Sequenciador PacBio (Pacific Biosciences) Sequenciador PacBio Sequenciador de terceira geração Utiliza de sensores de luz com o menor volume de detecção do mundo Zero-mode waveguide (ZMW) Baseado na técnica de sequenciamento em tempo real de molécula única (SMRT) Demanda menos de um dia desde a preparação do template até a obtenção dos dados de sequenciamento SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Histórico PacBio lançado PacBio lançado em versão beta, Criação do Lançado em 2013 a versão RS II, a qualcomercialmente trouxe método SMRT em com no ano de 2011 aperfeiçoamentos na performance e comprimento 2009 comercialização na versão RS limitada em 2010 de leitura do sequenciador Eid et al. (2009) SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Vantagens em relação aos sequenciadores de segunda geração Segunda geração • Leituras curtas e abundantes (> 1 bilhão) • Limitado na detecção de regiões genômicas complexas Terceira geração • Leituras longas permitindo superar estas limitações • Não necessita de pausa entre os passos de leitura SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Preparação da biblioteca da amostra SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Sequenciamento por SMRT Baseado em duas tecnologias de papel fundamental Replicação do template utilizando dNTP ligados a fluoróforos ligados ao fosfato terminal Zero-mode waveguide SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Sequenciamento por SMRT dsDNA Template DNA polimerase SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Zero-mode waveguide (ZMW) Nanoporo com 100 nm de profundidade e 70 nm de largura Detém o menor volume de captação de luz existente [20 zeptolitros ( 20x10E-21 litros)] DNA polimerase + template imobilizados ao fundo do orifício SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Zero-mode waveguide (ZMW) Cada célula SMRT possui 150.000 ZMWs, permitindo leitura simultânea de milhares de templates Produtividade de 0,5 a 1 bilhão de bases por célula SMRT SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Método de sequenciamento SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Método de sequenciamento SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Características do método Tamanho das leituras: em média 10 – 16 kb Quantidade de reads: ~ 55.000 Pacbio RSII (por célula SMRT) Tempo por rodada de sequenciamento: 0,5 a 6 horas Taxa de erro: 13 a 15% SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Características do método SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Aplicações do sequenciador PacBio Montagem genômica de novo Sequenciamento de regiões genômicas problemáticas Sequenciamento de RNAs usando o protocolo Iso-Seq Caracterização de SNPs Estudos epigenéticos SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) PacBio e detecção de bases metiladas SEQUENCIADOR PACBIO (PACIFIC BIOSCIENCES) Sequenciador PacBio (Pacific Biosciences) Grupo: Andrei Félix Mendes Matheus Soares da Silva
