níveis dos teores de lisozima sérica em ruminantes e em equinos

NÍVEIS DOS TEORES DE LISOZIMA SÉRICA
EM RUMINANTES E EM EQUINOS
SUBMETIDOS A DIFERENTES SITUAÇÕES
FISIOPATOLÓGICAS
Artur Cezar de Carvalho Fernandes1, Tamyres Izarelly Barbosa da Silva2, Willder Rafael Ximenes Cunha3,
Daniel Dias da Silva3, Renata Gomes Revorêdo2, Hélio Lauro Soares Vasco Neto2 , Lúcio Esmeraldo Honório
de Melo4, Emerson Israel Mendes5, Paula Carneiro Leão Oiticica6
Introdução
Material e métodos
A lisozima, que está presente em quase todos os
seres vivos sob diferentes formas, é uma enzima
lisossômica com atividade hidrolítica [1,2,], sendo
relativamente pequena, termolábel e altamente
estável [2,3]. Esta pode ser encontrada na maioria
dos fluidos orgânicos como a saliva, secreção
nasal, mucosa intestinal, no leite dentre outros
[3,4,5]. É principalmente produzida pelo
monócito-macrófago e parcialmente pelos
granulócitos, onde permanecem até serem
secretadas nos vários líquidos como o soro, a
lágrima, entre outros [1,6]. Seus teores variam em
função das diferentes situações fisiopatológicas:
em condições normais são comumente baixos e
em processos infecciosos os teores são geralmente
elevados [4]. Na titulação da lisozima se usa uma
bactéria sensível a ação lítica da enzima, o
Micrococcus lysodeikticus,em um meio de cultura
gelatinoso, geralmente a agarose [1]. Este teste
consiste na quantificação da lisozima sérica a
partir da ,medida dos diâmetros dos halos de lise
bacteriana, consequência de sua propriedade lítica
frente a germes gram-positivos (Micrococcus
lysodeikticus), que são proporcionais as
concentrações de lisozima [1,6,7]. Objetivou-se
com a realização deste estudo validar a
imunodifusão para determinar os teores séricos da
lisozima em caprinos e equinos, a partir de sua
prévia padronização para bovinos. Este ensaio
imunossorológico integra o estudo da clínica
imunológica das espécies ruminantes e eqüina,
voltado à montagem de um sistema de avaliação
in vitro do estado imunitário de rebanhos
pecuários submetidos a diferentes situações
fisiopatológicas e de manejo.
Globalmente, foram utilizadas 583 amostras
séricas bovinas, caprinas e equinas procedentes de
criações das Mesorregiões Metropolitana de
Recife,
Mata Pernambucana
e Agreste
Pernambucano, sendo 404 bovinas, 143 caprinas e
36 equinas. Em relação à espécie bovina, os
animais foram submetidos previamente à
tuberculinização (Teste Cervical Comparativo –
TCC) e amostras séricas dos mesmos foram
examinadas para brucelose (Antígeno Acidificado
Tamponado – AAT) e leucose (Imunodifusão
Radial Dupla de Ouchterlony - IDGA). Em função
destes resultados e com o objetivo de determinar a
concentração sérica de lisozima (Imunodifusão
Radial Simples de Mancini) em diferentes
situações foram constituídos os seguintes grupos
experimentais: GI (amostras soropositivas ao
IDGA para LEB); GII (amostras soropositivas ao
AAT para brucelose); GIII (amostras de bovinos
positivos ao TCC para tuberculose); GIV
(amostras soropositivas ao IDGA para LEB e de
bovinos positivos ao TCC para tuberculose); GV
(amostras soropositivas ao IDGA para LEB e ao
teste AAT para Brucelose); GVI (bovinos
positivos ao TCC e amostras soropositivas ao
AAT para brucelose); GVII (amostras séricas ou
bovinos negativos aos testes aplicados). Amostras
séricas caprinas foram previamente testadas para
CAE (Artrite Encefalite Caprina) e, em seguida,
submetidas à imunodifusão para determinar a
concentração sérica de lisozima. As amostras
equinas foram submetidas exclusivamente à
imunodifusão para determinar a concentração
sérica de lisozima. Os procedimentos relativos ao
processamento das amostras de sangue recémcolhidas e aos exames sorológicos das espécies
1. O Primeiro autor é Graduando do Curso de Medicina Veterinária na Universidade Federal Rural de Pernambuco;
2. O Segundo Autor é Graduando do Curso de Zootecnia na Universidade Federal Rural de Pernambuco;
3. O Terceiro Autor é Graduando do Curso de Medicina Veterinária na Universidade Federal Rural de Pernambuco;
4. O quarto Autor é Professor Associado do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de
Pernambuco;
5. O Quinto Autor é doutor em Ciências Veterinárias pela UFRPE;
6. O Sexto Autor é Mestranda em Ciência Veterinária na UFRPE.
estudadas foram realizados no Laboratório
Pesquisa em Clínica de Grandes Animais
DMV da UFRPE, sendo o sorodiagnóstico
CAEV realizado no Laboratório de Virologia
DMV da UFRPE.
de
do
da
do
Resultados e Discussão
Dentre as 404 amostras bovinas, 143 (35%)
apresentaram
soropositividade
para
LEB,
demonstrando uma elevada disseminação da
doença nos rebanhos. Desse universo amostral,
400
foram
efetivamente
submetidas
à
imunodifusão para titulação da lisozima sérica e
analisadas de acordo com a aplicação dos grupos
experimentais. Observou-se que o grupo de
amostras soropositivas para LEB (GI), com uma
concentração média de lisozima de 7,4 /ml,
apresentou uma titulação média de lisozima séria
em níveis inferiores ao apresentado pelo grupo de
amostras soronegativas para todas as doenças
estudadas (GVIII, controle), com 7,6 /ml (Tabela
1). Das 143 amostras caprinas analisadas, 131
foram soronegativas para CAE e 12 reagiram
positivamente para o mesmo teste. Os teores de
lisozima sérica encontrados não foram diferentes
entre os animais soropositivos e soronegativos
para CAE, conforme descrição da tabela 2. As 36
amostras séricas eqüinas foram submetidas
também à imunodifusão, e analisadas de acordo
com o manejo aplicado, observando-se uma
discreta diferença de 0,1/ml entre animais de
tração e os criados em haras (tabela 3).
Preservadas as peculiaridades das diferentes
espécies pecuárias estudadas, os tamanhos
variados das amostras e os diferentes momentos
do exame das amostras, comparativamente, houve
diferença nos teores médios de lisozima entre as
espécies. Os resultados alcançados na pesquisa,
uma vez que reafirmaram a padronização da
técnica de Mancine para bovinos, são promissores
em relação aos pequenos ruminantes e aos
equinos, sendo eminente sua validação para
determinar a concentração de lisozima sérica
nessas espécies, prestando-se, inclusive, para ser
utilizada na rotina do Laboratório de Pesquisa em
Clínica de Grandes Animais. Adicionalmente, a
evidente disseminação da LEB nos rebanhos
estudados e os indícios da interferência do Vírus
da Leucose Bovina nos teores séricos de lisozima
sugere que a infecção pelo Vírus da Leucose
Bovina encontra-se ativo, podendo estar
comprometendo progressivamente a integridade
da saúde dos rebanhos examinados, merecendo
atenção especial dos produtores, veterinários e
autoridades. Entretanto, este estudo deve ser
consubstanciado a outros complementares, para
que se possa inferir o caráter imunossupressor da
infecção pelo VLB, corroborando, destarte, com a
hipótese da intercorrência entre Leucose e
bacterioses
de
importância
clínicoepidemiológica, como a tuberculose. Por fim, os
ensaios relativos aos teores de lisozima sérica nas
espécies eqüina e caprina devem ter o universo
amostral ampliado, para que se obtenham
resultados mais confiáveis e permita que se
aprofundem
os
estudos
dos
fatores
fisiopatológicos que interferem na imunologia
clínica dessas espécies.
Agradecimentos
Agradeço a Universidade Federal Rural de
Pernambuco e ao CNPq, pelo incentivo dado e a
oportunidade de ingressar na iniciação científica.
Referências
[1] AMBROGI, C. Studio di Parametri Immunologici atti a
Valutare Fenomini Immunodepressivi Nell’animale da
Esperimento. Milano, Tese de Láurea, 1986.
[2] STRYER, L. Bioquímica, 3 ed. Rio de Janeiro,
Guanabara, 1992. 881p
[3] FREEDMAN, S.O.; GOLD, P. Clinical Immunology, 2
ed. EUA, 1976. p.65-77.
[4] BIER, O. Microbiologia e Imunologia. 3 ed. Rio de
Janeiro, Melhoramentos, 1984. 1234p.
[5] TIZARD, I.R. Introdução à Imunologia Veterinária,
São Paulo, 5 ed. Roca, 1998. p.259-312.
[6] OSSERMAN, E.F.; LAWLOR,D.P. Serum and urinary
Lysozime
(Muramidase)
in
Monocitic
and
Monomyelocytic Leukemia.
The Journal of Immunology, 1966
[7] MANCINI, G.; CARBONARA, A.O.; HEREMANS,
J.F. Immunochemical quantitation of antigens by single
radial immunodiffusion. Immunochemistry, v.2, p.235254.1965.
[8] MILLER, J.M.; van der MAATEN, M.J. Use of
glycoprotein antigen in the imunodiffusion test for bovine
leukemia virus antibodies. European Journal of Cancer,
v.13, p 1369-75, 1977.
[9] BIRGEL, E.H. et al. Ocorrência de infecção causada
pelo vírus da leucose bovina em gado leiteiro criado no
Estado de São Paulo. Avaliação pela detecção de
anticorpos séricos por imunodifusão com antígeno viral.
In: CONFERENCIA ANUAL DA SOCIEDADE
PAULISTA DE MEDICINA VETERINARIA, 43.,
Campinas, 1988b. Anais... p.31.
Tabela 1. Concentração média de lisozima sérica em amostras bovinas examinadas pela imunodifusão, segundo o grupo
experimental no período de agosto de 2005 a junho de 2009. Recife – 2009
Grupo Experimental
Freqüência
Lisozima
Diâmetros dos halos
(mm)
GI (Leucose)
105
Concentração de lisozima
(/ml)
7,9 (+-1,7)
7,4 (±1,5)
GII (Brucelose)
9
8,0 (+-3,1)
6, 7 (+-2,3)
GIII (Tuberculose)
38
8,4 (+-2,7)
7,0 (+-1,1)
GIV (Leucose + tuberculose)
38
7,3 (+-2,4)
6,8 (+-1,4)
GV (Leucose + Brucelose)
1
9,5
6,9
GVI (Tuberculose + Brucelose)
2
6,0 (+-0,7)
7,0 (+-0,4)
GVII (Leucose + TB + Brucelose)
6
7,7 (+-1,9)
7,0 (+-0,6)
GVIII (Negativos)
201
8,3 (+-1,6)
7,6 (+-1,1)
Total
400
Tabela 2 – Média e desvio padrão dos diâmetros dos halos de lise e das concentrações séricas de lisozima e das amostras
caprinas examinadas. Recife – 2009.
Grupo Experimental
Freqüência
Lisozima
Diâmetros dos halos (mm)
Concentração de lisozima (/ml)
CAEV-Positivos
12
8,8 (+-1,2)
8,3 (+-0,7)
CAEV-Negativos
131
8,8 (±1,1)
8,3 (±0,6)
143
8,8 (±1,1)
8,3 (±0,6)
Total
Tabela 3 – Média e desvio padrão dos diâmetros dos halos de lise e das concentrações séricas de lisozima e das amostras
eqüinas examinadas. Recife – 2009.
Grupo Experimental
Freqüência
Lisozima
Diâmetros dos halos (mm)
Concentração de lisozima (/ml)
Equinos carroceiros
7
8,5 (+-0,9)
8,6 (+-0,1)
Equinos Haras
29
8,5 (±0,8)
8,5 (±0,6)
Total
36
8,5 (±0,8)
8,5 (±0,5)