INSTITUTO OSWALDO CRUZ Carlos André Mandarino Silva
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Carlos André Mandarino Silva Estudo do envolvimento do receptor nuclear PPAR na infecção pulmonar induzida por Klebsiella pneumoniae Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e Molecular Orientadores: Drª. Adriana Ribeiro Silva Dr. Cassiano Felippe Gonçalves de Albuquerque RIO DE JANEIRO 2015 FICHA CATALOGRÁFICA A SER ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DE MANGUINHOS PARA A VERSÃO FINAL DA TESE (A ser impressa no verso da primeira folha de rosto) INDICAR APENAS AS PALAVRAS-CHAVE NA VERSÃO APRESENTADA PARA A DEFESA PÚBLICA DA TESE Palavras chaves Pneumonia, sepse, PPARγ, Klebsiella pneumoniae INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Carlos André Mandarino Silva Estudo do envolvimento do receptor nuclear PPAR na infecção pulmonar induzida por Klebsiella pneumoniae ORIENTADORES: Drª. Adriana Ribeiro Silva Dr. Cassiano Felippe Gonçalves de Albuquerque Aprovada em: _____/_____/_____ EXAMINADORES: Prof. Drª. Ana Paula D'Alincourt Carvalho Assef Prof. Drª. Patricia Burth Prof. Drª. Gisele Pena de Oliveira Prof. Drª. Tatiana Paula Teixeira Ferreira Prof. Drª. Ana Paula Teixeira Monteiro Rio de Janeiro, 14 de maio de 2015 iii AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Roberto e Silvana, pelo amor incondicional, por toda a educação, ajuda e incentivo, sempre apoiando as minhas escolhas. A minha esposa Fabiana e meu filho, João Vitor, por toda compreensão nos momentos de ausência, por estarem do meu lado sempre, alegrando meus dias e me motivando nesta caminhada. Agradeço aos meus orientadores, Drª. Adriana Ribeiro Silva e Dr. Cassiano Gonçalves de Albuquerque, por terem me aceitado no seu grupo, por todos os ensinamentos, arranjando sempre uma solução simples e correta nos momentos de desespero. Aos amigos, Alessandra, Carol, Cristina, Gabriel, Larissa, Priscila, Raissa e Vitor, pela amizade e por estarem sempre dispostos a me ajudar nos dias dos experimentos. Sem vocês seria impossível concluir este trabalho. A Rose Branco pela amizade, carinho e por todo o seu apoio administrativo. Aos vizinhos de bancada, André Costa, Isaclaudia e Isabel, pela paciência com o amigo espaçoso nos dias de experimento. E por profetizar a seguinte frase: “Não importa o quanto você se organize, no final do mestrado vai ficar muito atolado”. Vocês estavam certos! A todos da secretaria acadêmica da Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular do Instituo Oswaldo Cruz, pelo apoio acadêmico e técnico para a realização deste trabalho. iv SUMÁRIO Resumo................................................................................................................................. vii Abstract................................................................................................................................ viii Lista de abreviaturas............................................................................................................ ix Lista de figuras..................................................................................................................... xii 1. Introdução..................................................................................................................... 1 1.1.Sepse: Conceito e epidemiologia..................................................................... 1 1.2.Fisiopatologia da sepse.................................................................................... 2 1.2.1. Origem das infecções................................................................................. 2 1.2.2. Reconhecimento de produtos microbianos e ativação da resposta inflamatória................................................................................................ 3 1.2.3. Mediadores da resposta inflamatória......................................................... 4 1.2.4. Ativação dos macrófagos........................................................................... 5 1.2.5. Ativação do endotélio e migração de células inflamatórias....................... 5 1.2.6. Mecanismos microbicidas dos neutrófilos................................................. 7 1.2.7. Tratamento na sepse................................................................................... 7 1.2.8. Receptores Ativados por Proliferadores de Peroxissomos........................ 8 1.2.9. Agonistas dos PPAR.................................................................................. 10 1.2.10. Papel do PPARγ no pulmão....................................................................... 11 2. Objetivos....................................................................................................................... 14 2.1. Objetivos gerais.............................................................................................. 14 2.2.Objetivos específicos....................................................................................... 14 3. Materiais e métodos..................................................................................................... 15 3.1.Animais........................................................................................................... 15 3.2.Inoculação com K. pneumoniae....................................................................... 15 3.3.Tratamento com ligantes do PPARγ................................................................ 16 3.4.Lavado broncoalveolar..................................................................................... 16 3.5.Contagem total e diferencial das células do lavado broncoalveolar................ 16 3.6.Análise do grau de severidade da sepse – escore clínico................................. 16 3.7.Histologia e escore patológico......................................................................... 17 3.8.Avaliação da carga bacteriana......................................................................... 17 3.9.Dosagem de citocinas....................................................................................... 17 v 3.10.Análise estatística........................................................................................... 18 4. Resultados..................................................................................................................... 19 4.1. Análise da sobrevida de animais infectados com K. pneumoniae.................. 19 4.2. Efeito do pós-tratamento com rosiglitazona na sobrevida dos animais após a injeção intratraqueal de bactérias.......................................................... 20 4.3. Efeito da rosiglitazona no escore clínico de gravidade da sepse em camundongos inoculados com de K. pneumoniae........................................... 21 4.4. Análise do tecido pulmonar.......................................................................... 22 4.5. Analise da celularidade do lavado broncoalveolar de camundongos inoculados com K. pneumoniae e tratados com rosiglitazona......................... 23 4.6. Efeito da rosiglitazona sobre a produção de citocinas no lavado broncoalveolar.................................................................................................. 25 4.7. Quantificação de unidades formadoras de colônia no lavado broncoalveolar de animais submetidos a instilação intratraqueal com K. pneumoniae...................................................................................................... 27 4.8. Análise do papel do PPARγ nos parâmetros inflamatórios de animais inoculados com K. pneumoniae....................................................................... 29 5. Discussão....................................................................................................................... 31 6. Conclusões..................................................................................................................... 36 7. Referências Bibliográficas........................................................................................... vi 37 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Estudo do envolvimento do receptor nuclear PPAR na infecção pulmonar induzida por Klebsiella pneumoniae RESUMO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Carlos André Mandarino Silva A pneumonia é uma das principais causas de sepse, com alta mortalidade nas unidades de terapia intensiva (UTI), mesmo com os recentes avanços da medicina. O estudo da sepse e de novas alternativas terapêuticas permanecem um desafio devido à complexidade desta síndrome, cujo principal componente é uma resposta inflamatória exacerbada. O PPARγ (receptor ativado por proliferadores de peroxissoma) é um fator de transcrição da família de receptores nucleares, caracterizados por seu padrão de distribuição nos tecidos e por sua função metabólica. Recentemente, várias populações de leucócitos, incluindo monócitos/macrófagos, linfócitos e células dendríticas, também têm sido evidenciadas expressando PPARγ, sugerindo um importante papel para esta molécula na regulação de respostas imunes. O fármaco antidiabético rosiglitazona pertence à família das tiazolidinedionas. Este fármaco é agonista de PPARγ e apresenta além dos efeitos no metabolismo da glicose, uma potente ação anti-inflamatória, inclusive nas células do trato respiratório. Nosso objetivo principal foi caracterizar o papel do PPARγ em um modelo de pneumosepse em camundongos Swiss webster. Os animais foram desafiados com a bactéria Klebsiella pneumoniae, uma importante causadora de infecções relacionadas à assistência à saúde, tanto no meio ambiente comunitário quanto hospitalar. Foram feitas análises de sobrevida, parâmetros inflamatórios, produção de citocinas, migração celular e eliminação bacteriana no lavado broncoalveolar 24 horas após a instilação intratraqueal de K. pneumoniae. Os animais foram tratados ou não com o agonista de PPARγ, rosiglitazona e/ou seu antagonista, GW9662, 5 horas após o desafio com a bactéria. O tratamento aumentou a sobrevida e causou melhora no quadro clínico dos camundongos desafiados e tratados com rosiglitazona. A rosiglitazona diminuiu a produção de mediadores pró-inflamatórios como TNF-α, IL-6. A infecção com K. pneumoniae levou a um aumento no acúmulo de neutrófilos no pulmão e o pós-tratamento com rosiglitazona foi capaz de reverter este fenômeno, diminuindo também o número de unidades formadoras de colônias (UFC) do lavado broncoalveolar. A administração do antagonista do PPARγ, GW9662 30 min antes da administração da rosiglitazona foi capaz de reverter seus efeitos anti-inflamatórios, demonstrando que os efeitos protetores da rosiglitazona dependem da ativação do PPARγ. A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais o PPARγ modula a sepse induzida por pneumonia é de extrema importância para que novas intervenções terapêuticas sejam propostas para o tratamento da sepse. vii INSTITUTO OSWALDO CRUZ Estudo do envolvimento do receptor nuclear PPAR na infecção pulmonar induzida por Klebsiella pneumoniae ABSTRACT DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Carlos André Mandarino Silva Pneumonia is a leading cause of sepsis with high mortality in intensive care units (ICU), even with recent medical advances. The study of sepsis and new therapeutic options remain a challenge due to the complexity of this syndrome, whose main component is an exaggerated inflammatory response. The PPARγ (receptor peroxisome proliferator-activated) is a transcription factor of nuclear receptor family characterized by their pattern of tissue distribution and its metabolic function. Recently, various leukocyte populations, including monocytes / macrophages, lymphocytes and dendritic cells, also have been evidenced expressing PPARγ, suggesting a role for this molecule in regulation of immune responses. The antidiabetic drug rosiglitazone belongs to the family of thiazolidinediones. This drug is PPARγ agonist addition to the effects and features in the metabolism of glucose, potent antiinflammatory action, including the respiratory tract cells. Our main objective was to characterize the role of PPARγ in a pneumosepse model in mice Swiss webster. The animals were challenged with Klebsiella pneumoniae bacteria, a major cause of infections related to health care, both through community and hospital environment. Survival analyzes were performed, inflammatory parameters, cytokine production, cell migration and bacterial elimination in the bronchoalveolar lavage fluid 24 hours after intratracheal instillation of K. pneumoniae. The animals were treated or not with the PPARγ agonist rosiglitazone and / or its antagonist, GW9662 5 hours after challenge with bacteria. The treatment increased the survival and caused improvement in the clinical picture of and challenged mice treated with rosiglitazone. Rosiglitazone decreased production of proinflammatory mediators such as TNF-α, IL-6. Infection with K. pneumoniae led to an increase in neutrophil accumulation in the lung and the post-treatment with rosiglitazone was able to reverse this phenomenon, also reducing the number of colony forming units (CFU) of bronchoalveolar lavage. The administration of the PPARγ antagonist, GW9662 30 min before administration of rosiglitazone was able to reverse its anti-inflammatory effects, demonstrating that the protective effects of rosiglitazone depend on the activation of the PPARγ. The elucidation of the molecular mechanisms by which PPARγ modulates the pneumonia-induced sepsis is of utmost importance so that new therapeutic interventions are proposed for the treatment of sepsis. viii Lista de Abreviaturas AMP - Adenosina monofosfato cAMP - Adenosina monofosfato cíclico AP-1 - Proteína ativadora-1 BASES - Estudo epidemiológico da sepse no Brasil BPM - Batimentos por minuto BSA - Albumina bovina sérica CBP - Proteína Ligadora de CREB CREB - Elemento de resposta ao AMP cíclico CD - Grupo de Diferenciação CECAL - Centro de Criação de Animais de Laboratório da Fundação Oswaldo Cruz CLP - Ligadura e punção cecal CEUA - Comitê de Ética no Uso de Animais CXCR2 - Receptor 2 da quimiocina CXC TMB - Tetrametilbenzidina DMSO - Dimetil Sulfóxido ELISA - Ensaio imunoenzimático ERN - Espécies reativas de nitrogênio ERO - Espécies reativas de oxigênio EPM - Erro padrão da média fMLP - formil-metionil-leucil-fenilalanina G-CSF - Fator estimulador de colônia de granulócitos GM-CSF - Fator estimulador de colônia de macrófago-granulócito HE - Hematoxilina e eosina HDAC - Histona deacetilase HMGB1 - Proteína 1 do grupo box de alta mobilidade ICAM - Molécula de adesão intercelular IFN - Interferon IL - Interleucina Ig - Imunoglobulina iNOS - Óxido nítrico sintase induzida ix i.p. - Intraperitoneal KC - Homóloga murina da quimiocina IL-8 LBP - Proteína ligante de LPS LTB4 - Leucotrieno B4 LPS - Lipopolissacarídeo LT - Leucotrieno MAPK - Proteína quinase ativada por mitógeno MIF - Fator inibidor da migração de macrófagos MMP - Metaloproteinases NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo-Fosfato NFAT - Fator nuclear de ativação de linfócitos T NF-kB - Fator nuclear kappa-B NETs - Redes extracelulares formadas por neutrófilos NO - Óxido nítrico NcoR - Receptor nuclear co-repressor NOD - Domínio de Oligomerização Nucleotídeo PAF - Fator de ativação plaquetária PAMP - Padrões moleculares associados a patógenos PBS - Salina Tamponada por Fosfato PKC - Proteína quinase C PG - Prostaglandina 15dPGJ2 - 15 deoxi -2,14 prostaglandina J2 PMA - Forbol 12-miristato 13-acetato PMNs - Leucócitos Polimorfonucleares PPAR - Receptor ativado por proliferador de Peroxissomo PPRE - Elemento responsivo ao proliferador de peroxissomo PRR - Receptor de reconhecimento de padrões RIG - Gene do ácido retinóico induzível RXR - Receptor X retinóide SIRS - Síndrome da resposta inflamatória sistêmica SP-A - Proteína surfactante A SRC-1 - Receptor co-ativador de esteróides 1 x STAT - Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição TGF-β - Fator transformador de crescimento β TLR - Receptores do tipo toll TNF - Fator de necrose tumoral TSA - Ágar de soja triptica UTI - Unidade de Terapia Intensiva UFC - Unidade Formadora de Colônia VCAM - Molécula de adesão vascular xi Lista de Figuras Figura 1.2.8. Mecanismos da inibição da expressão de genes pró-inflamatórios dependentes de PPARγ...................................................................................................... 10 Figura 1.2.9. Estrutura química da rosiglitazona e pioglitazona...................................... 11 Figura 1.2.10. Expressão e efeitos do PPARγ em células estruturais e células do sistema imunológico nos pulmões..................................................................................... 12 Figura 4.1. Analise da taxa de sobrevida de animais inoculados com diferentes concentrações de K. pneumoniae....................................................................................... 19 Figura 4.2. Rosiglitazona aumenta a sobrevida dos animais infectados com K. pneumoniae........................................................................................................................ 20 Figura 4.3. Efeito da rosiglitazona sobre o escore clínico de gravidade da sepse............ 21 Figura 4.4. Histologia e escore patológico do tecido pulmonar....................................... 22 Figura 4.5. Análise da celularidade de amostras do BAL de camundongos tratados com rosiglitazona............................................................................................................... 24 Figura 4.6. Efeito da rosiglitazona na produção de citocinas........................................... 26 Figura 4.7. Efeito do agonista de PPARγ rosiglitazona sobre a carga bacteriana presente no BAL................................................................................................................ 28 Figura 4.8. Análise do papel do PPARγ na iinflamação induzida por K. pneumoniae........................................................................................................................ 30 Figura 5. Esquema final.................................................................................................... 35 xii 1. Introdução 1.1.Sepse: conceito e epidemiologia A Sepse é uma associação entre a Sindrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) e um quadro de infecção (1). Esta resposta inflamatória sistêmica pode também ser desencadeada por procesos não infecciosos como trauma, isquemia, queimadura, pancreatite e hemorragia. É determinada por um conjunto de efeitos tais como a taquipnéia, alterações de temperatura, taquicardia e alterações no número de leucócitos. Esta síndrome resulta de uma complexa interação entre o microorganismo infectante e a resposta imune, pró-inflamatória e pró-coagulante do hospedeiro (2, 3). Como a população de pacientes sépticos é bastante diversificada, e tendo em vista que diferentes estímulos e agentes podem servir de gatilho para desencadear a sepse, ela passou a não ser definida como uma doença, e sim como uma síndrome, o que levou à necessidade de um consenso para uma melhor definição. Assim, a Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica em humanos é definida quando dois ou mais dos seguintes sintomas clínicos são diagnosticados: temperatura corporal > 38 ºC ou < 36 ºC; frequência cardíaca > 90 bpm; frequência respiratória > 20 movimentos/minuto; leucometria> 12.000/mm3 ou < 4.000/mm3 ou ainda, presença de mais de 10% de bastonetes. Quando a SIRS ocorre secundariamente a um processo infeccioso, é denominada Sepse, que quando acompanhada por falência de um ou mais órgãos, é classificada como Sepse Grave. O choque séptico ocorre quando há hipotensão severa não revertida pela expansão volêmica adequada e administração de vasoconstritores (1, 4, 5). A sepse é a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva (UTI), sendo considerada uma das maiores causas de morte nos Estados Unidos (6), com uma incidência em torno de 750.000 casos/ano, acometendo três indivíduos em cada mil habitantes, resultando em 215.000 mortes/ano. Em pacientes internados a incidência é estimada em 2,26 casos por 100 altas hospitalares. Na Europa a incidência é de aproximadamente um caso a cada mil habitantes (7, 8). No Brasil, estudos epidemiológicos sobre sepse são escassos. Nas últimas décadas, aproximadamente 25% dos pacientes internados em UTI apresentaram critérios diagnósticos para sepse grave e choque séptico, com taxas progressivas de mortalidade por sepse (34,7%), sepse grave (47,3%) e choque séptico (52,2%). O Estudo Epidemiológico da Sepse no Brasil (BASES) desenvolvido em cinco UTI dos estados de São Paulo e Santa Catarina, mostrou uma incidência de sepse, sepse grave e choque séptico de 1 46,9%, 27,3% e 23%, respectivamente. A mortalidade nestes pacientes foi 33,9%, 46,9% e 52,2%, respectivamente (9). 1.2.Fisiopatologia da Sepse 1.2.1. Origem das infecções A infecção pode ter sua origem na comunidade ou ser de origem nosocomial, quando ocorre durante a hospitalização, não estando presente no momento da admissão hospitalar, sendo esta última relacionada com uma maior taxa de mortalidade (10). A pneumonia, um distúrbio inflamatório agudo de natureza infecciosa, é a principal infecção encontrada em ambos os casos (infecção nosocomial ou comunitária) tanto no Brasil (11, 12) quanto no mundo (1, 13). A pneumonia está associada com uma quantidade considerável de doenças na maioria das regiões do mundo (14, 15). É uma das principais doenças infecciosas graves, sendo responsável por um considerável número de internações hospitalares, com uma incidência crescente em muitas partes do mundo e um aumento da taxa de complicações graves como a sepse (16, 17). As bactérias (tanto as gram-positivas quanto as gram-negativas) são os principais microrganismos responsáveis pelas infecções pulmonares que desencadeiam a sepse. Nos casos das pneumonias adquiridas na comunidade, ocorre o predomínio das bactérias grampositivas, enquanto que nos casos das pneumonias adquiridas no hospital, as gram-negativas são as mais encontradas (1). As enterobactérias (como Escherichia coli e espécies de Klebisiella) são os principais microrganismos responsáveis pela sepse gram-negativa, sendo que infecções por K. pneumoniae são as principais responsáveis pelas pneumonias nosocomiais (1, 18). A bactéria Klebsiella pneumoniae é um bacilo entérico, membro da família das Enterobacteriaceae, está intimamente associada ao trato gastrointestinal de mamíferos, e não raramente tem sido isolada na boca de indivíduos com ou sem doença periodontal e em orofaringe de portadores assintomáticos. A colonização da orofaringe é uma importante fonte de infecções pulmonares em pacientes debilitados por alcoolismo, diabetes e portadores de doenças pulmonares crônicas. As infecções causadas por Klebsiella spp. tendem a ocorrer em pessoas imunocomprometidas sendo responsável por alta taxa de mortalidade (19). Nos indivíduos normais, a árvore brônquica abaixo da carina é isenta de microrganismos, o mesmo não acontecendo nas vias aéreas superiores e cavidade oral, onde, 2 habitualmente, vivem microrganismos saprófitas e patogênicos. A estrutura das vias aéreas e sua segmentação progressiva, a filtração aerodinâmica e o transporte mucociliar compõem os principais mecanismos de defesa mecânicos que atuam para impedir que microrganismos cheguem até os alvéolos pulmonares, um importante local de trocas gasosas e altamente vascularizado (20). Em alguns casos, microrganismos conseguem transpor estes mecanismos de defesa das vias aéreas superiores, atingindo os alvéolos pulmonares. Esta porção final do trato respiratório inferior conta com uma população de macrófagos alveolares residentes, cujo principal função é fagocitar e eliminar os microrganismos que chegam até o local. Quando não é possível eliminar os patógenos, estas células devem coordenar uma resposta inflamatória, que dependendo da sua intensidade, pode levar ao desenvolvimento das doenças inflamatórias pulmonares como a pneumonia (21, 22). Desta forma, a pneumonia pode ser definida como um distúrbio inflamatório agudo, de natureza infecciosa, que ocorre no parênquima pulmonar e está associado com evidência clínica e/ou radiológica de consolidação de parte ou partes de um ou ambos os pulmões (23). 1.2.2. Reconhecimento dos produtos microbianos e ativação da resposta inflamatória Na vigência de uma infecção local o agente infeccioso é reconhecido por células residentes que iniciam a produção de mediadores inflamatórios (24). O reconhecimento de microrganismos pelas células do hospedeiro depende da expressão de receptores de membrana capazes de identificar moléculas associadas aos microrganismos, sendo chamados de receptores de reconhecimento padrão (PRR). Esta família de receptores reconhece diferentes produtos microbianos, chamados de padrões moleculares associados a patógenos (PAMP), tais como o lipopolissacarídeo (LPS), flagelina, zimosan e peptidoglicano (25, 26). O início da resposta do hospedeiro pelo reconhecimento dos PAMP durante a sepse envolve três famílias de receptores de reconhecimento padrão: receptores do tipo Toll (TLR); receptores do tipo NOD (Domínio de oligomerização de nucleotídeo) e receptores do tipo RIG-I (Gene do ácido retinóico induzível). A interação entre essas famílias de receptores assegura uma coordenação fina e eficiente da resposta imune inata (24, 27, 28). A ativação da sinalização do TLR induz ativação de proteínas adaptadoras envolvidas na transdução de sinal. A sinalização via estas proteínas adaptadoras, culmina com a ativação de uma série de fatores de transcrição, entre eles o fator nuclear κB (NF-κB), levando a expressão e supressão de um grande número de genes. Entre os genes expressos em resposta a 3 ativação da via de TLR e NF-κB, estão os que codificam citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (29). 1.2.3. Mediadores da resposta inflamatória Em resposta a presença de microrganismos, as células do sistema imune inato como macrófagos e neutrófilos liberam diversos mediadores inflamatórios, dentre os quais as citocinas que atuarão como indutoras ou moduladoras da inflamação. O desequilíbrio entre os dois processos, com liberação excessiva de citocinas pró-inflamatórias, leva ao dano tecidual e consequentemente, a disfunção de órgãos (30). As citocinas são produzidas e liberadas por diferentes tipos celulares incluindo linfócitos T, linfócitos B, mastócitos, células fagocíticas, células dendríticas, mononucleares e neutrófilos, entre outras (31, 32). De forma geral, as citocinas são classificadas em subgrupos, como: interleucinas (IL), TNF-α, fatores de crescimento transformante (TGF), quimiocinas, interferons (IFN) e fatores estimuladores de colônia (CSF). Elas também podem ser classificadas conforme sua atividade biológica como: pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α,) e anti-inflamatórias (IL-10) (33). Mediadores como o TNF-α, as interleucinas (IL-1β, IL-6, IL-8), o fator inibitório de migração de macrófagos (MIF), e mediadores lipídicos (PAF – Fator de ativação plaquetária, leucotrienos e prostaglandinas), tem sido associados com a sepse (34, 35). Em humanos com sepse e em animais submetidos a modelos experimentais de sepse, as citocinas são liberadas de maneira sequencial denominada “tempestade de citocinas”. Nestes casos, o TNF-α é apontado como mediador primário da inflamação, sendo implicado com um grande número de doenças infecciosas e não infecciosas(36). Ele está associado com as anormalidades hemodinâmicas, leucopenia e coagulopatia observados no curso da doença (35-37). Além disso, o TNF-α é um potente indutor da liberação de outras citocinas como a IL-1β, IL-6 e IL8 (11, 32). Tanto a IL-1β assim como o TNF-α induzem febre, sendo que a IL-1β ainda induz a produção e liberação de IL-6 (38). A IL-6 além de ser um mediador inflamatório, também funciona como um marcador da gravidade da sepse. Já foi descrito que níveis elevados de IL6 e IL-8 são preditores no prognóstico da sepse e estão associados com a disfunção de múltiplos órgãos e a mortalidade precoce e tardia (39, 40). A família da IL-1 (IL-1α, IL-1β, IL-18) desempenha importante papel no desenvolvimento da resposta imune e do processo inflamatório por meio da liberação de 4 outras citocinas e quimiocinas, além de estimular a síntese de eicosanóides como a prostaglandina E2, aumenta a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (NOSi) e de metaloproteinases (MMP1) (41, 42). A IL-1 é sintetizada principalmente por monócitos e macrófagos, age sinergicamente com o TNF-α amplificando a resposta inflamatória, promovendo a expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais e nos leucócitos, e desta forma a diapedese celular (42). 1.2.4. Ativação dos macrófagos Os macrófagos são células fagocíticas mononucleares altamente especializadas. Atuando como sentinelas, são as primeiras células do sistema imune inato a reconhecer componentes microbianos através dos receptores de superfície (43). A ativação destes receptores por PAMP estimula a fagocitose e a internalização dos microrganismos para vesículas intracelulares, onde são destruídos. Durante a infecção, os macrófagos atuam como células apresentadoras de antígenos, potencializando a ativação de Linfócitos T e B através do aumento na expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade de classe II, de moléculas CD40 e de receptores de TNF-α na sua superfície (44). Além das citocinas e quimiocinas, estas células também produzem espécies reativas do oxigênio, como ânion superóxido (O2), radical hidroxila (OH), peróxido de hidrogênio (H2O2), e espécies reativas de nitrogênio, como o óxido nítrico (NO), aumentando a sua capacidade bactericida e citotóxica (45). Desta forma, a ativação de macrófagos durante um processo inflamatório, poderá amplificar esta resposta, que se for exacerbada, conduzirá para a sepse e choque séptico. 1.2.5. Ativação do endotélio e migração de células inflamatórias A ativação de alguns receptores, como por exemplo os TLR, leva à secreção de quimiocinas e citocinas, como a IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 entre outras, que irão favorecer o recrutamento de leucócitos para o sítio de infecção (46). A produção destes mediadores inflamatórios por células residentes leva à ativação do endotélio, aumento da permeabilidade vascular e inicia o processo de influxo de leucócitos circulantes para o tecido. A ativação de células endoteliais pelo TNF-α, por exemplo, causa alterações na morfologia celular e na expressão de moléculas de adesão, que culminam com a adesão e o extravasamento de leucócitos para o tecido (47). Dentre eles, o neutrófilo é o primeiro e seu número aumenta 5 significativamente dentro das primeiras horas após a infecção. Por isso, esta célula é por muitos considerada a primeira linha de defesa do organismo contra infecções (48). O recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção é um elemento crucial na resposta do sistema imune inato. Na maioria dos tecidos, a cascata de recrutamento de leucócitos envolve as seguintes etapas: marginação, rolamento, aderência e transmigração através da parede dos vasos em direção a gradientes quimiotáticos. O recrutamento de neutrófilos é iniciado por mudanças na superfície do endotélio, que resultam da estimulação por mediadores inflamatórios (incluindo a histamina, leucotrienos e citocinas) que são liberados a partir de leucócitos sentinelas nos tecidos quando eles entram em contato com patógenos (49). Na fase de marginação e rolamento dos neutrófilos ocorre a interação entre as Lselectinas, que são constitutivamente expressas nos leucócitos circulantes, com as E-selectinas e P-selectinas cuja expressão é aumentada nas células endoteliais após a ativação por quimiocinas e mediadores inflamatórios tais como o TNF-α (50). A adesão dos leucócitos nas células endoteliais ocorre através das integrinas, que são moléculas responsáveis por aumentar a afinidade entre as células. A integrina α1β2 também conhecidas por CD11a/CD18, são expressas na maioria dos leucócitos e são moduladas por componentes microbianos, citocinas inflamatórias e quimiocinas. Estas integrinas interagem com moléculas de adesão na superfície das células endoteliais, tais como as ICAM (molécula de adesão intercelular-1) e VCAM (molécula de adesão vascular) (51). A transmigração (diapedese) é o estágio final da migração dos neutrófilos e consiste na passagem dos neutrófilos pelo endotélio através das junções estreitas das células endoteliais e das células infectadas ou lesadas. Este processo é regulado por um amplo espectro de moléculas quimiotraentes incluindo tanto componentes microbianos como o formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), LPS, quanto componentes derivados do hospedeiro como citocinas (TNF-α, IL-1), componentes do complemento (C3a, C5a), mediadores lipídicos (leucotrieno B4, PAF, PG) e quimiocinas (CXCL8), liberados pelas células residentes e pelas células recrutadas ao foco infeccioso (52). 6 1.2.6. Mecanismos microbicidas dos neutrófilos Uma vez alcançado o foco infeccioso, os neutrófilos são capazes de fagocitar e eliminar os microorganismos invasores. A expressão de receptores para a porção Fc de imunoglobulina (Ig) G (FcγRIII) e de proteinas da cascata do complemento (C3R) pelos neutrófilos permite o reconhecimento e a fagocitose de microorganismos opsonizados (53). Estes microorganismos são eliminados pela ação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN), e enzimas citotóxicas armazenadas nos grânulos citoplasmáticos dos neutrófilos (54). A produção de ERO depende da atividade da enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase. A atividade de NADPH oxidase gera peróxido de hidrogênio e outras EROs e, em conjunto com a enzima mieloperoxidase, transforma íons cloreto em ácido hipocloroso, um potente composto antimicrobiano (53). Embora a participação de outros mecanismos microbicidas seja reconhecida, como peptídeos antimicrobianos (defensinas), proteases e ERN, a produção de ERO e ácido hipocloroso é considerada o mais importante mecanismo antimicrobiano de neutrófilos (51). Recentemente, um novo mecanismo antimicrobiano de neutrófilos foi descrito. São as redes extracelulares de neutrófilos (NET), estruturas extracelulares composta por DNA associado às histonas e às proteínas de todos os tipos de grânulos neutrofílicos que auxilia no aprisionamento físico e morte de bactérias (55). 1.2.7. Tratamento na sepse De acordo com as Diretrizes Internacionais para Gestão da Sepse grave e choque séptico de 2012, o objetivo principal do tratamento do paciente séptico é a manutenção de um suporte cardiorrespiratório e metabólico, que permita manter o paciente vivo até a sua recuperação integral e paralelamente combater o agente infeccioso. Desta forma, as principais terapias aplicadas para o tratamento da sepse e choque séptico incluem: a) controle do agente infeccioso através da antibióticoterapia, b) reversão do choque, com reposição volêmica e aminas vasoativas, suporte ventilatório e nutrição precoce, c) medidas adicionais como terapia com proteína C ativada, corticóides e o controle da glicemia e, d) avaliação hemodinâmica da perfusão tecidual (56). Para um correto diagnóstico do microrganismo causador, é recomendada a obtenção das culturas bacterianas antes do início da antibioticoterapia, desde que a cultura não cause um atraso significativo no início da administração do antibiótico. A antibioticoterapia combinada é a mais indicada no caso de pacientes com alto risco, ou seja, aqueles que 7 apresentam sepse grave e choque séptico, pois normalmente terá que ser iniciada antes da conclusão do diagnóstico preciso, cobrindo todos os possíveis patógenos (56). A falha para iniciar a antibioticoterapia apropriada está relacionada com o aumento de morbidade e mortalidade. Atualmente, existem outras abordagens terapêuticas aplicadas à sepse, dentre as quais pode-se destacar o uso de hemoderivados (manutenção da concentração de hemoglobina, a utilização de hemodiálise) e ainda, o tratamento com corticosteroides, antiinflamatórios que se ligam a receptores nucleares, regulando atranscrição de genes relacionados à inflamação (56-58). 1.2.8. Receptores Ativados por Proliferadores de Peroxissomos Os receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) são fatores de transcrição da família de receptores nucleares, caracterizados por seu padrão de distribuição nos tecidos e por sua função metabólica. Estruturalmente podem ser incluídos como membros da subfamília de receptores que incluem os receptores para os hormônios esteróides, para a vitamina D3 (VDR) e para o ácido 9-cis retinóico (RXR) (59). Já foram descritos 3 isotipos de PPAR em mamíferos: o PPARα, PPARβ/δ e o PPARγ (58). O PPARα é encontrado no fígado, músculo, coração, endotélio e rins. Tem como principais ligantes endógenos os ácido graxos livres e exógenos os fibratos, fármaco utilizado para tratamento no controle da hiperlipidemia. Os receptores PPARα são envolvidos na oxidação de ácidos graxos livres, na transcrição de fatores com atividade anti-inflamatória e no metabolismo de lipoproteínas (60). O PPARβ/δ é expresso em fígado, intestino, músculo e tecido adiposo e, está envolvido na regulação do metabolismo de colesterol (61). O PPARγ é expresso principalmente no tecido adiposo, desempenhando um papel fundamental na diferenciação dos adipócitos e servindo também como um importante regulador da transcrição de genes envolvidos no metabolismo da glicose e lipídeos (61), mas também é expresso pelo endotélio vascular, plaquetas, monócitos e por macrófagos, sugerindo um significativo papel para esta molécula na regulação de respostas imunes (62). Após a ativação por seus agonistas, o PPARγ se liga ao RXR, formando um complexo heterodímero PPAR-RXR que se liga a sequências exclusivas do DNA localizadas na região reguladora ou promotora de genes-alvo, conhecidas como elementos responsivos aos PPAR (PPRE). Este mecanismo mediado pela ligação do receptor à sequência exclusiva de DNA é conhecido como transativação gênica e modula a transcrição de genes envolvidos no controle 8 do metabolismo de lipídeos, na homeostasia da glicose, na diferenciação celular, proliferação e apoptose, bem como na resposta inflamatória (63). Além disso, estudos indicam que agonistas dos PPAR são agentes que possuem propriedades anti-inflamatórias, uma vez que inibem a expressão de citocinas próinflamatórias, quimocinas e moléculas de adesão, entre outros, por meio de outro mecanismo biológico denominado de transrepressão (64, 65). A transrepressão também denominada regulação negativa é o mecanismo pelo qual agonistas dos PPAR ativam receptores celulares e inibem a liberação de substâncias como, por exemplo, mediadores pró-inflamatórios. Existem cinco mecanismos pelos quais o PPARγ atua para inibir a transcrição de genes próinflamatórios. Dentre eles destacam-se: 1) o heterodímero PPAR-RXR liga-se a outros fatores de transcrição tais como o fator nuclear-kappa B (NF-κB), o fator ativador da proteína 1 (AP1), o fator estimulador e ativador de transcrição-1 (STAT-1) e o fator nuclear de ativação de linfócitos T (NFAT), desta forma, impedindo a ligação destes FT a suas regiões responsivas no DNA, reduzindo a expressão de mediadores pró inflamatórios (62, 66), 2) o heterodímero PPARγ/RXR ativado liga-se a proteínas co-ativadoras como, por exemplo, a proteína ligante em resposta a ativação do AMPc (CBP) e a proteína co-ativadora 1 do receptor de esteróide (SCR1), que são essenciais para a ativação de AP-1 e NF-κB, inibindo a expressão de genes pró inflamatórios mediada pela ativação destes FT (67), 3) Em resposta a sumoilação, o PPARγ pode transreprimir os genes pró inflamatórios dependentes de NF-kB pela inibição da degradação de um complexo proteosssomal formado pelo receptor nuclear co-repressor (NcoR) + histona deacetilase 3 (HDAC3) + proteína transduscina do tipo β1 (TLB1/TLBR1), todos responsável pela ativação do NF-kB no sítio promotor (68), 4) o heterodímero PPARγ/RXR é capaz de inibir a fosforilação de algumas proteínas kinases (MAPK) promovendo a inibição da cascata de ativação destas e consequente inibição da transcrição de mediadores promovida pela ativação dos PPARγ (62, 69), e 5) O PPARγ pode inibir a translocação da proteína quinase Cα (PKCα) atenuando a ativação da NADPH oxidase e consequentemente a produção de ROS pelos macrófagos (fig. 1.2.8) (70). O PPARγ possui ligantes endógenos e exógenos, o principal ligante endógeno é o derivado da prostaglandina D2 [15-Deoxi-Delta-12,14-prostaglandina J2 (15D-PGJ2)] (71). Dentre os ligantes exógenos (sintéticos), destacam-se as tiazolidinedionas (glitazonas) que são fármacos antidiabéticos utilizados na clínica no controle do diabetes tipo II e o antagonista sintético GW9662 (72). 9 Figura 1.2.8. Mecanismos da inibição da expressão de genes pró-inflamatórios dependentes de PPARγ. Em presença do agonista, o PPARγ (A) se associa diretamente com fatores de transcrição pró-inflamatórios (FT), tais como o NF-kB, STAT, e AP-1 e inibe a expressão de genes pró-inflamatórios; (B) sequestra fatores de transcrição co-ativadores, tais como o CBP (proteína de ligaçãoCREB) e SRC-1 (Receptor Co-activator de esteroides 1) inibindo a sua ligação com FT pró-inflamatórios, diminuindo a expressão de genes próinflamatórios; (C) em reposta a sumoilação (Su), o PPARγ inibe a degradação do complexo (NcoR)+(HDAC3)+(TLB1/TLBR1), o qual por sua vez, permitiria a expressão dos genes próinflamatórios regulados pelo o NF-kB. (D) além desses 3 mecanismos de transrepressão, o PPARγ pode inibir MAPK que são necessárias para a indução da expressão de genes próinflamatórios. (E) A expressão do PPARγ inibe a translocação da PKCα, consequentemente inibindo a ativação da NADPH oxidase. Em C e E, a formação do heterodímero com o RXR não é necessária. Figura adptada de Schmidt et al., 2010 (59). 1.2.9 Agonistas dos PPAR As tiazolidinedionas ou glitazonas incluem a pioglitazona, rosiglitazona, troglitazona e ciglitazona. Estas apresentam como característica química comum um anel diona, que confere as mesmas a atividade anti-hiperglicêmica e o restante da molécula difere entre os fármacos do grupo e é responsável pela especificidade farmacodinâmica e farmacocinética (Fig. 1.2.9 (72). Estas drogas têm sido descritas como agonistas de PPARγ e são sensibilizadoras da ação da insulina. Elas representam 21% das prescrições médicas para pacientes com Diabetes Mellitus tipo 2 nos Estados Unidos e 5% na Europa (73). Ambas glitazonas ligam-se em torno de 99% às proteínas plasmáticas. A rosiglitazona apresenta um tempo de meia-vida (t½) plasmática de 100-150 h, incluindo seus metabólitos, enquanto a pioglitazona apresenta t½ de 16-24 h, incluindo seus metabólitos (74). 10 Figura 1.2.9. Estrutura química da rosiglitazona e pioglitazona. Figura adaptada de Gomes, 2006 (75). 1.2.10. Papel do PPARγ no pulmão O PPARγ é expresso em macrófagos e monócitos (76), eosinófilos (77, 78), células dendríticas (79, 80), linfócitos B e T (81), mastócitos (82), linhagens de células epiteliais das vias aéreas (Beas e A549) (83-86), fibroblastos primários (Burgess e cols., 2005) e na musculatura lisa das vias aéreas (87). No pulmão, o PPARγ esta presente principalmente no epitélio das vias aéreas e em diferentes células inflamatórias, residentes e estruturais, das vias aéreas (88). Dados da literatura relatam um significativo papel para o PPARγ na modulação da inflamação pulmonar, uma vez que diversos tipos celulares foram evidenciados expressando esta molécula (89). Em células epiteliais das vias respiratórias o tratamento com agonistas do PPARγ inibiu a produção de citocinas induzidas por fatores quimiotáticos de neutrófilos e monócitos/macrófagos, incluindo a IL-8 e MCP-1, reduzindo significativamente a expressão da enzima iNOS (83, 86). Nas células do musculo liso das vias aéreas, o tratamento com agonistas de PPARγ também reduziu a produção de citocinas e fator de estimulação de colônias granulócitos de macrófagos (G-CSF e GM-CSF), que são importantes ativadores de fatores de sobrevivência para os eosinófilos e neutrófilos, respectivamente. No mesmo estudo, os agonistas PPARγ se mostraram mais potentes do que o glicocorticóide dexametasona na inibição do crescimento e liberação de G-CSF pelas células da musculatura lisa (fig. 1.2.10) (87). 11 Figura 1.2.10. Expressão e efeitos do PPARγ em células estruturais e células do sistema imunológico nos pulmões. Figura adaptada de Becker et al., 2006 (88). No pulmão, os macrófagos alveolares participam nas defesas do hospedeiro através da produção inicial de quimiocinas tais como IL-8 e MCP-1, e de fatores de crescimento, tais como GM-CSF, que aumentam a sobrevivência dos monócitos. Além disso, os macrófagos alveolares estão envolvidos na regulação da inflamação e na resposta imune adaptativa. Desta forma PPARγ tem efeito anti-inflamatório em monócitos/macrófagos (89). Esta atividade benéfica também foi encontrada para PPARγ em macrófagos alveolares (90). O tratamento com agonistas do PPARγ foi capaz de reduzir significativamente a produção de citocinas em macrófagos alveolares humano e de rato, quando estimulados com TNF-α e IL-12 (90). Em macrófagos alveolares de rato, os agonistas do PPARγ também suprimiram o burst oxidativo induzido por PMA e a expressão iNOS induzida por LPS em co-estimulação com IFN-γ (90). Estes estudos sugerem uma complexa interação entre o início e a resolução do processo inflamatório conjuntamente às alterações na expressão do PPARγ. Dado que este receptor pode ser regulado, tanto por mediadores inflamatórios quanto pelos níveis endógenos de seus ligantes. Entretanto, ainda não foi determinado se os efeitos dos ligantes do PPARγocorrem via receptor ou não (88). 12 Embora existam trabalhos que descrevam algumas propriedades anti-inflamatórias dos agonistas do PPARγ em modelos experimentais, ainda não está bem esclarecido o mecanismo de ação molecular pelo qual o PPARγ esteja envolvido no controle da infecção e aumento da sobrevida de animais sépticos. Desta forma o presente estudo visa elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o PPARγ atua para modular a inflamação durante a sepse em um modelo de infecção pulmonar causada pela bactéria K. pneumoniae, uma importante causadora de infecções relacionadas à assistência à saúde, tanto no meio ambiente comunitário quanto hospitalar (91). Para este fim, foram utilizados modelos animais, onde avaliamos as taxas de letalidade, as contagens bacterianas, índices inflamatórios em animais desafiados com a bactéria K. pneumoniae, após o tratamento com ligantes do PPARγ. E propor novas abordagens terapêuticas adjuvantes com os tratamentos da sepse já praticados. 13 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral O objetivo do presente estudo é avaliar o papel do receptor PPARγ em modelos de pneumosepse induzida pela bactéria K. pneumoniae . 2.2. Objetivos específicos 2.2.1. Investigar os efeitos da ativação do PPARγ na sobrevida e no escore clínico de animais após o desafio com a K. pneumoniae; 2.2.2. Investigar o papel da ativação do PPARγ na migração de células inflamatórias para os pulmões de animais após o desafio com a K. pneumoniae; 2.2.3. Estudar o envolvimento da rosiglitazona na eliminação bacteriana, na produção citocinas em animais desafiados com a K. pneumoniae; 14 3. Materiais e métodos 3.1. Animais Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss webster machos pesando entre 20 e 30 gramas fornecidos pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) da FIOCRUZ. Os animais foram mantidos em isoladores ventilados (Gabinete Biotério mod. EB-273, Insight, Brasil) no biotério do Pavilhão Ozório de Almeida até o momento do experimento, com livre acesso a água e ração, sendo submetidos a um ciclo de 12 h de claro/escuro. Os animais receberam uma dose de vermífugo (Drontal Puppy - Bayerl) por via oral (gavagem) e foram utilizados uma semana após o tratamento. Os protocolos utilizados nesta tese foram aprovados pelo comitê de Ética no Uso de animais da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA nº 0260/05-FIOCRUZ). 3.2. Inoculação com K. pneumoniae A bactéria utilizada foi a Klebsiella pneumoniae – ATCC 700603 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA). As bactérias patogênicas foram obtidas a partir de 10 passagens em camundongos C57/BL6 (injeção intratraqueal e recolha do baço 24 h depois) e congeladas em freezer - 80 ° C em caldo de infusão cérebro coração (BHI) contendo glicerol a 10% até à sua utilização. Após a sequência de passagens, as bactérias foram congeladas na fase log de crescimento. Antes de cada ensaio, alíquotas foram descongeladas, lavadas duas vezes em solução salina estéril, suspensas em caldo BHI e incubadas por 18 h a 37 ° C antes da inoculação. Posteriormente centrifugadas a 14000 rpm por 5 min para a separação do meio de cultura, o pellet resultante foi ressuspenso em solução salina estéril. A concentração da suspensão bacteriana foi determinada através de um espectrofotômetro (SpectraMax 190), medindo a quantidade de absorbância a 650-660 nm e comparada com uma curva padrão predeterminada. As bactérias foram em seguida diluídas em salina estéril para a concentração desejada para a inoculação. Os camundongos foram anestesiados através da inalação com isoflurano. A traqueia foi exposta e 50 µL de inoculo bacteriano ou de solução salina foram administradas através de uma agulha estéril de calibre 26G. A incisão na pele foi fechada com fio de sutura. Os animais foram acompanhados até que morreram ou foram sacrificados 24 h após a infecção. 15 3.3. Tratamento com ligantes de PPARγ. Os animais foram tratados com o agonista de PPARγ, rosiglitazona (0,5mg/kg,i.p.) e/ou com antagonista GW9662 (0,5 mg/kg, i.p.) 5 horas após a instilação. Em experimento de análise de sobrevida a rosiglitazona também foi administrada 5 h após a cirurgia. Os animais receberam injeção i.p. de veículo DMSO como controle do tratamento. Todas as análises foram realizadas 24 h após o procedimento cirúrgico. 3.4. Lavado broncoalveolar A lavagem broncoalveolar (BAL) foi realizada para obter os leucócitos nos espaços alveolares. A traqueia foi exposta e um cateter de polietileno de 1,7 mm de diâmetro exterior, inserida. Foi instilado para os pulmões através da traqueia 1 ml de PBS estéril, e o fluido de lavagem broncoalveolar foi aspirado. 3.5. Contagem total e diferencial das células do lavado broncoalveolar A contagem total de células do lavado broncoalveolar foi efetuada em câmeras de Neubauer em microscópio óptico (Olympus, aumento de 10x), após a diluição de 40X das mesmas em solução de Turk. A análise diferencial de leucócitos foi realizada sob objetiva de imersão em citoesfregaços preparados em citocentrífuga (Cytospin-Shandon-450 rpm por 5 minutos) e corados com Panótico. Foram contadas 100 células consecutivas em microscópio de luz, com objetiva (aumento de 100x) de imersão em óleo. A quantidade de cada tipo celular foi calculada a partir da porcentagem encontrada com relação ao número total de células. Para obtenção dos sobrenadantes, os lavados broncoalveolares foram centrifugados a 900 g durante 10 minutos e armazenados a -80°C para análises futuras. 3.6. Análise do grau da severidade da sepse - escore clínico. Os animais foram submetidos à instilação intratraqueal de K. pneumoniae e tratados de acordo com item 3.3. Após 24 horas, os animais tiveram o escore clínico avaliado. Para fazer o escore, foram analisados os seguintes parâmetros: piloereção, força ao agarrar um objeto, taxa de respiração (antes e depois do esforço), alteração nas fezes, lacrimação/alteração nas pálpebras, alteração de temperatura corporal, alerta (escape ao toque), exploração do ambiente e atividade locomotora. Para cada parâmetro apresentado, o animal recebia um ponto e na ausência do parâmetro ele não pontuava. Em seguida, os pontos eram somados para a classificação clínica do animal, sendo que o escore 0 significa que o animal não apresentou 16 nenhuma alteração clínica, e o escore menor ou igual a 3 significa uma sepse leve, entre 4 e 7 significa uma sepse moderada e entre 8 e 11 significa uma sepse grave (92). 3.7. Histologia e escore patológico Os animais foram anestesiados através de inalação de vapor de isoflurano e posteriormente perfundidos com solução salina (NaCl 0,9%, 4ºC) por 3 minutos. A traqueia foi localizada e os pulmões foram preenchidos com 1 mL de solução de formalina 4%, retirados e deixados nessa solução por 24 h para fixação, quando então a solução foi substituída por etanol 70%. O lóbulo esquerdo do pulmão foi então desidratado e incluído na parafina e foram realizados cortes transversais de 5 μm com o auxílio de um micrótomo. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e analisados em microscópio de luz. As pontuações da lesão pulmonar levam em consideração a hemorragia intra-alveolar, a infiltração de leucócitos e rompimento do tecido. Foram realizadas análises qualitativas e comparativas entre os grupos, com diferentes graus de gravidade. 3.8. Avaliação da carga bacteriana Os animais foram submetidos à instilação intratraqueal e 5 horas após tratados com rosiglitazona e/ou GW 9662 ou veículo. No tempo 24 h, foi realizado o BAL em fluxo laminar. Em seguida foram coletadas alíquotas do BAL e feitas diluições de 1:100 e 1:1000 em PBS e 20 µL dos lavados foram plaqueados em placa de Ágar MacConkey (Merck) e incubadas na estufa a 37ºC por 24 h para posterior contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). Os resultados foram expressos em número de unidades formadoras de colônia por mL. 3.9. Dosagem de citocinas Os sobrenadantes de lavado broncoalveolar foram estocados a -80°C para dosagens de citocinas tais como TNF-α e IL-6 pelo método ELISA (ensaio imunoenzimático). Foram utilizados anticorpos monoclonais específicos (Duo set kit – R&D Systems). Foi utilizado o protocolo da Pharmingen, no qual placas de 96 poços (Nunc) foram revestidas com anticorpos de captura. As placas foram cobertas com papel alumínio e incubadas overnight a 4°C. No dia seguinte, após 3 lavagens com PBS/Tween, os sítios inespecíficos foram bloqueados pela adição de PBS/BSA 1%. Após 1 h as placas foram lavadas por 4 vezes com PBS/Tween 17 novamente e, em seguida, foram adicionadas proteínas recombinantes em diferentes concentrações (curvas padrão), bem como as amostras de lavado peritoneal. Novamente as placas foram incubadas overnight a 4°C. No último dia após a rinsagem, o anticorpo de detecção foi adicionado também diluído em PBS/BSA 1% +Tween 20 a 0,05 %. Após 1 h de incubação a temperatura ambiente, adicionou-se avidina-peroxidase (diluição 1:200, R&D). Após 30 minutos, as placas foram lavadas com solução de lavagem e em seguida, adicionouse a solução de TMB (3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina, Sigma). A reação foi paralisada com a adição solução de ácido sulfúrico (Próquimios) 2 N (50 μL/poço) e a leitura foi feita no comprimento de onda de 405 nm em espectrofotômetro (Spectra Max, Molecular Devices®). 3.10. Análise Estatística Os resultados foram representados como média e erro padrão da média (EPM) e avaliados estatisticamente através da análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste t de Student-Neuman-Keuls (SNK) no software GraphPadPrisma 5.0. Os valores de p<0,05 foram considerados significativos. As curvas de sobrevida foram expressas como percentagem de camundongos vivos, observados num período de 0-168 horas. Para a curva de sobrevida foi utilizado teste estatístico Mantel-Cox-logrank, no qual P<0,05 foram considerados significativos. 18 4. Resultados: 4.1. Análise da sobrevida de animais infectados com K. pneumoniae. Nós investigamos a relação entre unidades formadoras de colônia (UFC) de K. pneumoniae e taxa de mortalidade durante 7 dias. A taxa de sobrevivência dos animais foi de 100% (salina), 90% (1 x 107 e 1 x 108), 60% (2 x 108), 40% (5 x 108) e nenhum animal morreu antes de 48 h. Com base no resultado dessa curva, para os demais experimentos o número de 5 x 108 UFC por animal foi escolhido por apresentar uma taxa de sobrevida em torno de 40%, e os demais parâmetros foram avaliados 24 horas após a inoculação da bactéria. Sobrevida (%) 100 Salina 80 K. pneumoniae 1 x 107 60 K. pneumoniae 1 x 108 K. pneumoniae 2 x 108 40 K. pneumoniae 5 x 108 20 0 0 24 48 72 96 120 144 168 horas Figura 4.1. Análise da taxa de sobrevida de animais inoculados com diferentes concentrações de K. pneumoniae. Camundongos foram submetidos à instilação intratraqueal com K. pneumoniae (1 x 107, 1, 2 e 5 x 108 UFC). Os animais controle receberam a inoculação do mesmo volume de solução salina estéril. A curva de sobrevida foi analisada por um período de 7 dias. Os resultados foram expressos como porcentagem de sobrevivência e são representativos de dois experimentos diferentes. Foram utilizados 10 animais por grupo. 19 4.2. Efeito do pós-tratamento com rosiglitazona na sobrevida após a injeção intratraqueal de bactérias. Para analisarmos se o tratamento com rosiglitazona seria capaz de melhorar a sobrevida dos animais neste modelo de pneumosepse, os animais foram tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) por via i.p. 5 h após a injeção de bactérias. A sobrevida foi avaliada em um período de 7 dias. Os camundongos que receberam a bactéria K. pneumoniae e tratados com salina tiveram uma taxa de sobrevida de 30%. Porém, o pós-tratamento com rosiglitazona em animais sépticos foi capaz de melhorar a sobrevida dos animais de forma relevante, com taxa de sobrevida de 70%. Os animais que receberam solução salina estéril intratraquealmente, tratados ou não com rosiglitazona, foram usados como controle. Sobrevida (%) 100 Salina + DMSO 80 * 60 Salina + Rosi K. pneumoniae + DMSO K. pneumoniae + Rosi 40 20 0 0 24 48 72 96 120 144 168 horas Figura 4.2. Rosiglitazona aumenta a sobrevida dos animais infectados com K. pneumoniae. Camundongos submetidos à instilação intratraqueal com 5 x 108 UFC de K. pneumoniae foram tratados com rosiglitazona (Rosi) ou veículo (DMSO) 5 horas após o estímulo. A taxa de sobrevida foi avaliada por 7 dias. N= 10 animais por grupo. (*) representa significância estatística quando comparado ao grupo controle (K. pneumoniae + DMSO). 20 4.3. Efeito da rosiglitazona no escore clínico de gravidade da sepse em camundongos inoculados com de K. pneumoniae. Para avaliar a gravidade da sepse nos animais, fizemos um escore ou pontuação dos sinais clínicos 24 horas após o procedimento cirúrgico. Quanto maior o escore maior a gravidade da sepse (92). Os animais controle, tratados ou não com rosiglitazona, tiveram um escore clínico próximo de zero, mostrando que a manipulação cirúrgica dos animais, o anestésico e o tratamento com a rosiglitazona por si só, não afetaram o quadro clínico dos animais. No entanto, 24 horas após injeção de bactérias, os animais que receberam apenas solução salina como tratamento já apresentavam um escore que indicava sepse moderada. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 os i on ia e K K .p .p ne u ne u m m on ia e Sa lin a + + D M R SO os i R + D + a Sa lin # * M SO Escore 24 h Todavia, o tratamento com rosiglitazona foi capaz de reduzir significativamente esse escore. Figura 4.3. Efeito da rosiglitazona sobre o escore clínico de gravidade da sepse. Camundongos receberam K. pneumoniae intratraquealmente e foram tratados com rosiglitazona ou veículo nos animais controles. Vinte e quatro horas após foi realizada a análise do escore clínico. Dados representados como média (n= 5/grupo Salina + DMSO e Salina + Rosi; 9/grupo K. pneumoniae + DMSO; 8/grupo K. pneumoniae + Rosi). (*) representa diferença estatística em relação aos grupos Salina + DMSO e Salina + Rosi. (#) representa a significância em relação ao grupo K. pneumoniae + DMSO (p<0,05). 21 4.4. Análise do tecido pulmonar Para avaliar o impacto da infecção no local, foi realizada a análise histológica do tecido pulmonar. Camundongos foram inoculados intratraquealmente com 5 x 108 UFC de K. pneumoniae e tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg, i.p.) ou salina nos animais controles, 5 horas após o procedimento cirúrgico. Vinte e quatro horas após os pulmões foram coletados. Podemos observar, na figura 4.4A, as imagens representativas de secções de tecido pulmonar de camundongos. O tratamento com rosiglitazona levou a redução no infiltrado inflamatório, quando comparadas ao grupo de animais que receberam K. pneumoniae e tratados com salina. Foi realizada a quantificação do dano microscópico pulmonar através da atribuição de escores, a qual está ilustrada Figura 4.4B. A) B) Escore de extensão da lesão pulmonar com base na análise histológica Salina + Salina + Rosi K. pneumoniae + DMSO Lesão pulmonar - - K. pneumoniae + DMSO Rosi +++++ +++ As pontuações da lesão pulmonar levam em consideração a hemorragia intra-alveolar, a infiltração de leucócitos e rompimento do tecido. O símbolo - representa as áreas sem infiltrado inflamatório e os símbolos + à + + + + + representam o grau da lesão pulmonar. Figura 4.4. Histologia e escore patológico do tecido pulmonar. Camundongos receberam K. pneumoniae intratraquealmente e foram tratados com rosiglitazona ou veículo nos animais controles, 5 horas após a inoculação. 24 h após a injeção de bactérias os pulmões foram coletados. Cortes dos pulmões foram obtidos, corados com HE e examinados ao microscópio óptico (A) Imagens representativas do escore da lesão pulmonar (B). 22 4.5. Análise da celularidade do lavado broncoalveolar de animais inoculados com K. pneumoniae e tratados com rosiglitazona Os neutrófilos são células que possuem um papel crucial na defesa contra infecções bacterianas, incluindo a sepse. Estas células estão envolvidas na eliminação de microorganismos por causa do seu amplo estoque de enzimas proteolíticas e sua rápida produção de espécies reativas de oxigênio (93). Investigamos então, o papel da rosiglitazona na resposta inflamatória induzida pela infecção microbiana causada pela K. pneumoniae e analisamos o perfil leucocitário no lavado broncoalveolar dos animais. Para tal, camundongos foram inoculados com 5 x 108 UFC de K. pneumoniae e tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) por via i.p. 5 horas após a instilação, enquanto o grupo controle recebeu apenas solução salina estéril. Após 24 h, foram obtidas amostras do BAL para contagem de leucócitos totais e determinação da contagem diferencial. As análises da celularidade do BAL, como mostrado na figura 4.5A, demonstraram um aumento significativo no número de leucócitos totais nos animais desafiados com a K. pneumoniae tratados com veículo quando comparados com o grupo controle. Este aumento correspondeu ao aumento do número de neutrófilos, não havendo diferença significativa nas células mononucleares entre os grupos. O tratamento com rosiglitazona foi eficaz em reduzir o número de leucócitos totais, assim como o número de neutrófilos no BAL quando comparados com o grupo K. pneumoniae + salina. 23 A) Totais N° cel (x10-6) 8 * Salina Salina + Rosi K. pneumoniae K. pneumoniae + Rosi 6 4 # 2 0 B) Mononucleares 2.5 Salina Sal + Rosi K. pneumoniae K. pneumoniae + Rosi N° cel (x10-6) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 C) Neutrófilos 8 Salina Salina + Rosi K. pneumoniae K. pneumoniae + Rosi N° cel (x10-6) * 6 4 # 2 0 Figura 4.5. Análise da celularidade de amostras do BAL de camundongos tratados com rosiglitazona. Camundongos receberam K. pneumoniae intratraquealmente e foram tratados com rosiglitazona ou veículo nos animais controles, 5 horas após a inoculação. Vinte e quatro horas após a injeção de bactérias, amostras do BAL foram recolhidas para a análise da celularidade. Os dados representam a média ± E.P.M. (n=7/grupo). (*) representa diferença estatística em relação aos grupos Salina e Salina + Rosi. (#) representa a significância em relação ao grupo K. pneumoniae com relação ao grupo K. pneumoniae + Rosi (p<0,05). 24 4.6. Efeito da rosiglitazona sobre a produção de citocinas do lavado broncoalveolar. Estudos prévios têm demonstrado um relevante papel de quimiocinas e citocinas pró e anti-inflamatórias na patogênese da sepse. Diversas células da resposta imune inata como macrófagos e neutrófilos ao reconhecerem produtos bacterianos através dos seus receptores de superfície, irão produzir vários mediadores inflamatórios, como as citocinas e quimiocinas. Estes mediadores atuam promovendo ativação celular e maior recrutamento de leucócitos para o tecido (49). Desta forma, resolvemos investigar se o tratamento com rosiglitazona poderia alterar o padrão de produção de algumas citocinas importantes na sepse. Os animais foram instilados com a K. pneumoniae por via intratraqueal e tratados com rosiglitazona ou veículo (grupo controle) 5 horas após o procedimento cirúrgico. No tempo 24 h, o BAL coletado, foi centrifugado e o sobrenadante livre de células foi obtido, e as citocinas como IL-6 e TNF-α foram dosadas através do método ELISA. Os animais que foram estimulados com a bactéria e receberam apenas o veículo produziram mais TNF-α e IL-6. O tratamento com rosiglitazona foi capaz de reduzir a produção de TNF-α e de IL-6 (figura 4.6 A e B, respectivamente). 25 A) 2.5 IL-6 (ng/ml) 2.0 1.5 1.0 0.5 os i R SO M + D on ia e m on ia e + + K K .p .p ne u ne u m Sa lin a Sa lin a + D R M SO os i 0.0 B) 1.5 TNF- (ng/ml) * 1.0 # 0.5 SO + on ia e ne u K K .p .p ne u m m on ia e Sa lin a + + D R M os i R M SO D + a Sa lin os i 0.0 Figura 4.6. Efeito da rosiglitazona na produção de citocinas. Camundongos receberam K. pneumoniae intratraquealmente e foram tratados com rosiglitazona ou veículo nos animais controles, 5 horas após a inoculação. Vinte e quatro horas após a indução da sepse, alíquotas do BAL foram obtidas e centrifugadas. No sobrenadante do lavado foram detectadas a produção de IL-6 (A), TNF-α (B) Foram utilizados 7 animais por grupo. Os resultados representam a média ± E.P.M (n=7/por grupo). (*) representa diferença estatística em relação aos grupos Salina + DMSO e Salina + Rosi. (#) representa a significância em relação ao grupo K. pneumoniae + DMSO com relação ao grupo K. pneumoniae + Rosi (p<0,05). 26 4.7. Quantificação de UFC no lavado broncoalveolar de animais submetidos à instilação intratraqueal com K. pneumoniae. Neste experimento, investigamos o efeito do tratamento com rosiglitazona na carga bacteriana presente no pulmão de animais instilados com K. pneumoniae. Para isso, camundongos Swiss foram inoculados intratraquealmente com 5 x 108 UFC de K. pneumoniae e tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg, i.p.) ou salina nos animais controles, 5 horas após o procedimento cirúrgico. Vinte e quatro horas após, tiveram amostras de BAL recolhidas para determinação das UFC. Como podemos observar na figura 4.7, o tratamento com rosiglitazona levou a redução na carga bacteriana presente no BAL, quando comparadas ao grupo de animais que receberam K. pneumoniae e tratados com salina. A) * # BAL 400 200 K .p ne R os um on ia e+ D M e+ ia um on .p ne K 27 i SO i R os + a lin Sa lin a + D M SO 0 Sa UFC x 10-6 600 B) Figura 4.7. Efeito do agonista de PPARγ rosiglitazona sobre a carga bacteriana presente no BAL. Camundongos receberam K. pneumoniae intratraquealmente e foram tratados com rosiglitazona (Rosi) ou veículo nos animais controles, 5 horas após a inoculação. Vinte e quatro horas após a indução da sepse, alíquotas do BAL foram plaqueadas para análise de UFC. (A) Contagem manual de UFC e (B) Foto representativa do gráfico exposto, de pelo menos 6 animais por grupo. (*) p< 0,05 em relação ao grupo Salina; (#) p< 0,05 em relação ao grupo K. pneumoniae + DMSO. 28 4.8. Análise do papel do PPARγ nos parâmetros inflamatórios de animais inoculados com K. pneumoniae. A fim de avaliar se os efeitos antiinflamatórios da rosiglitazona demonstrados acima são através da ativação do PPARγ, os animais foram desafiados com a bactéria K. pneumoniae e tratados ou não com o agonista, a rosiglitazona, e/ou com o antagonista, GW9662, 5 horas após o desafio. 24 horas após o procedimento cirúrgico foi avaliada a gravidade da sepse, através do escore clínico (fig. 4.8 A), a migração de neutrófilos para o foco infeccioso (fig. 4.8 B) e a produção de citocinas pró-inflamatórias (fig. 4.8 C) dos animais com sepse. O tratamento com a rosiglitazona foi capaz de melhorar o escore clínico, reduzir a migração de neutrófilos e também reduzir a produção de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α e a IL-6. O tratamento com o antagonista do PPARγ, GW9662, quando administrado em conjunto, foi capaz de reverter os efeitos antiinflamatórios rosiglitazona. 29 A) * B) + 6 -6 Neutrófilos (x10 ) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 * 4 # 2 W ia G W um e + K D . .p M pn on ia S ne e um um e + O R on on os ia ia i e e + + G R W os i+ G W K C) i+ G + os K ne on um .p K .p ne Sa l in a + R l in Sa Sa Sa a + l in a l in a + D R M os i SO + R Sa Sa lin os lin i .p a a + ne + G R u W os K mo i+ .p ni ae G ne W um + K D K o .p M .p SO ne nia ne um um e + on on Ro si ia ia e e + + G R W os i+ G W K Sa lin a D + a Sa lin + 0 M SO escore 24 h # D) 2.5 * TNF- (ng/ml) 1.5 1.0 0.5 0.5 M SO a + D + a Sa lin Sa lin R Sa Sa lin os l K i . p ina a + ne + G G u W W K mo + .p ni a e Ro ne si um + K K on DM .p .p SO ia ne ne um um e + on on Ro si ia ia e e + + G G W W + R os i 0.0 a + Sa DM lin SO a + R Sa Sa lin os l K i . p ina a + ne + G G u W W K mo + .p ni a e Ro ne si um + K K on DM .p .p SO ia ne ne um um e + on on Ro si ia ia e e + + G G W W + R os i 0.0 * 1.0 Sa lin IL-6 (ng/ml) 2.0 1.5 Figura 4.8. Análise do papel do PPARγ na inflamação induzida por K. pneumoniae. Camundongos receberam 5 x 108 UFC de K. pneumoniae intratraquealmente e foram tratados com rosiglitazona (Rosi) e/ou GW9662 (GW) ou veículo nos animais controles, 5 horas após a inoculação. Os dados representam a média ± E.P.M. (pelo menos 5 animais por grupo) Vinte e quatro horas após a indução da sepse foi feita a análise do escore clínico (A). Alíquotas do BAL foram recolhidas para a análise da celularidade (B) e posterior dosagem de citocinas IL6 (C) e TNF-α (D). (*) representa significância do grupo K. pneumoniae + DMSO em relação aos grupos Salina (p< 0,05). (#) representa significância do grupo K. pneumoniae + Rosi em relação ao K. pneumoniae + DMSO (p< 0,05). (+) representa significancia do grupo K. pneumoniae + GW + Rosi em relação ao grupo K. pneumoniae + Rosi (p< 0,05). 30 5. Discussão Atualmente a síndrome séptica pode ser originada da regulação deficiente da resposta imune inata do indivíduo aos produtos microbianos. O desequilíbrio entre a produção de mediadores pró e anti-inflamatórios é considerado pivô no desequilíbrio desta resposta. De fato, diversos estudos pré-clínicos demonstraram que o desbalanço de mediadores impede a manutenção da homeostasia do indivíduo e está amplamente aceito que a resposta inflamatória sistêmica é mais fatal do que a invasão do patógeno propriamente dita (94, 95), uma vez que há relatos de muitos pacientes onde a infecção foi controlada, mas a resposta inflamatória perdurou levando estes pacientes a óbito “estéril”, ou seja, sem a presença do microrganismo que desencadeou a sepse (97). Os pulmões são os locais mais comuns de infecção na sepse, respondendo por quase 50% de todas as fontes de infecção (6). Além disso, os principais microrganismos responsáveis pela sepse gram-negativa são da família Enterobacteriaceae (por exemplo, Escherichia coli e Klebsiella sp.) e infecções causadas por K. pneumoniae estão entre as principais responsáveis pela pneumonia nosocomial (18). Modelos animais vêm sendo usados para estudar a fisiopatologia da sepse com o objetivo de reproduzir as alterações observadas na sepse humana (96). No presente trabalho, utilizamos um modelo de sepse induzida por pneumonia, que consiste na injeção por via intratraqueal de bactérias K. pneumoniae nos pulmões de camundongos Swiss. Este modelo satisfaz diversos critérios essenciais para um bom modelo de sepse: possui uma fonte local de infecção, induz septicemia e libera produtos microbianos na periferia do sítio de injúria. Portanto, é um modelo de grande valia para a investigação de diversos aspectos da sepse, tais como, metabolismo, antibioticoterapia, presença de componentes microbianos, função imunológica e secreção de mediadores inflamatórios (97). As Tiazolidinedionas (TZD) são potentes medicamentos sensibilizadores de insulina que atuam através da ativação do PPARγ. A pioglitazona, a troglitazona e a rosiglitazona são TZD com potentes propriedades de sensibilização da insulina e largamente utilizadas para o tratamento de diabetes tipo 2 (72). Além do controle da glicose, a ativação do PPARγ por estas drogas também tem sido envolvida na modulação da aterosclerose, proliferação de adipócitos e inflamação (98). De fato, os ligantes naturais e sintéticos de PPARγ foram testados em modelos experimentais de sepse devido aos seus efeitos anti-inflamatórios 31 conhecidos. As evidências mostram que o tratamento com TZD e ligantes naturais para PPARγ reduz a liberação de IL-6, IL-10, TNF-α, CCL2 e também a infiltração de neutrófilos no pulmão e no fígado induzido na sepse polimicrobiana ou endotoxemia (99). Além disso, o tratamento de camundongos endotoxêmicos com agonistas de PPARγ reduziu os níveis das proteínas de alta mobilidade eletroforética do grupo B1 (HMGB1) e marcadores para disfunção orgânica. Como consequência, a sobrevivência dos animais foi significativamente aumentada por estes tratamentos (100). A administração de rosiglitazona 5 h após a injeção de bactérias se mostrou bastante eficaz na prevenção da mortalidade por sepse, melhorando a sobrevida dos animais nas primeiras 24 h e permanecendo assim por toda a cinética de análise. O tratamento dos animais com rosiglitazona em 5 h tem grande relevância clínica, uma vez que neste momento os animais já se encontravam com a sepse estabelecida. Interessantemente, no presente modelo, não foi observada qualquer mortalidade antes de 24 h após a inoculação de bactérias. Essa mortalidade lenta pode ser uma vantagem em comparação com os outros modelos de sepse que apresentam uma mortalidade significativa dentro de 6-12 h após o desafio e, consequentemente, não podem ser reproduzidas da forma como ocorre durante a sepse humana (101). A fim de avaliar a gravidade da sepse, foi feito um escore clínico no qual foram atribuídas pontuações de acordo com a evolução da doença nos animais. Deste modo avaliamos que o modelo de sepse adotado no presente estudo foi classificado como sepse moderada e que o tratamento com rosiglitazona foi capaz de melhorar a condição clínica destes animais. Além disso, o antagonista de PPARγ, GW9662, reverteu este efeito protetor. Isto sugere que a resposta da rosiglitazona é mediada pelo receptor PPARγ. Um dos controles do organismo contra a infecção é a eliminação bacteriana por células da resposta imune inata, como os macrófagos e neutrófilos. Os neutrófilos são as primeiras células do sistema imunológico que chegam para eliminar o patógeno invasor. Estas células quando ativadas, produzem uma série de mediadores pró-inflamatórios (TNF-α, IL1β), ROS e NO. O intenso influxo de neutrófilos para os pulmões está associado ao dano tecidual causado pela liberação do conteúdo dos grânulos das células polimorfonucleares. O excesso na produção desses mediadores está envolvido no dano tecidual, aumento da permeabilidade vascular e falência dos órgãos (102). A análise histológica dos pulmões dos animais desafiados com a K. pneumoniae mostrou um importante infiltrado de células para o espaço alveolar e o tratamento com a rosiglitazona foi capaz de reduzir significativamente o número destas células no pulmão. Da 32 mesma maneira que a análise histológica, a contagem de células das amostras do BAL dos animais sépticos também mostrou uma grande quantidade de leucócitos, principalmente de neutrófilos, presentes no lavado broncoalveolar dos animais desafiados com a bactéria. O tratamento com a rosiglitazona foi capaz de reduzir o acúmulo de neutrófilos neste local, efeito revertido pelo tratamento com o GW9662. A ativação do PPARγ possui um importante efeito anti-inflamatório neste modelo. Estes resultados corroboraram com o estudo mostrado por (103) em que outra glitazona, a Ciglitazona foi capaz de diminuir o infiltrado de leucócitos no pulmão, fígado e cólon em um modelo sepse polimicrobiana em ratos, que foi relacionada com uma evidente redução da mortalidade nos animais sépticos. Na sepse, a excessiva e prolongada produção de citocinas na resposta inflamatória, é ainda mais deletéria do que a infecção propriamente dita. Esta teoria é especialmente notável na sepse grave, na qual a excessiva produção de citocinas pró-inflamatórias causam aumento na permeabilidade capilar, dano tecidual e falência múltipla de órgãos (35). Trabalhos in vitro tem sugerido que as vias de NF-kB e da AP-1 controlam vários genes inflamatórios, tais como os de iNOS, moléculas de adesão e citocinas (104, 105). O TNF-α é uma citocina próinflamatória produzida principalmente por macrófagos e mastócitos ativados, sendo considerado um mediador essencial da inflamação. Esta citocina induz a vasodilatação levando a hipoperfusão tecidual, choque e falência de órgãos. Os macrófagos e mastócitos bem como as células endoteliais e os fibroblastos também produzem IL-6, em resposta a estímulos como endotoxinas bacterianas, IL-1 e TNF-α (36). A IL-6 atua estimulando os linfócitos B e T e induz a febre (106). Estudos mostram que o alto nível de IL-6 está associado com o aumento da mortalidade na sepse grave (107, 108). Por outro lado, a via de sinalização que induz a expressão da IL-6 foi essencial para o desenvolvimento da inflamação sistémica, a qual foi demonstrada em animais knockouts para esta citocina (108). Estas evidências sugerem que tanto a IL-6, quanto o TNF-α podem ter um papel fundamental no desenvolvimento da sepse. As nossas análises demonstraram que o tratamento com rosiglitazona diminuiu a produção dessas citocinas. E mais uma vez, o antagonista de PPARγ, GW9662, reverteu este efeito protetor, indicando que a resposta da rosiglitazona é realmente mediada pelo receptor PPARγ na produção citocinas. A bactéria K. pneumoniae desenvolveu diversos mecanismos para resistir ao sistema imune inato do hospedeiro. Sua patogenicidade pode ser atribuída à produção de enterotoxina estável ao calor; à habilidade de metabolizar a lactose; à presença de cápsula ou 33 lipopolissacarídeo; à presença de adesinas com ou sem fímbrias que favorece sua adesão às mucosas e às células epiteliais (109). Estes mecanismos protegem a bactéria das defesas mecânicas e celulares do trato respiratório e favorecem a infecção. Desta forma, é de grande importância a descoberta de novos alvos moleculares que venham auxiliar o hospedeiro no combate a infecção. A eliminação bacteriana é essencial para impedir a disseminação do microrganismo (92). Para avaliar o papel da rosiglitazona na eliminação bacteriana, foi feita a contagem do número de UFC presente no pulmão de animais tratados e não tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg), após 24 h da indução da sepse. Desta forma, foi observado que o tratamento com rosiglitazona permitiu uma redução significativa no número de UFC recuperadas a partir do BAL, corroborando com a hipótese de que os efeitos deste fármaco seriam parcialmente responsáveis pela diminuição da mortalidade dos animais sépticos. De maneira interessante, em um trabalho de Araújo, 2012 (110), também foi possível observar um efeito protetor da rosiglitazona, no crescimento bacteriano em um modelo de sepse polimicrobiana induzida por CLP (ligadura e punção cecal) em camundongos Swiss. Neste estudo, o pós-tratamento com rosiglitazona (0,5 mg/kg, i.v.) 15 min após o processo cirúrgico diminuiu da carga bacteriana (UFC) no lavado peritoneal destes animais. A autora relata ainda que esta eliminação bacteriana pode estar associada à indução do mecanismo de NETose envolvendo a formação de NET (redes extracelulares de neutrófilos) pela rosiglitazona (artigo submetido). As NET são estruturas formadas por fibras de cromatina associadas a proteínas de grânulos citoplasmáticos que confinam e matam patógenos, auxiliando na contenção do processo infeccioso. Este mecanismo também previne o dano colateral ao tecido do hospedeiro por reter proteases tóxicas e reduzir a sua atividade proteolítica (111-113). Estes dados reforçam a idéia de que os ligantes de PPARγ interferem no crescimento bacteriano em diferentes modelos experimentais de sepse. Em conjunto, nossas analises permitiram avaliar o papel da ativação do receptor nuclear PPARγ para modular a resposta inflamatória provocada pela bactéria K. pneumoniae. O tratamento dos animais com rosiglitazona teve ação em diversos parâmetros fisiopatológicos da sepse, modulando a resposta inflamatória, reduzindo o infiltrado celular no foco infeccioso, aumentando a eliminação bacteriana, melhorando o quadro clínico e diminuindo a mortalidade dos animais sépticos (fig. 5). Futuros esclarecimentos sobre os mecanismos moleculares pelos quais PPARγ modula a inflamação poderão melhorar a nossa 34 compreensão a respeito do papel imuno-modulador do PPARγ nas doenças inflamatórias pulmonares e sistêmicas como a sepse e também sugerir um potencial uso como adjuvantes no tratamento de tais doenças. Figura 5. Esquema final. Os animais receberam K. pneumoniae por via intratraqueal e foram tratados com o agonista PPARγ, rosiglitazona (rosi). A ativação do PPARγ reduziu a expressão de citocinas pró inflamatórias, como TNF-α e IL-6, diminuindo o acúmulo de neutrófilos e aumentando a eliminação bacteriana. Refletindo na melhora dos sinais clínicos dos animais e consequentemente no aumento da sobrevida. 35 6. Conclusões O agonista de PPARγ rosiglitazona diminuiu a migração de neutrófilos no foco infeccioso, alem de reduzir a síntese de citocinas, como o TNF-α e IL-6 no BAL de animais submetidos à instilação intratraqueal com K. pneumoniae. O tratamento com a rosiglitazona reduziu carga bacteriana no BAL de animais submetidos à instilação intratraqueal com K. pneumoniae. O tratamento com a rosiglitazona aumentou o escore clínico e a sobrevida dos animais desafiados com a bactéria K. pneumoniae. Os efeitos antiinflamatórios da rosiglitazona foram revertidos quando administrada juntamente com o GW9662, indicando que o mecanismo de ação desta glitazona depende da ativação do PPARγ. 36 7. Referências Bibliográficas 1. Bone RC, Sibbald WJ, Sprung CL. The ACCP-SCCM consensus conference on sepsis and organ failure. Chest. 1992;101(6):1481-3. 2. Russell JA. Management of sepsis. N Engl J Med. 2006;355(16):1699-713. 3. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 2003;348(2):138-50. 4. Bone RC. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS. Crit Care Med. 1996;24(7):1125-8. 5. Blackwell TS, Christman JW. Sepsis and cytokines: current status. Br J Anaesth. 1996;77(1):110-7. 6. Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med. 2003;348(16):1546-54. 7. Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR. 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