Isolamento e sequenciamento do DNA ribossomal de duas

Isolamento e sequenciamento do DNA ribossomal de duas prováveis
bactérias simbióticas a partir de culturas do nematóide anidrobiótico
Panagrolaimus superbus
Guidelli, ¹ GV; Evangelista, CCS ¹; Tunnacliffe, A2; Pereira, ¹ TC.
1 – Lab. de Genética Molecular da Anidrobiose, FFCLRP-USP.
2 - Institute of Biotechnology, University of Cambridge, United Kingdom.
1. Objetivos
O nematóide P. superbus faz parte de um
seleto grupo de organismos capazes de
sobreviver à dessecação extrema, ingressando
em um estado de animação suspensa
conhecido como anidrobiose ("vida sem água").
Notou-se que culturas deste verme mantidas
em laboratório apresentam organismo(s)
contaminante(s) que, quando eliminados via
hipoclorito de sódio, impedem o seu
crescimento. Adicionalmente, o nematóide
parece alimentar-se preferencialmente deste(s)
organismo(s) em detrimento de OP50
(linhagem de alimentação). Considerando estas
observações, sugere-se a existência de uma
relação ecológica essencial entre essas
espécies, e a partir disso, decidimos isolar,
caracterizar e identificar o(s) organismo(s)
contaminante(s).
2. Métodos
Para o isolamento do organismo coletou-se
uma amostra em meio NGM, crescendo em LB
líquido, plaqueando-a sobre LB ágar. Clones
com coloração e morfologia distinta de OP50
foram coletados, repetindo-se o procedimento
três vezes até o completo isolamento do
organismo. Posteriormente, realizou-se o
sequenciamento do DNA ribossomal (16S),
utilizando-se o método de PCR. O teste de
resistência foi realizado em apenas um dos
organismos contaminantes, utilizando-se os
seguintes compostos: deferoxamina, colistina,
canamicina,
estreptomicina,
ampicilina,
tetraciclina e cloranfenicol. Para análise da
resistência a dessecação extrema apenas um
dos contaminantes foi submetido a um
ambiente contendo sílica gel (dessecação),
sendo, posteriormente, reidratado com LB.
3. Resultados
O procedimento permitiu o completo isolamento
de
duas
espécies
contaminantes.
O
sequenciamento do DNA ribossomal revelou
tratar-se de: uma espécie pertencente ao
gênero Ralstonia e uma espécie de bactéria
não cultivada. O tratamento com antibióticos
demonstrou que Ralstonia sp. é resistente aos
seguintes compostos: deferoxamina, colistina,
canamicina, estreptomicina e ampicilina, mas
suscetível a cloranfenicol e tetraciclina. Quando
as colônias de P. superbus eram tratadas com
algum destes dois últimos antibióticos, os
vermes interrompiam seu crescimento. No
experimento de resistência à dessecação a
taxa de sobrevivência da bactéria não cultivada
foi semelhante a do grupo controle.
4. Conclusões
A identificação dessas bactérias, possivelmente
essenciais para o ciclo de vida do nematóide P.
superbus, constitui o primeiro passo para a
elucidação da relação ecológica entre essas
bactérias e o verme. Estudos mais detalhados
com relação à suscetibilidade a antibióticos e a
resposta dessas bactérias diante do estresse
hídrico extremo poderão esclarecer possíveis
relações evolutivas referentes ao processo de
anidrobiose.
5. Referências Bibliográficas
Tunnacliffe, A. and Lapinski, J. (2003)
Resurrecting Van Leeuwenhoek’s rotifers: a
reappraisal of the role of disaccharides in
anhydrobiosis. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B
358, 1755–1771.