Para cada formulação foram realizadas três réplicas.
Os dados obtidos neste estudo foram ajustados aos dois modelos cinéticos descritos no capítulo 2.
Avaliação in vitro da permeação do gel de cetoconazol
Método descrito no capítulo 2 - Reformulações
Avaliação in vitro da retenção de cetoconazol na pele
O estudo de retenção da pele foi realizado por meio de fita adesiva de acordo com o método
descrito na Guideline OECD, 2004 [79]. No fim do ensaio in vitro de permeação da pele, descrito no
capítulo 2, as amostras de pele foram lavadas de forma a retirar o excesso de formulação e secas com
papel. De seguida, as amostras de pele foram colocadas sobre uma superfície lisa, o EC foi removido
aplicando 20 fitas adesivas (Scotch® 3M, UK). A fim de melhorar a reprodutibilidade da técnica de
remoção de fita, um cilindro (2 kg) e um disco de acrílico foram usados, a pressão foi aplicada durante
10 segundos em cada fita. Todas as fitas (excluído a primeira) com o EC removido e a pele restante
(epiderme e derme viáveis), que foi cortada em pedaços pequenos, foram usadas no processo de
extração anteriormente validado. Neste processo de extração, foram adicionados 3,0 ml de fase
recetora e 0,5 ml de metanol às fitas com EC e aos pedaços de pele cortados. Ambas as amostras
foram vigorosamente agitadas durante 2 minutos num misturador vertical (Kinematica AG), e sonicadas
durante 20 minutos, a fim de obter a lise celular. A solução final foi centrifugada (Megafuge 1.0 R,
Heraeus instruments) a 30000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado (0,2 µm) e injetado
no HPLC (Sistema Beckman: Detetor: 166 Detectro, System Gold®; Bomba: 126 Solvent Module,
System Gold®; Injetor automático: MIDAS, Holland Spark) para quantificar a quantidade (%) de
cetoconazol retido nessas camadas da pele.
Análise estatística
Método descrito no capítulo 2 - Reformulações
40
3.1.4. Desenvolvimento galénico - Ensaios preliminares
O tensioativo estearato de sucrose foi utilizado para a formação desta emulsão. Trata-se de um
tensioativo não iónico pouco irritante para a pele e olhos. Apresenta um valor de EHL 15, o que indica
ser um ótimo tensioativo para formar emulsões O/A. Quando utilizado sozinho, o fabricante, recomenda
o processo de fabrico a frio, podendo ser utilizado tanto na fase oleosa como na fase aquosa. Em
relação à concentração recomendada, esta deverá estar entre 1,0 a 5,0 % [78], [80].
Tendo por base as recomendações mencionadas, foi necessário estudar a fase oleosa e o método
de fabrico para a formação da emulsão. A primeira fase oleosa utilizada na formulação foi a parafina
líquida, formulação emul líquida 1, ilustrada na Tabela 22. Em relação às características organoléticas,
esta formulação apresentou cor banca/translúcida e aspeto homogéneo. No entanto, analisando o
tamanho de gotícula, obtiveram-se tamanhos na ordem dos 47 µm (d(0,9): 46,9 ± 0,2 µm, Span: 3,2 ±
0,1).
Tabela 22 - Constituição da formulação emul líquida 1 (%, m/m).
Matéria-prima
Parafina líquida
Estearato de sucrose
Água purificada
Formulação emul líquida 1 (%, m/m)
Fase Oleosa
1
Fase Aquosa
1
98
Devido aos resultados obtidos na formulação emul líquida 1 procedeu-se à alteração da fase
oleosa. Como se pretende obter uma formulação com tamanho de gotícula pequena (< a 500 nm)
decidiu-se então utilizar como fase oleosa o óleo utilizado na formação da emulsão O/A convencional
(capítulo 2), o octildodecanol. Foram desenvolvidas três formulações, as formulações emul líquida 2, 3
e 4, cuja composição apenas difere na percentagem de tensioativo (Tabela 23). O método de produção
destas formulações encontra-se ilustrado na Figura 11.
Tabela 23 - Composição das formulações emul líquida 2, 3 e 4 (%, m/m).
Matéria-prima
Octildodecanol
Estearato de sucrose
Água purificada
Formulação emul
Formulação emul
líquida 2 (%, m/m)
líquida 3 (%, m/m)
Fase Oleosa
1
1
Fase Aquosa
1
2
98
97
Formulação emul
líquida 4 (%, m/m)
1
3
96
41
Estearato de sucrose + Água purificada
Fase
Oleosa
Homogeneização
com vareta de vidro
Fase Aquosa
Ultra-turrax® T25
2 minutos, 15 000 rpm
Temperatura Ambiente
(25 ± 2°C)
Emulsão O/A
Figura 11 - Método de produção das formulações emul líquida 1, 2, 3 e 4.
As formulações da Tabela 23 apresentaram, em termos de características organoléticas, cor branca
e aspeto homogéneo, à exceção da formulação emul líquida 2 que apresentou uma cor branca mais
translúcida, como sucedeu anteriormente com a formulação emul líquida 1.
Em relação ao tamanho de gotícula no tempo zero, a formulação emul líquida 2 apresentou 21 µm
(d(0,9): 21,3 ± 0,2 µm, Span: 2,0 ± 0,0), a formulação emul líquida 3 20 µm (d(0,9): 19,7 ± 0,4 µm, Span:
2,2 ± 0,0) e a formulação emul líquida 4 18 µm (d(0,9): 18,0 ± 0,3 µm, Span: 2,4 ± 0,1). Com os
resultados obtidos observou-se que quanto maior a quantidade de tensioativo menor o tamanho de
gotícula.
Após 5 dias os resultados das três formulações em termos do tamanho de gotícula foram: 24 µm
(d(0,9): 24,0 ± 0,1 µm, Span: 2,3 ± 0,0), 35 µm (d(0,9): 35,2 ± 5,0 µm, Span: 3,2 ± 1,0) e 50 µm (d(0,9):
49,5 ± 16,2 µm, Span: 5,3 ± 1,8) para a formulação emul líquida 2, 3, 4, respetivamente. Verificou-se
um aumento significativo no tamanho de gotícula das formulações com maior quantidade de tensioativo
(Figura 12).
Volume (%)
8
6
4
2
0
0
1
100
Tamanho de partícula (µm)
Formulação emul líquida 2: T0
10000
Formulação emul líquida 2: Após 5 dias
Figura 12 - Representação gráfica do tamanho de gotícula da
formulação emul líquida 2 no tempo zero e após 5 dias.
42
Após análise dos resultados anteriores decidiu-se continuar o estudo apenas com a formulação
emul líquida 2. Por forma a otimizar o tamanho de gotícula procedeu-se à utilização de dois
equipamentos homogeneizadores, o Ultra-Turrax® T25 e o Ultra-Turrax® Basic 10. O processo de
fabrico, representado na Figura 11, sofreu modificações no tempo de homogeneização, em ambos os
Ultra-Turrax®, e na velocidade de homogeneização, no equipamento Ultra-Turrax® Basic 10. O
processo de fabrico de ambas as formulações está esquematizado na Figura 13. Para melhor
compreensão a formulação emul líquida 2 é referente ao Ultra-Turrax® T25 e a formulação emul
líquida 2A ao homogeneizador Ultra-Turrax® Basic 10 (homogeneizador com uma haste mais
pequena).
a
Formulação emul líquida 2
Estearato de sucrose + Água purificada
Homogeneização
com vareta de
vidro
Fase
Oleosa
Formulação emul líquida 2A
b
Estearato de sucrose + Água purificada
Homogeneização
com vareta de
vidro
Fase
Oleosa
Fase Aquosa
Fase Aquosa
Ultra-Turrax® T25
Ultra-Turrax® Basic 10
5/10 minutos, 15 000
rpm
Emulsão O/A
Temperatura
Ambiente
(25 ± 2°C)
5/10 minutos, 30 000
rpm
Emulsão O/A
Temperatura
Ambiente
(25 ± 2°C)
Figura 13 - a) Processo de fabrico melhorado da formulação emul líquida 2. b) Processo de
fabrico da formulação emul líquida 2A.
Tabela 24 - Tamanho de gotícula da formulação emul líquida 2 e 2A a tempos de homogeneização
diferentes (média ± DP, n=5).
Formulação emul
líquida 2
Formulação emul
líquida 2A
Duração da Homogeneização
5 minutos
10 minutos
(d(0,9), µm)
Span
(d(0,9), µm)
Span
32,5 ± 1,7
2,7 ± 0,0
40,7 ± 2,8
4,1 ± 0,0
10,8 ± 1,3
22,8 ± 2,6
1,9 ± 0,0
5,1 ± 0,0
O resultado do tamanho de gotícula das duas formulações está indicado na Tabela 24. Quanto
maior o tempo de homogeneização menor o tamanho de gotícula, para ambas as formulações. Na
formulação emul líquida 2 houve um aumento do tamanho de gotícula de 24 µm para 40 µm, apesar
do tempo de homogeneização ser ligeiramente superior. Este aumento poderá ter ocorrido devido à
utilização de uma haste do Ultra-Turrax® T25 diferente. A formulação emul líquida 2A foi a que
apresentou tamanho de gotícula menor, 1,9 µm, e por esta razão foi utilizada nos próximos estudos.
43
À formulação emul líquida 2A, foram acrescentados viscosantes com o objetivo de formar um creme
O/A. Foram adicionados os excipientes álcool cetílico e a monoestearato glicerilo, sendo as mesmas
matérias-primas para a formação do creme O/A convencional (capitulo 2). A formulação encontra-se
representada na Tabela 25 e o método de fabrico na Figura 14.
Tabela 25 - Composição da formulação emul creme 2A (%, m/m).
Matéria-prima
Estearato de sucrose
Octildodecanol
Álcool cetílico
Monoestearato
glicerilo
Formulação emul creme 2A (%, m/m)
Fase Oleosa
1,0
1,0
2,5
7,5
Fase Aquosa
Água purificada
88,0
Fase Oleosa
Fase Aquosa
Banho a Temperatura
máxima = 70°C
Banho a Temperatura
máxima = 70C
Fase Aquosa
Ultra-turrax® Basic 10,
até arrefecimento total, a
30 000 rpm
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Emulsão O/A
Figura 14 - Método de fabrico para a formação do creme O/A.
O creme obtido apresentou cor branca e aspeto homogéneo. No entanto, ocorreu um aumento no
tamanho de gotícula da formulação emul líquida 2A para a formulação emul creme 2A, isto é, passou
de 1,9 µm para 8,9 µm (d(0,9): 8,9 ± 1,1 µm, Span: 2,9 ± 0,4) respetivamente. Assim, por forma a obter
um tamanho de gotícula mais baixo, colocou-se o tensioativo primário na fase aquosa, uma vez que
este tensioativo pode ser aplicado em qualquer uma das fases. Os resultados obtidos não foram os
esperados, porque a formulação não adquiriu viscosidade e o tamanho de gotícula foi maior, na ordem
dos 22,0 µm (d(0,9): 22,1 ± 0,9 µm, Span: 12,9 ± 0,5).
Outro ponto importante para a obtenção da fórmula inovadora foi a dissolução do cetoconazol,
porque ao contrário do creme convencional para esta formulação pretendia-se uma maior dissolução
do cetoconazol, com o objetivo de aumentar o fármaco disponível no EC. Para este efeito, a substância
ativa foi homogeneizada com octildodecanol em duas proporções (m/m), 1:1 e 1:2. Verificou-se que
ambas as formulações apresentaram cor branca. No entanto, a proporção 1:2 apresentou menor
viscosidade. De acordo com os resultados obtidos, procedeu-se então à realização da formulação com
4 % de octildodecanol. Por forma a compreender as alterações que este aumento iria trazer, procedeu-
44
se ao fabrico do placebo de acordo com o método de fabrico da Figura 13-b. Esta formulação
apresentou cor branca e aspeto homogéneo e em relação ao tamanho de gotícula mostrou gotículas
de 1,0 µm (d(0,9): 1,0 ± 0,0 µm, Span: 2,8± 0,0). Não houve diferenças significativas no tamanho de
gotícula aquando do aumento da percentagem de octildodecanol, de 1 % para 4 %. Sendo os resultados
favoráveis, procedeu-se à formação do creme placebo, como realizado anteriormente, através do
processo de fabrico indicado na Figura 14. Este creme apresentou cor branca e aspeto homogéneo e
a análise ao tamanho de gotícula revelou que este creme continha gotículas na ordem dos 13,0 µm
(d(0,9): 12,8 ± 0,4 µm, Span: 2,6 ± 0,1) .
O fabricante do tensioativo estearato de sucrose recomenda a utilização deste tensioativo com
outro, o distearato de sucrose, referindo que a utilização dos dois excipientes melhora a estabilidade
das emulsões. Deste modo, testou-se a junção dos dois tensioativos, com a quantidade e procedimento
sugeridos pelo fabricante. Preparam-se duas formulações (Tabela 26) de acordo com o processo de
fabrico da Figura 15.
Tabela 26 - Composição da formulação emul creme 5 e 6 (%, m/m).
Matérias-primas
Estearato de sucrose
Distearato de sucrose
Octildodecanol
Álcool cetílico
Monoestearato glicerilo
Estearato de sucrose
Distearato de sucrose
Água Purificada
Formulação emul creme 5
(%, m/m)
Fase Oleosa
1,0
3,0
4,0
2,5
7,5
Fase Aquosa
----82,0
Formulação emul creme 6
(%, m/m)
----4,0
2,5
7,5
1,0
3,0
82,0
45
Fase Oleosa
Fase Aquosa
Banho a Temperatura
máxima= 70-75°C.
Banho a Temperatura
máxima= 70-75C.
Fase Oleosa
Adicionou-se lentamente
à fase aquosa.
Fase Aquosa
Homogeneizou-se, no Ultraturrax® Basic 10, durante 5
minutos, a 30 000 rpm.
Emulsão O/A
Agitou-se até aos 35°C,
com vareta de vidro.
Emulsão O/A
Homogeneizou-se, no Ultraturrax® Basic 10, durante 1
minutos, a 30 000 rpm
Emulsão O/A
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 15 - Processo de fabrico das formulações emul creme 5 e 6.
Tabela 27 - Resultado da análise do tamanho de gotícula das formulações emul creme 5 e 6 (média ±
DP, n=5).
Tamanho de gotícula
d(0,9), µm
Span
Formulação emul creme 5
14,6 ± 2,4
4,7 ± 0,7
Formulação emul creme 6
14,8 ± 1,4
3,1 ± 0,1
Em relação às características organoléticas, ambas as formulações apresentaram cor branca e
aspeto homogéneo. Ambas apresentaram aproximadamente 14 µm de tamanho de gotícula (Tabela
47). Como se pretendia obter tamanhos de gotícula inferiores a este valor, sujeitou-se a formulação
emul creme 5 a maior tempo de homogeneização, 10 minutos, utilizando o Ultra-turrax Basic 10. No
entanto, este procedimento não resultou pois a formulação não sofreu qualquer alteração.
Após a realização de ensaios de solubilidade em vários excipientes, verificou-se que o cetoconazol
era solúvel em etoxidiglicol. Deste modo, procedeu-se ao desenvolvimento de novas formulações
46
utilizando este solubilizante (Tabela 28). O método de fabrico está representado na Figura 13-b. Os
resultados estão expressos na Tabela 29 e Figura 16.
Tabela 28 - Composição da formulação emul líquida 7, 8, 9 e 10 (%, m/m).
Matérias-primas
Formulação
emul líquida 7
(%, m/m)
Etoxidiglicol
1
Estearato de sucrose
Água Purificada
1
98
Formulação
emul líquida 8
(%, m/m)
Fase Oleosa
2
Fase Aquosa
2
96
Formulação
emul líquida 9
(%, m/m)
Formulação
emul líquida 10
(%, m/m)
5
10
5
90
10
80
Tabela 29 - Características da formulação emul líquida 7, 8, 9 e 10.
Características
Organoléticas
(cor, aspeto)
Tamanho de
gotícula (nm) /
PdI (média ±
DP, n=3)
Formulação
emul líquida 7
Cor
branca/translúcid
a, homogéneo
Formulação
emul líquida 8
Cor
branca/translúcid
a, homogéneo
Formulação
emul líquida 9
Cor branca/
pouco translúcida,
homogéneo
Formulação
emul líquida 10
Cor branca,
homogéneo,
bolhas de ar
386,9 ± 21,4 /
0,4 ± 0,1
339,4 ± 8,2 /
0,3 ± 0,0
344,6 ± 11,3 /
0,2 ± 0,0
---
Intensidade (%)
Aspeto
macroscópico
15
10
5
0
1
100
Tamanho (nm)
10000
Formulação emul líquida 9
Figura 16 - Tamanho de gotícula da formulação emul líquida 9.
Comparando os resultados, as formulações são muito semelhantes tanto nas características
organoléticas como no tamanho de gotícula, à exceção da formulação emul líquida 10. Sendo o objetivo
dissolver a substância ativa no etoxidiglicol quanto maior a percentagem deste excipiente maior será a
probabilidade de dissolver a substância ativa. De entre as formulações que apresentaram os melhores
resultados a formulação escolhida foi a 9.
Apesar de se ter 5 % (m/m) do solubilizante na formulação selecionada, esta percentagem foi muito
pequena para conseguir dissolver 2 % (m/m) de cetoconazol, quantidade introduzida no creme
convencional, tendo sido apenas possível introduzir 0,13 % de substância ativa na formulação.
47
A introdução do cetoconazol (0,13 %) na formulação emul líquida 9 não alterou as características
organoléticas. Em relação ao tamanho de gotícula a introdução desta substância ativa não alterou
significativamente o tamanho de gotícula ((375,4 ± 5,5; PdI: 0,3 ± 0,1) nm). Assim, sendo esta
formulação a mais promissora deu-se continuidade ao estudo.
Esta formulação não apresentava a viscosidade pretendida. A fim de melhorar este parâmetro
adicionou-se um agente gelificante, a hidoxipropilmetilcelulose (HPMC). Inicialmente testaram-se três
percentagens de HPMC 0,5 %, 1,0 % e 2,0 % em água. Através de inspeção visual, a mais apelativa
foi a formulação com 1,0 % HPMC.
Escolhida a percentagem de HPMC procedeu-se à geleificação da formulação mais promissora,
inicialmente o placebo da formulação emul líquida 9 e à posteriori a formulação emul líquida 9 com 0,13
% de cetoconazol. Ambas as formulações apresentaram cor banca e aspeto homogéneo. Em termos
do tamanho de gotícula, o placebo e a formulação com 0,13 % cetoconazol apresentaram
aproximadamente 90 µm.
Formulação Final
Considerou-se como formulação final a formulação emul 9 gelificada com HPMC e com 0,13 % de
cetoconazol. A formulação foi posteriormente caracterizada.
Características físicas e químicas:
A formulação final apresentou cor branca e aspeto homogéneo, tanto para o placebo como para a
formulação com substância ativa, como é possível verificar pela Figura 17.
Com S.A
Placebo
Figura 17 - Imagem da formulação 9 com 0,13 % de
cetoconazol (esquerda) e o respetivo placebo (direita).
Foram realizados ensaios como, determinação do tamanho de gotícula, do pH e da viscosidade da
formulação final e respetivo placebo. Também se efetuou o doseamento do cetoconazol na formulação
final, formulação emul 9 gel com 0,13 % de cetoconazol. Os resultados destes ensaios estão
representados na Tabela 30 e Figura 18.
48
Tabela 30 - Resultados das características físico-químicas da formulação final com cetoconazol e
respetivo placebo.
Tamanho de
gotícula
(média ± DP, n=5)
Formulação emul
9 gel com 0,13 %
cetoconazol
Placebo
Formulação emul
9 gel
d(0,9),
µm
Span
pH
Viscosidade
aparente
(Pa.s)
Doseamento (%)
(média ± DP, n=3)
90,8 ± 3,4
1,8 ± 0,1
7,2
0,3
94,4 ± 0,7
84,2 ± 3,0
1,0 ± 0,1
7,0
0,4
---
Volume (%)
10
8
6
4
2
0
0
1
100
Tamanho de partícula (µm)
10000
Figura 18 - Representação da distribuição de tamanhos de gotícula
da formulação final com cetoconazol.
Relativamente à viscosidade, em termos macroscópicos, a formulação final apresentou uma
consistência adequada para aplicação tópica.
Avaliação in vitro da cedência de cetoconazol do gel
Neste ensaio foram analisados a formulação final e o creme comercial com 2 % de cetoconazol,
ambas em n=3 vezes. O perfil de cedência de cetoconazol da formulação em estudo e do creme
comercial encontra-se ilustrado pela Figura 19. Os parâmetros cinéticos estão expressos na Tabela 31.
49
a
Quantidade cetoconazol
cedida (µg/cm 2)
6300
5400
4500
3600
2700
1800
900
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tempo (h)
Cetoconazol cedido (%)
Formulação emul 9 gel com 0,13 % cetoconazol
Creme comercial com 2 % de cetoconazol
70
60
50
40
30
20
10
0
b
0
1
2
3
4
5
6
7
Tempo (h)
Formulação emul 9 gel com 0,13 % cetoconazol
Creme comercial com 2 % de cetoconazol
Figura 19 - Perfil de cedência in vitro de cetoconazol da formulação emul 9 gel e creme comercial
(média ± DP, n=3). a) Quantidade de cetoconazol (µg/cm2) cedido. b) Percentagem de
cetoconazol cedido.
Tabela 31 - Parâmetros cinéticos obtidos no modelo de Ordem Zero e no modelo de Higuchi para a
formulação final e de referência (média ± DP, n=3).
Formulação
final
Creme
comercial
k
119,22 ±
88,90
683,12 ±
215,21
Modelo Ordem Zero
b
R2
277,19 ±
0,58 ± 0,16
134,87
391,54 ±
0,97 ± 0,02
162,03
Modelo Higuchi
k
b
R2
426,21 ±
-42,81 ±
0,68 ± 0,17
314,13
228,31
2264,37
-1163,53
0,97 ± 0,01
± 710,09 ± 363,22
Ao fim de 6 horas, a formulação emul 9 gel com 0,13 % de cetoconazol e o creme comercial com
2 % cetoconazol, libertaram 34,3 ± 21,0 % (822 µg/cm2) e 10,4 ± 0,9 % (4576 µg/cm2) de fármaco,
respetivamente. A partir da análise estatística ANOVA, verificou-se que houve diferenças significativas
entre os perfis de libertação de cetoconazol das duas formulações estudadas (p < 0,05).
Avaliação in vitro da permeação do gel de cetoconazol
Este ensaio foi realizado em células de Franz de 1 cm2, onde se utilizou como membrana pele
porco recém-nascido para separar a fase dadora da recetora. As formulações, tanto a formulação final
50
como o creme comercial, foram analisadas em n=6 vezes. Os resultados da permeação de cetoconazol
Quantidade cetoconazol
permeada (µg/cm2)
estão indicados na Figura 20. Os parâmetros de permeação estão indicados na Tabela 32.
20
a
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Cetoconazol permeado
(%)
Formulação emul 9 gel com 0,13 % cetoconazol
16
18
20
22
24
26
Creme comercial com 2 % cetoconazol
0,5
b
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Formulação emul 9 gel com 0,13% cetoconazol
16
18
20
22
24
26
Creme comercial com 2% Cetoconazol
Figura 20 - Permeação da pele in vitro de cetoconazol da formulação emul 9 gel e creme
comercial (média ± DP, n=6). a) Quantidade de cetoconazol (µg/cm2) permeado. b)
Percentagem de cetoconazol permeado.
Tabela 32 - Parâmetros da permeação cutânea da formulação final e do creme comercial (média ±
DP, n=6).
Formulação emul 9 gel com
0,13 % cetoconazol
Creme comercial com 2 %
cetoconazol
Fluxo (µg/cm2/h)
Kp (cm/h)
Lag time
0,05 ± 0,05
2,9x10-5 ± 3,3x10-5
4,75 ± 0,00
0,57 ± 0,18
2,9x10-5 ± 8,9 x10-6
1,55 ± 0,71
Após 24 horas, a formulação final e o creme comercial, permearam 0,20 ± 0,22 % e 0,19 ± 0,07 %
de fármaco, respetivamente. Ao efetuar a análise estatística ANOVA, averiguou-se que não houve
diferenças significativas entre a formulação final e o creme comercial (p > 0,05).
51
Avaliação in vitro da retenção de cetoconazol na pele
A pele que foi utilizada no ensaio da permeação de cetoconazol, ensaio anterior, foi utilizada para
determinar a quantidade de cetoconazol existente no EC e nas camadas viáveis da pele (epiderme e
derme). Os resultados deste ensaio encontram-se ilustrados na Figura 21.
1,4
Formulação emul 9 gel
com 0,13 % cetoconazol
10
8
Creme comercial com 2 %
cetoconazol
6
4
1,2
Cetoconazol (%)
Quantidade de cetoconazol
(ug/ml)
12
1
Creme comercial com 2 %
cetoconazol
0,8
0,6
0,4
2
0,2
0
0
EC
Formulação emul 9 gel
com 0,13 % cetoconazol
Camadas viaveis da pele
EC
Camadas viaveis da pele
Figura 21 - Quantidade (esquerda) e percentagem (direita) de cetoconazol retido no EC e camadas
viáveis da pele, da formulação emul 9 gel e de um creme comercial (média ± DP, n=3).
Os valores de fármaco para a formulação final foi de 0,76 ± 0,46 % para o EC e de 0,33 ± 0,10 %
para as camadas viáveis da pele. No caso do creme comercial, obteve-se 0,10 ± 0,03 % para o EC e
0,04 ± 0,01 % para as camadas viáveis da pele de cetoconazol.
3.1.5. Discussão dos resultados
No início deste estudo era pretendido a formação de uma emulsão com 2 % (m/m) de cetoconazol.
No entanto, apenas foi possível introduzir 0,13 % (m/m) de substância ativa na formulação final, uma
vez que se pretendia a dissolução do cetoconazol. Esta pequena quantidade de substância ativa poderá
não invalidar a eficácia da formulação, visto tratar-se de um produto diferente da formulação
convencional, principalmente na dissolução do cetoconazol na formulação e no tamanho da gotícula,
fatores que influenciam os resultados da cedência e da permeação.
A formulação final, formulação emul 9 gel com 0,13 % cetoconazol, e respetivo placebo
apresentaram cor branca opaca, aspeto homogéneo e tamanho de gotícula na ordem dos 90 µm. A
gelificação da formulação final levou a algumas alterações na formulação, isto porque as formulações
no estado líquido apresentaram cor esbranquiçada translúcida, não opaca e tamanho de gotícula na
ordem dos 360 nm.
Como mencionado anteriormente, as microemulsões líquidas são transparentes e apresentam
tamanho de gotícula inferior a 100-200 nm. Os resultados obtidos da formulação final no estado líquido
não permitiram obter uma microemulsão. O tensioativo utilizado na formulação aparentemente não foi
suficiente para originar uma microemulsão. Possivelmente, uma mistura de tensioativos, adição de um
52
co-tencioativo à formulação, poderia obter uma formulação transparente e consequentemente redução
do tamanho de gotícula suficiente para estar na gama de tamanho de gotículas das microemulsões.
Isto porque, muitos tensioativos não são capazes de reduzir suficientemente a tensão interfacial entre
as duas fases, o que origina tamanhos de gotículas maiores e consequentemente sistemas
opacos/translúcidos. O mesmo não acontece quando há a adição de um co-tensioativo à formulação,
porque a mistura de tensioativos é mais eficiente na redução da tensão interfacial entre óleo-água,
proporcionando a redução máxima do tamanho de gotícula da fase dispersa, levando assim à formação
de sistemas opticamente transparentes [36].
A formulação final líquida não é uma microemulsão mas sim uma nanoemulsão, porque este tipo
de formulações podem ser transparentes/translúcidas ou leitosas, dependendo do tamanho de gotícula.
Outro indício que afirma esta possível conclusão é o processo de fabrico, isto porque a formulação final
foi sujeita a energia mecânica para a sua formação, no caso das microemulsões normalmente a
emulsificação é designada espontânea, no entanto, nas nanoemulsões é necessário energia de entrada
para a sua formação.
O ensaio de cedência in vitro permitiu avaliar a capacidade que o fármaco possui para se libertar
do veículo. Na Figura 19, está representado o perfil de cedência da formulação emul 9 gel e do creme
comercial. Tratam-se de veículos com características e teores de substância ativa diferentes. Verificouse que em ambos os veículos a quantidade de fármaco libertado não atingiu metade da quantidade
inicial introduzida na fase dadora. Também se verificou, que a formulação emul 9 gel libertou uma maior
percentagem de cetoconazol. Pode-se concluir que este veículo é melhor para a cedência de
cetoconazol quando comparado com o creme comercial. Este resultado pode estar relacionado com a
presença de um promotor cutâneo (etoxidiglicol) na formulação e também ao facto da substância ativa
estar dissolvida na formulação, e não suspensa como acontece com o creme convencional. O
etoxidiglicol para além de solubilizar o fármaco é também descrito como um promotor cutâneo [81],
[82].
O modelo de Higuchi descreve estatisticamente melhor o mecanismo de libertação do fármaco,
uma vez que apresentou o melhor valor de R2. A análise estatística (ANOVA) indica que existem
diferenças significativas entre as duas formulações, o que está de acordo com o delineamento do
estudo de desenvolvimento.
O estudo de permeação permite adquirir conhecimento sobre o comportamento do fármaco quando
aplicado no órgão onde é desejada a sua ação, a pele. Pela análise da Figura 12, observou-se que a
quantidade de fármaco permeada ao longo do tempo foi muito reduzida, 0,20 % de fármaco, apesar da
quantidade inicial de cada formulação ser bastante diferente. Este resultado indica que a pele é uma
barreira muito difícil de permear pois a presença do promotor cutâneo, o menor tamanho da gotícula e
a dissolução do fármaco não foram suficientes para ultrapassar a pele. A formulação emul 9 gel permitiu
obter os mesmos resultados que o creme comercial. A partir da Tabela 32, verifica-se que a formulação
inovadora apresenta menor fluxo que o creme comercial, o que indica que o cetoconazol na formulação
emul 9 gel tem maior dificuldade em permear o EC. Os resultados obtidos para o lag time indicam qual
a formulação onde o cetoconazol demorou mais tempo a ser detetado na fase recetora das células de
53
Franz, o que poderá significar que o fármaco fica retido durante mais tempo no EC. Neste caso, foi a
formulação emul 9 gel que obteve maior valor de lag time, permitindo uma ação mais duradora para as
infeções superficiais da pele.
O estudo da retenção de cetoconazol na pele teve por objetivo verificar em que camada a
deposição de cetoconazol era mais acentuada, se no EC ou nas camadas viáveis da pele (epiderme e
derme), sendo neste caso a retenção ideal no EC. Através da figura da percentagem de cetoconazol
permeado, Figura 21 - direita, verificou-se entre as duas formulações estudadas, formulação emul 9 gel
e creme comercial, que foi a formulação inovadora que apresentou maior percentagem de fármaco
retido no EC e nas camadas viáveis da pele, sendo a camada mais superficial da pele a que apresentou
maior retenção de fármaco. No entanto, as formulações estudadas são muito distintas no teor em
cetoconazol. Analisando a Figura 21 - esquerda, observa-se que em ambas as formulações a retenção
de cetoconazol foi mais acentuada no EC. Porém, foi a formulação emul 9 gel que apresentou menor
quantidade de fármaco retido nas camadas da pele estudadas. Apesar disso, a diferença não é
significativa, isto é, difere em 2 µg/ml no EC e 0,74 µg/ml nas camadas viáveis da pele em relação ao
creme comercial. Assim, apesar da grande diferença no teor de cetoconazol nas formulações a ação
das duas formulações foi muito semelhante, mostrando capacidades promissoras na formulação emul
9 gel.
3.2. Lipossomas
A segunda formulação inovadora escolhida foram os lipossomas convencionais. Normalmente o
processo de fabrico destes sistemas é muito complexo para aplicação numa indústria farmacêutica. No
entanto, foi utilizado um produto ao qual apenas é necessário adicionar a substância ativa e a água, e
com agitação são obtidos os lipossomas. Com estes lipossomas instantâneos a sua expansão para
uma linha de produção é mais acessível e menos dispendiosa que os processos convencionais para
obtenção destas vesículas.
3.2.1. Matérias-primas
As matérias-primas utilizadas para a execução da formulação com lipossomas estão indicadas na
Tabela 33.
54
Tabela 33 - Características gerais das matérias-primas utilizadas no desenvolvimento galénico das
formulações lipossomais [55], [83], [84].
Matéria-prima
Cetoconazol
INCI name
Ketoconazole
Função
Antifúngico
Propanediol e
Lecitina
Propanediol (and) Lecithin
Fosfolípido constituinte das
bicamadas
Lecitina e
Glicerina e Álcool
Lecithin (and) Glycerin (and) Alcohol
Fosfolípido constituinte das
bicamadas
Propilenoglicol
Etoxidiglicol
1,2-Propanediol
Ethoxydiglycol
Solvente
Solvente
3.2.2. Equipamentos utilizados para a preparação da formulação
Os equipamentos utilizados para a preparação da formulação e ensaios são:
-
Balanças Analíticas: modelo AE260 Delta Range® - Mettler Tolero®; modelo PB303 Delta
Range® - Mettler Toledo®;
-
Banho de Ultra-sons: modelo Bransonic® Ultrasonic cleaner B-5200 E1-Sotel;
-
Placa de agitação magnética: Variomag Telesystem, Thermo scientific;
-
Homogeneizador: Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach,Germany: Haste:
Hélice anelar
[85];
3.2.3. Métodos
Dissolução do cetoconazol
Pesou-se 0,1 g de cetoconazol para um gobelé. De seguida, foram medidos 2,0 ml de solvente, em
pipeta volumétrica, e foram adicionados ao gobelé que continha a substância ativa. Misturaram-se as
matérias-primas numa placa de agitação com o auxílio de um magnete, até à sua homogeneização.
Registaram-se os resultados obtidos.
Doseamento da substância ativa
Método descrito na alínea 3.1.3- Métodos (Emulsões)
Eficiência de Incorporação (EI)
Para determinar a quantidade de cetoconazol incorporado nos lipossomas foi necessário recorrer
à ultra-centrifugação. Num tubo apropriado foi adicionado 1 g de formulação e o restante volume foi
preenchido com água. Os tubos foram centrifugados, numa ultra-centrifuga (Optima XL90, Beckman),
a 180 000 xg durante 2 horas, à temperatura de 15°C. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido
e o precipitado foi ressuspenso em água. A quantificação do fármaco foi realizada após extração do
55
mesmo com metanol sob agitação vigorosa. O método de deteção utilizado foi a espectrofotometria UV
(U-2001 spectrophotometer, Hitachi) a 242,6 nm. As amostras foram analisados em duplicado.
Distribuição do tamanho de partícula
Método descrito na alínea 3.1.3- Método- Distribuição do tamanho de gotícula (Emulsões)
TEM - Microscópio Eletrónico de Transmissão
Análise de morfologia dos lipossomas foi feita por microscopia electrónica de transmissão (TEM)
Resumidamente, a amostra foi aplicada à grelha de cobre e seca à temperatura ambiente (25 ± 2°C) e
analisada no equipamento Hitachi 8100 acoplado a um detetor EDS Thermo Noran no Instituto Superior
Técnico (IST).
Determinação do pH
Método descrito no capítulo 2 - Reformulações
Avaliação in vitro da permeação de cetoconazol
Método descrito no capítulo 2 - Reformulações
Avaliação in vitro da retenção de cetoconazol na pele
Método descrito na alínea 3.1.3- Métodos (Emulsões)
Análise estatística
Método descrito no capítulo 2 - Reformulações
3.2.4. Desenvolvimento galénico - Ensaios preliminares
O principal objetivo no desenvolvimento galénico foi formular o cetoconazol de modo a solubilizálo e evitar a degradação. Os lipossomas surgem como uma alternativa às formulações anteriores com
vista a atingir estes dois objetivos. Neste estudo utilizaram-se matérias-primas que levam à formação
instantânea do lipossoma mal se adicione água (Figura 22). Assim, em termos industriais, este
processo de preparação representa uma mais-valia, uma vez que o processo é facilmente transponível
(Figura 23). Não há, portanto, a necessidade de construir uma linha de produção com equipamentos
específicos para a produção de lipossomas convencionais que por norma é dispendiosa [83], [84].
56
Figura 22 - Esquema representativo da
formação dos lipossomas instantâneos [84].
Figura 23 - Representação do processo de fabrico de lipossomas instantâneos para
substâncias ativas hidrossolúveis e lipossolúveis [84].
As matérias-primas utilizadas foram o P + L (Propanediol e Lecitina) e o L + G + A (Lecitina e
Glicerina e Álcool).
A concentração recomendada pelo fabricante de P + L, para a formação dos lipossomas, recai no
intervalo de 0,1 – 3,0 % [83]. Tendo por base este intervalo, iniciou-se este estudo formulando um
placebo (formulação lipo 1) com a concentração média recomendada de fosfolípido, 1,5 %, sendo a
restante formulação constituída por água destilada (98,5 %). O processo de fabrico utilizado para a
produção da formulação teve por base o recomendado pelo fabricante. O placebo (formulação lipo 1)
foi formado de acordo com o processo da Figura 24.
57
Processo de Fabrico (Formulação lipo 1)
Água purificada
Adicionou-se lentamente num
homogeneizador Heidolph,
entre 800-1000 rpm
P+L
Homogeneizou-se durante 20
minutos, à mesma velocidade.
Lipossoma
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 24 - Processo de Fabrico do placebo (formulação lipo 1).
Esta primeira experiência permitiu a obtenção de vesículas com tamanho de partícula de 289,5 ±
3,4 nm e PdI: 0,3 ± 0,0; (média ± DP, n=3) e em termos de características organoléticas a formulação
apresentou aspeto homogéneo e cor amarela.
Sendo o objetivo incorporar 2 g de cetoconazol nos lipossomas optou-se por utilizar a concentração
máxima de fosfolípidos (3 %) para as formulações seguintes. A substância ativa apresenta-se no estado
sólido, na forma de pó e é recomendado pelo fabricante que quando assim é, a substância ativa seja
introduzida no processo de fabrico na forma líquida. Assim sendo, misturou-se o cetoconazol com
propanediol. A escolha deste excipiente recaiu na constituição do produto de preparação de
lipossomas, uma vez que este excipiente compõe o P + L e a utilização deste poderia ajudar na
incorporação da substância ativa no lipossoma. Procedeu-se então à formulação de 2 preparações com
base no que foi referido anteriormente, Tabela 34. O procedimento de fabrico encontra-se na Figura
25.
Tabela 34 - Composição da formulação lipo 2 e 3 (%, m/m).
Matérias-primas
P+L
Cetoconazol
Propanediol
Água Purificada
Formulação lipo 2
(%, m/m)
3
2
2
93
Formulação lipo 3
(%, m/m)
3
2
--95
58
Processo de Fabrico (Formulação lipo 2)
Cetoconazol
+
Propanediol
Água
Purificada
P+L
Homogeneizou-se
(homogeneizador
Heidolph) a 800-1000 rpm
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
Cetoconazol + Propanediol
+
(P + L)
Homogeneizou-se
durante 20 minutos, à
mesma velocidade.
Lipossomas
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Processo de Fabrico (Formulação lipo 3)
Água
Purificada
Cetoconazol + (P + L)
Homogeneizou-se
(homogeneizador
Heidolph) a 800-1000 rpm
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
Cetoconazol + (P + L) + Água Purificada
Homogeneizou-se durante 20
minutos, à mesma velocidade.
Lipossomas
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 25 - Processo de produção da formulação lipo 2 e 3.
Em termos de características organoléticas, a formulação lipo 2 e 3 apresentaram aspeto
homogéneo e cor amarelo esbranquiçado. Esta cor deveu-se ao cetoconazol adicionado, o que poderá
indicar que a quantidade de cetoconazol incorporado nos lipossomas foi reduzido.
Visualmente é percetível que o cetoconazol não está dissolvido, o que poderá estar interligado com
a quantidade mínima de substância ativa na camada fosfolipídica. Por forma a solucionar a dissolução
do cetoconazol testaram-se vários excipientes, de acordo com o método – Dissolução do cetoconazol
(3.2.3 - Métodos). Os resultados estão descritos na tabela abaixo, Tabela 35.
59
Tabela 35 – Ensaio de dispersão do cetoconazol.
Excipiente
Etanol Absoluto
(Ethyl alcohol)
Isopropanol
(isopropyl alcohol)
Miristato de
isopropilo
(Isopropyl
myristate)
Propilenoglicol
(Propylene glycol)
Polissorbato 80
(Polysorbate 80)
Polissorbato 20
(Polysorbate 20)
Hexilenoglicol
(Hexylene glycol)
Triglicerídeos
ácido
caprílico/cáprico
(Caprylic/Capric
Triglyceride)
Tegosoft® TN
(C12-15 Alkyl
benzoate)
Características da Mistura
Aspeto
Outras
Cor
---
Não homogéneo
Ocorreu sedimentação.
Branca
Não homogéneo,
opaco
Ocorreu sedimentação.
Branca
Não homogéneo,
opaco
Ocorreu sedimentação de uma pequena
parte de cetoconazol
Branca
Amarelo
claro
Amarelo
Branca
Não homogéneo,
opaco
Homogéneo,
opaco
Homogéneo,
opaco
Homogéneo,
opaco
Ocorreu mínima sedimentação.
-------
Branca
Homogéneo,
opaco
---
Branca
Homogéneo,
opaco
---
Etoxidiglicol
(Ethoxydiglycol)
Branca
Homogéneo,
opaco*
Tegosoft® XC
(Phenoxyethyl
caprylate)
Branca
Homogéneo,
opaco
*Em relação aos outros excipientes
utilizados notou-se uma ligeira
diferença, isto é visualmente era
menos opaco.
---
De todos os excipientes estudados o que se destacou foi o etoxidiglicol, como é evidenciado pela
Tabela 35. Por forma a tentar dissolver mais esta substância ativa, foram adicionados mais 2 ml de
etoxidiglicol, tendo-se obtido uma mistura transparente e homogénea. Assim, 80 ml de etoxidiglicol são
necessários para dissolver 2 g de cetoconazol. Tendo em conta que 4 ml deste excipiente corresponde
a 3,8528 g serão necessários 77 g de etoxidiglicol em 100 g de formulação.
Com base no que foi mencionado prepararam-se as formulações indicadas na Tabela 36, de acordo
com o processo de fabrico da Figura 26.
Tabela 36 - Constituição da formulação lipo 4 e 5 (%, m/m).
Matérias-primas
P+L
Cetoconazol
Etoxidiglicol
Água Purificada
Formulação lipo 4 (%,
m/m)
3
2
88
7
Formulação lipo 5 (%,
m/m)
10
2
68
20
60
Processo de Fabrico (Formulação lipo 4, 5, 6, 7 e 9)
Cetoconazol
+
Etoxidiglicol
Água
Purificada
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se (Placa de
agitação) a 800-1000 rpm.
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
Cetoconazol + Etoxidiglicol
+
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se
durante 20 minutos, à
mesma velocidade.
Lipossomas
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 26 - Processo de fabrico utilizado para a formulação lipo 4, 5, 6, 7 e 9.
Processo de Fabrico (Formulação lipo 9(a) e 10)
Cetoconazol
+
Etoxidiglicol
Água
Purificada
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se
(Homogeneizador Heidolph)
a 800-1000 rpm.
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
Cetoconazol + Etoxidiglicol
+
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se
durante 20 minutos, à
mesma velocidade.
Lipossomas
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 27 - Processo de fabrico usado nas formulações lipo 9(a) e 10.
As concentrações de P + L e água purificada foram adicionadas de acordo com bibliografia do
fabricante [86], [84].
61
A formulação lipo 4 apresentou características organoléticas aceitáveis, ou seja, cor amarelo claro,
aspeto translúcido e homogéneo. O mesmo não sucedeu com a formulação lipo 5, onde surgiram
pequenas partículas em suspensão, aparentemente “precipitado” de fosfolípido. É possível observar
estas características na Figura 28.
Para verificar qual o melhor fosfolípido comercial, reformularam-se as mesmas formulações com L
+ G + A (formulação lipo 6 e 7). O excipiente novo apresenta na sua constituição maior quantidade de
lípidos em comparação com o P + L, o que poderia proporcionar maior incorporação de cetoconazol
nos lipossomas. Os resultados obtidos da formulação lipo 6 e 7 foram os mesmos da formulação lipo 4
e 5, como apresentado na Figura 28.
Formulação
lipo 4
Formulação
lipo 5
Formulação
lipo 6
Formulação
lipo 7
Figura 28 - Fotografia das quatro formulações lipo 4, 5, 6 e 7.
Por forma a estreitar o caminho a seguir, quantificou-se a substância ativa nos lipossomas (Tabela
37) e o tamanho de partícula (Tabela 38) das formulações onde se obtiveram os resultados pretendidos,
ou seja, nas formulações lipo 4 e 6.
Tabela 37 - Eficiência de Incorporação (EI) de cetoconazol nas formulações lipo 4 e 6.
EI (µg/ml)
EI (%)
Formulação lipo 4
(P + L)
15,3
14,3
Formulação lipo 6
(L + G + A)
36,6
35,6
Tabela 38 - Tamanho de partícula das formulações lipo 4 e 6 (média ± DP, n=3).
Tamanho de Partícula
(nm)
PdI
Formulação lipo 4
(P + L)
Formulação lipo 6
(L + G + A)
118,5 ± 2,5
112,9 ± 1,8
0,2 ± 0,0
0,2 ± 0,0
62
Intensidade (%)
15
10
5
0
1
10
100
1000
Tamanho ( d. nm)
Formulação lipo 4
10000
Formulação lipo 6
Figura 29 - Representação gráfica da distribuição do tamanho das
partículas das formulações lipo 4 e 6, n=3.
Através da Tabela 37 é percetível que a formulação lipo 6 apresentou maior quantidade de
cetoconazol incorporado nos lipossomas. No entanto, estes resultados não são significativos devido à
falta de reprodutibilidade das amostras. Em relação ao tamanho de partícula, as duas formulações
apresentam um tamanho muito semelhante, como demonstrado pela Tabela 38 e Figura 29. Com base
nestes resultados, as formulações com que se prosseguiram os estudos foram as que incluíram na sua
composição o L + G + A.
De modo a aumentar a incorporação de cetoconazol nos lipossomas, testaram-se outras
formulações onde se aumentou a quantidade de L + G + A acima de 3 g. Nestas circunstâncias ocorreu
sempre “precipitação” do fosfolípido. Também se experimentou outra indicação pelo fabricante, onde a
incorporação de 2 % de substância ativa correspondia à utilização de 8-10 % de L + G + A e 10-12 %
de água purificada. Nestas condições obteve-se, igualmente, “precipitado” de fosfolípido [84]. Pensouse ainda que o modo de agitação poderia estar a influenciar a formação dos lipossomas, isto porque o
fabricante utiliza para fazer as suas formulações um homogeneizador do género do homogeneizador
Heidolph com uma haste hélice anelar e não uma placa de agitação. Assim, prepararam-se algumas
formulações com o homogeneizador Heidolph, como foi o caso da formulação representada na tabela
abaixo (Tabela 39).
Tabela 39 - Constituição da formulação lipo 8 e 8.1 (%, m/m).
Matérias-primas
L+G+A
Cetoconazol
Etoxidiglicol
Água Purificada para
formação lipossomas
q.b. de Água Purificada
Placa de Agitação
(Figura 30)
Formulação lipo 8 (%,
m/m)
8
2
77
Homogeneizador
Heidolph (Figura 31)
Formulação lipo 8.1 (%,
m/m)
8
2
77
10
10
3
3
63
Processo de Fabrico (Formulação lipo 8, 9.1 e 9.2)
Cetoconazol
+
Etoxidiglicol
Água
Purificada
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se (Placa de
agitação) a 800-1000 rpm
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
q.b. de Água
Purificada
Cetoconazol + Etoxidiglicol
+
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se
durante 20 minutos, à
mesma velocidade.
Lipossomas
Adicionou-se de uma só
Homogeneizou-se com
vez a água aos
uma vareta de vidro.
lipossomas.
Formulação completa
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 30 - Processo de fabrico utilizado nas formulações lipo 8, 9.1 e 9.2.
Processo de Fabrico (Formulação lipo 8.1, 9.1.1, 9.2.1, 10.1, 10.2 e 11)
Cetoconazol
+
Etoxidiglicol
Água
Purificada
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se
(Homogeneizador Heidolph)
a 800-1000 rpm.
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
q.b. de Água
Purificada
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Cetoconazol + Etoxidiglicol
+
(P + L) / (L + G + A)
Homogeneizou-se
durante 20 minutos, à
mesma velocidade.
Lipossomas
Adicionou-se de uma só
Homogeneizou-se com
vez a água aos
uma vareta de vidro.
lipossomas.
Formulação completa
Figura 31 - Processo de fabrico usado nas formulações lipo 8.1, 9.1.1, 9.2.1, 10.1, 10.2 e 11.
64
A formulação lipo 8.1, apresentou exatamente as mesmas características que a formulação
produzida na placa de agitação, ou seja, ocorreu o “precipitado” do fosfolípido, ficando assim
demonstrado que a forma de agitação não influência a formação das preparações.
O objetivo principal, mencionado anteriormente, é a incorporação do cetoconazol nos lipossomas
para prevenir a sua degradação. Como foi observável não foi viável a incorporação de 2,0 % de
substância ativa nas formulações. Partindo destes resultados, resolveu-se incorporar apenas 0,5 – 1,0
% de cetoconazol, tendo por base a formulação mais promissora, a formulação lipo 6.
Inicialmente reduziu-se a quantidade de etoxidiglicol de acordo com a quantidade de cetoconazol
adicionado na formulação, como indicado na Tabela 40. O processo de fabrico para a formulação lipo
9 encontra-se na Figura 26 e para as outras duas formulações na Figura 30.
Tabela 40 - Composição da formulação lipo 9, 9.1 e 9.2 (%, m/m).
Matérias-primas
L+G+A
Cetoconazol
Etoxidiglicol
Água Purificada para
formação lipossomas
q.b. de Água Purificada
Formulação lipo 9
(%, m/m)
3,0
2,0
88,0
Formulação lipo 9.1
(%, m/m)
3,0
1,0
44,0
Formulação lipo 9.2
(%, m/m)
3,0
0,5
22,0
7,0
7,0
7,0
---
45,0
67,5
Os resultados obtidos não foram ao encontro do esperado, porque ocorreu a “precipitação” do
fosfolípido nas formulações que apresentavam menor quantidade de etoxidiglicol, formulação lipo 9.1
e 9.2. Assim optou-se por manter a quantidade de etoxidiglicol e apenas diminuir a concentração de
cetoconazol, como indicado pela Tabela 41. O processo de fabrico para a formulação lipo 9 (a)
encontra-se na Figura 27 e para as outras duas formulações na Figura 31.
Tabela 41 - Constituição das formulações lipo 9(a), 9.1.1 e 9.2.1 (%, m/m).
Matérias-primas
L+G+A
Cetoconazol
Etoxidiglicol
Água Purificada para
formação lipossomas
q.b. de Água
Purificada
Formulação lipo
9(a) (%, m/m)
3,0
2,0
88,0
Formulação lipo
9.1.1 (%, m/m)
3,0
1,0
88,0
Formulação lipo
9.2.1 (%, m/m)
3,0
0,5
88,0
7,0
7,0
7,0
---
1,0
1,5
Ao manter a concentração de etoxidiglicol os resultados obtidos foram os esperados, isto é, ambas
as formulações (9.1.1 e 9.2.1) apresentaram cor amarela, aspeto homogéneo e líquido translúcido. Em
termos de eficiência de incorporação de substância ativa e de tamanho de partícula, os resultados
encontram-se ilustrados na Tabela 42 e na Figura 32.
65
Tabela 42 - Eficiência de incorporação (EI) e tamanho de partícula das formulações lipo 9(a), 9.1.1 e
9.2.1 (média ± DP, n=3).
Intensidade (%)
Formulação lipo 9(a)
Formulação lipo 9.1.1
Formulação lipo 9.2.1
EI (µg/ml)
3,5 ± 1,3
5,5 ± 0,9
5,2 ± 1,0
EI (%)
3,4 ± 1,2
10,2 ± 1,7
20,9 ± 1,7
Tamanho de Partícula (nm)
145,6 ± 0,8
160,9 ± 2,0
210,8 ± 3,1
PdI
0,4 ± 0,1
0,2 ± 0,0
0,2 ± 0,0
15
10
5
0
1
10
100
Tamanho (nm)
Formulação lipo 9(a)
Formulação lipo 9.1.1
1000
10000
Formulação lipo 9.2.1
Figura 32 - Representação gráfica do tamanho de partícula das formulações lipo
representadas na Tabela 41, n=3.
A concentração de cetoconazol máxima incorporada nos lipossomas das formulações
representadas na Tabela 41 é muito baixa, aproximadamente 5,5 µg/ml. É evidente que este fosfolípido
não é apropriado para incorporar nem metade da substância ativa pretendida. Em termos de tamanho
de partícula, verificou-se um aumento do tamanho à medida que existe maior quantidade de água na
formulação (Tabela 42), apesar da quantidade de água purificada ser adicionada após a formação dos
lipossomas aparentemente existe uma influência no tamanho de partícula das vesículas lipídicas.
Comparando a eficiência de incorporação da formulação lipo 6 (36,6 µg/ml) com a formulação lipo
9(a), sendo a mesma formulação, observa-se uma grande disparidade dos resultados com os obtidos
para a formulação lipo 6, facto que poderá estar relacionado com a eficácia de separação por ultracentrifugação do cetoconazol não incorporado. Foram preparadas novamente as formulações
ilustradas na Tabela 41, mas com o fosfolípido P + L (Tabela 43). O processo de fabrico para a
formulação lipo 10 encontra-se na Figura 27 e para as outras duas formulações na Figura 31.
Tabela 43 - Composição das formulações lipo 10, 10.1 e 10.2 (%, m/m).
Matérias-primas
P+L
Cetoconazol
Etoxidiglicol
Água Purificada para
formação lipossomas
q.b. de Água
Purificada
Formulação lipo 10
(%, m/m)
3,0
2,0
88,0
Formulação lipo 10.1
(%, m/m)
3,0
1,0
88,0
Formulação lipo 10.2
(%, m/m)
3,0
0,5
88,0
7,0
7,0
7,0
---
1,0
1,5
66
A eficiência de incorporação das formulações da Tabela 43 encontram-se na tabela abaixo (Tabela
44).
Tabela 44 - Eficiência de Incorporação (EI) da formulação lipo 10, 10.1 e 10.2 (média ± DP, n=3).
EI (µg/ml)
EI (%)
Formulação lipo 10
0,7 ± 0,1
0,7 ± 0,1
Formulação lipo 10.1
1,0 ± 0,2
1,8 ± 0,3
Formulação lipo 10.2
0,6 ± 0,0
2,4 ± 0,1
A concentração máxima de cetoconazol incorporado nos lipossomas com P + L, apresentada na
Tabela 44, é de 1,0 µg/ml, aproximadamente menos 4,0 µg/ml de cetoconazol incorporado nos
lipossomas constituídos pelo L + G + A (Tabela 42). Assim, as formulações de L + G + A continuam a
ser as mais promissoras.
Foi mencionado anteriormente que a concentração de cetoconazol incorporado nas vesículas
lipídicas foi muito baixo, no máximo de 5,5 µg/ml. Com estes resultados, o passo seguinte foi elaborar
uma formulação com a quantidade máxima que os lipossomas conseguiram incorporar de substância
ativa, 5,5 µg/ml, apesar de não ser a quantidade pretendida. Assim, preparou-se a formulação cuja
composição está presente na Tabela 45. Para além desta formulação foi também preparado o placebo
(Tabela 45). A formulação lipo 11 foi preparada de acordo com o processo de fabrico mencionado na
Figura 31 e o placebo de acordo com o processo de fabrico representado na Figura 33.
Tabela 45 - Constituição da formulação lipo 11 e respetivo placebo (%, m/m).
Matérias-primas
L+G+A
Cetoconazol
Etoxidiglicol
Água Purificada para formação
lipossomas
q.b. de Água Purificada
Formulação lipo 11
(%, m/m)
3,000
0,094
88,000
Placebo Formulação lipo 11
(%, m/m)
3,000
--88,000
7,000
7,000
1,906
2,000
67
Processo de Fabrico (Formulação 12)
Etoxidiglicol
L+G+A
Homogeneizou-se
(Homogeneizador Heidolph)
a 800-1000 rpm.
Água
Purificada
Etoxidiglicol + (L + G + A)
Adicionou-se lentamente
e homogeneizou-se à
mesma velocidade.
q.b. de Água
Purificada
Homogeneizou-se
durante 20 minutos, à
mesma velocidade.
Lipossomas
Adicionou-se de uma só
vez a água aos
lipossomas.
Homogeneizou-se com
uma vareta de vidro.
Formulação completa
Temperatura Ambiente (25 ± 2°C)
Figura 33 - Processo de fabrico do placebo da formulação lipo 11.
Em termos de características organoléticas, a formulação lipo 11 apresentou cor amarela, aspeto
translúcido e homogéneo. Relativamente à eficiência de incorporação, estes lipossomas continham
aproximadamente 72 % de cetoconazol, como indicado na Tabela 46. Apesar de a quantidade
incorporada não ser a desejada inicialmente (2 g de cetoconazol em 100 g), conseguiu-se uma
percentagem suficientemente promissora da concentração máxima de cetoconazol (5,5 µg/ml) nos
lipossomas. Além do mencionado, esta pequena concentração de cetoconazol nos lipossomas poderá
não invalidar a sua eficácia aquando da sua aplicação, uma vez que se trata de uma forma inovadora
de libertação controlada.
O tamanho de partícula (Tabela 46 e Figura 34) tanto da formulação com substância ativa
(formulação lipo 11) como do placebo apresentaram praticamente o mesmo tamanho de lipossomas, e
como têm um pouco mais de água na sua constituição, que as formulações apresentadas na Tabela
42, o tamanho é ligeiramente maior que o da formulação lipo 9.2.1.
Tabela 46 – A Eficiência de Incorporação (EI) e o tamanho de partícula da formulação lipo 11 e
respetivo placebo (média ± DP, n=3).
Formulação lipo 11
Placebo Formulação lipo 11
EI (µg/ml)
EI (%)
3,6 ± 0,0
---
72,4 ± 0,9
---
Tamanho de Partícula
(nm)
213,4 ± 2,6
215,5 ± 0,6
PdI
0,2 ± 0,0
0,2 ± 0,0
68
Intensidade (%)
15
10
5
0
1
10
100
Tamanho (nm)
Placebo Formulação lipo 11
1000
10000
Formulação lipo 11
Figura 34 - Representação gráfica da formulação lipo 11 e respetivo
placebo, n=3.
Formulação Final
De acordo com os resultados anteriores a formulação final selecionada foi a formulação lipo 11 com
0,094 % de cetoconazol. A formulação foi posteriormente caracterizada.
Características físicas e químicas:
Características organoléticas
A formulação final e respetivo placebo apresentam cor amarela e aspeto homogéneo, para além
destas características a formulação também é translúcida, como se observa na pela Figura 35.
Formulação lipo 11
Placebo
Figura 35 - Imagem da formulação lipo 11 e respetivo
placebo.
Tamanho de partícula
O tamanho de partícula da formulação final e respetivo placebo foi analisado no equipamento Zeta
sizer por difração laser, como mencionado aquando da descrição do método. Para a formulação com
substância ativa obteve-se um tamanho de partícula de 213 ± 3 nm e para o placebo de 216 ± 1 nm,
como ilustrado na Tabela 46 e Figura 34.
TEM - Microscópio Eletrónico de Transmissão
A formulação final com fármaco e respetivo placebo foram analisadas no equipamento TEM, com
o propósito de obter uma imagem dos lipossomas preparados. O resultado está expresso na Figura 36
e Figura 37.
69
A
B
Figura 36 - Ilustração da morfologia dos lipossomas. A: Formulação lipo
11 com 0,094 % cetoconazol. B: Formulação placebo.
Figura 37 - Morfologia dos lipossomas
da formulação placebo.
Os lipossomas apresentam aspeto multilamelar e tamanho não homogéneo. O tamanho de
partícula obtido através deste equipamento e através de espectroscopia de correlação fotónica
(Zetasizer) não foi coincidente. Através da microscopia TEM, aparentemente, os lipossomas exibem
tamanho inferior a 100 nm. Não se observaram diferenças relativamente ao tamanho dos lipossomas
com e sem fármaco e foram observados nas duas formulações resíduos que aparentam ser
fosfolípidos.
Doseamento da substância ativa e determinação do pH
O doseamento de cetoconazol da formulação lipo 11 foi analisado pelo método de HPLC, onde se
quantificaram triplicados da formulação. Com um elétrodo de pH determinou-se o pH da formulação
final e respetivo placebo. Os resultados estão representados na Tabela 47.
Tabela 47 - Resultado do doseamento de cetoconazol e do pH da formulação lipo 11 e respetivo
placebo (média ± DP, n=3).
Formulação lipo 11
Placebo Formulação lipo 11
Recuperação (%)
89,60 ± 1,10
---
pH
5,97
5,75
70
Eficiência de Incorporação (EI)
A quantidade de cetoconazol incorporada nos lipossomas na formulação lipo 11 preparada com
0,094 % cetoconazol, foi analisada pelo método de HPLC, em triplicado. O resultado foi de 72,4 ± 0,9
%, como representado na Tabela 46, dos 0,094 % iniciais de cetoconazol.
Avaliação in vitro da permeação de cetoconazol
O ensaio foi realizado em células de Franz de 1 cm 2, onde se utilizou como membrana pele porco
recém-nascido para separar a fase dadora da recetora. Foram testados a formulação lipo 11 e o creme
comercial, cada um em n=6 vezes. Os resultados da permeação do fármaco da formulação em estudo
0,30
a
0,25
0,20
0,15
Jkjm
0,10
0,05
0,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (h)
Cetoconazol permeado (%)
Cetoconazol permeado (%)
e do creme comercial estão representados na Figura 38 e Figura 39.
0,30
b
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Formulação lipo 11 com 0,094 % cetoconazol
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (h)
Creme comercial com 2 % cetoconazol
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
a
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (h)
Formulação lipo 11 com 0,094 % cetoconazol
Quantidade cetoconazol
permeada (µg/cm2)
Quantidade cetoconazol
permeada (µg/cm2)
Figura 38 - Permeação da pele in vitro de cetoconazol da formulação lipo 11 (a) e creme
comercial (b) em percentagem de cetoconazol (média ± DP, n=6).
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
b
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (h)
Creme comercial com 2 % cetoconazol
Figura 39 - Permeação da pele in vitro de cetoconazol da formulação lipo 11 (a) e creme
comercial (b) em quantidade de cetoconazol (média ± DP, n=6).
71
Tabela 48 - Parâmetros da permeação cutânea da formulação lipo 11 e do creme comercial (média ±
DP, n=6).
Formulação lipo 11 com
0,094 % cetoconazol
Creme comercial com 2 %
cetoconazol
Fluxo (µg/cm2/h)
Kp (cm/h)
Lag time
0,002 ± 0,004
2,5x10-6 ± 4,4x10-6
4,750 ± 0,010
0,570 ± 0,180
2,9x10-5 ± 8,9 x10-6
1,550 ± 0,710
Após 24 horas, obtiveram-se valores de 0,02 ± 0,03 % cetoconazol para a formulação lipo 11 e
0,19 ± 0,07 % de cetoconazol para o creme comercial.
A partir da análise estatística ANOVA, verificou-se que não houve diferenças significativas entre a
formulação final e a formulação de referência (p > 0,05).
Avaliação in vitro da retenção de cetoconazol na pele
A pele que foi utilizada no ensaio de permeação, ensaio anterior, foi utilizada para determinar a
quantidade de fármaco existente no EC e nas camadas viáveis da pele (epiderme e derme). Os
resultados deste ensaio encontram-se ilustrados na Figura 40.
1,8
Formulação lipo 11 com
0,094 % de cetoconazol
10
8
Creme comercial com 2 %
cetoconazol
6
4
2
1,6
Cetoconazol (%)
Quantidade de cetoconazol
(ug/ml)
12
1,4
1,2
Formulação lipo 11 com
0,094 % de cetoconazol
Creme comercial com 2 %
cetoconazol
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,0
EC
Camadas viáveis da pele
EC
Camadas viáveis da pele
Figura 40 - Quantidade (esquerda) e percentagem (direita) retida de cetoconazol na EC e
camadas viáveis da pele da formulação lipo 11 e creme comercial (média ± DP, n=3).
Os valores de fármaco para a formulação lipo 11 para o EC foi de 0,36 ± 0,11 % e de 0,96 ± 0,62
% para as camadas viáveis da pele. No caso do creme comercial, obteve-se 0,10 ± 0,03 % para o EC
e 0,04 ± 0,01 % para as camadas viáveis da pele de cetoconazol.
72
3.2.5. Discussão dos Resultados
O tratamento tópico com cetoconazol é uma escolha atrativa para as infeções fúngicas da pele
devido a vantagens como efeito localizado e redução de efeitos secundários sistémicos pelo fármaco.
Porém, existem algumas limitações por parte da substância ativa devido à sua baixa solubilidade em
água e irritação da pele, sendo possível ultrapassar estas limitações desenvolvendo sistemas
vesiculares lipídicos [52].
A formulação final com 0,094 % de cetoconazol e respetivo placebo apresentaram características
organoléticas conformes, isto é, cor amarela, aspeto translúcido e homogéneo (Figura 35). Em relação
às características morfológicas, Figura 36, ambas as formulações apresentaram lipossomas do tipo
multilamelar, no entanto, notou-se pequenas diferenças entre eles relativamente ao tamanho. Nas
imagens da Figura 36 também é possível observar, em ambas as formulações, pequenos fragmentos
possivelmente de fosfolípido não transformado. Os lipossomas observados são opacos, daí não ter
sido possível observar nitidamente as bicamadas lipídicas deste tipo de lipossomas. No entanto, os
resultados estão de acordo com o descrito pelo fabricante do produto de preparação de lipossomas,
que indica que são formadas vesículas multilamelares.
Em relação ao tamanho de partícula, obtiveram-se vesículas na ordem dos 200 nm. Este facto não
se confirmou aquando da análise morfológica, que mostrou a presença de lipossomas abaixo dos 100
nm (Figura 37). Porém, a figura que representa a distribuição do tamanho de partícula dos lipossomas
(Figura 34) apresenta para ambas as formulações uma distribuição de tamanho que vai dos 60 nm aos
1000 nm. A probabilidade de ocorrer aumento de volume por parte dos lipossomas aquando da
preparação da amostra para a analisar no Zeta sizer, assim como perda de volume associada à
preparação da amostra para a análise por TEM, poderão ter contribuído para a discrepância entre os
resultados obtidos por técnicas diferentes.
Inicialmente era pretendido obter uma formulação com a quantidade de cetoconazol igual ao
existente no mercado, 20 mg/g, isto é 2 % de substância ativa em 100 g. No entanto, como mencionado
anteriormente este tipo de lipossomas apenas conseguiu incorporar 5,5 µg/ml de cetoconazol. A
formulação final foi formada com o intuito de introduzir a capacidade máxima de substância ativa, onde
se obteve uma EI de aproximadamente 72 % da quantidade inicial, Tabela 46. Gunjan Tiwari (2013)
formulou lipossomas com várias concentrações de cetoconazol, em vesículas com 5 µg/ml obteve
apenas 16,4 % de EI de cetoconazol, menos do que o obtido na formulação lipo 11 com 0,094 %
cetoconazol [87]. Guo, et al (2015) desenvolveram vários tipos de lipossomas com o intuito de
incorporar 3 mg/g de cetoconazol, e concluíram que os lipossomas convencionais foram o veículo onde
a EI foi mais baixa, aproximadamente 50,3 % [52]. Patel, et al. (2009) formularam lipossomas com 2 %
de substância ativa, onde metade da quantidade introduzida foi incorporada nos lipossomas
(aproximadamente 54,4 %) [62]. Os dois últimos autores mostraram que é possível formar lipossomas
convencionais com maior quantidade de fármaco incorporado. A disparidade deste resultado
provavelmente está relacionado com a utilização de fosfolípidos diferentes. No entanto, o processo de
fabrico utilizado para a preparação de lipossomas com L + G + A não é condicionante, ou seja, pode
ser adaptado por qualquer indústria, o que não acontece com o método convencional para a formação
73
destas vesículas. Há que salientar que uma formulação com baixa concentração de fármaco não
implica que a sua ação terapêutica não seja conseguida.
Em termos do estudo da permeação in vitro de cetoconazol em pele de porco recém-nascido,
verificou-se que a percentagem de fármaco permeada após 24 horas foi muito reduzida (Figura 38),
cerca de 0,02 % e 0,20 % para a formulação final e para o creme comercial, respetivamente. Estes
resultados são promissores, uma vez que se pretende a retenção de cetoconazol no EC para originar
ação nos microrganismos depositados nesta camada. Entre as duas formulações a mais promissora,
aparentemente é a formulação com lipossomas, visto ser a que obteve resultados mais baixos de
fármaco permeado através da pele. No entanto, as duas formulações contêm teor de substância ativa
muito distintos. Os parâmetros de permeação destas formulações (Tabela 48) são díspares. Na
formulação inovadora obteve-se um fluxo mais baixo e um lag time maior, o que poderá indicar maior
dificuldade por parte do fármaco em permear o EC, daí maior retenção de cetoconazol nesta camada.
Patel, et al (2009) afirmaram que estes sistemas permitem uma elevada acumulação de fármaco na
pele, com o fluxo de permeação relativamente baixo, comparativamente às formas farmacêuticas
convencionais. Para além disto, os autores associam o fluxo baixo, obtido nos seus resultados, à
libertação prolongada do fármaco, causada pelas diversas bicamadas lipídicas presentes nos
lipossomas multilamelares [61].
Ao analisar os resultados obtidos na retenção do fármaco na camada EC e nas camadas viáveis
da pele, Figura 40, verificou-se que a formulação com lipossomas permitiu deposição de fármaco em
maior quantidade na epiderme e derme e não no EC como pretendido. Estes resultados possivelmente
estão relacionados com o facto de os lipossomas terem tamanho reduzido e conseguirem alcançar as
camadas mais profundas da pele. Outra possibilidade foi o facto do maior constituinte desta formulação
ser o etoxidiglicol e sendo este um promotor cutâneo, a probabilidade do fármaco penetrar mais
profundamente na pele é bastante elevada. A segunda possibilidade apresenta-se como a mais
provável, uma vez que os lipossomas convencionais não penetram profundamente a pele, mas sim
permanecem confinados à camada superior, EC, com uma penetração mínima nos tecidos mais
profundos [52].
74
Capitulo 4 - Eficácia das formulações
Um dos microrganismos que provoca infeções fúngicas superficiais da pele é a Candida albicans.
Para o tratamento deste tipo de infeções é utilizado o antifúngico cetoconazol. Para determinar se as
formulações estudadas, convencionais e inovadoras, são eficazes contra a Candida albicans foi
necessário realizarem-se dois tipos de ensaios: o método Etest® e o método Kirby-Bauer ou método de
difusão em disco, que por norma é utilizado em testes in vitro de determinação da sensibilidade
microbiana (antibiograma).
4.1. Método
O método Kirby-Bauer foi realizado em discos de difusão e também em pele de porco-recém
nascido, obtida num matadouro. Para ambos os métodos, procedeu-se à inoculação da levedura
Candida albicans (ATCC 10231) em meio SDA (Agar Sabouraud Dextrose), anteriormente plaqueado.
No ensaio Etest®, após a inoculação foi adicionada a fita Etest® impregnada com cetoconazol e
procedeu-se à incubação a 37°C durante 24h. Após o tempo de incubação observou-se a concentração
mínima inibitória (CMI) para este microrganismo. Para o método adaptado Kirby-Bauer, adicionou-se
discos de papel (OxoidTM antimicrobial susceptibility test discs,Thermo Scientific, UK) e discos de pele
às placas com o meio de cultura, os dois tipos de discos foram aplicados de forma a não ocorrer
sobreposição de halos de inibição. Os discos de pele foram feitos com um punção de biopsia de 13
mm de diâmetro. Adicionou-se aproximadamente 10 µl e 15 µl de amostra nos discos de papel e de
pele, respetivamente. Após adição da amostra as placas foram incubadas a 37°C durante 24 horas.
Após o tempo de incubação, a eficácia da formulação foi determinada medindo o diâmetro do halo de
inibição, uma vez que o diâmetro da zona de inibição é proporcional à sensibilidade do microrganismo
e à eficácia do antifúngico.
4.2. Resultados
O resultado obtido no Etest® (um dos métodos realizados para a eficácia das formulações) permite
determinar a concentração mínima inibitória do antifúngico em estudo, em C. albicans. O resultado está
expresso na Figura 41.
Figura 41 - CMI obtida através do método Etest®.
75
Verifica-se que a concentração mínima inibitória de cetoconazol em C. albicans é de 0,047 µg/ml
(Figura 41).
Para o método Kirby-Bauer, foram utilizados 3 padrões com concentrações de cetoconazol de 5
µg/ml (P1), 15 µg/ml (P2) e 38 µg/ml (P3). Estes padrões foram realizados de acordo com a
concentração das formulações inovadoras, formulação lipo 11 (5 µg/ml) e formulação emul 9 gel (35
µg/ml). Os resultados deste ensaio em discos de papel e de pele estão representados na Figura 42.
a
P1
P2
PE
P1
P3
P2
b
P2
PL
P2
PL
PT- Placebo reformulação
F8;
PT
PE
PT
PL- Placebo Formulação
lipo 11;
E
L
E
E- Formulação emul 9 gel;
L
T
T
P1, P2, P3- Padrões;
P3
PE- Placebo Formulação
emul 9 gel;
E
E
Legenda:
L
T
T
L
T- Reformulação F8;
L- Formulação lipo 11.
Figura 42 - Resultados obtidos do método Kirby-Bauer para os discos de papel (a) e de pele (b).
Nos discos de papel (Figura 42 - a), os resultados obtidos em termos do halo de inibição para os
padrões foram aproximadamente: 25 mm, 28 mm e 32 mm para o P1, P2, e P3, respetivamente. No
caso das preparações farmacêuticas em estudo, os halos de inibição obtidos foram: 32 mm, 35 mm e
39 mm para formulação emul 9 gel, reformulação F8 e formulação lipo 11, respetivamente. Em relação
aos placebos, ocorreu inibição da levedura apenas no placebo da reformulação F8, esta inibição
provavelmente está relacionada com a presença do conservante, imidazolidinil ureia.
Tendo em conta que o padrão P1 apresenta uma concentração idêntica à formulação lipo 11 (5
µg/ml), comparando os seus halos de inibição é percetível que ocorreu uma difusão maior na
formulação lipo 11. No caso da formulação emul 9 gel, esta apresentou o mesmo halo de inibição que
o padrão P3, no entanto, o padrão apresenta maior concentração de cetoconazol, mais 2 µg/ml. Na
reformulação F8, que apresenta 421 µg/ml de cetoconazol, apenas se obteve um halo de inibição de
35 mm, sendo um resultado muito idêntico à formulação emul 9 gel que apresenta uma concentração
de cetoconazol muito mais baixa.
Em relação aos discos de pele, através da Figura 42 - b é visível que não ocorreu formação de halo
de inibição nos padrões e nos placebos, referentes às preparações farmacêuticas em estudo. Das três
formulações estudadas, apenas ocorreu inibição de C. albicans na formulação lipo 11, em ambos os
discos.
76
4.3. Discussão dos resultados
A partir do Etest®, determinou-se a concentração mínima de cetoconazol que inibe o crescimento
microbiano, neste caso da C.albicans. A CMI obtida foi de 0,047 µg/ml (Figura 41). Todas as
formulações estudadas apresentam uma concentração bastante superior à CMI obtida no ensaio
Etest®, o que poderá indicar que as formulações estudadas são eficazes contra a levedura utilizada.
Como mencionado anteriormente, a formulação lipo 11 apresenta 5 µg/ml, a formulação emul 9 gel 35
µg/ml e a reformulação F8 421 µg/ml.
Os resultados obtidos no método Kirby-Bauer referentes aos discos de papel, indicam que a
formulação lipo 11, apesar de ser a preparação com menor quantidade de cetoconazol na sua
constituição, foi a que apresentou uma inibição mais acentuada. No caso da formulação emul 9 gel,
esta apresentou uma inibição idêntica à reformulação F8, no entanto, existe uma diferença significativa
na quantidade de cetoconazol, que é bastante menor na formulação emul 9 gel. Assim, as formulações
inovadoras, apesar de apresentarem menor quantidade de antifúngico, apresentaram melhores
resultados. Estes resultados indicam, mais uma vez, que a utilização de um promotor cutâneo,
etoxidiglicol, e a dissolução do cetoconazol têm influência na eficácia da formulação, comparativamente
à reformulação F8, em que o cetoconazol está suspenso e não possui o promotor cutâneo.
O propósito para a realização do método Kirby-Bauer é compreender se se está perante um
microrganismo resistente, intermediário ou sensível à quantidade de fármaco aplicada. Para tal, é
necessário um valor de referência em termos de halo de inibição referente ao fármaco e microrganismo
estudado. Normalmente, a entidade EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing) apresenta uma base de dados onde é possível obter a CMI e a difusão em disco relacionando
o microrganismo e o fármaco. Porém, para o fármaco em estudo, cetoconazol, não existem dados de
difusão em disco para C. albicans. Assim, foi realizada uma pesquisa para tentar encontrar valores de
referência.
Da pesquisa efetuada apenas se encontrou um teste de suscetibilidade antifúngica com o resultado
do intervalo de inibição para C. albicans, porém, este teste é feito com comprimidos designados de
Neo-Sensitabs™ (Rosco Diagnostica), onde é necessário a utilização do meio de cultura Mueller-Hinton
agar com 2,0 % glucose e 0,5 μg/ml azul de metileno. A utilização de um Neo-Sensitabs™ com 15 µg
de cetoconazol incorporado forma um halo de inibição de 31 - 42 mm em C. albicans ATCC 90028. No
entanto, estes dados e os resultados obtidos não são comparáveis, uma vez que os dois ensaios
utilizam discos de difusão, meios de cultura distintos e estirpes diferentes, que provavelmente são
diferenças significativas que podem levar à obtenção de resultados distintos [88].
Os discos de pele, no método Kirby-Bauer, foram utilizados para entender o comportamento do
fármaco nas formulações estudadas, se este conseguia passar ou não todas as camadas de pele e
inibir a proliferação de C. albicans. Para o tratamento de infeções superficiais da pele, é necessário a
acumulação de cetoconazol na camada EC para ocorrer uma ação eficaz. Nos resultados obtidos para
este ensaio, apenas surgiu inibição de C. albicans na formulação lipo 11. O que indica que o fármaco
presente nos lipossomas passou todas as camadas da pele e não ficou retino no EC, como já tinha
77
sido provado através do ensaio de retenção in vitro. Assim, apesar da formulação lipo 11 apresentar os
melhores resultados na inibição de C. albicans, nos discos de papel, não é a melhor formulação para o
tratamento deste tipo de infeções da pele.
Assim, a melhor formulação é a formulação emul 9 gel com 0,13 % cetoconazol. Isto porque, apesar
de ter sido a formulação que apresentou menor inibição de C. albicans no estudo em discos de papel,
a diferença não é acentuada tendo em conta que a quantidade de cetoconazol é muito menor,
comparativamente à reformulação F8.
78
Capítulo 5 - Conclusão
Os objetivos deste trabalho foram, a reformulação de uma preparação tópica contendo 2 % de
cetoconazol de forma a estabilizar físico-química e microbiologicamente o produto já existente no
mercado e desenvolver formulações inovadoras aplicando a nanotecnologia e micro encapsulação de
modo a encapsular o antifúngico pretendido.
O primeiro objetivo foi alcançado, uma vez que se reformulou a preparação tópica já existente de
modo a estabilizar o cetoconazol. A inclusão de novo conservante (imidazolidinil ureia), antioxidante
(BHT) e quelante (EDTA), originou uma formulação estável durante o ensaio de estabilidade (3 meses).
Para além da estabilidade físico-química do cetoconazol, também foi conseguida a estabilidade
microbiológica da formulação com a adição de 0,5 % de imidazolidinil ureia. Assim, a melhor
reformulação apresenta na sua composição o conservante imidazolidinil ureia, o antioxidante BHT e o
quelante EDTA. Os resultados obtidos nos ensaios in vitro da cedência e permeação do cetoconazol
da formulação foram promissores. No entanto, o método de fabrico das formulações desenvolvidas e a
validação destes ensaios deverá ser realizada em condições industriais de forma a validar as
conclusões até aqui apontadas.
Durante o desenvolvimento galénico da formulação inovadora emulsão, apenas foi possível
incorporar 0,13 % de cetoconazol, uma vez que foi pretendida a dissolução da substância ativa. Após
a caracterização da formulação final líquida, conclui-se que que se tratava de uma nanoemulsão, devido
ao seu aspeto organolético, tamanho de gotícula e processo de fabrico. Os ensaios in vitro, permitem
concluir que a formulação emul 9 gel é promissora, principalmente no estudo da retenção de
cetoconazol na pele, uma vez que esta preparação obteve resultados idênticos aos obtidos com o
creme comercial, apesar de existir uma diferença significativa no teor de cetoconazol.
Em relação à formulação inovadora com lipossomas, também foi necessária a dissolução do
cetoconazol, neste caso para conseguir incorporar o antifúngico nas bicamadas lipídicas destas
vesículas. Em termos de eficiência de incorporação, conclui-se que estas vesículas incorporam no
máximo 72 % da concentração inicial de cetoconazol, 5,5 µg/ml. A formulação final, formulação lipo 11,
apresentou resultados promissores no ensaio de permeação in vitro. No entanto, no ensaio de retenção
in vitro conclui-se que a retenção de cetoconazol foi mais acentuada nas camadas viáveis da pele do
que no EC, onde é pretendida a sua ação.
Os resultados favoráveis de ambas as formulações inovadoras, provavelmente estão associados a
fatores como a dissolução do cetoconazol e a presença de um promotor cutâneo (etoxidiglicol), utilizado
para dissolver o fármaco, que permitem que o fármaco fique mais disponível para concretizar a sua
ação. O ensaio da eficácia das formulações, em C. albicans, veio salientar estes indícios. Isto porque,
a formulação lipo 11 apresentou o halo de inibição mais acentuado, apesar de ser a formulação que
apresenta menor teor de cetoconazol, tendo a formulação emul 9 gel demonstrado um halo de inibição
equivalente à reformulação F8, sendo o teor de antifúngico bastante diferente. Apesar da formulação
lipo 11 apresentar os melhores resultados não é a formulação adequada, visto que, ocorreu inibição de
79
C. albicans nos discos de pele, o que indicou que o cetoconazol neste sistema não fica retido onde a
sua ação é desejada, no EC, para o tratamento de infeções superficiais da pele.
Assim, conclui-se que a melhor formulação é a formulação emul 9 gel com 0,13 % cetoconazol.
Isto porque, apesar de ter sido a formulação que apresentou menor inibição de C. albicans no estudo
em discos de papel, a diferença não é acentuada tendo em conta que o teor de cetoconazol é muito
menor, comparativamente à reformulação F8.
Como perspetivas, é necessário a realização de estudos de estabilidade por forma a verificar a
estabilidade físico-química (degradação do cetoconazol) e microbiológica das formulações estudadas
e também aprofundar o estudo referente à eficácia das formulações em C. albicans.
Em estudos futuros deverá ser implementado Quality by Design (QbD) presente na diretiva ICH Q8
(R2) - Pharmaceutical Development.
80
Referências Bibliográficas
[1]
R. R. Seeley e et.al., Anatomia e Fisiologia Humana., Lusociência, 2003.
[2]
B. Brennan e J. J. Leyden, «Overview of topical therapy for common superficial fungal
infections and the role of new topical agents», J. Am. Acad. Dermatol., vol. 36, n. 2, pp. S3–S8,
Fev. 1997.
[3]
J. C. De Oliveira, Tópicos de Micologia Médica., Rio de Janeiro, 2012.
[4]
W. F. C. Ferreira e J. C. F. Sousa, Microbiologia: volume 2., Lidel.
[5]
R. J. Hay, «Fungal infections.», Clin. Dermatol., vol. 24, n. 3, pp. 201–12, 2006.
[6]
I. P. Kaur e S. Kakkar, «Topical delivery of antifungal agents.», Expert Opin. Drug Deliv., vol. 7,
n. 11, pp. 1303–27, Nov. 2010.
[7]
L. Name, F. Name, O. Training, P. Training, C. Darin, R. O. Training, M. Kimberly, G. Deepa,
E. Board, E. Principal, I. Primary, F. Systems, E. B. Study, e N. Co-investigator, Microbiologia
Médica, n. 1. 2014.
[8]
M. Ameen, «Epidemiology of superficial fungal infections.», Clin. Dermatol., vol. 28, n. 2, pp.
197–201, Mar. 2010.
[9]
B. Havlickova, V. a Czaika, e M. Friedrich, «Epidemiological trends in skin mycoses
worldwide.», Mycoses, vol. 51 Suppl 4, pp. 2–15, Set. 2008.
[10]
R. Hay, «Superficial fungal infections», Medicine (Baltimore)., vol. 41, n. 12, pp. 716–718, Dez.
2013.
[11]
D. M. Hawkins e A. C. Smidt, «Superficial Fungal Infections in Children», Pediatr. Clin. North
Am., vol. 61, n. 2, pp. 443–455, 2014.
[12]
M. Borgers e H. Degreef, «The role of ketoconazole in seborrheic dermatitis.», Ther. Clin., vol.
80, n. 4, pp. 359–63, 2007.
[13]
Merck Manual Professional Version. Seborrheic Dermatitis. Disponível em:
http://www.merckmanuals.com/professional/dermatologic-disorders/dermatitis/seborrheicdermatitis. Acesso em: 21/09/2015.
[14]
R. Hay, «Superficial fungal infections», Medicine (Baltimore)., vol. 33, n. 4, pp. 89–90, Abr.
2005.
[15]
S. Güngör, M. S. Erdal, e B. Aksu, «New Formulation Strategies in Topical Antifungal
Therapy», J. cosmétics, Dermatological Sci. Appl., vol. 2013, n. January, pp. 56–65, 2013.
[16]
L. K. Pershing, J. Corlett, e C. Jorgensen, «In vivo pharmacokinetics and pharmacodynamics
of topical ketoconazole and miconazole in human stratum corneum.», Antimicrob. Agents
Chemother., vol. 38, n. 1, pp. 90–95, Jan. 1994.
[17]
W. F. C. Ferreira e J. C. F. Sousa, Microbiologia: volume 1. Lidel.
[18]
A. J. Carrillo-Muñoz, G. Giusiano, P. A. Ezkurra, e G. Quindós, «Antifungal agents: Mode of
action in yeast cells», Rev Esp Quimioter., vol. 19, n. 2, pp. 130–139, 2006.
[19]
S. C. A. Chen e T. C. Sorrell, «Antifungal Agents», MJA, vol. 187, n. 7, pp. 404–409, 2007.
81
[20]
Infarmed (2012). Prontuário Terapeutico-11 2013. Disponível em:
http://www.infarmed.pt/portal/pls/portal/!PORTAL.wwpob_page.show?_docname=8944263.PD
F. Acesso em: 3/9/2015.
[21]
M. Catalán e C. Montejo, «Antifúngicos sistémicos. Farmacodinamia y farmacocinetica», Rev.
Iberoam Micol, vol. 23, pp. 39–49, 2006.
[22]
M. Skiba, M. Skiba-Lahiani, H. Marchais, R. Duclos, e P. Arnaud, «Stability assessment of
ketoconazole in aqueous formulations.», Int. J. Pharm., vol. 198, n. 1, pp. 1–6, Mar. 2000.
[23]
Y. Vander Heyde, A. N. M. Nguyet, M. R. Detaevenier, D. L. Massart, e J. Plaizier-Vercammen,
«Simultaneous determination of ketoconazole and formaldehyde in a shampoo: liquid
chromatography method development and validation.», J. Chromatogr. A, vol. 958, n. 1–2, pp.
191–201, Jun. 2002.
[24]
Farmacopeia Portuguesa. 9ª ed. 2008. [Formato eletrónico].
[25]
Pubchem. Ketoconazole. Disponível em:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/456201#section=Top. Acesso em: 20/1/2015
[26]
M. Castro-Puyana, C. García-Ruiz, A. Cifuentes, A. L. Crego, e M. L. Marina, «Identification
and quantitation of cis-ketoconazole impurity by capillary zone electrophoresis-mass
spectrometry.», J. Chromatogr. A, vol. 1114, n. 1, pp. 170–7, Mai. 2006.
[27]
C. D. Waugh e V. A. Medical, «Ketoconazole», 2007.
[28]
G. P. Bodey, «Azole antifungal agents.», Clin. Infect. Dis., vol. 14 Suppl 1, pp. S161–9, 1992.
[29]
G. S. Hall, Interactions of Yeasts, Moulds, and Antifungal Agents. Springer,2012.
[30]
L. J. Swinyer, J. Decroix, A. Langner, J. N. Quiring, e S. Blockhuys, «Ketoconazole Gel 2 % in
the Treatment of Moderate to Severe Seborrheic Dermatitis», Ther. Clin., vol. 79, n. June, pp.
475–482, 2007.
[31]
Infarmed. Cetoconazol. Disponível em: http://www.infarmed.pt/infomed/pesquisa.php. Acesso
em: 21/01/2015
[32]
L. Lachman, H. A. Lieberman, e J. L. Kanig, Teoria e Prática na Indústria
Farmacêutica.Fundação Calouste Gulbenkian, 2001.
[33]
G. W. Lu e P. Gao, «Emulsions and Microemulsions for Topical and Transdermal Drug
Delivery», em Handbook of Non-Invasive Drug Delivery Systems, 2010, pp. 59–94.
[34]
Takeo Mitsui, «7-Cosmetics and physical chemistry», em New cosmetic science, 1996, pp.
165–190.
[35]
M. E. Aulton, Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design. Churchill Livingstone.
[36]
T. P. Formariz, M. C. C. Urban, A. A. D. S. Júnior, M. P. D. Gremião, e A. G. De Oliveira,
«Microemulsões e fases líquidas cristalinas como sistemas de liberação de fármacos», Rev.
Bras. Ciências Farm., vol. 41, n. 03, pp. 301–313, 2005.
[37]
J. C. Schwarz, V. Klang, M. Hoppel, D. Mahrhauser, e C. Valenta, «Natural microemulsions:
Formulation design and skin interaction», Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 81, n. 3, pp. 557–562,
2012.
82
[38]
S. Sahoo, F. Dilnawaz, e S. Krishnakumar, «Nanotechnology in ocular drug delivery», Drug
Discov. Today, vol. 13, n. 3–4, pp. 144–151, 2008.
[39]
M. L. Bruschi, «Drug delivery systems», em Strategies to Modify the Drug Release from
Pharmaceutical Systems, 2015, pp. 87–194.
[40]
A. Raid e W. Jingyuan, «Microemulsions as drug delivery systems», Pharm. Sci. Encycl. Drug
Discov. Dev. Manuf., vol. 8, n. 4, pp. 504–511, 2010.
[41]
C. C. Peng, L. C. Bengani, H. J. Jung, J. Leclerc, C. Gupta, e a. Chauhan, «Emulsions and
microemulsions for ocular drug delivery», J. Drug Deliv. Sci. Technol., vol. 21, n. 1, pp. 111–
121, 2011.
[42]
T. Wan, T. Xu, J. Pan, M. Qin, W. Pan, G. Zhang, Z. Wu, C. Wu, e Y. Xu, «Microemulsion
based gel for topical dermal delivery of pseudolaric acid B: In vitro and in vivo evaluation», Int.
J. Pharm., vol. 493, n. 1–2, pp. 111–120, 2015.
[43]
M. N. Yukuyama, D. D. M. Ghisleni, T. J. a. Pinto, e N. a. Bou-Chacra, «Nanoemulsion:
process selection and application in cosmetics - a review», Int. J. Cosmet. Sci., pp. 1–12, 2015.
[44]
O. Sonneville-Aubrun, J. T. Simonnet, e F. L’Alloret, «Nanoemulsions: A new vehicle for
skincare products», Adv. Colloid Interface Sci., vol. 108–109, n. 03, pp. 145–149, 2004.
[45]
J.-Y. Fang, Y.-L. Leu, C.-C. Chang, C.-H. Lin, e Y.-H. Tsai, «Lipid nano/submicron emulsions
as vehicles for topical flurbiprofen delivery.», Drug Deliv., vol. 11, n. 2, pp. 97–105, 2004.
[46]
S. Tamilvanan, «Oil-in-water lipid emulsions: implications for parenteral and ocular delivering
systems», Prog. Lipid Res., vol. 43, n. 6, pp. 489–533, 2004.
[47]
G. Nicolaos e et.al., «Improvement of cefpodoxime proxetil oral absorption in rats by an oil-inwater submicron emulsion», Int. J. Pharm., vol. 263, n. 1–2, pp. 165–171, 2003.
[48]
B. B. Lundberg, «A submicron lipid emulsion coated with amphipathic polyethylene glycol for
parenteral administration of paclitaxel (Taxol)», J. Pharm. Pharmacol., vol. 49, n. 1, pp. 16–21,
1997.
[49]
G. J. Nohynek, J. Lademann, C. Ribaud, e M. S. Roberts, «Grey Goo on the Skin?
Nanotechnology, Cosmetic and Sunscreen Safety», Crit. Rev. Toxicol., vol. 37, n. 3, pp. 251–
277, 2007.
[50]
S. R. Mudshinge, A. B. Deore, S. Patil, e C. M. Bhalgat, «Nanoparticles: Emerging carriers for
drug delivery.», Saudi Pharm. J., vol. 19, n. 3, pp. 129–41, Jul. 2011.
[51]
S. Narasimha Murthy e H. N. Shivakumar, «Topical and Transdermal Drug Delivery», em
Handbook of Non-Invasive Drug Delivery Systems, First Edit., Vitthal S. Kulkarni, 2010, pp. 1–
36.
[52]
F. Guo, J. Wang, M. Ma, F. Tan, e N. Li, «Skin targeted lipid vesicles as novel nano-carrier of
ketoconazole: characterization, in vitro and in vivo evaluation.», J. Mater. Sci. Mater. Med., vol.
26, n. 4, pp. 1–13, Abr. 2015.
[53]
A. C. Peraro 2011. Estabilidade física e metodologia analítica para formulações farmacêuticas
contendo cetoconazol. Tese de Mestrado em Pós–Graduação em Fármaco e Medicamentos
Área de Produção e Controle Farmacêuticos. Faculdade de Ciências FarmacêuticasUniversidade de São Paulo. São Paulo.
83
[54]
J. W. Wiechers, A. C. Watkinson, S. E. Cross, e M. S. Roberts, «Predicting skin penetration of
actives from complex cosmetic formulations: an evaluation of inter formulation and inter active
effects during formulation optimization for transdermal delivery.», Int. J. Cosmet. Sci., vol. 34,
n. 6, pp. 525–35, Dez. 2012.
[55]
R. C. Rowe, P. J. Sheskey, e M. E. Quinn, Handbook of pharmaceutical excipientes. London,
UK: Pharmaceutical Press, 2009.
[56]
drstraetmans. Multifunctional Additives: product information Dermosoft® OMP. Disponível em:
http://www.in-cosmeticsasia.com/__novadocuments/12535. Acesso em: 26/1/2015
[57]
Lonza. IsocilTM PC. Disponível em: http://www.lonza.com/products-services/consumercare/personal-care/search-by-brand/isocil-pc.aspx. Acesso em: 26/1/2015 [53] J. Kumar, S.
Muralidharan, e S. Parasuraman, «Antifungal Agents : New Approach for Novel Delivery
Systems», J. Pharm. Sci. Res, vol. 6, n. 5, pp. 229–235, 2014.
[58]
V. C. Ramalho e N. Jorge, «Antioxidantes utilizados em óleos, gorduras e alimentos
gordurosos», Quim. Nova, vol. 29, n. 4, pp. 755–760, 2006.
[59]
J. Kumar, S. Muralidharan, e S. Parasuraman, «Antifungal Agents : New Approach for Novel
Delivery Systems», J. Pharm. Sci. Res, vol. 6, n. 5, pp. 229–235, 2014.
[60]
M. R. Patel, R. B. Patel, J. R. Parikh, A. B. Solanki, e B. G. Patel, «Investigating effect of
microemulsion components: In vitro permeation of ketoconazole.», Pharm. Dev. Technol., vol.
16, n. 3, pp. 250–8, Jun. 2011.
[61]
R. P. Patel, H. H. Patel, e A. H. Baria, «Formulation and Evaluation of Carbopol Gel Containing
Liposomes of Ketoconazole. (Part-II)», Int. J. Drug Deliv. Technol., vol. 1, n. 2, pp. 42–45,
2009.
[62]
R. P. Patel, H. Patel, e A. H. Baria, «Formulation and Evaluation of Liposomes of
Ketoconazole», Int. J. Drug Deliv. Technol., vol. 1, n. 1, pp. 16–23, 2009.
[63]
S. Shirsand, M. Para, D. Nagendrakumar, K. Kanani, e D. Keerthy, «Formulation and
evaluation of Ketoconazole niosomal gel drug delivery system.», Int. J. Pharm. Investig., vol. 2,
n. 4, pp. 201–7, Out. 2012.
[64]
E. B. Souto e R. H. Müller, «SLN and NLC for topical delivery of ketoconazole.», J.
Microencapsul., vol. 22, n. 5, pp. 501–10, Ago. 2005.
[65]
E. B. Souto e R. H. Müller, «The use of SLN and NLC as topical particulate carriers for
imidazole antifungal agents.», Pharmazie, vol. 61, n. 5, pp. 431–7, Mai. 2006.
[66]
C. Danel, N. Azaroual, C. Chavaria, P. Odou, B. Martel, e C. Vaccher, «Comparative study of
the complex forming ability and enantioselectivity of cyclodextrin polymers by CE and 1H
NMR.», Carbohydr. Polym., vol. 92, n. 2, pp. 2282–92, Fev. 2013.
[67]
M. T. Esclusa-Díaz, M. Guimaraens-Méndez, M. B. Pérez-Marcos, e et.al, «Characterization
and in vitro dissolution behaviour of ketoconazole/B-and 2-hydroxypropyl-B-cyclodextrin
inclusion compounds», Int. J. Pharm., vol. 5173, n. 96, pp. 203–210, 1996.
[68]
J. Zhang, L. Wang, C. Gao, L. Zhang, e H. Xia, «Ocular pharmacokinetics of topically-applied
ketoconazole solution containing hydroxypropyl beta-cyclodextrin to rabbits.», J. Ocul.
Pharmacol. Ther., vol. 24, n. 5, pp. 501–506, Out. 2008.
84
[69]
Seppic. Dermo-purifying ingredients. Disponível em: http://www.seppic.com/cosmetics/dermopurifying-active-ingredient-@/2620/view-838-category.html;jsessionid=y3EVwl6CcSlxge3s5AWUg. Acesso em: 2/9/2015.
[70]
Jornal Oficial da União Europeia (2009). Regulamento (CE) N.o 1223/2009 do Parlamento
Europeu e do Conselho de 30 de Novembro de 2009 relativo aos produtos
cosméticos.Disponível em:
http://www.inem.pt/files/2/documentos/20110111123415381769.pdf. Acesso em: 26/1/2015.
[71]
ema (1992). Specifications and Control Tests on the Finished Product. Disponível em:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500
003368.pdf. Acesso em: 5/09/2015
[72]
R. Manadas, M. E. Pina, e F. Veiga, «A dissolução in vitro na previsão da absorção oral de
fármacos em formas farmacêuticas de liberação modificada», Rev. Bras. Ciência do Solo, vol.
38, n. 4, 2002.
[73]
Y. Vander Heyden, a N. M. Nguyet, M. R. Detaevernier, e D. L. Massart, «Simultaneous
determination of ketoconazole and formaldehyde in a shampoo : liquid chromatography method
development and validation», J. Chromatogr. A, vol. 958, pp. 191–201, 2002.
[74]
The scientific committee on cosmetic products and non-food products intended for consumers.
Opinion: a clarification on the formaldehyde and para-formaldehyde entry in directive
76/768/EEC on cosmetic products.Disponível em:
http://ec.europa.eu/food/fs/sc/sccp/out187_en.pdf. Acesso em: 15/9/2015.
[75]
Prepared for NCI to support chemical nomination by Technical Resources International.
Imidazolidinyl urea 39236-46-9. Disponível em:
https://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/chem_background/exsumpdf/imidazolidinylurea_508.pdf.
Acesso em: 15/9/2015.
[76]
A. Review, C. Ingredient, e S. Assessments, Annual review of cosmetic ingredient safety
assessments: 2005-2006., vol. 27 Suppl 1, n. July 2007. 2008.
[77]
The scientific committee on cosmetic products and non-food products intended for consumers.
Opinion: the determination of certain formaldehyde releasers in cosmetic products. Acesso em:
15/9/2015.
[78]
Sisterna®. Personal Care: Product range. Disponivel em: http://www.sisterna.com/personalcare/sucrose-esters/. Acesso em:27/2/2015
[79]
OCDE, «Guideline for the testing of chemicals: Skin Absorption: in vitro Method», Test, 2004.
[80]
Sisterna®. Sucrose esters cosmetic applications. Disponibilizado pelo fabricante.
[81]
D. F. B. Rafeiro. 2013. Novas estratégias de promoção da permeação transdérmica. Tese
mestrado em Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas. Escola de Ciências e
Tecnologias da Saúde, Universidade Lusofona.Lisboa.
[82]
Gattefosse. Transcutol CG®: Efficacy booster for cosmetic formulations Superior solubilizer
High purity, multifunctional ingredient.Disponível em:
http://www.incosmetics.co.za/images/pdf/transcutolcg.pdf. Acesso em: 27/8/2015
[83]
Lucas Meyer Cosmetics.Pro-LipoTM Neo - Smart Liposome Technology. Disponível em:
http://www.hpcimedia.com/images/PDF/LMC_Brochure_Pro-Lipo.pdf. Acesso em: 5/3/2015
85
[84]
Lucas Meyer Cosmetics e Biotec (2013). Pro-Lipo® Tecnologias em Lipossomas. Disponível
em:http://www.vitalpharmaudia.com.br/site/public_images/produto/3f5ab7c107fc5af8ada25fff95
539d1b.pdf. Acesso em: 10/3/2015
[85]
Heidolph (2015). Powerful Stirring. Disponível em: http://www.heidolphinstruments.com/fileadmin/media/3._Support/Kataloge/2015/EN/HeiTorque_Catalog_2015.pdf. Acesso em: 30/9/2015
[86]
Lucas Meyer Cosmetics. My perfect foundation 14.247.01. Disponível em:
http://lucasmeyercosmetics.com/docs/formulations/93.My_Perfect_Foundation_14.247.01_C15
2.pdf. Acesso em: 5/3/2015.
[87]
G. Tiwari 2013. Preparation and Characterization of ketoconazole encapsulated liposome and
ethosome: A Comparative study. Master of Science. National Institute of Technology.
Rourkela. India.
[88]
Rosco Diagnostica (2011). Susceptibility Testing of Yeasts 2011- Agar Diffusion Method with
Neo-Sensitabs - Using Mueller-Hinton agar with 2% glucose and 0.5 μg/ml methylene blue.
Disponível em: http://rosco.dk/gfx/yeasts.pdf. Acesso em: 21/9/2015.
86
Anexos
Anexo I - Determinação da fase recetora
Para cada fase recetora estudada foram pesados 0,2 g de cetoconazol, sendo a quantidade
máxima que poderá ser dissolvida em cada célula de Franz de 1 cm 2, no creme convencional. O
cetoconazol foi adicionado aos poucos, até a formulação não ter capacidade de dissolver mais a
substância ativa. A Tabela 49, indica as várias fases recetoras estudas e respetivo resultado.
Tabela 49 - Fases recetoras estudadas para os ensaios in vitro.
Fase recetora
Propanediol- 70 %
Água- 30 %
Propanediol- 50 %
Água- 50 %
Propanediol- 30 %
Água- 70 %
Hexilenoglicol- 70 %
Água- 30 %
Hexilenoglicol- 50 %
Água- 50 %
Hexilenoglicol- 30 %
Água- 70 %
Tween 80- 5 %
Água- 95 %
PBS- 100 %
Metanol- 20 %
Água- 80 %
Etanol- 25 %
Água- 75 %
Metanol- 30 %
Água- 70 %
Etanol- 40 %
Água- 60 %
Propanediol- 50 %
Etanol 96 %- 50 %
Quantidade de cetoconazol dissolvido
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
<0,2
0,2
Através da Tabela 49, verifica-se que em todas as fases aquosas com água não foi possível
dissolver a quantidade máxima necessária para os ensaios em células de Franz.
87
Anexo II – Doseamento da substância ativa
A Figura 43, representa o cromatograma da formulação F8 placebo. Este gráfico comprova que
não existe interferência de nenhum excipiente da formulação, uma vez que não existem picos
interferentes no tempo de retenção específico para o cetoconazol.
Figura 43 - Cromatograma da formulação F8 placebo.
88