localização subcelular da proteína do capsídeo

LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DA PROTEÍNA DO CAPSÍDEO DO VÍRUS RESPONSÁVEL PELA
DOENÇA AZUL DO ALGODOEIRO EM CÉLULAS DE TABACO TRANSGÊNICAS 1*
Tatiane da Franca Silva (UFRJ/ [email protected]), Régis Lopes Corrêa (UFRJ), Marcos de
Bonis (UFRJ), Gilberto Sachetto Martins (UFRJ) e Maite Vasln de Freitas Silva (UFRJ)
RESUMO - O agente causal da doença azul do algodoeiro, o Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) é um
vírus pertencente ao gênero Polerovirus família Luteoviridae. Membros desta família possuem RNA
genômico organizado em 5 a 6 fases abertas de leitura (ORFs). A ORF3 codifica a proteína do
capsídeo (CP) viral e a ORF 4 uma proteína do movimento, sendo transcrita a partir de uma mudança
de fase de leitura da ORF 3. A proteína codificada pela ORF 5 é responsável pela transmissão viral
sendo produzida através de uma fusão traducional com o capsídeo e expressa ocasionalmente através
do não reconhecimento do códon de terminação capsidial. Dentre as múltiplas funções da CP no ciclo
viral, está a ligação ao RNA e, possivelmente, o endereçamento da partícula para o núcleo . Com o
objetivo de compreender a função da CP, caracterizando a sua localização subcelular, promovemos a
transformação de células Nicotiana tabacum BY-2 com uma construção contendo a fusão da CPCLRDV e a proteína GFP (Green-Fluorescent protein). Analisando diversas linhagens transgênicas,
observamos a expressão da CP:GFP próximo ao núcleo, em vesículas associadas à membrana
perinuclear. Embora preliminares estes resultados já foram observados para outros luteovírus e abrem
novas perspectivas sobre o papel da CP no ciclo viral.
Palavras-chave: localização subcelular, capsídeo do CLRDV, doença azul
INTRODUÇÃO
Considerada uma das mais importantes patologias bióticas relatadas na cultura do algodão, a
doença azul do algodoeiro apresenta ampla disseminação, sendo encontrada nas Américas, África e
Asia. Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), membro da família Luteoviridae (gênero Polerovirus), foi
identificado como agente causal desta patologia (CORRÊA et al., 2005). Baseado na organização
genômica, mecanismos de expressão e estratégias de replicação, a família Luteoviridae é agrupada
em três genêros: Luteovirus, Polerovirus e Enamovirus (D’ARCY et al., 1999). Todos os membros da
família apresentam restrição aos feixes vasculares e o RNA genômico estruturado em cinco ou seis
fases abertas de leitura (ORFs) designadas ORF0 até ORF6 (PFEFFER et al., 2002).
As ORFs 1 e 2 estão sobrepostas, e codificam proteínas envolvidas com a replicação (RdRp RNA polimerases dependentes de RNA). A ORF3 codifica a proteína do capsídeo (CP) viral e a ORF4
a proteína do movimento, a qual é transcrita a partir de uma mudança da fase da leitura da ORF 3. A
proteína de transmissão (ORF5) é expressa ocasionalmente pelo não reconhecimento do códon de
término da ORF3. A ORF0 codifica uma proteína supostamente envolvida no processo de
silenciamento gênico (TERRADOT et al., 2001).
A proteína do capsídeo está envolvida em vários estágios do ciclo de vida viral. Exerce uma
função crucial na associação do vírus ao afídeo, além de participar de vários eventos pós-transmissão,
1 Agências Financiadoras: FACUAL e CNPq.
como o empacotamento da partícula e o acúmulo de RNA viral na planta (REUTENAUER et al., 1993;
BRAULT et al., 2003).
Com base na estrutura protéica da CP de outros vírus icosaédricos, a proteína pode ser
dividida em dois domínios. Um rico em arginina, que interage com o RNA viral, localizado na região Nterminal e o domínio da capa, que compõem a estrutura principal do capsídeo (LEE et al. 2005). Em
luteovirus, próximo à região N-terminal, há um putativo sinal de localização nuclear (NLS - nuclear
localization signals) (MUKHERJEE et al., 2003).
Vários trabalhos têm sugerido a associação de Luteovirus ao núcleo da célula vegetal.
Partículas íntegras de Beet western yellows virus, gênero Polerovirus (ESAU E HOEFERT, 1972), e de
Barley yellow dwarf virus, gênero Luteovirus (NASS et al., 1995), têm sido encontrada no núcleo. Esta
localização, provavelmente está sendo direcionada pelo sinal específico NLS, que pode apresentar
uma região de sobreposição ao domínio de ligação RNA. Estes domínios podem estar competindo
entre si, modulando o envolvimento da CP em diferentes funções durante as infecções por luteovirus
(HAUPT et al., 2005).
Com o objetivo de melhor entender a função da CP do CLRDV durante o processo de infecção,
caracterizou-se, neste trabalho, a localização subcelular da proteína do capsídeo. Para isso, células de
Nicotiana tabacum foram transformadas com uma construção contendo CP-CLRDV fusionada a
proteína verde fluorescente GFP (Green-Fluorescent Protein).
Luteovirus
Polerovirus
Enamovirus
Figura 1. Esquema do genoma dos gêneros Luteovirus, Polerovirus e Enamovirus. Os números 0 a 5
correspondem as OFRs 0 a 5, respectivamente
MATERIAL E MÉTODOS
A seqüência integra da ORF3, obtida por PCR utilizando oligos específicos para a amplificação
da CP integra, foi clonada, através do sistema de recombinação Gateway (KARIMI et al., 2002) no
vetor de destino pK7FWG2. A construção resultante originou a fusão da CP a GFP sob o controle do
promotor, constitutivamente expresso 35S do Cauliflower mosaico vírus. Esta construção foi inserida,
por eletroporação, na cepa LB404 de Agrobacterium tumefaciens. Células BY-2 (Bright Yellow - 2) de
Nicotiana tabacum foram co-inoculadas com a cultura de bactérias transformantes, durante três dias no
escuro. Em seguida, a co-cultura foi plaqueada em meio de seleção, contendo os antibióticos
vancomicina e canamicina, e mantidas no escuro a 28 °C por duas ou três semanas. Após este
período, vários calos, supostamente transformados, foram obtidos e isoladamente transferidos para
uma nova placa contendo o mesmo meio seletivo. A expressão de GFP foi confirmada por análise em
microscópio confocal e de fluorescência.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Através do sistema de clonagem por recombinação Gateway obtive-se a CP do CLRDV
fusionada a GFP no vetor de transformação por Agrobacterium tumefaciens pKFWG2. Cepas de
agrobacterium contendo este vetor foram usadas para transformar células da linhagem de crescimento
contínuo de tabaco BY-2. Após transformação e seleção, linhagens de calos transgênicas foram
analisadas por microscopia. Verificou-se, por meio de análise em microscópio de fluorescência, uma
fraca expressão da proteína GFP no núcleo ou próximo a ele nas linhagens transgênicas de BY-2 (Fig.
2). Uma análise preliminar em microscópio confocal permitiu a localização mais detalhada da
expressão CP-GFP, em vesículas próximas ou associadas à membrana perinuclear (Fig. 3). Estas
estruturas vesiculares foram encontradas em 32 linhagens independentes de BY-2 transgênicas, e
podem ser observadas em microscopia sob luz visível; entretanto, encontram-se ausentes tanto em
células BY-2 não transgênicas quanto em células transformadas somente com a proteína GFP (Fig. 4).
Vários trabalhos têm descrito a associação de partículas virais de luteovírus, como o Beet
western yellows vírus (ESAU E HOEFERT, 1972) ou o Barley yellow dwarf virus (NASS et al., 1995), ou
ainda somente a proteína do capsídeo com o núcleo (HAUPT et al., 2005). Embora partículas virais do
PLRV (Potato leafroll virus, gênero Polerovirus) não tenham sido encontradas nesta organela, a
seqüência do capsídeo apresenta NLS, e sua localização nuclear foi confirmada por imunomicroscopia
e pela expressão da fusão protéica CP::GFP. A função desta proteína, isolada da partícula viral, no
núcleo ainda não foi elucidada, mas possivelmente pode estar de alguma forma controlando a
expressão gênica do hospedeiro (HAUPT et al., 2005).
Para melhor visualização das alterações observadas na membrana perinuclear das linhagens
transgênicas CP:GFP as células transformadas foram submetidas à microscopia eletrônica. A análise
em microscópio de transmissão revelou um padrão alterado da membrana nuclear presente apenas
nas linhagens expressando a CP do CLRDV. Inúmeras vesículas formadas aparentemente por
evaginações na membrana nuclear foram observadas. Um exemplo é mostrado na figura 5. A fim de
analisar se a formação de vesículas estava relacionada diretamente a presença da CP viral ou a algum
evento durante a transformação apenas, foram analisados ao ME células de BY-2 não transformadas e
células de BY-2 transformadas apenas com o gene da GFP (GFP livre). Em ambos os casos não se
observou a formação de vesículas perinucleares. A formação destas vesículas, portanto, está
associada à CP do CLRDV.
Vesículas associadas à membrana nuclear e a membrana plasmática foram também
observadas em análises ao ME de cortes ultrafinos realizadas com células de floema de plantas de
algodão infetadas com o CLRDV emblocadas (Fig. 6). Padrão de vesiculação similar ao encontrado
neste trabalho foi descrito anteriormente em plantas infectadas com outros vírus da família
Luteoviridae, por exemplo com o Pea enation mosaic virus (ZOETEN et al., 1972) (Fig. 5E). A função
destas vesículas no processo de infecção necessita de maiores estudos, porém alguns autores
sugerem função no transporte do capsídeo para o núcleo onde poderia estar ocorrendo à montagem da
partícula viral (Esau e Hoefert, 1972).
CONCLUSÕES
Os dados preliminares obtidos neste trabalho revelam a associação da CP do CLRDV com a
membrana nuclear da célula vegetal a com a sua morfologia alterada. Para melhor caracterização da
localização do capsídeo do CLRDV, estão sendo geradas plantas transgênicas de tabaco expressando
a fusão CP::GFP e construções contendo: deleções na seqüência da CP, fusões da ORF4 e 5 com a
proteína GFP.
CONTRIBUIÇÃO PRÁTICA E CIÊNTÍFICA DO TRABALHO
Este trabalho revela, pela primeira vez, à capacidade da CP, na ausência da partícula viral
integra, em reproduzir o padrão de vesiculação encontrado. Além de abrir novas perspectivas sobre o
papel da CP no ciclo viral.
Figure 2: Localização intracelular da CP do CLRDV fusionada a GFP. Imagens em microscópio de
fluorescência sob luz UV. A - Linhagem transformada somente com a proteína GFP; B-D - Linhagens
transformadas com a construção CP-CLRDV fusionada a GFP.
Figura 3: Localização intracelular da CP do CLRDV fusionada a GFP. A – Imagens de microscopia
confocal das linhagens transgênicas sob luz ultravioleta; B – Imagens de microscopia sob a luz visível
de linhagens transgênicas BY-2 CP:GFP. C - sobreposição das imagens A e B mostrando a colocalização de CP;GFP e vesículas perinucleares; D - microscopia, sob a luz visível, de células de
calos não transformadas de BY-2, mantidos nas mesmas condições que as linhagens transgênicas.
A
B
C
D
Figura 4, Microscopia sob a luz visível, A e B – Linhagens transgênica CP:GFP; C – linhagens
transformada somente com GFP; D – Células BY- 2 selvagens (não transgênicas).
A
B
E
D
Ne
W
C
Va
Figura 5. Microscopia eletrônica mostrando a formação de vesículas perinucleares em linhagens
transgênicas CP:GFP e em plantas infectadas com luteovirus. A - Células BY-2 selvagens. B e C
ampliações da figura D, mostrando detalhe da membrana nuclear vesiculada. D - BY-2 transformadas
com a construção CP:GFP. E- Planta infectada com Pea enation mosaic virus (Zoeten et al., 1972); N,
nucleo; Ne, membrana nuclear; W – parede celular; Ves, vesículas; Va, vacúolo. A barra presente em
A,B,C e D equivale a 3µm e em E 1µm.
W
N
Figura 6. Microscopia Eletrônica de plantas de algodão infectadas em casa de vegetação com o
CLRDV ; N, núcleo; W, parede celular. Barra: 3 µm.
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