Construção de um vetor de expressão de siRNA contra o gene GFP

51º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 51º Congresso Brasileiro de Genética • 7 a 10 de setembro de 2005
Hotel Monte Real • Águas de Lindóia • São Paulo • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 85-89109-05-4
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Palavras Chaves: RNAi; GFP
Pujiz, RS; Vasques, LR; Strauss, B; Krieger JE
Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular; Instituto do Coração, Universidade de São Paulo.
Construção de um vetor de expressão
de siRNA contra o gene GFP
Após o seqüenciamento do genoma de diversos organismos, o grande desafio passou a ser identificar a
função dos genes. Existem diversas maneiras de inferir a função de um determinado gene, quer seja
por busca de homologia com genes já descritos em outros organismos, pela verificação do seu nível de
expressão em diferentes tecidos, ou pela localização da proteína dentro da célula. Entretanto, a função
de um determinado gene pode ser melhor analisada em sistemas biológicos. Manipulações genéticas
podem ser realizadas em cultura de células e em modelos animais para observação das alterações
fenotípicas e possíveis aplicações em terapias gênicas. Assim, além da expressão de gene exógeno,
diversas tecnologias vêm sendo desenvolvidas para a inibição da expressão de genes-alvos. Dentre
estas, o silenciamento gênico pós-transcricional por pequenos RNAs interferentes (siRNAs) tem se
mostrado bastante eficiente. Uma vez desenhados e sintetizados, estes siRNAs podem promover a
quebra da expressão no nível da transcrição, degradando o RNA do gene-alvo. Para a execução de
experimentos utilizando a interferência por RNA (RNAi) é importante demonstrar que o sistema
biológico em que será empregado é capaz de desencadear a inativação do gene-alvo com especificidade,
sem interferir na expressão de outros genes. Com este propósito, foi objetivo deste trabalho construir
um plasmídeo de expressão de siRNAs para a inativação do gene GFP (green fluorescent protein). O
siRNA-GFP (siGFP) gerado, pode tanto funcionar como um controle positivo da RNAi, demonstrando
que o sistema celular utilizado é capaz de desencadear a inativação do gene-alvo com especificidade,
como pode ser utilizado como controle negativo, demonstrando não interferir na expressão de outros
genes. O siGFP foi desenhado a partir de uma seqüência-alvo previamente descrita, e clonado no
vetor pBS/hU6-1. A integridade de sua seqüência foi confirmada por seqüenciamento automático e
o plasmídeo obtido em larga escala foi utilizado na transfecção da linhagem de glioma de rato C6GFP. A inativação do gene GFP foi observada na linhagem C6-GFP, onde foram obtidos clones
com níveis baixíssimos de expressão do gene quando observados em microscópio de fluorescência.
Assim, foi demonstrado que a linhagem de glioma de rato é capaz de desencadear a RNAi e pode ser
utilizada para a inativação de outros genes. Além disso, o plasmídeo poderá ser utilizado para testar
diferentes métodos de entrega do cassete de expressão de siRNAs em modelo animal GFP positivo,
em diferentes órgãos e tecidos.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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