Populações microbianas e perfil fermentativo em

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
VIÇOSA-MG-BRASIL
Novo Plano de Estudos
“Populações microbianas e perfil fermentativo em silagens de alfafa
tratadas com inoculantes microbianos e enzimáticos”
Odilon Gomes Pereira
Junho/2008
1. Resumo
Denomina-se silagem o produto de uma fermentação anaeróbia controlada de
determinada forragem verde, armazenada em uma estrutura denominada silo, enquanto que
ensilagem refere-se ao termo utilizado para definir o conjunto de operações destinadas ao
enchimento do silo (corte, picagem, transporte, compactação etc). O processo de produção
de silagem envolve a acidificação da massa ensilada pelos produtos da fermentação (ácidos
orgânicos, principalmente ácido lático) de açúcares presentes na planta.
A acidificação é o resultado natural do metabolismo de bactérias presentes na
cultura, por ocasião da colheita. Os tipos e as quantidades de ácidos dependem do conteúdo
de umidade da cultura na época da ensilagem e da população relativa de diferentes espécies
de bactérias presentes na cultura, conhecida como microflora epifítica (Wilkinson et al.,
2003). O processo de ensilagem é complexo, devido ao grande número de microrganismos
envolvidos, e pode ser considerada uma metabiose, ou seja, ocorre o desenvolvimento
simultâneo e sucessivo de microrganismos de diversos gêneros e espécies, que dependem
principalmente do pH, do potencial de oxirredução e do tipo e quantidade de substratos
presentes no meio.
Uma adequada acidificação é essencial para o êxito de preservação da massa
ensilada, especialmente quando a concentração de umidade da cultura é relativamente alta,
devido à acidez prevenir o desenvolvimento de microrganismos deterioradores, que são
menos tolerantes às condições ácidas do que as bactérias produtoras do ácido lático (BAL)
(Woolford, 1984; McDonald et al., 1991).
Embora a produção de silagem seja um processo natural, iniciado pela população
microbiana epifítica presente nas plantas por ocasião da colheita, inoculantes comerciais
para silagem, consistindo de culturas puras ou mistas de BAL homoláticas são
frequentemente adicionadas pelos produtores por ocasião da ensilagem, visando favorecer a
fermentação homolática e garantir uma silagem de alta qualidade (Bolsen et al., 1996).
Assim, objetiva-se, com esse estudo, quantificar a população microbiana de silagens de
alfafa tratadas com dois inoculantes microbianos e um enzimático usando-se meios de
culturas seletivos. Serão realizadas, também, análises da composição bromatológica (FDN,
FDA e PB) e do padrão fermentativo das silagens.
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2. Introdução e Justificativa:
A utilização de forragens conservadas, principalmente na forma de silagem, é uma
alternativa viável, para que se possa garantir o fornecimento de forragem de alta qualidade,
durante o período de escassez de alimentos. Neste contexto, as culturas de milho e sorgo
têm se destacado como as espécies mais utilizadas no processo de ensilagem, por sua
facilidade de cultivo, altos rendimentos e, especialmente, pela qualidade da silagem
produzida. O potencial de uma planta para ensilagem é dependente do teor original de
umidade, que deve situar-se próximo a 70%, do conteúdo de carboidratos solúveis (acima
de 8% na MS) e do baixo poder tampão, que não deve oferecer resistência à redução do pH
para valores entre 3,8 e 4,0 (McCullough, 1977).
Os parâmetros mais utilizados na avaliação da qualidade da silagem são os teores de
ácidos orgânicos (lático, acético e butírico), nitrogênio amoniacal e pH. No entanto, o teor
adequado de matéria seca, antes da ensilagem, é um fator importante para que ocorra uma
boa fermentação no silo (Ashbell e Weinberg, 2003), evitando fermentações indesejáveis.
Além disso, a matéria seca está intimamente ligada à maturidade da planta, e, à medida que
ocorre seu amadurecimento, menor será o teor de nitrogênio não protéico, proteína bruta e
digestibilidade in vitro da matéria seca das silagens (Snyman e Joubert, 1996).
O pH indica, geralmente, se a fermentação foi adequada ou não (Fisher e Burns,
1987). Os valores adequados situam-se entre 3,8 e 4,2, sendo que, acima desse valor, há a
indicação de fermentação butírica (McDonald et al., 1991). O ácido lático é produzido pelas
bactérias dentro do silo, as quais têm como principal substrato os carboidratos solúveis
(Weinberg e Muck, 1996), cujo aumento é responsável pela redução dos valores de pH, das
concentrações de ácido butírico e de nitrogênio amoniacal (Langston et al., 1962).
Portanto, pode-se inferir que o processo de ensilagem é complexo devido aos vários
fatores que se relacionam, como a espécie vegetal utilizada e suas características físicoquímicas, tanto quanto a variação da microflora epifítica entre espécies vegetais, das
condições climáticas, da condução das operações de ensilagem, da extensão do período de
conservação e do manejo do fornecimento da silagem após a abertura do silo. Além disso,
envolve mudanças bioquímicas dos substratos, devido à ação de vários grupos de
microrganismos. Desta forma, o conhecimento da microflora pode auxiliar na compreensão
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das interações que possam ocorrer dentro e fora do silo, podendo tornar-se mais um
parâmetro para avaliação da qualidade de silagens.
Deve-se salientar que a ensilagem tem como principal objetivo maximizar a
preservação original dos nutrientes encontrados na forragem fresca, durante o
armazenamento, com o mínimo de perdas de matéria seca e energia. Para tal, é necessário
que a respiração da planta e sua atividade proteolítica, bem como a atividade clostrídica e o
crescimento de microrganismos aeróbios, sejam limitados.
Além do manejo adequado, a planta ao ser colhida deve apresentar um teor de
umidade ideal para a ocorrência de uma compactação ótima da massa ensilada e
manutenção dos nutrientes, bem como o teor de carboidratos solúveis necessita ser
suficiente para promover uma boa fermentação. Os substratos disponíveis para a
fermentação são usados por microrganismos que utilizam rotas metabólicas diferenciadas,
com a consequente produção de ácido lático, principal produto da fermentação de bactérias
láticas, ou de outros produtos, tais como etanol e CO2, que são indesejáveis, tanto pela
perda de energia no processo fermentativo da silagem (característica de silagens pobres em
proteína), quanto por ser um composto neutro para a nutrição do ruminante (Van Soest,
1994). Portanto, uma população adequada de bactérias láticas é necessária para garantir
uma boa produção de ácido lático, promovendo uma redução mais rápida no pH, inibindo a
atividade de microrganismos deletérios à silagem, como enterobactérias, bactérias
clostrídicas e outros. Neste contexto, os inoculantes comerciais, consistindo de culturas
puras ou mistas de BAL homoláticas, são frequentemente adicionados pelos produtores, por
ocasião da ensilagem, visando favorecer a fermentação homolática e garantir uma silagem
de alta qualidade (Bolsen et al., 1996). Estes inoculantes são produtos seguros, fáceis de
serem manuseados, não corrosivos e não poluentes, sendo considerados produtos naturais
(Filya et al., 2000). Em contraste às bactérias homoláticas, que melhoram principalmente o
início do processo de ensilagem, um novo microrganismo de silagem, o Lactobacillus
buchneri, tem sido bem sucedido na melhoria da estabilidade aeróbia de silagens. O
Lactobacillus buchneri foi aprovado para uso nos Estados Unidos em 2001 e, em 2003,
reivindicou-se o título de “melhorador” de estabilidade aeróbia de silagens, reivindicação
esta que nenhum outro fabricante de inoculante de silagem pode fazê-la legalmente (Kung
Jr., 2006).
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O estudo da flora epifítica ou flora original das plantas, segundo Pahlow (1989),
tem revelado resultados altamente variáveis quanto à composição e ao número de
microrganismos. Estes parâmetros estão sujeitos aos fatores ambientais, os quais são
influenciados pela localização geográfica, onde os estudos estão sendo conduzidos. Deste
modo, os fatores climáticos e a composição das plantas irão interferir diretamente nos
vários complexos bioquímicos e processos microbiológicos que transcorrem desde o
momento da colheita da forragem até o fornecimento da silagem ao animal.
Portanto, pesquisas de identificação da flora epifítica da forrageira são essenciais,
antes da recomendação do uso de inoculantes microbianos (Pahlow, 1989; Pitt, 1990).
Pahlow (1989), na Alemanha, observou que a população lática epifítica encontrada em
plantas de milho variou de 5 x 103 a 1 x 107 unidades formadoras de colônia por grama de
forragem fresca (ufc/g). Para que as BAL dos inoculantes obtenham êxito, estas devem
superar a população epifítica de BAL da forragem ensilada, tornando-se a população
dominante. Neste contexto, segundo Mahanna (1993), taxas de inoculação da ordem de 105
células viáveis/g de forragem seriam suficientes para que a população de bactérias
produtoras do ácido lático seja dominante no processo de fermentação. No entanto, este
mesmo autor comenta que a aplicação excessiva de bactérias láticas não é recomendada,
pois promoverá uma rápida fermentação, de modo que o material ensilado conservará suas
características nutritivas por um período bem menor após a abertura do silo, se comparado
à silagem devidamente inoculada.
O uso de aditivos microbianos representa uma importante ferramenta, pois contribui
para a redução da proteólise enzimática, advinda do rápido decréscimo do pH dentro do
silo, favorecendo a produção de grandes quantidades de ácido lático, o que representa uma
possibilidade de ocorrer maior recuperação da matéria seca ensilada (Henderson, 1993).
As BAL da microflora epifítica são essenciais para fermentação da massa ensilada,
conforme já destacado. Entretanto, nenhum grupo varia tanto, em número, quanto este, indo
do limite de detecção (101) a 105 UFC g-1 forragem, na alfafa, 106, em gramíneas perenes, e
107, em milho e sorgo (Pahlow et al., 2003). A população de BAL, na cultura a ser ensilada,
encontra-se em baixo número, aumentando consideravelmente ente a colheita e a
ensilagem. Isto se deve à reativação de células dormentes e não culturáveis de BAL,
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durante o processo de picagem (Woolford, 1984; McDonald et al., 1991), ocorrendo
mudanças substanciais na população de espécies individuais de BAL.
Já as enzimas são aditivos relativamente novos quando comparados aos
inoculantes bacterianos sendo que a maioria das enzimas utilizadas nos aditivos para
silagem é produto microbiano, tendo atividade enzimática. Aditivos enzimáticos são
produtos contendo uma variedade de proteínas que auxiliam em certas reações bioquímicas
na silagem. As classes mais comuns de enzimas nestes produtos são as celulases,
hemicelulases e amilases. Os aditivos à base de enzimas podem conter um único complexo
enzimático, uma combinação de complexos enzimáticos e uma combinação desses
complexos com bactérias do ácido lático (Kung Jr., 2002). Os principais objetivos das
enzimas são: 1) reduzir o teor de fibra da silagem e 2) proporcionar açúcar extra para
fermentação.
Naquelas espécies que apresentam baixo conteúdo de açúcar, as enzimas poderiam
aumentar os produtos da fermentação, favorecendo a produção de ácido lático e redução do
pH (Muck e Bolsen, 1991; Muck e Kung Jr., 1997). Isto ocorre principalmente em
leguminosas e gramíneas ensiladas com 60-75% de umidade, uma vez que, nessas silagens,
o menor pH e os produtos adicionais da fermentação poderiam inibir leveduras e fungos,
resultando em melhor estabilidade aeróbia (Muck e Kung Jr., 1997).
Embora esses aditivos já sejam utilizados a algum tempo, algumas questões a
respeito da interação de inoculantes microbianos e enzimáticos e os efeitos desta interação
sobre o perfil fermentativo e a população microbiana em silagens de alfafa ainda não estão
respondidas. Portanto, objetiva-se com o presente estudo avaliar a população de batérias
produtoras do ácido lático, enterobactérias, fungos e leveduras e o perfil fermentativo
(ácidos lático, acético e butírico e pH e nitrogênio amoniacal), bem como o teor de FDN e
FDA em silagens de alfafa tratadas com dois inoculantes microbianos e um enzimático.
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3. Síntese da Bibliografia de Referência
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4. Objetivos
1- Quantificar a população de bactérias produtoras de ácido lático, enterobactérias e fungos e
leveduras em silagens de alfafa, na presença ou ausência de inoculantes microbianos e
enzimáticos, em diferentes períodos de fermentação;
2- Avaliar o perfil fermentativo e o conteúdo de matéria seca, PB e FDN e FDA.
5. Metodologia Empregada
Propõe-se a condução deste experimento, objetivando-se quantificar a população
microbiana,
bem
como
avaliar
o
perfil
fermentativo
em
silagens
de
alfafa (Medicago sativa), produzidas com dois inoculantes microbianos e um enzimático. A
alfafa será ensilada em sacos de náilon, os quais serão selados a vácuo. Em cada saco será
colocado cerca de 500g de forragem. Após a ensilagem os sacos (bags) serão armazenados
em temperatura ambiente. Por ocasião da ensilagem, será feita a aplicação de dois
inoculantes bacterianos e de um enzimático, segundo recomendações dos fabricantes, com
auxílio de um pulverizador de 500ml de capacidade. No tratamento controle (sem aditivo),
será aplicado a mesma quantidade de água a ser usada nos tratamentos com aditivados.
Adotar-se-á um arranjo fatorial 4x5 (três aditivos e um controle x cinco períodos de
fermentação), no delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro
repetições. Os períodos de fermentação serão: 0; 2; 4; 7 e 60 dias.
5.1. Análises laboratoriais
O teor de MS da forragem e das silagens será determinado por meio de secagem em
estufa de ventilação forçada a 60o C por 48 h. Essas amostras serão moídas em moinho tipo
“Willey”, com peneira de 1 mm e armazenadas para posteriores análises laboratoriais. Nas
amostras moídas serão efetuadas determinações de FDN e FDA segundo Van Soest e
Robertson (1985). O nitrogênio total será determinado pela pela combustão da amostra
(Leco CNS 2000 Analyzer, Leco Corporation, St. Joseph, MI).
Amostras da forragem fresca e das silagens (25g) serão homogeneizadas em
225 mL de uma solução estéril por 1 min. O pH dessa mistura será registrado
imediatamente em pegâmetro. Em seguida, será realizada a filstragem dessa mistura em
papel de filtro Whatman 54 para obtenção do extrato aquoso. Amostras do extrato aquoso
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serão diluídas sucessivamente a analisadas para bactérias do ácido lático (BAL),
enterobactérias, leveduras e fungos, utilizando-se meios de culturas seletivos para cada
grupo microbiano. O número de BAL será determinado pelo plaqueamento em Agar
Rogosa (Oxoid). As placas serão incubadas a 32oC por 48h. O número de enterobactérias
será determinado pelo plaqueamento em Violet Red Bile Glucose Agar (Oxoid), em
sobrecamada. As placas serão incubadas 36oC por 18h. Leveduras e fungos serão
determinados pelo plaqueamento em Malt Extract Agar (Oxoid), o qual será acidificado
com ácido lático 85%, na concentração 0.5vol/vol, após a autoclavagem. As placas serão
incubadas a 32oC por 48h.
Uma porção do extrato aquoso será acidificada com ácido sulfúrico 50%, para reduzir
o pH deste e em seguida armazenada em freezer. Nesse extrato serão efetuadas determinações
dos ácidos lático, acético e butírico em HPLC, segundo Muck & Dickerson (1998). No extrato
aquoso também serão determinados nitrogênio amoniacal (Chaney e Marbach, 1962) e
carboidratos solúveis em água (Nelson, 1944).
5.2. Análises Estatísticas
Os dados referentes ao perfil fermentativo e a composição bromatológica serão
analisadas utilizando-se o programa estatístico SAS (1999). Na comparação dos fatores
qualitativos será utilizado o teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade, para a
comparação das médias.
6. Plano de Trabalho e Cronograma de Execução
Durante o estágio, planeja-se desenvolver as seguintes atividades:
- Preparar amostras de silagens de alfafa para quantificação da população microbiana;
- Preparar meios de cultura seletivos para quantificação da população microbiana;
- Preparar amostras para determinações da composição bromatológica, bem como aquelas
referentes ao perfil fermentativo (pH, nitrogênio amoniacal e ácidos orgânicos);
- Realizar as análises laboratoriais acima relatadas; e,
- Revisão de literatura e redação do relatório.
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Além das atividades acima, o estágio proporcionará oportunidades para
acompanhamento de outros projetos desenvolvidos com silagens na Delaware University,
bem como, acompanhar o funcionamento de outros equipamentos.
Cronograma de execução
Ano
Atividade
Mês
J
- Ensilagem
-Preparação de meios de culturas e
F M A M J
J
A S O N D
X X
X X X X
quantificação das populações microbianas;
- Análises bromatológicas, de pH e ácidos
2008
X X X X
orgânicos;
- Tabulação dos dados e análises
X X
estatísticas;
- Redação do relatório.
X
7. Forma de Análise de Resultados
A área de microbiologia de silagens e sua relação com o perfil fermentativo da
massa ensilada, tem despertado grande interesse entre os pesquisadores que trabalham com
conservação de forragens. Como resultado desse estágio, esperamos nosso aprimoramento
com técnicas relacionadas a quantificação microbiana em silagens, bem como,
oportunidade para conhecimento de novas técnicas relacionadas ao assunto, possibilitando
assim oportunidade para intensificação de pesquisas com microbiologia de silagens em
condições tropicais, onde estudos desta natureza ainda são bastante escassos. Esperamos
ainda, que o presente estágio nos proporcione condições para ajustes e, ou, inserções de
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novos procedimentos metodológicos nos projetos desenvolvidos em nosso programa de
pós-graduação, para que possamos entender melhor a dinâmica de microrganismos e o
processo de fermentação de silagens produzidas com forrageiras de clima tropical. Além da
formação pessoal, estágios desta natureza também proporcionam oportunidade para
fortalecimento do nosso programa de pós-graduação e inserção do mesmo em nível
internacional.
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