BB 13. Estudo da produção de Proteína Verde Fluorescente (GFP

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BB 13. Estudo da produção de Proteína Verde Fluorescente (GFP) utilizando Escherichia coli BL21
Camila Lopes1,2, Danuza Rossi1, Sandro Roberto Valentini1, Valéria Carvalho Santos Ebinuma1, Jorge
Fernando Brandão Pereira1.
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Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP. 2Unifal - MG.
Introdução: A proteína verde fluorescente (GFP, do inglês “Green Fluorescent Protein”) é produzida
naturalmente por águas-vivas do gênero Aequorea. Porém, cientistas isolaram e clonaram seu gene de
interesse, a fim de promover sua expressão em outros organismos. Esta proteína não depende de outros
componentes para emitir fluorescência, já que o fluoróforo encontra-se na sua cadeia polipeptídica. Ao se
ligar com outras proteínas, a GFP não altera as propriedades desses ligantes, conferindo sua aplicabilidade de
marcador biológico eficiente e não invasivo. Dentre os diversos microrganismos capazes de expressar a GFP,
encontra-se a bactéria Escherichia coli, que foi utilizada no presente estudo. Objetivo: Este trabalho avaliou
a viabilidade do emprego da bactéria E. coli BL21 na produção de GFP, para posterior emprego em
processos de purificação com sistemas aquosos bifásicos com líquidos iônicos (SABs-LIs). Metodologia:
Colônias de E. coli BL21 com os plasmídeos pET-28(a) e pLysS foram fermentadas em meio de cultura
Luria-Bertani acrescido dos antibióticos canamicina (50µg/mL) e cloranfenicol (50µg/mL). Os meios foram
inoculados e incubados sob agitação a 100 rpm e 30ºC de temperatura. Após a determinação da curva de
crescimento (durante 72h, com amostragem às 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 32, 36, 48h) de E. coli BL21,
procedeu-se o estudo da produção de GFP. Adicionou-se o composto indutor de produção de GFP Isopropil-β-D-1-Tiogalactopiranosídeo (IPTG) ao caldo fermentativo após 6h da inoculação da bactéria.
Durante o bioprocesso, foram coletadas amostras do meio fermentado de hora em hora (durante 6h), as quais
foram posteriormente utilizadas para determinar o crescimento celular por absorbância UV-Vis a 600 nm. A
produção de GFP foi analisada por fluorimetria em comprimentos de onda de excitação (395 nm) e emissão
(520 nm) específicos para quantificação da GFP, e por gel de eletroforese SDS-PAGE. Resultados e
discussão: Os resultados obtidos demonstraram que a 30ºC a E. coli apresenta uma fase exponencial de
crescimento da primeira hora até às 12h de incubação. Desse modo, determinou-se que a indução da
produção de GFP por adição de IPTG deveria ser após 6h de fermentação. As análises por eletroforese SDSPAGE confirmaram que ocorreu a produção da GFP logo após a indução, tendo sido observadas bandas
largas em todos os tempos coletados. As análises por fluorimetria demonstraram um aumento da
fluorescência com o decorrer do tempo de fermentação, mostrando que a E. coli possui grande capacidade de
produção da proteína. Conclusão: Os resultados obtidos mostraram que é viável a utilização da E. coli BL21
para a produção de GFP. A otimização da via fermentativa para a produção de GFP em larga escala é
fundamental quando se objetiva a sua purificação por técnicas mais econômicas e sustentáveis como os
SABs-LIs. Assim, a avaliação da produção de GFP foi uma etapa chave para a escolha dos melhores
sistemas para a sua recuperação direta a partir do caldo fermentado e viabilização de sua extração em escala
piloto (trabalho em desenvolvimento).
Palavras-chave: Proteína verde fluorescente, Escherichia coli BL21.
Apoio Financeiro: FAPESP(Processo 14/16424-7), CNPq, CAPES.
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