BB 13. Estudo da produção de Proteína Verde Fluorescente (GFP

BB 13. Estudo da produção de Proteína Verde Fluorescente (GFP) utilizando Escherichia coli BL21
Camila Lopes1,2, Danuza Rossi1, Sandro Roberto Valentini1, Valéria Carvalho Santos Ebinuma1, Jorge
Fernando Brandão Pereira1.
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Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP. 2Unifal - MG.
Introdução: A proteína verde fluorescente (GFP, do inglês “Green Fluorescent Protein”) é produzida
naturalmente por águas-vivas do gênero Aequorea. Porém, cientistas isolaram e clonaram seu gene de
interesse, a fim de promover sua expressão em outros organismos. Esta proteína não depende de outros
componentes para emitir fluorescência, já que o fluoróforo encontra-se na sua cadeia polipeptídica. Ao se
ligar com outras proteínas, a GFP não altera as propriedades desses ligantes, conferindo sua aplicabilidade de
marcador biológico eficiente e não invasivo. Dentre os diversos microrganismos capazes de expressar a GFP,
encontra-se a bactéria Escherichia coli, que foi utilizada no presente estudo. Objetivo: Este trabalho avaliou
a viabilidade do emprego da bactéria E. coli BL21 na produção de GFP, para posterior emprego em
processos de purificação com sistemas aquosos bifásicos com líquidos iônicos (SABs-LIs). Metodologia:
Colônias de E. coli BL21 com os plasmídeos pET-28(a) e pLysS foram fermentadas em meio de cultura
Luria-Bertani acrescido dos antibióticos canamicina (50µg/mL) e cloranfenicol (50µg/mL). Os meios foram
inoculados e incubados sob agitação a 100 rpm e 30ºC de temperatura. Após a determinação da curva de
crescimento (durante 72h, com amostragem às 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 32, 36, 48h) de E. coli BL21,
procedeu-se o estudo da produção de GFP. Adicionou-se o composto indutor de produção de GFP Isopropil-β-D-1-Tiogalactopiranosídeo (IPTG) ao caldo fermentativo após 6h da inoculação da bactéria.
Durante o bioprocesso, foram coletadas amostras do meio fermentado de hora em hora (durante 6h), as quais
foram posteriormente utilizadas para determinar o crescimento celular por absorbância UV-Vis a 600 nm. A
produção de GFP foi analisada por fluorimetria em comprimentos de onda de excitação (395 nm) e emissão
(520 nm) específicos para quantificação da GFP, e por gel de eletroforese SDS-PAGE. Resultados e
discussão: Os resultados obtidos demonstraram que a 30ºC a E. coli apresenta uma fase exponencial de
crescimento da primeira hora até às 12h de incubação. Desse modo, determinou-se que a indução da
produção de GFP por adição de IPTG deveria ser após 6h de fermentação. As análises por eletroforese SDSPAGE confirmaram que ocorreu a produção da GFP logo após a indução, tendo sido observadas bandas
largas em todos os tempos coletados. As análises por fluorimetria demonstraram um aumento da
fluorescência com o decorrer do tempo de fermentação, mostrando que a E. coli possui grande capacidade de
produção da proteína. Conclusão: Os resultados obtidos mostraram que é viável a utilização da E. coli BL21
para a produção de GFP. A otimização da via fermentativa para a produção de GFP em larga escala é
fundamental quando se objetiva a sua purificação por técnicas mais econômicas e sustentáveis como os
SABs-LIs. Assim, a avaliação da produção de GFP foi uma etapa chave para a escolha dos melhores
sistemas para a sua recuperação direta a partir do caldo fermentado e viabilização de sua extração em escala
piloto (trabalho em desenvolvimento).
Palavras-chave: Proteína verde fluorescente, Escherichia coli BL21.
Apoio Financeiro: FAPESP(Processo 14/16424-7), CNPq, CAPES.