(11) (21) PI 0308441

(11) (21)
PI 0308441-8 A
(22) Data de Depósito: 13/03/2003
(43) Data de Publicação: 18/01/2005
República Federativa do Brasil (RPI 1776)
Ministério do Desenvolvimento, Indústria
e do Comércio Exterior
Instituto Nacional da Propriedade Industrial
(54) Título: PROTEÍNA VARIANTE DE P4 DE
HAEMOPHILUS INFLUENZAE NÃO TIPIFICÁVEL,
COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MOLÉCULA DE
NUCLEOTÍDEO ISOLADA, CÉLULA HOSPEDEIRA, E,
MÉTODOS PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE
EM UM SER HUMANO CONTRA H. INFLUENZAE NÃO
TIPIFICÁVEL, E PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA
VARIANTE DE P4
(30) Prioridade Unionista:
15/03/2002 US 60/364,688
(71) Depositante(s):
Wyeth Holdings Corporation (US) , The
Curators Of The University Of Missouri (US)
(72) Inventor(es):
Bruce A. Green, Gary W. Zlotnick, Leah D.
Fletcher, Arnold L. Smith, Thomas J. Reilly
(74) Procurador:
Momsen, Leonardos & Cia.
(86) Pedido Internacional:
PCT USO3/07895 de 13/03/2003
(87) Publicação Internacional:
WO 03/078453 de 25/09/2003
(51) Int. C17.:
CO7K 1/00
A61K 39/02
A61K 39/102
CO7H 21/04
C12P 21/06
C12N 1/20
ce, v,E•
P
(57) Resumo: "PROTEÍNA VARIANTE DE P4 DE HAEMOPHILUS
INFLUENZAE NÃO TIPIFICÁVEL, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA,
MOLÉCULA DE NUCLEOTÍDEO ISOLADA , CÉLULA HOSPEDEIRA, E,
MÉTODOS PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM SER
HUMANO CONTRA H. INFLUENZAE NÃO TIPIFICÁVEL, E PAPA
PRODUZIR UMA PROTEÍNA VARIANTE DE P4". Uma proteina variante
P4 que tem atividade enzimática reduzida e que induz anticorpo à proteina
P4 do tipo selvagem e/ou tem boa atividade bacteriana contra H.
influenzae não tipificável, é útil como um componente ativo em uma
composição imunogênica para seres humanos. Os métodos de uso destas
proteinas, e as composições contendo-as em combinação com antígenos
adicionais, também são fornecidas.
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"PROTEÍNA VARIANTE DE P4 DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE NÃO
TIPIFICÁVEL, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MOLÉCULA DE
NUCLEOTÍDEO ISOLADA, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODOS
PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM SER HUMANO
5 CONTRA H INFLUENZAE NÃO TIPIFICÁVEL, E PARA PRODUZIR
UMA PROTEÍNA VARIANTE DE P4"
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção diz respeito em geral aos campos das
composições imunogênicas e, mais particularmente, das composições
10
imunogênicas contra a otite média.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A Haemophilus influenzae não tipificável (NTHi) cauda
doenças nos seres humanos, incluindo a pneumonia, a otite média, a sinusite e
a traqueobronquite febril aguda nos adultos. Esta bactéria é também um
15 agente etiológico freqüente da otite média em crianças e bebês. Tendo em
vista que a infecção pelo NTHi confere apenas imunidade específica da cepa,
os seres humanos podem ser repetidamente infectados. De fato, a doença mais
crônica causada por esta bactéria é a otite de repetição em crianças, resultando
em tratamentos que incluem a exposição repetida a antibióticos ou cirurgia
20
para a inserção de tubos de drenagem nos ouvidos.
Nenhuma das composições imunogênicas disponíveis para
tratar as cepas de H. influenzae tipificáveis (que são caracterizadas por uma
cápsula conhecida) são úteis no tratamento da NTHi. Assim, consideráveis
pesquisas têm sido conduzidas para encontrar um componente que possa ser
25 útil em prevenir a infecção causada pela NTHi. Em pesquisas de componentes
candidatos para prevenir a ocorrência da otite média em seres humanos, a
lipoproteína bacteriana denominada Proteína 4 (P4; anteriormente referida
como "proteína e de membrana externa") de NTHi foi identificada como um
componente desejável por causa de sua capacidade de eliciar anticorpos
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bactericidas à bactéria em seres humanos. A P4 foi observada eliciar os
anticorpos bacterianos que atuam em sinergia com anticorpos contra outras
proteínas da membrana externa de NTHi. Por causa disto, a proteína pode ser
usada em combinação com outras proteínas da membrana externa para induzir
5
uma resposta bactericida mais potente.
O gene hel que codifica p4 é antigenicamente conservado
dentro e entre as cepas de H. influenzae. Ver, por exemplo, as Patentes dos
Estados Unidos n' 5.780.601, 5.955.580 e 5.601.831 e as Patentes Européias
EP O 606 921 e EP O 462 210, entre outras, que ficam aqui incorporadas como
10 referência. As seqüências do gene hel (SEQ ID NO: 1) e a pré-proteína
codificada de 274 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) são disponíveis do banco de
dados da NCBI, Acesso rig- M68502 e identificadas em Green, B. A. et al.,
1991 Infect. Immun., 59(9): 3191-3198. A P4 de NTHi madura é uma proteína
lipidada de 254 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 3), codificada
15 pelos nucleotídeos 209 a 970 da SEQ ID NO: 1. A proteína pré-P4 não
processada de 274 aminoácidos tem um peptídeo de sinal de 20 aminoácidos
que específica o sítio para acilação de ácidos graxos (SEQ ID NO: 2,
aminoácidos de 1 a 20), e é codificada pelos nucleotídeos 149 a 970 da SEQ
ID NO: 1, com os nucleotídeos 149 a 208 codificando o sinal ou o peptídeo
20
condutor.
A função da proteína P4 em Haemophilus pensou-se
originalmente que fosse o transporte da hemina (Reidl, J. e J. J. Mekalanos.
1996 J. Exp. Med., 183: 621-629,5. Entretanto, verificou-se mais tarde que a
proteína P4 era uma enzima da membrana externa, isto é, uma ácido fosfatase
25 bacteriana (Reilly, T. J. et al., 1999 J. Bacteriol., 181: 6797-6805). O mais
recente trabalho na área apresentou diferentes opiniões pelos laboratórios
quanto à verdadeira função da proteína P4 (Kemmer, G. et al, 2001 J.
Bacteriol., 183: 3974-3981; Reidl, J. et al., 2000 Mol. Microbiol., 35: 15731581; Reilly, T. e A. Smith, 1999 Prot. Exp. Purif., 17: 401-409; Reilly, T. J.
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et al., 1999. J. Bacteriol., 181: 6797-6805; e Reilly, T. J. et al., 2001 FEBS
Lett., 494: 19-23).
A identificação de P4 como uma proteína enzimática criou
uma preocupação potencial quanto a seu uso como um componente de uma
5 composição imunogênica para seres humanos. Esta proteína é
enzimaticamente ativa e seu substrato in vivo não está completamente
definido. Embora a P4 do tipo selvagem não tenha nenhum efeito prejudicial
conhecido quando administrada a seres humanos, é geralmente aceito que as
proteínas não enzimaticamente ativas ou aquelas com atividade reduzida são
10 preferidas às proteínas enzimaticamente ativas para uso em composições
imunogênicas a serem administradas a seres humanos. Uma proteína
enzimaticamente ativa não é preferida para uso como um componente
imunogênico, porque sua atividade enzimática pode provocar uma reação
inesperada indesejável no ser humano imunizado, que não a indução de
15
anticorpos.
Os fragmentos de proteína P4 ou as seqüências de P4
"mutante" variante descritas de uma forma geral pelos documentos e patentes
acima mencionadas, não são caracterizadas em termos da propriedade mais
importante para uma composição imunogênica, isto é, a imunogenicidade.
20 Nenhuma informação é fornecida sobre os efeitos da mutação sobre a
imunogenicidade. Ademais, nenhuma indicação é fornecida que modifique
que a atividade enzimática tenha qualquer efeito sobre o potencial
imunogênico. Assim, nada na técnica anterior fornece qualquer diretriz para a
seleção de mutantes da proteína P4 para produzir um componente para uma
25
composição imunogênica.
Uma necessidade contínua existe na técnica quanto às
composições terapêuticas e profiláticas que compreendam as proteínas
variantes de P4 de NTHi, que tenham atividade enzimática reduzida e que
sejam imunologicamente equivalentes à proteína do tipo selvagem, para uso
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seguro em composições imunogênicas para seres humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína variante de
P4 (mutante) que possui atividade enzimática reduzida em comparação com a
5 proteína P4 do tipo selvagem e que induza anticorpos à proteína P4 do tipo
selvagem e/ou que tenha atividade bactericida contra NTHi. Esta proteína
variante é útil na indução de uma resposta imune protetora contra NTHi em
um ser humano imunizado.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição
10 imunogênica compreendendo uma proteína variante de P4 de NTHi como
aqui descrito, um carreador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente,
um adjuvante. Esta composição pode conter proteínas ou peptídeos
antigênicos adicionais e é útil na indução de uma resposta imune protetora
contra NTHi.
15
Em ainda um outro aspecto, a invenção fornece moléculas de
nucleotídeos isoladas ou recombinantes compreendendo uma seqüência de
ácido nucleico codificando uma variante de P4 da invenção. A invenção
também fornece vetores tais como plasmídeos, vírus recombinantes, etc.,
contendo estas moléculas sob o controle regulador de seqüências que
20
orientam a expressão da variante em uma célula hospedeira.
Ainda outro aspecto desta invenção fornece uma célula
hospedeira compreendendo um vetor que contém uma molécula de
nucleotídeo como descrito neste relatório.
Ainda outro aspecto desta invenção inclui métodos para
25 induzir uma resposta imune em um ser humano contra NTHi mediante
administração da proteína variante ou de composições contendo-a.
Um outro aspecto ainda da invenção envolve métodos para a
expressão recombinante de uma proteína variante de P4 por uma célula
hospedeira transformada, transfectada ou transduzida por um vetor que
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contenha estas moléculas.
Outro aspecto desta invenção inclui o uso de uma proteína
variante de P4 como um carreador para outro antígeno, em que o outro
antígeno pode ser uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um
5 polissacarídeo, um oligossacarídeo, um sacarídeo, um lipopolissacarídeo, um
lipooligossacarídeo ou um lipossacarídeo. A proteína P4 variante tem
atividade enzimática reduzida em comparação com a proteína P4 do tipo
selvagem, mas não necessita necessariamente ou induzir anticorpo à proteína
P4 do tipo selvagem ou ter atividade bactericida contra NTHi, com a condição
10 de que a proteína carreadora da variante de P4 não tenha uma fenilalanina na
posição 122 de aminoácido da SEQ ID NO: 3.
Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes a uma
pessoa habilitada na técnica, após leitura da seguinte descrição detalhada da
invenção.
15
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção atende às necessidades da técnica em
fornecer uma proteína variante de P4 enzimaticamente não ativa, que induz
anticorpos à proteína P4 do tipo selvagem e/ou tem atividade bactericida
contra NTHi. As composições que contêm tais proteínas variantes de P4,
20 moléculas de ácido nucleico codificando-as, e métodos de uso de tais
proteínas e moléculas de ácido nucleico, proporcionam novos meios para
induzir a imunidade contra NTHi em seres humanos.
A. Proteínas P4 Variantes desta Invenção
As proteínas P4 variantes são definidas como proteínas P4
25 mutantes que têm ou muito poucos níveis de atividade enzimática de P4, ou
nenhuma atividade enzimática de P4 detectável. Quando usadas como
componentes em composições imunogênicas, estas proteínas P4 variantes
conservam as propriedades imunológicas desejáveis da proteína P4 do tipo
selvagem. Estas propriedades incluem a eliciação de anticorpos reativos de
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ELISA contra P4 do tipo selvagem e/ou anticorpos bactericidas contra NTHi.
Quando usadas como proteínas carreadoras, as proteínas P4 variantes não
necessitam conservar as propriedades imunológicas da proteína P4 do tipo
selvagem.
5
Tendo em vista que a correlação clínica de proteção contra
NTHi não é conhecida, a substituição de uma P4 do tipo selvagem por uma
P4 mutante em uma composição imunogênica pode apenas ser bem sucedida
se o mutante eliciar os títulos de ELISA e/ou os títulos bacterianos
equivalentes àqueles eliciados pela lipoproteína P4 recombinante (rLP4) do
10 tipo selvagem. Essas proteínas P4 variantes são componentes desejáveis das
composições imunogênicas úteis para a profilaxia de infecção de NTHi.
Como usadas neste relatório, as expressões "proteína P4 variante" ou
"proteína P4 mutante" se referem a uma proteína ou lipoproteína que carrega
mutações específicas em resíduos de aminoácidos que substancialmente
15 removam a atividade enzimática da P4 do tipo selvagem, e ainda permitam a
retenção da capacidade da proteína de induzir uma resposta imune a NTHi em
uma ser humano.
Por "resposta imune" ou "imunidade", já que os termos são
intercambiavelmente aqui usados, denota-se a indução de uma resposta
20 humoral (isto é, célula B) e/ou celular (isto é, célula T). Adequadamente, uma
resposta imune humoral pode ser avaliada pela medição dos anticorpos
específicos do antígeno de P4 presentes no soro de animais imunizados em
resposta à introdução das variantes da proteína P4 desta invenção em um
hospedeiro. Em uma modalidade exemplar abaixo, a resposta imune é
25 avaliada pelo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) dos soros de
animais imunizados. O ensaio de linfócitos citotóxicos T (CTL) pode ser
empregado para medir a resposta da célula T de linfócitos isolados do baço de
animais imunizados.
Preferivelmente a proteína P4 variante desta invenção é uma
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lipoproteína, isto é, ela contém uma cisteína modificada em seu término
amino, ao qual um glicerol acilado graxo é ligado a tioéter e um ácido graxo é
ligado a seu grupo amino terminal. Em uma modalidade de uma proteína
variante de P4 desta invenção, o peptídeo condutor é o peptídeo condutor de
5 P4 do tipo selvagem de H. influenzae, isto é, os aminoácidos de 1 a 20 da
SEQ ID NO: 2. Entretanto, outros peptídeos que especificam um sítio para
acilação graxa em uma célula bacteriana podem ser fundidos à proteína
variante de P4 no lugar da seqüência do tipo selvagem, para fornecer uma
lipoproteína. Exemplos de outros peptídeos condutores incluem aqueles da
10 proteína P6 de H. influenzae, a proteína OspA de Borrelia burgdorferi e
aqueles dos peptídeos de sinal lipídicos bacterianos Gram-positivos.
Em ainda outra forma de realização desta invenção, em que a
proteína variante P4 é usada como uma proteína carreadora, ela pode
preferivelmente ser não lipidada, isto é, seja expressa sem um peptídeo
15 condutor. Por exemplo, ela carece do peptídeo condutor dos aminoácidos 1 a
20 da SEQ ID NO: 2 ou ela é fundida a um peptídeo condutor que careça de
um sítio para acilação graxa.
Na totalidade deste relatório descritivo, a identificação do
resíduo de aminoácido em que as mutações específicas sejam localizadas, é
20 aquele número de resíduo correspondente à seqüência de aminoácidos
lipidados maduros processados de p4 do tipo selvagem, isto é, a SEQ ID NO:
3.
Esta invenção é direcionada a uma proteína variante de P4 de
NTHi que tem atividade enzimática reduzida em comparação com a proteína
25 P4 do tipo selvagem e que induz o anticorpo à proteína P4 do tipo selvagem
e/ou que tem atividade bactericida contra NTHi, em que a proteína variante de
p4 tem uma mutação selecionada do grupo consistindo de:
(a) uma mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO:
3, que é uma glutamina na proteína P4 do tipo selvagem;
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(b) uma mutação no resíduo de aminoácido 48 da SEQ ID NO:
3, que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem;
(c) uma mutação no resíduo de aminoácido 64 da SEQ ID NO:
3, que é um ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem;
5
(d) uma mutação no resíduo de aminoácido 161 da SEQ ID
NO: 3, que é uma lisina na proteína P4 do tipo selvagem;
(e) uma mutação no resíduo de aminoácido 218 da SEQ ID
NO: 3, que é uma asparagina na proteína P4 do tipo selvagem;
(f) mutações nos resíduos de aminoácido 35 e 37 da SEQ ID
10
NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem, em que as mutações
não sejam ácido glutâmico, glutamina ou treonina;
(g) mutações nos resíduos de aminoácido 64 e 66 da SEQ ID
NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
15 Especificamente, uma primeira modalidade de uma proteína
variante de P4 específica desta invenção é uma proteína que contém uma
mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO: 3, que é uma
glutamina na proteína P4 do tipo selvagem. Em uma modalidade, a proteína
variante de P4 contém um ácido glutâmico na posição de aminoácido 39 da
20
SEQ ID NO: 3. Alternativamente, a proteína variante de P4 contém um ácido
aspártico ou asparagina na posição aminoácido 39 da SEQ ID NO: 3.
Uma segunda modalidade de uma proteína variante de P4
desta invenção contém uma mutação no resíduo de aminoácido número 48,
que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem. Desejavelmente, esse
25 resíduo de aminoácido na proteína variante de P4 é uma cisteína. A
substituição do resíduo de Phe pelo resíduo de Cys na posição 48 é uma
mudança não conservativa que se pode ter esperado rompesse a estrutura
protéica. Entretanto, esta proteína variante de P4 tem propriedades antigênicas
e imunogênicas desejáveis. Esta proteína variante de P4 também carece da
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capacidade de complementar as mutações hemA em E. coli. Ver Reilly, T. J.
et al., 2001 FEBS Lett. 494: 19-23, aqui incorporada como referência em sua
totalidade. Alternativamente, a proteína variante de P4 contém uma serina ou
outros aminoácidos que possuem grupos polares não carregados, tais como a
5 glicina, a treonina, a tirosina, a asparagina e a glutamina, na posição de
aminoácido 48 da SEQ ID NO: 3.
Uma terceira modalidade de uma proteína variante de P4 desta
invenção contém uma mutação na posição 64 do resíduo de aminoácido da
SEQ ID NO: 3, que é ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem. Em
10 uma modalidade, a proteína variante de P4 contém uma asparagina ou ácido
glutâmico no resíduo 64. Alternativamente, a proteína variante de P4 contém
alanina na posição 64 de aminoácido da SEQ ID NO: 3.
Uma quarta modalidade de uma proteína variante de P4 desta
invenção contém uma mutação na posição 161 do resíduo de aminoácido da
15 SEQ ID NO: 3, que é lisina na proteína P4 do tipo selvagem. Em uma
modalidade, a proteína variante de P4 contém uma arginina no resíduo 161.
Uma quinta modalidade de uma proteína variante de P4 desta
invenção contém uma mutação na posição 218 do resíduo de aminoácido de
SEQ ID NO: 3, que é asparagina na proteína P4 do tipo selvagem. Em uma
20 modalidade, a proteína variante de P4 contém uma glutamina no resíduo 218.
Alternativamente, a proteína variante de P4 contém um ácido aspártico ou
ácido glutâmico na posição 218 de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
Uma sexta modalidade de uma proteína variante de P4 desta
invenção contém mutações nas posições 35 e 37 do resíduo de aminoácido de
25 SEQ ID NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem. Em uma
modalidade, a proteína variante de P4 contém uma asparagina nos resíduos 35
e 37. A proteína variante de P4 não contém um ácido glutâmico, glutamina ou
treonina mas posições 35 e 37 de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
Uma sétima modalidade de uma proteína variante de P4 desta
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invenção contém mutações nas posições 64 e 66 de resíduo de aminoácido de
SEQ ID NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem. Em
uma modalidade, a proteína variante de P4 contém uma alanina nos resíduos
64 e 66. Alternativamente, a proteína variante de P4 contém asparagina ou
5
ácido glutâmico nas posições 64 e 66 de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
Determinou-se que a eliminação ou redução da atividade
enzimática nas proteínas variantes de P4 não seguem nenhum padrão óbvio
quanto ao fato de ser a imunogenicidade contra P4 do tipo selvagem
preservada. Diversas mutações na seqüência de P4 eliminam ou reduzem a
10 atividade enzimática, mas também tornam as proteínas mutantes incapazes de
eliciar ou os títulos de ELISA elevados ou os títulos bactericidas elevados.
Observou-se uma falta de correlação entre a atividade enzimática e a
imunogenicidade, entre os títulos de ELISA elevados e os títulos bactericidas
elevados, e entre a possibilidade de previsão dos efeitos de mudanças
15 conservadas na estrutura antigênica em uma variedade de proteínas variantes
de P4 que tivessem sido pesquisadas e identificadas abaixo nos exemplos.
Por exemplo, tentativas iniciais para eliminar a atividade
enzimática na proteína P4 foram feitas nos motivos DD conhecidos (dois
resíduos de ácido aspártico adjacentes ou próximos) comuns às fosfatases
20 ácidas bacterianas (Thaller, M. C. et al., 1998. Prot. Sci., 7: 1647-1652), isto
é, os resíduos de aminoácido 64 e 66 de SEQ ID NO: 3 e as posições de
aminoácido 184 e 185 de SEQ ID NO: 3. Quando as proteínas variantes P4
contendo ou um mutante duplo de duas alaninas no lugar dos dois ácidos
aspárticos nas posições 64 e 66 ou um mutante duplo de duas alaninas no
25 lugar dos dois ácidos aspárticos nas posições 184 e 185, foram avaliadas
quanto à atividade enzimática, ambas eram enzimaticamente inativas.
Entretanto, quando estas proteínas foram usadas para imunizar
camundongos, os anti-soros produzidos apresentaram baixos títulos de ELISA
em relação à P4 do tipo selvagem. Isto foi apresentado como sendo por causa
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de uma mudança nos epítopos reconhecidas pelos anticorpos, já que os antisoros tinham títulos elevados em relação às proteínas homólogas. Ao
contrário, quando a atividade bactericida destes anti-soros foi avaliada, os
anti-soros para ambas as proteínas mutantes apresentaram altos níveis de
5 atividade bactericida quanto aos mutantes D64A e D66A, e baixos níveis de
atividade bactericida quanto aos mutantes D184A e D185A. Assim, os
mutantes D64A e D66A são componentes úteis para inclusão em uma
composição imunogênica, enquanto os mutantes D184A e D185A não o são.
Outro mutante proposto continha uma substituição do resíduo de Asp na
10 posição 64 com um resíduo Glu altamente conservador, resultando em uma
variante de P4 (D64E) que eliciava altos títulos de ELISA em relação à P4 do
tipo selvagem, não obstante ele tivesse baixos títulos bactericidas em relação
a NTHi. Ainda outras proteínas de P4 mutantes propostas, que não satisfazem
os critérios quanto às proteínas variantes de P4 úteis como componentes de
15 uma composição imunogênica desta invenção são apresentadas nos exemplos
abaixo.
Outras proteínas variantes de P4 úteis nesta invenção incluem
uma lipoproteína de 254 aminoácidos madura de comprimento completo, com
uma ou mais das mutações específicas fornecidas acima, ou um polipeptídeo
20 ou um seu fragmento contendo os resíduos mutageneizados descritos acima e
cuja proteína, polipeptídeo ou fragmento retêm a atividade enzimática
reduzida, atividades de ELISA e/ou bactericida (BC) da variante de P4 de
comprimento completo da qual são derivados.
Fragmentos imunologicamente ativos, enzimaticamente
25 inativos, destas proteínas variantes de P4 ordinariamente conterão pelo menos
cerca de 25 aminoácidos contíguos das proteínas variantes de P4 contendo o
sítio de mutagênese observado acima. Mais tipicamente um fragmento de
proteína variante de P4 contém pelo menos cerca de 100 aminoácidos
contíguos. Outro fragmento de uma proteína variante de P4 contém pelo
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menos cerca de 150 aminoácidos contíguos. Ainda outra modalidade de uma
proteína variante de P4 contém pelo menos cerca de 200 aminoácidos
contíguos de comprimento.
Um fragmento da proteína variante de P4 é útil nos métodos
5 descritos abaixo, se ele induzir uma resposta imune protetora a NTHi no
paciente. Os fragmentos incluem truncações da região de terminal carbóxi da
proteína P4. Por exemplo, uma proteína variante de P4 truncada ao redor do
resíduo 200 (isto é, ela contém os aminoácidos de 1 a 200 da SEQ ID NO: 3)
é um fragmento desejável. De forma semelhante, as proteínas variantes de P4
10 truncadas ao redor dos resíduos 210, 221 ou 232 são fragmentos desejáveis.
Outros fragmentos ainda das variantes de P4 não enzimaticamente ativas,
imunologicamente ativas, desta invenção, podem ser selecionados. Os
fragmentos acima podem também conter uma ou mais das mutações
específicas descritas acima.
15
Outras proteínas variantes de P4 adequadas podem incluir
aquelas em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo
substituído. Ainda outra proteína variante de P4 adequada é aquela em que o
polipeptídeo é fundido com outro composto, tal como um composto para
aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol). Outra
20 proteína variante de P4 adequada é aquela em que aminoácidos adicionais são
fundidos ao polipeptídeo, tal como uma seqüência condutora ou secretória, ou
uma seqüência que seja empregada para intensificar a imunogenicidade da
proteína variante de P4. Outras modificações ainda da proteína variante de P4
incluem a deleção acima mencionada da seqüência de sinal ou condutora no
25 término N de P4, isto é, codificada pelos nucleotídeos 148 a 208 da SEQ ID
NO: 1 e/ou a deleção de outras regiões que não efetuam a imunogenicidade.
De forma semelhante, uma modificação das proteínas variantes de P4 aqui
descritas inclui a substituição da seqüência de sinal ou condutora por outra
seqüência de sinal ou condutora. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.780.601,
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aqui incorporada como referência.
Ainda outro exemplo de proteínas variantes de P4 adequadas
são aquelas em que aminoácidos opcionais (por exemplo, -Gly-Ser-) ou outro
aminoácido ou espaçadores de composto químico podem ser incluídos nos
5 términos dos peptídeos com a finalidade de ligar as proteínas entre si ou a um
carreador. Por exemplo, proteínas de variante de P4 úteis podem incluir uma
ou mais das proteínas variantes de P4 acima descritas acopladas a uma
proteína carreadora. Alternativamente, uma proteína variante de P4 útil pode
estar presente em uma proteína de fusão contendo proteínas variantes de P4
10 múltiplas, opcionalmente acopladas a proteína carreadora. Para estas formas
de realização, a proteína carreadora é desejavelmente uma proteína ou outra
molécula que possa intensificar a imunogenicidade da proteína variante de P4
selecionada. Um tal carreador pode ser uma molécula maior que também
tenha um efeito adjuvante. Carreadores de proteína convencionais exemplares
15 incluem, sem limitação, a proteína DnaK de E. coli, galactocinase (galK, que
catalisa a primeira etapa do metabolismo da galactose nas bactérias),
ubiquitina, o fator de acasalamento a, 0-galactosidase, e a proteína NS-1 da
influenza. Toxóides (isto é, a seqüência que codifica a toxina de ocorrência
natural, com suficientes modificações para eliminar sua atividade tóxica) tais
20 como o toxóide da difteria e o toxóide do tétano, suas respectivas toxinas, e
quaisquer formas mutantes destas proteínas, tais como a CRIVI I97 (uma forma
não tóxica de toxina da difteria, ver Patente U.S. 5.614.382), também podem
ser empregadas como carreadores. Outros carreadores incluem a exotoxina A
de Pseudomonas, a toxina termolábil de E. coli e partículas rotavirais
25 (incluindo partículas de rotavírus e de VP6). Alternativamente, um fragmento
ou epítopo da proteína carreadora ou de outra proteína imunogênica pode ser
usado. Por exemplo, um hapteno pode ser acoplado a um epítopo de célula T
de uma toxina bacteriana. Ver a Patente U.S. 5.785.973. De forma
semelhante, uma variedade de proteínas bacterianas de choque térmico, por
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exemplo hsp-70 micobacteriana, pode ser usada. A glutationa-S-transferase
(GST) é outro carreador útil. Uma pessoa habilitada na técnica pode
facilmente selecionar um carreador apropriado para uso neste contexto. As
proteínas de fusão podem ser formadas por técnicas padrão para acoplar
5 materiais proteináceos. As fusões pode ser expressas de construções de genes
fundidos preparadas por técnicas recombinantes de DNA, como descrito
abaixo.
Outras proteínas variantes de P4 adequadas aqui descritas
podem diferir das proteínas variantes de P4 ou peptídeos especificamente
10 exemplificados, mediante modificações que não restaurem a atividade
enzimática e não reduzam a imunogenicidade, ou mediante combinações de
tais atributos. Por exemplo, as mudanças conservadoras de aminoácidos
podem ser feitas, as quais, embora alterem a seqüência primária da proteína
variante de P4, não alteram normalmente sua função.
15
Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático dos aminoácidos
pode ser considerado. A importância do índice hidropático dos aminoácidos
em conferir função biológica interativa a um polipeptídeo é geralmente
entendido na técnica (Kyte & Doolittle, 1982). É conhecido o fato de que
certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um
20 índice ou classificação hidropáticos semelhantes e ainda resultarem em um
polipeptídeo com atividade biológica semelhante. A cada aminoácido foi
designado um índice hidropático com base nas suas características de
hidrofobicidade e carga. Esses índices são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2);
leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9);
25 alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9);
tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).
Acredita-se que o caráter hidropático relativo do resíduo de
aminoácido determina a estrutura secundária e terciária do polipeptídeo
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resultante, a qual, por sua vez, define a interação do polipeptídeo com outras
moléculas, tais como enzimas, substratos, receptores, anticorpos, antígenos e
outros. É conhecido na técnica que um aminoácido pode ser substituído por
outro aminoácido tendo um índice hidropático semelhante e ainda obter-se um
5 polipeptídeo funcionalmente equivalente. Em tais mudanças, a substituição de
aminoácidos cujos índices hidropáticos estejam dentro de ±2 é preferida,
aqueles dentro de ±1 são particularmente preferidos, e aqueles dentro de ±0,5
são ainda mais particularmente preferidos.
A substituição de aminoácidos semelhantes também pode ser
10 feita com base na hidrofilicidade, particularmente onde o polipeptídeo ou
peptídeo equivalente biologicamente funcional dessa forma produzido se
destine ao uso em formas de realização imunológicas. A Patente U.S.
4.554.101, aqui incorporada como referência, estabelece que a maior
hidrofilicidade média local de um polipeptídeo, quando orientado pela
15 hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com sua
imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica do
polipeptídeo.
Como detalhado na Patente U.S. 4.554.101, os seguintes
valores da hidrofilicidade foram designados para os resíduos de aminoácido:
20 arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1);
serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ±
1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina
(-2,5); triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode ser substituído
25 por outro que tenha um valor de hidrofilicidade semelhante e ainda obter-se
um polipeptídeo biologicamente equivalente e, em particular,
imunologicamente equivalente. Em tais mudanças, a substituição de
aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estejam dentro de ±2 é preferida;
aqueles dentro de ±1 são particularmente preferidos; e aqueles dentro de ±0,5
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são ainda mais particularmente preferidos.
Como delineado acima, as substituições de aminoácido
baseiam-se geralmente na similaridade relativa dos substituintes de cadeia
lateral de aminoácido, por exemplo, suas hidrofobicidade, hidrofilicidade,
5 carga, tamanho etc. Substituições exemplares que levam várias das
características acima em consideração, são bem conhecidas daqueles versados
na técnica, e incluem: arginina e lisina; glutamina e aspartato; serina e
treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.
Além disso, modificações que não alteram normalmente a
10 seqüência primária da proteína variante de P4, incluem a derivação química in
vivo ou in vitro dos polipeptídeos, por exemplo acetilação, metilação ou
carboxilação. Igualmente incluídas como proteínas variantes de P4 desta
invenção são estas proteínas modificadas por glicosilação, por exemplo
aquelas produzidas pela modificação dos padrões de glicosilação de um ppt
15 durante sua síntese e processamento, ou em outras etapas de processamento:
ou pela exposição do polipeptídeo a enzimas que afetem a glicosilação, tais
como as enzimas de glicosilação ou desglicosilação de mamíferos. Também
abrangidas como proteínas variantes de P4 são as seqüências mutageneizadas
identificadas acima, as quais têm resíduos de aminoácido fosforilados, por
20
exemplo, a fosfotirosina, a fosfosserina ou a fosfotreonina.
Igualmente incluídas como proteínas variantes de P4 são as
seqüências acima que tenham sido modificadas usando-se técnicas biológicas
moleculares comuns, de modo a melhorar sua resistência à degradação
proteolítica ou para otimizar as propriedades de solubilidade. Entre tais
25 proteínas variantes de P4 estão incluídas aquelas que contêm resíduos outros
que não os L-aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo os Daminoácidos ou os aminoácidos sintéticos de ocorrência não natural. Entre
outras modificações conhecidas que podem estar presentes nas proteínas
variantes de P4 da presente invenção acham-se, sem limitação, a acilação, a
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ADP-ribosilação, a amidação, a ligação covalente da flavina, a ligação
covalente de uma porção heme, a ligação covalente de um nucleotídeo ou
derivado de nucleotídeo, a ligação covalente de um lipídeo ou derivado de
lipídeo, a ligação covalente defosfotidilinositol, a reticulação, a ciclização, a
5 formação de ligação dissulfeto, a desmetilação, a formação de reticulações
covalentes, a formação de cistina, a formação de piroglutamato, formilação,
gama-carboxilação, a formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação,
metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, prenilação,
racemização, selenoilação, sulfatização, adição de aminoácidos mediada por
10
RNA de transferência a proteínas tais como arginilação e ubiquitinação.
B. Proteínas Variantes de P4 Codificando Moléculas de Ácido
Nucleico
Outro aspecto desta invenção inclui moléculas de ácido
nucleico isoladas, sintéticas ou recombinantes e seqüência codificando as
15 proteínas variantes de P4 acima descritas tendo as mutações direcionadas ao
sítio especificadas ou fragmentos de proteínas P4 (fragmentos estes que
podem ainda conter uma ou mais daquelas mutações).
Uma molécula de nucleotídeo isolada compreendendo uma
seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína variante de P4, pode
20 estar preferivelmente sob o controle de seqüências reguladores que dirijam a
expressão da variante de P4 em uma célula hospedeira. Como descrito neste
relatório, tais moléculas de ácido nucleico podem ser usadas para expressar a
proteína variante de P4 in vitro ou para permitir a expressão da proteína
variante de P4 in vivo em um ser humano.
25
Como aqui usada, a expressão "molécula ou seqüência de
nucleotídeo isolada" se refere a um segmento ou fragmento de ácido nucleico
que esteja livre de contaminação por outros componentes biológicos que
possam estar associados com a molécula ou seqüência em seu ambiente
natural. Por exemplo, uma modalidade de uma molécula ou seqüência de
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nucleotídeo isolada desta invenção é uma seqüência separada das seqüências
que a flanqueiam em um estado de ocorrência natural, por exemplo, um
fragmento de DNA que tenha sido removido das seqüências que são
normalmente adjacentes ao fragmento, tais como as seqüências adjacentes ao
5 fragmento em um genoma em que ele ocorra naturalmente. Além disso, as
seqüências e moléculas de nucleotídeos desta invenção foram alteradas para
codificar uma proteína variante de P4 desta invenção. Assim, a expressão
"molécula ou seqüência de ácido nucleico isolada" também se aplica a
seqüências ou moléculas de ácido nucleico que tenham sido substancialmente
10 purificadas de outros componentes que naturalmente acompanham o ácido
nucleico não mutageneizado, por exemplo RNA ou DNA ou proteínas, na
célula. Uma molécula ou seqüência de nucleotídeos isolada desta invenção
também abrange a seqüência e moléculas que tenham sido preparadas por
outros métodos convencionais, tais como métodos recombinantes, métodos
15 sintéticos, por exemplo mutagênese, ou combinações de tais métodos. As
seqüências ou moléculas de nucleotídeos desta invenção não devem ser
interpretadas como estando limitadas unicamente às seqüências de
nucleotídeos específicas aqui apresentadas, mas, ao invés, devem ser
interpretadas como incluindo qualquer e todas as seqüências de nucleotídeos
20 que compartilhem a homologia (isto é, tenham identidade de seqüência) com
as seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas.
As expressões "substancial homologia" ou "substancial
similaridade", quando se refiram a um ácido nucleico ou seu fragmento,
indicam que, quando otimamente alinhadas com inserções ou deleções de
25 nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou seu filamento
complementar), existe identidade de seqüência de nucleotídeos em pelo
menos cerca de 70% das bases de nucleotídeos, conforme medido por
qualquer algoritmo de identidade de seqüência bem conhecido, tal como
Fasta, um programa na Versão 6.1 de GCG. O termo "homólogo", como aqui
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usado, se refere a similaridade de seqüência entre duas moléculas poliméricas,
por exemplo entre duas moléculas de ácido nucleico, por exemplo duas
moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de
polipeptídeo. Quando uma posição de nucleotídeo ou aminoácido em ambas
5 as duas moléculas é ocupada pelo mesmo nucleotídeo monomérico ou
aminoácido, por exemplo se uma posição em cada uma das duas moléculas de
DNA for ocupada por adenina, então elas são homólogas naquela posição. A
homologia entre duas seqüências é uma função direta do número de posições
semelhantes ou homólogas, por exemplo se metade (por exemplo cinco
10 posições em um polímero de dez subunidades de comprimento) das posições
em duas seqüências de compostos for homóloga, então as duas seqüências são
50% homólogas. Se 90% das posições, por exemplo 9 dentre 10, forem
semelhantes ou homólogas, as duas seqüências compartilham 90% de
homologia. Como exemplo, as seqüências de DNA 3'ATTGCC5' e
15 3'TATGCGS' compartilham 50% de homologia. Pela expressão
"substancialmente homólogas" como aqui usado, denota-se DNA ou RNA
que são cerca de 70% homólogos, mais preferivelmente cerca de 80%
homólogos, e o mais preferível cerca de 90% homólogos ao ácido nucleico
desejado.
20
A invenção é também direcionada a uma molécula isolada de
nucleotídeo compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que seja pelo
menos 70%, 80% ou 90 homóloga a uma seqüência de ácido nucleico
codificando uma proteína variante de P4 de NTHi que tem atividade
enzimática reduzida em comparação com a proteína P4 do tipo selvagem e
25 que induz anticorpo à proteína P4 do tipo selvagem e/ou que tem atividade
bactericida contra moduladores do receptor de androgênio seletivos de tecido
de fórmula estrutura NTHi, em que a proteína variante de P4 tenha uma
mutação selecionada do grupo consistindo de:
(a) uma mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO:
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3, que é uma glutamina na proteína P4 do tipo selvagem;
(b) uma mutação no resíduo de aminoácido 48 da SEQ ID NO:
3, que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem;
(c) uma mutação no resíduo de aminoácido 64 da SEQ ID NO:
5
3, que é um ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem;
(d) uma mutação no resíduo de aminoácido 161 da SEQ ID
NO: 3, que é uma lisina na proteína P4 do tipo selvagem;
(e) uma mutação no resíduo de aminoácido 218 da SEQ ID
NO: 3, que é uma asparagina na proteína P4 do tipo selvagem;
(f) mutações nos resíduos de aminoácido 35 e 37 da SEQ ID
10
NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem, em que as mutações
não sejam ácido glutâmico, glutamina ou treonina;
(g) mutações nos resíduos de aminoácido 64 e 66 da SEQ ID
NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem; e
15 (h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g), em
que a seqüência de ácido nucleico codifica pelo menos uma das mutações de
(a) a (g).
Além disso, por causa da degenerescência do código genético,
qualquer códon de três nucleotídeos que codifique um resíduo de aminoácido
20
transformado de P4, aqui descrito, está dentro do escopo da invenção.
Quando, como aqui examinado, as proteínas variantes de P4
e/ou as seqüências de DNA que as codifica, ou outras seqüências úteis nas
moléculas de ácido nucleico ou composições aqui descritas, sejam definidas
pelo seu percentual de homologias ou identidades para com as seqüências
25 identificadas, os algoritmos usados para calcular o percentual de homologias
ou o percentual de identidades incluem o seguinte: o algoritmo de SmithWaterman [J. F. Collins et al., 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 67-72; J. F.
Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop
et al., eds.) em Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein
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Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, Reino Unido (1987)
pp. 417], e os programas BLAST e FASTA (E. G. Shpaer et al., 1996,
Genomics, 38: 179-191). Estas referências ficam aqui incorporadas como
referência.
5
Pela descrição de dois DNAs como sendo "operavelmente
ligados" como aqui usado, denota-se que um DNA de filamento único ou de
filamento duplo compreende cada um dos dois DNAs e que os dois DNAs são
dispostos dentro do DNA de uma maneira tal que pelo menos uma das
seqüências de DNA seja capaz de exercer um efeito fisiológico pelo qual ele é
10
caracterizado em relação ao outro.
Preferivelmente, para uso na produção de uma proteína
variante de P4 desta invenção ou para administrá-la para produção in vivo em
uma célula, cada seqüência codificando a proteína e seqüências reguladoras
necessárias se acham presentes em um vetor recombinante viral ou não viral
15 separado (incluindo métodos não virais de liberação de uma molécula de
ácido nucleico em uma célula). Alternativamente, duas ou mais destas
seqüências de ácido nucleico codificando cópias em duplicata de uma
proteína variante de P4 ou codificando proteínas variantes de P4 múltiplas
diferentes desta invenção, podem estar contidas em um transcrito
20 policistônico, isto é, uma molécula única projetada para expressar produtos de
genes múltiplos.
Pelo termo "vetor", como aqui usado, denota-se uma molécula
de DNA derivada de espécies virais ou não virais, por exemplo bacterianas,
que tenha sido projetada para codificar uma seqüência de ácido nucleico
25 exógena ou heteróloga. Assim, o termo inclui plasmídeos bacterianos
convencionais. Tais plasmídeos ou vetores podem incluir seqüências de
plasmídeos de vírus ou fagos. Esses vetores incluem vetores cromossômicos,
epissômicos e derivados de vírus, por exemplo vetores derivados de
plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, epissomos de levedura, elementos
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cromossômicos de levedura, e vírus. Os vetores também podem ser derivados
de suas combinações, tais como aquelas derivadas de elementos genéticos de
plasmídeos e bacteriófagos, cosmídeos e fagemídeos. O termo também inclui
vírus não replicadores que transferem um gene de uma célula para outra. O
5 termo deve também ser interpretado como incluindo compostos não
plasmídeos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para as
células, tais como, por exemplo, os compostos de polilisina e outros.
As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem vetores
não virais ou métodos para liberação da seqüência que codifica a proteína
10 variante de P4 a uma célula hospedeira de acordo com esta invenção. Uma
variedade de vetores não virais é conhecida na técnica e pode incluir, sem
limitação, plasmídeos, vetores bacterianos, vetores bacteriófagos, DNA
"desnudo" e DNA condensado com lipídeos ou polímeros catiônicos.
Exemplos de vetores bacterianos incluem, sem limitação,
15 seqüências derivadas do bacilo Calmette Guérin (BCG), Salmonella, Shigella,
E. coli e Listeria, entre outros. Vetores plasmídicos adequados incluem, por
exemplo, pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18,
pUC19, pLG339, pR290, pK37, pKC101, pAC105, pVA51, pKH47,
pUB110, pMB9, pBR325, Col El, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124,
20 pCR1, RP4, pBAD18 e pBR328.
Exemplos de vetores de expressão de Escherichia coli
indutíveis adequados incluem pTrc (Amann et al., 1988 Gene, 69: 301-315),
os vetores de expressão da arabinose (por exemplo, pBAD18, Guzman et al.,
1995 J. Bacteriol., 177: 4121-4130) e pETIId (Studier et al., 1990 Methods in
25
Enzymology, 185: 60-89). A expressão do gene alvo do vetor pTrc conta com
a transcrição da RNA hospedeiro polimerase de um promotor híbrido de fusão
trp-lac. A expressão do gene alvo do vetor pETIId conta com a transcrição de
um promotor de T7 de fusão gn10-lac mediado por uma RNA polimerase
viral coexpressa T7 gnl. Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas
23
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hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS I 74 (DE3) de um prófago residente
abrigando um gene T7 gn 1 sob o controle transcricional do promotor lacUV
5. O sistema pBAD conta como promotor de arabinose indutível que é
regulado pelo gene araC. O promotor é induzido na presença de arabinose.
5 Um vetor exemplar é um vetor bacteriófago de filamento único
ou duplo. Por exemplo, um vetor de clonagem adequado, mas não fica
limitado aos vetores tais como o sistema de vetores de bacteriófago X, Âgt11,
vtWESAB, Charon 4, Xgt-WES-XB, Charon 28, Charon 4A, Âgt-1-2LBC,
2 gt-1-XB, Ml3mp7, Ml3mp8 ou Ml3mp9, entre outros.
10
Em outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor de
expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em uma levedura
tal como S. cerivisiae incluem pYepSec I (Baldari et al., 1987), pMFa (Kurjan
e Herskowitz, 1982), pJRY88 (Schultz et al., 1987), e pYES2 (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA).
15
Alternativamente, os vetores de expressão de baculovírus são
usados. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em
células de insetos cultivadas (por exemplo, células Sf 9 ou Sf 21) incluem a
série pAc (Smith et al., 1983) e a série pVL (Lucklow e Summers, 1989).
Em ainda outra modalidade, um vetor de expressão de
20 mamífero é usado para expressão em células de mamíferos. Exemplos de
vetores de expressão de mamíferos incluem pCDM8 (Seed, 1987) e pMT2PC
(Kaufman et al., 1987). Quando usado em células de mamíferos, as funções
de controle do vetor de expressão são freqüentemente fornecidas por
elementos reguladores virais.
25
Um tipo de vetor recombinante é um vetor viral de RNA ou
DNA recombinante de filamento único ou duplo. Uma variedade de sistemas
de vetores vitais é conhecida na técnica. Exemplos de tais vetores incluem,
sem limitação, os vetores adenovirais recombinantes, os vetores com base no
vírus do herpes simples (HSV), os vetores virais adeno-associados (AAV), os
24
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vetores híbridos adenovirais/AAV, os retrovírus ou lentivirus recombinantes,
os vetores poxvírus recombinantes, os vetores do vírus vacínia recombinantes,
os vetores de SV-40, os vírus de insetos tais como o baculovírus, e outros que
sejam construídos para levar ou expressar uma composição de ácido nucleico
5
selecionada de interesse.
Os vetores de retrovírus que podem ser empregados incluem
aqueles descritos na EP O 415 731; nas Publicações das Patentes
Internacionais TO WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698 e WO
93/25234, Patente U.S. 5.219.740; Publicações das Patentes Internacionais n'
10 WO 93/11230 e WO 93/10218; Vile e Hart, 1993 Cancer Res. 53: 3860-3864;
Vile e Hart, 1993 Cancer Res. 53: 962-967; Ram et al., 1993 Cancer Res. 53:
83-88; Takamiya et al., 1992 1 Neurosci. Res. 33: 493-503; Baba et al., 1993
J. Neurosurg. 79: 729-735; Patente U.S. 4.777.127; Patente GB d 2.200.651;
e EP O 345 242. Exemplos de retrovírus recombinantes adequados incluem
15
aqueles descritos na Publicação de Patente Internacional n WO 91/02805.
Vetores com base nos alfavírus também podem ser usados
como a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína variante de P4.
Tais vetores podem ser construídos de uma ampla variedade de alfavírus,
incluindo, por exemplo, os vetores dos vírus Sindbis, o vírus de Semliki
20 Forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), o vírus do Rio Ross (ATCC VR373; ATCC VR-1246) e o vírus da encefalite eqüina venezuelana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532). Exemplos
representativos de tais sistemas de vetor incluem aqueles descritos nas
Patentes U.S. 5.091.309, 5.217.879 e 5.185.440; e nas Publicações de
25 Patentes Internacionais n" WO 92/10578, WO 94/21792, WO 95/27069, WO
95/27044 e WO 95/07994.
Exemplos de vetores adenovirais incluem aqueles descritos por
Berkner, 1988 Biotechniques 6: 616-627; Rosenfeld et al., 1991 Science 252:
431-434; Publicação da Patente Internacional d . WO 93/19191; Kolls et al.,
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1994 PNAS 91: 215-219; Kass-Eisler et al., 1993 PNAS 90: 11498-11502;
Guzman et al., 1993 Circulation 88: 2838-2848; Guzman et al., 1993 Cir.
Res. 73: 1202-1207; Zabner et al., 1993 Cell 75: 207-216; Li et al., 1993
Hum. Gene Ther. 4: 403-409; Cailaud et al., 1993 Eur. J. Neurosci. 5: 12875 1291; Vincent et al., 1993 Nat. Genet. 5: 130-134; Jaffe et al., 1992 Nat.
Genet. 1: 372-378; e Levrero et al., 1991 Gene 101: 195-202. Vetores
adenovirais exemplares incluem aqueles descritos nas Publicações de Patentes
Internacionais ri s WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO
94/28938, WO 95/11984 e WO 95/00655. Outros vetores adenovirais incluem
10 aqueles derivados de adenovírus de chimpanzés, tais como aqueles descritos
na Patente U.S. 6.083.716.
Outro vetor viral se baseia em um parvovírus tal como um
vírus adeno-associado (AAV). Exemplos representativos incluem os vetores
de AAV descritos na Publicação de Patente Internacional ri' WO 93/09239,
15 Samulski et al., 1989 J. Virol. 63: 3822-3828, Mendelson et al., 1988 Virol.
166: 154-165, e Flotte et al., 1993 PNAS 90: 10613-10617. Outros vetores de
AAV particularmente desejáveis incluem aqueles baseados no AAV1; ver a
Publicação de Patente Internacional n WO 00/28061, publicada em 18 de
maio de 2000. Outros vetores de AAV desejáveis incluem aqueles que são
20 pseudotipificados, isto é, contêm um minigene composto de AAV 5' ITRS,
um transgene, e AAV 3' ITRs envolvido em um cápside de um sorotipo de
AAV heterólogo ao AAV ITRs. Métodos de produzir tais vetores de AAV
pseudotipificados são descritos em detalhes na Publicação de Patente
Internacional ri' WO 01/83692.
25
Em uma modalidade em que a molécula de ácido nucleico da
invenção é "DNA desnudo", ela pode ser combinada com polímeros incluindo
polímeros tradicionais e polímeros não tradicionais, tais como os polímeros
contendo ciclodextrina e polímeros interativos de não condensação, entre
outros. O DNA "desnudo" e o DNA condensado com lipídeos ou polímeros
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catiônicos são tipicamente liberados às células com o uso de métodos
químicos. Vários métodos químicos são conhecidos na técnica para liberação
às células e incluem o uso de lipídeos, polímeros ou proteínas para complexar
com DNA, opcionalmente condensando-os em partículas e liberando-os às
5 células. Outro método químico não viral inclui o uso de cátions para
condensar DNA, o qual é então colocado em um lipossomo e usado de acordo
com a presente invenção. Ver C. Henry, 2001 Chemical and Engineering
News , 79(48): 35-41.
A molécula de ácido nucleico é introduzida diretamente nas
10 células ou como DNA "desnudo" (Patente U.S. número 5.580.859) ou
formulada em composições com agentes que facilitem a imunização, tais
como a bupivicaína e outros anestésicos locais (Patente U.S. número
6.127.170).
Todos os componentes dos vetores virais e não virais acima
15 podem ser facilmente selecionados dentre materiais conhecidos na técnica e
disponíveis da indústria farmacêutica. A seleção dos componentes de vetores
e seqüências reguladores não é considerada uma limitação nesta invenção.
Cada seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína variante de P4 de
acordo com esta invenção, acha-se preferivelmente sob o controle de
20 seqüências reguladores que dirigem a replicação e a geração do produto de
cada seqüência de ácido nucleico em uma célula de mamífero. Pela expressão
"seqüência promotora/reguladora" denota-se uma seqüência de DNA
necessária para expressão de um ácido nucleico operavelmente ligado à
seqüência promotora/reguladora. Em alguns casos, a seqüência promotora/
25 reguladora pode funcionar de uma maneira específica do tecido. Por exemplo,
a seqüência promotora/reguladora é apenas capaz de conduzir a expressão em
uma célula de um tipo de tecido particular. Em alguns casos, esta seqüência
pode ser a seqüência promotora núcleo e, em outros casos, esta seqüência
pode também incluir uma seqüência intensificadora e outros elementos
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reguladores que sejam necessários para expressão de uma maneira específica
do tecido.
Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico codificando
uma proteína variante de P4 desta invenção e/ou o vetor recombinante ainda
5 compreendem seqüências reguladoras. Por exemplo, tais seqüências
reguladoras compreendem um promotor que dirige a expressão da proteína
variante de P4. Preferivelmente a seqüência promotora/reguladora é
posicionada na extremidade 5' da seqüência codificadora, tal que ela dirija a
expressão da proteína variante de P4 em uma célula.
10
Promotores adequados podem ser facilmente selecionados
dentre promotores constitutivos, promotores indutíveis, promotores
específicos do tecido e outros. Exemplos de promotores constitutivos que são
não específicos na atividade e empregados nas moléculas de ácido nucleico
codificando a proteína variante de P4 desta invenção, incluem, sem limitação,
15 o promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), o promotor de LTR
retroviral (opcionalmente com o intensificador do RSV), o promotor do
citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV) [ver,
por exemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor de SV40, o
promotor da diidrofolato redutase, o promotor da 0-actina, o promotor da
20
fosfoglicerol cinase (PGK) e o promotor de EFla (Invitrogen).
Promotores indutíveis que são regulados por compostos
exogenamente fornecidos incluem, sem limitação, o promotor da arabinose, o
promotor de metalotionina (MT) de carneiro zinco-indutível, o promotor do
vírus tumoral mamário de camundongo (MMTV) dexametasona (Dex)-
25 indutível, o sistema de promotores da polimerase T7 (WO 98/10088); o
promotor de insetos ecdisona (No et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:
3346-3351), o sistema tetraciclina-repressível (Gossen et al., 1992 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551), o sistema tetraciclina-indutível (Gossen et
al., 1995 Science, 268: 1766-1769, ver também Harvey et al., 1998 Curr.
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Opin. Chem. Biol., 2: 512-518), o sistema RU486-indutível (Wang et al.,
1997 Nat. Biotech., 15: 239-243 e Wang et al., 1997 Gene Ther., 4: 432-441)
e o sistema rapamicina-indutível (Magari et al., 1997 J. Clin. Invest., 100:
2865-2872).
5
Outros tipos de promotores indutíveis que podem ser úteis
neste contexto são aqueles regulados por um estado fisiológico específico, por
exemplo a temperatura ou a fase aguda ou em células de replicação apenas.
Promotores específicos de tecido úteis incluem os promotores de genes que
codificam a 0-actina esquelética, a cadeia 2A leve da miosina, a distrofina, a
10 creatina cinase muscular, assim como os promotores musculares sintéticos
com atividades mais elevadas do que os promotores de ocorrência natural (ver
Li et al., 1999 Nat. Biotech., 17: 241-245). Exemplos de promotores que são
específicos de tecidos são conhecidos para o fígado (albumina, Miyatake et
al. 1997 1 Virol., 71: 5124-5132; o promotor de núcleo do vírus da hepatite
15
B, Sandig et al., 1996 Gene Ther., 3: 1002-1009; a alfa-fetoproteína (AFP),
Arbuthnot et al., 1996 Hum. Gene Ther., 7: 1503-1514), osso (osteocalcina,
Stein et al., 1997 Mol. Biol. Rep., 24: 185-196; a sialoproteína óssea, Chen et
al., 1996 J. Bone Miner. Res., 11: 654-664), linfócitos (CD2, Hansal et al.,
1988 J. Immunol., 161: 1063-1068; cadeia pesada da imunoglobulina; cadeia
20 a do receptor de célula T), nuronal (promotor de enolase específica de
neurônios (NSE), Andersen et al. 1993 Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-515;
gene de cadeia leve de neurofilamento, Piccioli et al., 1991 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88: 5611-5615; o gene de vgf específico de neurônios, Piccioli et
al., 1995 Neuron, 15: 373-384); entre outros. Ver, por exemplo, a Publicação
25
de Patente Internacional n WO 00/55335 quanto a listas adicionais de
promotores conhecidos úteis neste contexto.
Seqüências reguladores adicionais para inclusão em uma
seqüência, molécula ou vetor de ácido nucleico ou nesta invenção, incluem,
sem limitação, uma seqüência intensificadora, uma seqüência de
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poliadenilação, uma seqüência doadora de encaixe e uma seqüência aceptora
de encaixe, um sítio para iniciação e terminação da transcrição posicionado no
início e no fim, respectivamente, do polipeptídeo a ser transladado, um sítio
de ligação ribossômica para translação na região transcrita, uma etiqueta de
5 epítopo, uma seqüência de localização nuclear, um elemerito IRES, um
elemento "TATA" de Goldberg-Hogness, um sítio de clivagem de enzima de
restrição, um marcador selecionável, e outros. As seqüências intensificadoras
incluem, por exemplo, a repetição em tandem de 72 pares de base de DNA
SV40 ou terminais longos repetidos retrovirais ou LTRs, etc., e são
10 empregadas para aumentar a eficiência transcricional. A seleção de
promotores e outros elementos de vetores comuns é convencional e muitas de
tais seqüências estão disponíveis com as quais se projeta as moléculas e
vetores de nucleotídeos úteis nesta invenção. Ver, por exemplo, Sambrook et
al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
15 Laboratory, New York, (1989) e referências nele citadas, por exemplo nas
páginas 3.18 a 3.26 e 16.17 a 16.27, e Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989). Uma pessoa
versada na técnica pode facilmente selecionar dentre tais seqüências
reguladores conhecidas, para preparar as moléculas desta invenção. A seleção
20
de tais seqüências reguladoras não é uma limitação desta invenção.
C. Métodos para Produzir as Proteínas Variantes de P4 e as
Moléculas de Nucleotídeos desta Invenção
A preparação ou síntese das seqüências de nucleotídeos e
proteínas variantes de P4, bem como as composições que contenham as
25 moléculas de nucleotídeos ou a proteína variante de P4 desta invenção
apresentadas neste relatório, situa-se bem dentro da capacidade da pessoa que
tenha experiência normal na técnica com o uso do material disponível. Os
métodos de síntese não são uma limitação desta invenção. Os exemplos
abaixo detalham as modalidades presentemente preferidas de síntese de
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seqüências que codificam a proteína variante de P4 desta invenção.
As proteínas variantes de P4 e as moléculas e seqüências de
nucleotídeos desta invenção podem ser produzidas por métodos de síntese
química, métodos recombinantes de engenharia genética, mutagênese dirigida
5
ao sítio, entre outros, e combinações desses métodos.
Por exemplo, as seqüências de nucleotídeos/proteínas variantes
de P4 da invenção podem ser preparadas convencionalmente recorrendo-se às
técnicas de síntese química conhecidas, por exemplo a síntese química de fase
sólida, tal como descrito por Merrifield, 1963 J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-
10 2154: J. Stuart e J. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical
Company, Rockford, IL (1984); Matteucci et al., 1981 J. Am. Chem. Soc.,
103: 3185; Alvarado-Urbina et al., 1980 Science, 214: 270. e Sinha, N. D. et
al., 1984 Nucl. Acids Res. 13: 4539, entre outros. Ver, também, por exemplo,
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,
2' Ed., T. E.
15 Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F.,
"Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects",
páginas 1 a 12 em POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION
OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983;
Seifter et al., 1990 Meth. Enzymol., 182: 626-646, e Rattan et al., 1992 Ann.
20
N. Y. Acad. Sci., 663: 48-62.
Alternativamente, as composições desta invenção podem ser
construídas recombinantemente usando-se as técnicas convencionais da
biologia molecular, a mutagênese dirigida ao sítio, a engenharia genética ou a
reação em cadeia da polimerase, tais como por clonagem e expressão de uma
25 molécula de nucleotídeo codificando uma proteína variante de P4 com outros
imunógenos opcionais e proteínas carreadoras opcionais dentro de um
microorganismo hospedeiro, etc., utilizando a informação aqui fornecida
[Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, 2' Ediç., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989);
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Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
New York (1997)]. As seqüências codificadoras para as proteínas variantes de
P4 e imunógenos opcionais podem ser preparadas sinteticamente [W. P. C.
Stemmer et al., Gene, 164: 49 (1995)]. Alternativamente, o DNA codificando
5 a proteína P4 do tipo selvagem pode ser isolado de Haemophilus influenza
como descrito na Patente U.S. 5.780.601, aqui incorporada como referência, e
mutageneizado.
Em geral, as técnicas de DNA recombinantes envolvem obter
por síntese ou isolamento uma seqüência de DNA que codifica a proteína
10 variante de P4 como descrito acima, e introduzi-la em um sistema de
expressão apropriado de vetor/célula hospedeira em que ela seja expressa.
Qualquer um dos métodos descritos para a inserção de DNA em um vetor de
expressão pode ser usado para ligar um promotor e outros elementos de
controle reguladores em sítios específicos dentro do vetor recombinante
15 selecionado. As proteínas variantes de P4 recombinantes desta invenção
podem ser produzidas como uma proteína lipidada ou não lipidada mediante o
uso da seqüência codificadora condutora de P4 ou seqüência não condutora
(ou uma seqüência condutora não especificando a acetilação de ácido graxo
como examinado acima), respectivamente.
20
Uma variedade de sistemas de célula hospedeira-vetor pode
ser usada para expressar as proteínas variantes de P4 desta invenção. Sistemas
para clonar e expressar as proteínas variantes de P4 e outras composições
desta invenção com o uso de moléculas de ácido nucleico sintéticas incluem o
uso de vários microorganismos e células que são bem conhecidas na
25 tecnologia recombinante. A célula hospedeira pode ser selecionada de
qualquer organismo biológico, incluindo as células procarióticas (por
exemplo, bacterianas) e as células eucarióticas, incluindo células de
mamíferos, de insetos, células de levedura. Preferivelmente, as células
empregadas nos vários métodos e composições desta invenção são células
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bacterianas.
Células bacterianas adequadas incluem, por exemplos, várias
cepas de E. coli, Bacillus e Streptomyces. As células de levedura, tais como as
Saccharomyces e Pichia, e as células de insetos tais como as células Sf9 e
5 Sf21, também são células hospedeiras úteis para fins de produção. Células de
mamíferos tais como as células de ovário de hamster chinês (CHO), as células
NIH3T3, PER C6, NSO, VERO ou COS, também são células hospedeiras
adequadas.
O vetor pode ser selecionado de um dos vetores virais ou dos
10 vetores não virais descritos acima, mas devem ser compatíveis com a célula
hospedeira usada. O vetor de DNA recombinante pode ser introduzido em
células hospedeiras apropriadas (bactérias, vírus, leveduras, células de
mamíferos ou coisa parecida) mediante transformação, transdução ou
transfecção (dependendo do sistema de vetor/célula hospedeira). Os sistemas
15 de hospedeira/vetor incluem, sem que a estes fiquem limitados, bactérias
transformadas com DNA bacteriófago, DNA plasmídeo ou DNA cosmídeo;
microorganismos tais como levedura contendo vetores de levedura; sistemas
celulares de mamíferos infectados com vírus (por exemplo o vírus vacínia, o
adenovírus etc.); e sistemas celulares de insetos infectados com vírus (por
20
exemplo, baculovírus).
A seleção de outras células hospedeiras adequadas e métodos
para transformação, cultura, amplificação, triagem e produção e purificação
de produtos, pode ser realizada por uma pessoa de experiência na técnica,
mediante referência a técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, Gething e
25
Sambrook, 1981 Nature, 293: 620-625, entre outros.
Tipicamente, a célula hospedeira é mantida sob condições de
cultura por um período de tempo suficiente para expressão. As condições de
cultura são bem conhecidas na técnica e incluem a composição iônica e a
concentração, a temperatura, o pH e outros. Tipicamente, as células
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transfectadas são mantidas sob condições de cultura em um meio de cultura.
Meios adequados para os vários tipos celulares são bem conhecidos na
técnica. Em uma forma de realização preferida, a temperatura é de cerca de 20
°C a cerca de 50 °C, mais preferível de cerca de 30 °C a cerca de 40 °C, e
5
ainda mais preferível de cerca de 37 °C.
O pH é preferivelmente de um valor de cerca de 6,0 a um valor
de cerca de 8,0, mais preferível de um valor de cerca de 6,8 a um valor de
cerca de 7,8 e, o mais preferível, de cerca de 7,4. A osmolalidade é de
preferência de cerca de 200 miliosmóis por litro (mOsm/litro) a cerca de 400
10 mOsm/litro e, mais preferivelmente de cerca de 290 mOsm/litro a cerca de
310 mOsm/litro. Outras condições biológicas necessárias para transfecção e
expressão de uma proteína codificada são bem conhecidas na técnica.
A proteína variante de P4 recombinante é recuperada ou
coletada ou das células hospedeiras ou suas membranas, ou do meio em que
15 aquelas células forem culivadas. A recuperação compreende isolar e purificar
a proteína variante de P4 recombinante. As técnicas de isolamento e
purificação para os polipeptídeos são bem conhecidas na prática e incluem
procedimentos tais como a precipitação, a filtração, a cromatografia, a
eletroforese e outros.
20
Quando produzidas por meios recombinantes convencionais,
as proteínas variantes de P4 desta invenção podem ser isoladas e purificadas
da célula ou seu meio mediante métodos convencionais, incluindo a
cromatografia (por exemplo a cromatografia de troca de íons, de afinidade, e
de coluna de tamanho), a centrifugação, a solubilidade diferencial, ou por
25 quaisquer outras técnicas padrão para a purificação de proteínas. Diversas
técnicas existem para a purificação de proteína heteróloga de células
procarióticas. Ver as Patentes U.S. 4.518.526, 4.599.197 e 4.734.362. A
preparação purificada produzida, no entanto, deve ser substancialmente isenta
de toxinas hospedeiras que possam ser nocivas aos seres humanos. Em
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particular, quando expressos em células hospedeiras bacterianas Gramnegativas, tais como de E. coli, o peptídeo ou proteína purificados devem
estar substancialmente livres de contaminação de endotoxinas. Ver, por
exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2'
5
Ediç., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989).
As proteínas variantes de P4 usadas nos métodos e
composições da invenção não ficam limitadas aos produtos de qualquer um
dos processos exemplares específicos aqui listados. De fato, a proteína pode
ser preparada pelos métodos dos textos citados imediatamente acima ou por
10 métodos dos textos citados em outra parte deste relatório descritivo. Situa-se
dentro da experiência da técnica isolar e produzir recombinante ou
sinteticamente composições protéicas para tal uso. A composição resultante
pode ser formulada em uma composição imunogênica com qualquer número
de imunógenos opcionais e escolhida quanto à eficácia por ensaios in vivo,
15 tais como o ensaio BC descrito nos exemplos abaixo. Alternativamente, as
proteínas e/ou moléculas de nucleotídeos preparadas como descrito acima,
podem ser úteis em ensaios de diagnóstico.
D. Composições Imunogênicas desta Invenção
As proteínas variantes de P4 desta invenção e as moléculas de
20 ácido nucleico que as codificam podem ser usadas em uma variedade de
composições imunogênicas, para induzir uma resposta imune protetora contra
a influenza H não tipificável. Essas composições imunogênicas podem ser
usadas para prevenir ou reduzir a suscetibilidade à otite média aguda e outras
doenças causadas por NTHi. As composições imunogênicas são úteis para
25 imunizar crianças em geral ou adultos contra a otite média ou elas podem ser
úteis para crianças em risco de contrair otite média (por exemplo, crianças
com uma história de infecção dos ouvidos).
Estas proteínas variantes de P4 de NTHi também são
adequadas para inclusão em composições imunogênicas contra várias cepas
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tipificáveis de H. influenzae, tais como H. influenzae do tipo b, porque o gene
hel que codifica a proteína P4 é antigenicamente conservado dentro e entre as
cepas de H. influenzae.
Tais composições imunogênicas podem ser formuladas como
5 vacinas univalentes ou multivalentes. Essas composições contêm além disso
uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína variante de P4 ou a
própria proteína, outro antígeno ou molécula de nucleotídeo que expresse esse
outro antígeno. Tais antígenos adicionais para uso em composições
imunogênicas desta invenção incluem epítopos de células B ou T de outros
10 antígenos. Entre tais "outros antígenos" para co-administração com uma
proteína variante de P4 desta invenção estão incluídos, sem limitação, outros
antígenos de H. influenzae, tais como outras proteínas de membrana externa
de H. influenzae (ou peptídeos ou proteínas tendo seus epítopos). Tais
proteínas de membrana externa de H. influenzae incluem a lipoproteína de
15 membrana externa associada a peptidoglicano (PAL) de 15000 daltons e a
lipoproteína de Haemophilus (PCP) de 15.000 daltons (Deich, R. A. et al.
1988 J. Bacteriol. 170(2): 489-498). O "outro" antígeno também pode incluir
componentes capsulares de oligo- ou polissacarídeo de H. influenzae, tal
como o polirribosilribitolfosfato (PRP), componentes lipopolissacarídeos,
20 lipooligossacarídeos ou lipossacarídeos de
H. influenzae
ou outros
microorganismos. "Outros" antígenos adicionais que podem ser incluídos nas
composições imunogênicas desta invenção incluem antígenos de outros
organismos (por exemplo, bactérias, vírus, fungos e parasitas encapsulados ou
não encapsulados). Por exemplo, antígenos de outros microorganismos
25 implicados na otite média, tais como Streptococcus pneumoniae (inclusive,
mas sem limitação, um ou mais polipeptídeos conhecidos de Streptococcus
pneumoniae, conjugados de lipopolissacarídeo-proteína e conjugados de
polissacarídeo-proteína, incluindo, porém sem limitação, a vacina de
polissacarídeo capsular pneumocócica de valência 23 correntemente
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disponível e a vacina do conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócica
de valência 7), Streptococcus pyogenes do grupo A, Staphylococcus aureus,
vírus sincicial respiratório e Moraxella cararrhalis (incluindo, mas não
limitado, as proteínas UspAl, UspA2, B 1 , C/D, E e 74 kDa) podem ser
5
incluídas nas composições imunogênicas desta invenção.
1. Uso de Proteínas Variantes de P4 em Composições
Imunogênicas
As proteína variante de P4 são desejavelmente formuladas nas
composições imunogênicas para indução de uma resposta imune protetora.
10 Assim, em uma modalidade, uma composição imunogênica desta invenção
contém uma ou mais das proteína variante de P4 como descrito acima, em um
carreador farmaceuticamente aceitável. Tais formulações compreendem a
proteína variante de P4 combinada com um carreador farmaceuticamente
aceitável, tal como água estéril ou solução salina isotônica estéril. Como aqui
15 usada, a expressão "carreador farmaceuticamente aceitável" intenta incluir
qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes
antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da
absorção, e outros, compatíveis com a administração a seres humanos. O
carreador apropriado será evidente àqueles versados na técnica e dependerá,
20
em grande parte, da via de administração.
As formulações incluem, porém sem limitação, suspensões,
soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e formulações
implantáveis de liberação prolongada ou biodegradáveis. Essas formulações
podem ainda compreender um ou mais ingredientes adicionais, incluindo, mas
25 sem limitação, agentes de suspensão, de estabilização ou de dispersão. Em
uma modalidade de uma formulação para administração parenteral, o
ingrediente ativo é fornecido na forma seca (isto é, em pó ou granular) para
reconstituição com um veículo adequado (por exemplo, água estéril isenta de
pirogênio) antes da administração parenteral da composição reconstituída.
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Outras formulações parenteralmente administráveis que são úteis, incluem
aquelas que compreendem o ingrediente ativo na forma microcristalina, em
uma preparação lipossômica, ou como um componente de um sistema
polimérico biodegradável. As composições para liberação prolongada ou
5 implantação podem compreender materiais poliméricos ou hidrofóbicos
farmaceuticamente aceitáveis, tais como uma emulsão, uma resina de troca de
íons, um polímero moderadamente solúvel, ou um sal moderadamente
solúvel.
Componentes adicionais ainda que podem estar presentes nas
10 composições imunogênicas protéicas desta invenção são adjuvantes,
preservativos, estabilizadores químicos ou outras proteínas antigênicas.
Tipicamente, os estabilizadores, adjuvantes e preservativos são otimizados
para determinar a melhor formulação quanto à eficácia no ser humano ou
animal alvo. Preservativos exemplares adequados incluem o clorobutanol, o
15 sorbato de potássio, o ácido sórbico, o dióxido de enxofre, o galato de propila,
os parabenos, a vanilina etílica, a glicerina, o fenol e o paraclorofenol.
Ingredientes estabilizadores adequados que podem ser usados incluem, por
exemplo, os casaminoácidos, a sacarose, gelatina, vermelho fenol, a amina NZ, o difosfato monopotássico, lactose, hidrolisado de lactalbumina, e leite em
20
pó.
Um adjuvante convencional é usado para intensificar uma
resposta imune. Tais adjuvantes incluem, entre outros, MPL ® (lipídeo A
monofosforílico 3-0-desacilado; Corixa, Hamilton, MT), que é descrito na
Patente U.S. número 4.912.094, que é aqui incorporado como referência.
25 Também adequado para uso como adjuvantes são os
compostos de fosfato de glicosamina aminoalquílicos (AGP), ou seus
derivados ou análogos, que são disponíveis da Corixa (Hamilton, MT), e que
são descritos na Patente dos Estados Unidos número 6.113.918, que fica aqui
incorporada como referência. Um tal AGP é 2-[(R)-3-
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tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-desóxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]b-D-glicopiranosídeo, que é também conhecido como 529 (anteriormente
conhecido como RC529). Este adjuvante 529 é formulado como uma forma
5
aquosa ou como uma emulsão estável.
Outros adjuvantes incluem o óleo mineral e emulsões em água,
sais de alumínio (alume), tal como o hidróxido de alumínio, o fosfato de
alumínio, etc., Amphigen, Avridine, L121/esqualeno, D-lactídeopolilactídeo/glicosídeo, polióis plurônicos, dipeptídeo muramílico, Bordetella
10 morta, saponinas, tais como Quil A ou Stimulon ® QS-21 (Antigenics,
Framingham, MA), descritos na Patente U.S. número 5.057.540, que fica aqui
incorporada como referência, e partículas deles geradas como ISCOMS
(complexos imunoestimulantes),
Mycobacterium tuberculosis,
lipopolissacarídeos bacterianos, polinucleotídeos sintéticos tais como
15 oligonucleotídeos contendo um motivo CpG (Patente U.S. número 6.207.646,
que fica aqui incorporada como referência), toxina da cólera (ou na forma de
tipo selvagem ou mutante, por exemplo em que o ácido glutâmico na posição
29 de aminoácido é substituído por outro aminoácido, preferivelmente uma
histidina, em conformidade com a Publicação de Patente Internacional n WO
20 00/18434, aqui incorporada como referência), uma toxina da coqueluche (PT),
ou uma toxina termolábil de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72,
CT-S109, PT-K9/G129; ver, por exemplo, as Publicações de Patentes
Internacionais ri s WO 93/13302 e WO 92/19265, aqui incorporadas como
referência. Várias citocinas e linfocinas são adequadas para uso como
25 adjuvantes. Um tal adjuvante é o fator estimulador de colônias de
granulócitos-macrófagos (GM-CSF), que tem uma seqüência de nucleotídeos
conforme descrito na Patente U.S. número 5.078.996, que é aqui incorporada
por referência. Um plasmídeo contendo cDNA de GM-CSF foi transformado
em E. coli e foi depositado na American Type Culture Coilection (ATCC),
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10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, sob o Número de
Acesso 39900. A citocina Interleucina-12 (IL-12) é outro adjuvante que é
descrito na Patente U.S. número 5.723.127, que é aqui incorporada como
referência. Outras citocinas ou linfocinas apresentaram-se tendo atividade
5 moduladora imune, incluindo, mas não limitando, as interleucinas 1-alfa, 1beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, os interferons-alfa, beta e
gama, o fator estimulador de colônias de granulócitos, e os fatores alfa e beta
de necrose tumoral, e são adequados para uso como adjuvantes.
Outros adjuvantes adequados incluem, sem que a estes fiquem
10 limitados: substâncias tensoativas (por exemplo, hexadecilamina,
octadecilamina, ésteres de aminoácidos octadecílicos, lisolecitina, brometo de
dimetil-dioctadecilamônio), metoxiexadecilglicerol e polióis plurônicos;
poliaminas, por exemplo pirano, dextransulfato, poli IC, carbopol; peptídeos,
por exemplo dipeptídeo muramílico, dimetilglicina, tuftisina; emulsões
15 oleosas; e géis minerais, por exemplo o fosfato de alumínio, etc. e complexos
imunoestimuladores. O imunógeno pode também ser incorporado nos
lipossomas, ou conjugado aos polissacarídeos, lipopolissacarídeos e/ou outros
polímeros para uso em uma formulação de vacina.
Como descrito acima, um componente imunogênico adicional
20 pode incluir um ou mais antígenos adicionais opcionais, como descrito acima.
Para a administração combinada com epítopos de outras proteínas de
membrana externa, a proteína variante de P4 pode estar presente
separadamente em mistura com os outros antígenos ou pode estar presente
como um conjugado ou como uma proteína de fusão compreendendo
25 determinantes de proteínas de membrana externa múltiplos ou determinantes
antigênicos múltiplos com outros antígenos de H. influenzae ou não de H.
influenzae. Por exemplo, os PAL e PCP de H. influenzae ou quaisquer
proteínas, peptídeos ou epítopos derivados deles, podem ser administrados
como uma mistura ou como um conjugado ou fusão com uma proteína
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variante de P4 desta invenção.
Na formulação das composições imunogênicas com as
proteínas variantes de P4 desta invenção, sozinhas ou nas várias combinações
descritas, o imunógeno é ajustado a uma concentração apropriada e formulado
5 com qualquer adjuvante adequado. Em algumas modalidades preferidas, a
composição imunogênica protéica da invenção é preparada para
administração a pacientes humanos na forma de, por exemplo, líquidos, pós,
aerossóis, tabletes, cápsulas, tabletes ou cápsulas com revestimento entérico,
ou supositórios.
2. Composições imunogênicas Contendo Moléculas de Ácido
10
Nucleico
Outra modalidade de uma composição imunogênica desta
invenção compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma
proteína variante de P4 desta invenção e um carreador farmaceuticamente
15 aceitável. As seqüências de ácido nucleico codificando uma proteína variante
de P4 para uso em uma composição imunogênica contra NTHi podem estar
presentes em um carreador adequado farmacêutica ou fisiologicamente
aceitável, tal como a solução salina isotônica ou solução de sais isotônicos. O
carreador apropriado será evidente àqueles versados na técnica e dependerá
20
em grande parte da via de administração.
Alternativamente, as composições imunogênicas compostas de
moléculas de polinucleotídeos desejavelmente contêm agentes ou "coagentes" opcionais de facilitação de polinucleotídeos, tais como um
anestésico local, um peptídeo, um lipídeo incluindo lipídeos catiônicos, um
25 lipossomo ou partículas lipídicas, um policátion tal como a polilisina, um
policátion tridimensional ramificado tal como um dendrímero, um
carboidrato, um anfifilico catiônico, um detergente, um tensoativo de
benzilamônio, ou outro composto que facilite a transferência de
polinucleotídeos para as células. Exemplos não exclusivos de tais agentes ou
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co-agentes de facilitação úteis nesta invenção são descritos nas Patentes U.S.
5.593.972, 5.703.055, 5.739.118, 5.837.533, Publicação de Patente
Internacional ri WO 96/10038, publicada em 4 de abril de 1996 e Publicação
de Patente Internacional n 2- WO 94/16737, publicada em 8 de agosto de 1994,
5
as quais ficam, cada uma, aqui incorporadas como referência.
Muitíssimo preferível, o anestésico local está presente em uma
quantidade que forma um ou mais complexos com as moléculas de ácido
nucleico. Quando o anestésico local é misturado com as moléculas de ácido
nucleico ou plasmídeos desta invenção, ele forma uma variedade de pequenos
10 complexos ou partículas que tamponam o DNA e ficam homogêneos. Assim
sendo, em uma modalidade das composições imunogênicas desta invenção, os
complexos são formados pela mistura do anestésico local com pelo menos um
plasmídeo desta invenção. Qualquer complexo único resultante desta mistura
pode conter uma variedade de combinações dos diferentes plasmídeos.
15 Alternativamente, em outra modalidade das composições desta
invenção, o anestésico local pode ser pré-misturado com cada plasmídeos
separadamente, e depois as misturas separadas podem ser combinadas em
uma composição única para garantir que a relação desejada dos plasmídeos
esteja presente em uma composição imunogênica única, se todos os
20 plasmídeos tiverem de ser administrados em uma administração de bolo
único. Alternativamente, o anestésico local e cada plasmídeo podem ser
misturados separadamente e administrados separadamente para se obter a
relação desejada. Quando, daqui por diante, os termos "complexo" ou "um ou
mais complexos" ou "complexos" forem usados para definir esta modalidade
25 da composição imunogênica, fica entendido que o termo abrange um ou mais
complexos, com cada complexo contendo uma mistura de plasmídeos
codificando a proteína variante de P4, ou uma mistura de complexos formada
discretamente, em que cada complexo contenha apenas um tipo de plasmídeo,
ou um ou uma mistura de complexos em que cada complexo contenha um
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DNA policistrônico.
Preferivelmente, os complexos têm entre cerca de 50 a cerca
de 150 nm de diâmetro. Quando o agente de facilitação usado for um
anestésico local, preferivelmente a bupivacaína, uma quantidade de cerca de
5 0,1 por cento em peso a cerca de 1,0 por cento em peso, com base no peso
total da composição de polinucleotídeos, é preferida. Ver também a
Publicação de Patente Internacional n -g- WO 99/21591, que é aqui incorporada
como referência, e que apresenta a incorporação de tensoativos de
benzilamônio como co-agentes, preferivelmente administrados em uma
10 quantidade entre cerca de 0,001 a 0,03% em peso. De acordo com a presente
invenção, a quantidade de anestésico local está presente em uma relação para
as referidas moléculas de ácido nucleico de 0,01 a 2,5% em p/v de anestésico
local para 1 a 10 .1,g/m1 de ácido nucleico. Outra faixa vai de 0,05 a 1,25% p/v
de anestésico local para 100 µg/ml a 1 mi/mi de ácido nucleico.
15
Neste procedimento de imunização de polinucleotídeos, as
proteínas variantes de P4 da invenção são expressa em uma base transiente in
vivo; nenhum material genético é inserido ou integrado nos cromossomas do
hospedeiro. Este procedimento deve ser distinto da terapia de genes, em que o
objetivo é inserir ou integrar o material genético de interesse no cromossoma.
20 Um ensaio é usado para confirmar que os polinucleotídeos administrados por
imunização não dão origem a um fenótipo transformado no hospedeiro
(Patente U.S. número 6.168.918).
As composições imunogênicas também podem conter outros
aditivos adequados para a modalidade selecionada de administração da
25 composição. A composição da invenção pode também envolver
polinucleotídeos liofilizados, que possam ser usados com outros excipientes
farmaceuticamente aceitáveis para desenvolver as formas de dosagem em pó,
líquidas ou em suspensão. Ver, por exemplo, Remington: The Science and
Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19'. edição (1995), por exemplo o Capítulo 95
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Aerosols; e a Publicação de Patente Internacional n WO 99/45966, cujos
preceitos são aqui incorporados por referência. As vias de administração
destas composições podem ser combinadas, se desejável, ou ajustadas.
Opcionalmente, como descrito acima, estas composições
5 imunogênicas contendo moléculas de ácido nucleico, podem incluir
seqüências de ácido nucleico codificando um ou mais dos antígenos
"adicionais" observados acima. Por exemplo, as moléculas de nucleotídeos
individuais codificando antígenos individuais podem ser misturadas com a
molécula de nucleotídeo que contenha a seqüência codificando a proteína
10 variante de P4. Alternativamente, a seqüência codificando a proteína variante
de P4 pode ser fundida à seqüência de DNA codificando um ou mais dos
outros antígenos de H. influenzae ou antígenos de outras bactérias, vírus,
parasitas ou fungos para criar antígenos multivalentes geneticamente fundidos
(compartilhando uma cadeia principal comum de peptídeos).
15
Estas composições imunogênicas contendo a molécula de
ácido nucleico podem conter aditivos adequados para administração através
de qualquer via de administração convencional. Em algumas modalidades
preferidas, a composição imunogênica da invenção é preparada para
administração a pacientes humanos na forma de, por exemplo, líquidos, pós,
20 aerossóis, tabletes, cápsulas, tabletes ou cápsulas com revestimento entérico,
ou supositórios.
3. Composições Imunogênicas Contendo Vírus Recombinante.
Em ainda outro aspecto desta invenção, as composições
imunogênicas podem conter um vírus recombinante que seja capaz de
25 expressar a proteína variante de P4 (e/ou qualquer imunógeno adicional).
Vírus não patogênicos adequados que podem ser engendrados para carregar a
molécula de ácido nucleico desta invenção para as células do hospedeiro,
incluem os poxvírus, tais como vacínia, adenovírus, vírus adeno-associados,
vírus canaripox, retrovírus e outros. Preferivelmente, para administração, o
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vírus é um vírus não replicador, tal como um adenovírus deletado em El,
típico daqueles usados na terapia gênica. Ver, como um exemplo, o
adenovírus defeituoso de replicação recombinante descrito na Patente U.S.
5.698.202, entre outros. Vários desses vírus não patogênicos são comumente
5 usados para a terapia gênica humana e como carreadores para outros agentes
de vacina, e são conhecidos e selecionáveis por uma pessoa habilitada na
técnica.
Preferivelmente, o vírus não replicador conduzindo uma
seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína variante de P4 desta
10 invenção é colocado em suspensão em uma solução biologicamente
compatível ou veículo de liberação farmaceuticamente aceitável. Um veículo
adequado é a solução salina estéril. Outras soluções de injeção estéreis
isotônicas aquosas e não aquosas e suspensões estéreis aquosas e não aquosas
conhecidas como sendo carreadores farmaceuticamente aceitáveis e bem
15
conhecidos daqueles de experiência na técnica, podem ser empregadas com
esta finalidade.
Opcionalmente, este tipo de composição imunogênica da
invenção pode ser formulado para conter outros componentes, incluindo, por
exemplo, adjuvantes, estabilizadores, ajustadores de pH, preservativos, como
20 mencionado acima. Esses componentes são bem conhecidos daqueles de
experiência na técnica de vacina.
Uma outra modalidade ainda adequada para uma composição
imunogênica de acordo com esta invenção é o uso de composições
imunogênicas inativadas, por exemplo, grandes quantidades do vírus
25 recombinante expressando as proteínas variantes de P4 desejadas são
cultivadas em cultura para prover a quantidade necessária de antígenos
relavantes e inativadas por meios convencionais. Uma mistura de vírus
inativados que expressam diferentes epítopos pode ser usada para a
formulação de composições imunogênicas "multivalentes", como descrito na
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Patente U.S. 5.780.601, aqui incorporada como referência. Esta composição
imunogênica deve também conter um adjuvante adequado, como descrito
acima, de modo a intensificar a resposta imunológica aos antígenos.
4. Composições Imunogênicas Contendo Bactéria Comensal
5 Em ainda outro aspecto da presente invenção, as moléculas de
ácido nucleico sintéticas desta invenção, que codificam a proteína variante de
P4 (incluindo qualquer proteína de fusão e/ou antígeno adicional), podem ser
incorporadas em um microorganismo não patogênico. O microorganismo
resultante, quando administrado a um hospedeiro humano, expressa e
10 multiplica as composições expressas desta invenção in vivo para induzir a
formação de anticorpos específicos. Por exemplo, uma bactéria comensal não
patogênica pode ser empregada para carregar as moléculas codificando a
proteína variante de P4 desta invenção e é útil para administração a um
paciente, podendo ser preparada mediante o uso de metodologia convencional
15 e selecionada dentre microorganismos não patogênicos conhecidos. Entre a
bactéria comensal que pode ser útil para liberação exógena da molécula de
ácido nucleico desta invenção ao paciente in vivo, incluem-se, sem limitação,
várias cepas de Streptococcus, por exemplo, S. gordonil ou E. coli, Bacillus,
Streptomyces e Saccharomyces.
20
As composições imunogênicas da presente invenção, como
descrito acima, não ficam limitadas pela seleção dos carreadores, adjuvantes
ou outros ingredientes convencionais, fisiologicamente aceitáveis, úteis nas
preparações farmacêuticas dos tipos descritos acima. A preparação destas
composições farmaceuticamente aceitáveis, a partir dos componentes acima
25
descritos, tendo isotonicidade de pH apropriada, estabilidade e outras
características convencionais, situa-se dentro da perícia técnica.
E. Métodos de Uso
As composições imunogênicas descritas acima podem ser
empregadas em um método para induzir uma resposta imune em um ser
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humano contra H. influenzae não tipificável. Em uma modalidade deste
método, uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica de proteína
variante de P4 como descrito acima, é administrada a um paciente. A
quantidade da proteína P4, molécula de ácido nucleico expressando a variante
5 de P4, ou vírus recombinante expressando a variante de P4 na composição, é
aquela quantidade eficaz para eliciar uma resposta imune contra NTHi.
Preferivelmente, a resposta imune é protetora contra a infecção de NTHi.
As vias de administração quanto às composições imunogênicas
desta invenção incluem, sem limitação, a administração parenteral, a
10 administração intraperitoneal, a administração intravenosa, a administração
intramuscular, a administração subcutânea, a administração intradérmica, a
administração oral, a administração tópica, a administração intranasal, a
administração intrapulmonar, a administração retal, a administração vaginal, e
outras. Todas essas vias são adequadas para administração destas
15 composições. A via apropriada é selecionada na dependência da natureza da
composição imunogênica usada, e de uma avaliação da idade, do peso, do
sexo e da saúde geral do paciente e dos antígenos presentes na composição
imunogênica, e fatores semelhantes, por um médico assistente.
Em geral, a seleção da "quantidade eficaz" ou dosagem
20 apropriadas para as composições imunogênicas da presente invenção também
se basearão na composição imunogênica particular empregada, bem como na
condição física do paciente, mais especialmente incluindo a saúde geral e o
peso do paciente imunizado. Tal seleção e ajuste da dose eficaz para mais ou
para menos acha-se dentro da experiência da técnica. A quantidade de
25 componente ativo necessária para induzir uma resposta imune,
preferivelmente uma resposta de proteção, ou produzir um efeito exógeno no
paciente sem efeitos colaterais adversos significativos, varia na dependência
da composição farmacêutica empregada e da presença opcional de um
adjuvante (para as composições que contenham proteína).
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11.
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Em uma modalidade, para as composições que contenham
componentes protéicos, por exemplo uma proteína variante de P4 ou proteínas
de fusão como descrito acima, cada dose compreenderá entre cerca de 1 In a
cerca de 20 mg dos imunogênios protéicos por mililitro de uma solução
5 estéril. Outras faixas de dosagem podem também ser consideradas por uma
pessoa habilitada na técnica. As doses iniciais podem ser opcionalmente
seguidas por reforços repetidos, quando desejável.
Em outra modalidade, as quantidades de moléculas de
nucleotídeo nas composições de DNA e de vetor, podem ser selecionadas e
10 ajustadas por uma pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, cada dose
compreenderá entre cerca de 50 gg a cerca de 1 mg de ácido nucleico
codificando o imunogênio, por exemplo o DNA plasmídeo, por mililitro de
uma solução estéril.
Para os vírus recombinantes, preferivelmente defeituosos de
15 replicação, contendo as moléculas de ácido nucleico codificando as proteínas
variantes de P4 desta invenção, a "quantidade eficaz" é uma quantidade de
vírus recombinante que seja eficaz em uma via de administração para
transfectar as células desejadas do paciente e prover níveis suficientes de
expressão do gene selecionado para prover um beneficio, isto é, a imunidade
20 protetora. Os níveis de imunidade podem ser monitorados para determinar a
necessidade, se alguma, quanto aos reforçadores. Entretanto, entende-se que
uma pessoa de experiência na técnica possa alterar tais dosagens dependendo
da identidade do vírus recombinante e da composição dos imunógenos (isto é,
da presença de proteínas variantes de P4 ou "outros antígenos" que o vírus
25
recombinante esteja liberando ao hospedeiro).
As quantidades das bactérias comensais que carreguem uma
seqüência de ácido nucleico expressando uma proteína variante de P4 a ser
liberada ao paciente, geralmente variará entre cerca de 10 3 a cerca de 10 12
céluas/kg.Etdoenpmsraltdoupesxriênca
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48
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na técnica, dependendo da bactéria que esteja sendo utilizada e das proteínas
variantes de P4 adicionais ou "outros antígenos" que estejam sendo liberados
ao hospedeiro pela bactéria viva.
F. Uso de Variantes de P4 como Proteínas Carreadoras
5 Além de sua utilidade como um imunógeno primário, a
proteína variante de P4 pode ser usada como uma proteína carreadora para
conferir ou intensificar a imunogenicidade de outros antígenos, quando o
outro antígeno puder ser uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, polissacarídeo,
oligonucleotídeo, sacarídeo, lipopolissacarídeo, lipooligossacarídeo ou
10 lipossacarídeo. A proteína variante de P4 tem atividade enzimática reduzida
em comparação com a proteína P4 do tipo selvagem, mas não necessita
necessariamente ou induzir anticorpo à proteína P4 do tipo selvagem ou ter
atividade bactericida contra NTHi, com a condição de que a proteína
carreadora da variante de P4 não tenha uma fenilalanina na posição 122 de
15
aminoácido da SEQ ID NO: 3. Por exemplo, a proteína variante de P4 é
quimicamente conjugada por meios convencionais a um polissacarídeo ou
lipopolissacarídeo ou expressa como uma proteína de fusão com outra
proteína.
G. Ensaios de Diagnóstico
20
As proteínas variantes de P4 e as moléculas de ácido nucleico
desta invenção, opcionalmente associadas com rótulos detectáveis ou com
componentes capazes de detectar a formação do complexo imune ou
hibridizações de DNA, podem também ser usadas como antígenos em ensaios
para a detecção de H. influenzae não tipificável em vários tecidos e fluidos
25 corporais, por exemplo o sangue, fluido espinhal, esputo etc. Estes ensaios e
formatos de ensaios são convencionais e devem ser dos mesmos formatos
descritos para uso dos reagentes de P4 do tipo selvagem, como descrito na
Patente U.S. 5.780.601.
Por exemplo, as proteína variante de P4 desta invenção pode
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ser empregada como reagentes em radioimunoensaios, ensaios ELISA,
ensaios de "sanduíche", reações da precipitina, reações da precipitina de
difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação,
imunoensaios fluorescentes, imunoensaios da proteína A e ensaios de
5
imunoeletroforese. A proteína variante de P4 desta invenção é opcionalmente
associada com um rótulo detectável.
As moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína
variante de P4 desta invenção ou quaisquer seqüências que hibridizam com
ela, também podem ser usadas como sondas nos ensaios de hibridização de
10 ácido nucleico para a detecção de H. influenzae não tipificável, em vários
tecidos ou fluidos corporais dos pacientes. Ensaios de hibridização adequados
incluem, sem limitação, os Southern blots, Northern blots, e manchas de
colônias, entre outros. A estringência da hibridização pode ser variada,
dependendo das exigências do ensaio.
15
Rótulos detectáveis adequados incluem, sem limitação, uma
proteína ou molécula química pequena que sejam capazes, atuando sozinhas,
ou de acordo com outras moléculas ou proteínas, de prover um sinal que seja
detectável ou direta ou indiretamente. Por exemplo, um rótulo detectável pode
ser um rótulo fluorescente, um rótulo luminescente, um radiorrótulo ou um
20 rótulo quimioluminescente. Um rótulo pode também ser uma enzima que
interaja com um substrato para produzir um sinal detectável. Ver, por
exemplo, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6' Ed.,
R. P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996); Patente U.S.
4.542.104 e Patente U.S. 5.272.257. Outros rótulos ainda incluem as proteínas
25 fluorescentes verdes e as proteínas fluorescentes azuis. Rótulos adequados
para as moléculas de ácido nucleico podem ser as seqüências de DNA
codificando um gene lux, beta-lactamase, uma enzima galactosidase, por
exemplo a beta-galactosidase (LacZ), a fosfatase alcalina, a timidina cinase, a
proteína fluorescente verde (GFP), a cloranfenicol acetiltransferase (CAT),
50
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•
uma enzima luciferase, ou uma enzima gliconase.
Qualquer número de sistemas marcadores adicionais, e
convencionalmente empregados, pode ser adaptado para associação com as
proteínas variantes de P4 e/ou seqüências de ácido nucleico codificando as
5 proteínas variantes de P4 desta invenção. Uma pessoa habilitada compreende
que a seleção e/ou a implementação de um sistema de rótulos envolve apenas
a experimentação de rotina.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar a produção
10 e atividade de proteínas variantes de P4 representativas desta invenção. Os
exemplos apresentados aqui mostram a construção de moléculas de
nucleotídeos isoladas codificando as proteína variante de P4, a expressão
recombinante nas células hospedeiras, e a purificação delas. As proteínas
purificadas foram analisadas quanto à atividade enzimática em um ensaio
15 colorimétrico sensível. As proteínas foram também usadas para imunizar
camundongos Swiss-Webster, junto com rLP4 do tipo selvagem, e os antisoros resultantes foram analisados quanto aos anticorpos de IgG totais contra
rLP4 do tipo selvagem e à atividade bactericida contra NTHi. Estes exemplos
demonstram que, determinando-se quais os mutantes de P4 carecem de
20 atividade enzimática, enquanto retêm a imunogenicidade do tipo selvagem e a
eliciação de anticorpos funcionais não seja uma questão insignificante. Três
das proteínas P4 mutantes construídas como descrito abaixo possuem as
propriedades imunológicas desejadas, a saber, eliciando tanto os títulos de
ELISA contra a P4 do tipo selvagem quanto altos níveis de anticorpos
25 bactericidas contra NTHi. Uma pessoa habilitada na técnica observará que,
embora reagentes e condições específicas sejam delineadas nos seguintes
exemplos, estes reagentes e condições não constituem uma limitação na
presente invenção.
EXEMPLO 1: MUTAGÊNESE DIRIGIDA AO SÍTIO DO GENE DE P4.
51
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• • •••
As fosfatases ácidas bacterianas têm sido bem estudadas
através dos anos, e foram divididas em classes múltiplas com base na sua
especificidade de substrato, localização celular, etc. (Thaller, M. C. et al.,
1998. Prot. Sci., 7: 1647-1652.9). As regiões com aminoácidos altamente
5 conservados entre as múltiplas fosfatases ácidas bacterianas, foram
identificadas como áreas prováveis para a mutagênese dirigida ao sítio para
eliminar ou reduzir a atividade enzimática, e, tornando as mudanças
conservadoras, manter a estrutura terciária.
A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada em P4 do tipo
10 selvagem após os iniciadores sintéticos terem sido usados para introduzir os
sítios BsmB 1 e as mutações desejadas como descrito abaixo. A digestão com
BsmBl e a religação resultou na seqüência de P4 mutante desejada com a
concomitante perda ao sítio BsmB 1. Estas proteínas mutantes lipidadas foram
expressas em células hospedeiras BLR de E. coli, e purificadas mediante leve
15
modificação do procedimento padrão usado para purificar rLP4 do tipo
selvagem lipidada.
Especificamente, um mutante duplo dirigido ao sítio de ácido
aspártico foi construído com base na informação de que dois resíduos de
ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem eram críticos à atividade da
20 fosfatase ácida. Um mutante designado P4-351 foi construído, no qual os
resíduos de aminoácido nas posições Asp64 e Asp66 da SEQ ID NO: 3 foram
mudados para Ala64 e Ala66A. Outro mutante designado P4-D184A, D 185A
foi construído, no qual o Asp184 e Asp185 do tipo selvagem da SEQ ID NO:
3 foram transformados em Ala184 e A1a185. Em outros mutantes, a
25 mutagênese dirigida ao sítio dos resíduos 35 e 37 de aminoácido da SEQ ID
NO: 3 resultou em quatro proteínas, mudando o resíduo ácido de alanina ou
em ácido glutâmico (A35G, A37G), treonina (A35T, A37T), asparagina
(A35D, A37D) ou glutamina (A35Q, A37Q). Estes mutantes foram
construídos para determinar se as mudanças para outra região que não Asp
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para Ala, resultariam em menos rompimento conformacional da molécula
protéica e, assim, melhor imunogenicidade contra P4 do tipo selvagem.
Adicionalmente, as seguintes mutações únicas na proteína P4
foram feitas para gerar as proteínas variantes de P4 N218Q, K161R, D64E,
5 Y122F, D64N, D64E e Q39E. Além disso, o resíduo de Phe na posição 48 foi
mudado para um resíduo de Cys. Este resíduo foi selecionado para a mutagênese,
com base em sua posição em um domínio putativo de ligação de hemina.
Esta variedade de proteínas mutantes expressas foi produzida
como identificado na Tabela 1.
10
Tabela 1. As proteínas variantes de P4 mutantes e as mutações.
Nome da P4 mutante
F48C
F48S
D64A, D66A
K161R
N218Q
D64N
D64E
D184A, D185A
A35E, A37E
A35T, A37T
A35N, A37N
A35Q A37Q
Q39E
Y122F
Resíduo(s) de aminoácido do
tipo selvagem
Phe48
Phe48
Asp64, Asp66
Phe161
Asn218
Asp64
Asp64
Asp184, Asp185
Ala35A1a37
A1a35, A1a37
A1a35, A1a37
A1a35, A1a37
G1n39
Tyr122
Resíduo(s) de aminoácido
mutageneizado(s)
Cys48
Ser48
A1a64, A1a66
Arg161
GIn218
P,sn64
GIu64
Ala 184, Ala 185
G1u35, G1u37
Thr35, Thr37
Asn 35, Asn 37
Gln 35, Gin 37
G1u39
Phe122
Todos os mutantes dirigidos ao sítio com exceção de F48C e
D64A, D66A, foram derivados do plasmídeo pLP339, um vetor de expressão
de pBAD18Cam contendo o gene de P4 de H. influenzae não tipificável do
tipo selvagem (NTHi) (Green, B. A. et al. 1991 Infect. Immun., 59: 319115 3198) sob o controla do promotor de arabinose. As proteínas mutantes D64A,
D66A e F48C foram derivadas do plasmídeo pHel3 (Reilly et al., 1999, citado
acima).
A maior parte das proteínas mutantes dirigidas ao sítio foi
construída com o uso do kit de mutagênese QuickChange (Stratagene) de
20
acordo com as diretrizes do fabricante. Os iniciadores usados para construir as
mutações de P4 acham-se listados na Tabela 2 abaixo. Os iniciadores de
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••• *:•• ••• • .:• ••• ••• ti• • • • •• • •• • •
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• * ** ** * • •
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oligonucleotídeos aqui usados (com exceção daqueles usados por Reilly et al.,
1999, citados acima), foram sintetizados em um sintetizador de
oligonucleotídeos PerSeptive Biosystems (Applied Biosystems, Foster City,
CA) usando-se a química de 0-cianoetilfosforamidita.
5
Tabela 2. Iniciadores usados para a mutagênese dirigida ao sítio do gene hel.
Mutação
F48C
D64A &
D66A
K161R
N218Q
D64N
D64E
D184A &
D 1 85A
A35E &
A37E
A35N &
A37N
A35Q &
A37Q
A35T &
A37T
Q39E
Y122F
Seqüência (5' to 3')
GCAAAAGTTGCATGCGATCACGCAAAAG
CTTTTGCGTGATCGCATGCAACTTTTGC
GCGGTTGTGGCTGCMAGCTGAAACTATGTTAG
CTAACATAGMCAGCTAAAGCAGCCACAACCGC
GCGCGTCTCTTGCATTTTAMGAAAAAAGACAAATCAGCTAGA
GCGGCTC
GCGCGTCTCGTGCAGATTCTTCCACGCCATTGAAACC
GCGCGTCTCTGCTGGGAAGGCGGMAGCTGAAG
GCGCGTCTCGCAGCCACCGTAGMGCTTGAGGTAACATGATGA
AAG
GCGCGTCTCTGGTAAGAAAAAAGCGGTTGTGGCTAAMAGATG
GCGCGTCTCGTACCTTTTGCCACTTT"TGCGTG
GCGCGTCTCGTACCTTTTGCCACTTT"TGCGTG
GCGCGTCTCTGGTAAGAAAAAAGCGGTTGTGGCTGAATTAGATG
CGCCGTCTCGCTGCCTTCGGTAATACCGTATATGGC
CGCCGTCTCGGCAGCTAAGTTATCACCTACATAAAGTACG
CGCCGTCTCTTAGAATATCAAGCGTACAATGCGGC
CCGCGTCTCATCTAA'TTCMATATTCGCCAGAATCTTGC
GCCCGTCTCCCT"TAAACTATCAAGCGTACAATGCGGC
GCCCGTCTCCTAAGYITTTATATTCGCCAGAATCTTGC
CCGCGTCTCATTACAATATCAAGCGTACAATGCGGC
GCCCGTCTCGGTAATTGTTTATATTCGCCAGAATCTTGC
CGGCGTCTCCATTAACTTATCAAGCGTACAATGCGGC
CGGCGTCTCCTAATGTTTTATATTCGCCAGAATCTTGC
GCATTAGCTTATGAAGCGTACAATGCGG
CCGCATTGTACGCTTCATAAGCTAATGC
CGGTAAAGTGTTCMGTAACAAACCGC
GCGGMGTTACAAAGAACACMACCG
SEQ ID
NOS
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
A clonagem sem sutura de BsmBI foi usada para gerar vários
dos mutantes de P4. As seções do gene de P4 foram amplificadas por reação
em cadeia da polimerase (PCR) (ciclador térmico PE2400, Applied
Biosystems, Foster City, CA) do plasmídeo pLP339. Primeiro, o iniciador
10 contendo um sítio de BsmBI e a mutação desejada foi pareado com o
iniciador do vetor apropriado e usado para amplificar uma seção do gene de
P4. Adicionalmente, um segundo iniciador contendo um sítio de BsmBI foi
pareado com um iniciador de vetor apropriado e usado para amplificar a seção
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remanescente do gene de P4. Cada seção do gene de P4 foi ligada e clonada
em pCR2.1-TOPO (Invitrogen).
Os transformantes foram examinados por PCR quanto à
presença de um inserto e confirmados por análise de seqüência. Os clones
5 corretos foram digeridos por restrição com BsmBI e SacI ou SphI (enzimas de
restrição fornecidas pela New England Biolabs) e os insertos foram
purificados sobre géis de agarose de baixo ponto de fusão. Os fragmentos
purificados em gel foram ligados sem sutura junto aos sítios de BsmBI.
Os genes de P4 mutageneizados que haviam sido clonados em
10 pCR2.1-TOPO foram subclonados em pBAD18Cam (Invitrogen) para
expressão da proteína P4 mutante usando os sítios Scal-Sphl, com exceção do
gene F48C. A seqüência F48C foi subclonada em pBAD18Cam usando os
sítios Nhel-Sacl.
EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS P4 MUTANTES
15 RECOMBINANTES LIPIDADAS
Os plasmídeos contendo estas proteínas P4 mutantes foram
transformados na cepa de E. coli BLR e todas as proteínas P4 mutantes foram
nela expressas recombinantemente. Os clones foram confirmados por
seqüenciação do gene de P4. Culturas noturnas de BLR contendo o plasmídeo
20 apropriado foram cultivadas em meio Hy-Soy tamponado com NaPO4
contendo glicose a 0,05% e 30 µg/m1 de cloranfenicol a 37 °C com aeração.
Frascos contendo o mesmo meio, exceto a glicose, foram inoculados com
uma diluição a 1:20 da cultura noturna e incubados em 37 °C com aeração até
que a OD600 alcançasse aproximadamente 2,0. As bactérias foram então
25 induzidas com arabinose a 0,5% e a incubação continuou por 3 horas. As
células bacterianas foram colhidas por centrifugação a 10.000 x g, 4 °C,
durante 30 minutos, e as pelotas celulares foram lavadas 1X com PBS. As
células foram repelotizadas e armazenadas congeladas a —20 °C. A expressão
da proteína P4 foi conferida pela análise de SDS-PAGE de lisados celulares
55
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completos usando-se géis a 12%.
EXEMPLO 3: PURIFICAÇÃO DE P4 RECOMBINANTE LIPIDADO E
MUTANTES.
As proteínas mutantes P4 foram depois purificadas como
5 segue: As células de E. coli foram recolocadas em suspensão em tampão
hipotônico (HEPES 10 mM-NaOH, pH 7,4, Na 2EDTA 1 mM) e lisadas sob
alta pressão [aproximadamente 18.000 psi (124,2 MPa) mediante a passagem
da suspensão celular através de um microfluidificador. As membranas foram
obtidas em seguida à ultracentrifugação por 1 hora a 300.000xg a 10 °C em
10 um rotor Beckman 45 Ti. As proteínas de membranas internas e externas
foram diferencialmente solubilizadas mediante extrações seqüenciais com
Triton X-100 a 1% (p/v) em HEPES 10 mM-NaOH, pH 7,4, MgC1 2 1 mM e
Zwittergent 3-12 a 1% (p/v) em Tris 50 mM-HC1, pH 8, Na 2EDTA 5 mM,
respectivamente. Os extratos de zwittergent 3-12 solubilizaram a rLP4 ou
15
proteínas mutantes.
As proteínas de interesse foram purificadas poro
fracionamento em colunas de troca de íons em tandem (DEAE & SPsepharose). A proteína rLP4 elui da SP-Sepharose em um gradiente de sal de
0-0,2M como dois picos designados Forma 1 e Forma 2. A Forma 2 é
20 convertida em Forma 1 por congelamento lento em um tampão de fosfato de
Na 10 mM, pH 7,1m NaCl 150 mM, Zwittergent 3-12 a 1%, seguido por
diálise em tampão de Tris-EDTA-Zwittergent 3-12, pH 8. A Forma 1
convertida é ainda purificada em uma coluna de SP-sepharose. Os mutantes
de rLP4 foram purificados pelo mesmo método que a proteína do tipo
25 selvagem, exceto quanto a mutação reduziu o pI da proteína. Nestes casos, em
seguida à extração o tampão foi mudado para HePES 10 mM-NaOH, pH 7,4,
Na2EDTA 1 mM, Zwittergent 3-12 a 1% (p/v) antes da etapa da coluna em
tandem. Este tampão também foi usado para eluição da coluna de SPSepharose. A maior parte dos mutantes de rLP4 eluiu em um pico único de
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proteína. A proteína foi ensaiada usando-se o ensaio de ácido bicinconínico de
acordo com as diretrizes do fabricante (Pierce).
EXEMPLO 4: ENSAIO QUANTO À ATIVIDADE DE FOSFATASE
As proteínas mutantes de P4 purificadas foram então
5 examinadas quanto à atividade enzimática em um ensaio de fase fluida
sensível. A atividade de fosfomonoesterase da rLP4 foi medida em
comparação com a rLP4 do tipo selvagem por um ensaio essencialmente
colorimétrico, como descrito por Reilly et al. 1999, acima citado. A adição de
Triton X-100 a 1% (p/v) ao tampão de ensaio intensificou a atividade da
10 rLP4. A quantidade de nmoles do p-nitrofenol produzido foi determinada pela
comparação da absorbância em 410 nm com aquela da curva padrão de pnitrofenol. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a
quantidade de atividade necessária para converter 1 gmol de substrato no
produto por minuto a 37 °C. A atividade específica foi definida como o
15
número de unidades da enzima por 1 mg de proteína. Os resultados são
apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Atividade Específica dos Mutantes de rLP4 (ensaio de pNPP)
Unidade/mg
% de peso a/
Mutante
O
rLP4-A35E,A37E
0 bi
O
O
rLP4-A35N,A37N
O
O
rLP4-A35Q,A37Q
O
O
rLP4-A35T,A37T
rLP4-D184A,D185A
O
O
rLP4-D64A,D66A
O
O
rLP4-N218Q
0,07
0,1
rLP4-K161 R
0,26
0,4
rLP4-tipo selvagem
70
100
rLP4-D64E
0,05
0,07
rLP4-D64N
0,13
0,2'
rLP4-Y122F
66
94
rLP4-Q39E
2,3
3,3
ND c/
rLP4-F48C
ND
rLP4-F48S
0,05
0,07
a/ Percentual de atividade em comparação com a rLP4 do tipo selvagem.
b/
Abaixo do limite de detecção.
c/ Sem dados.
57
•• •• • • ••1) • •• • •• • • •• •• •
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• ••••
• • • •••
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•
•
•
•
•
•
•• •••
•
••• •• •• •• ••
•
Cada mudança produzida nos resíduos específicos de P4
selecionados para conservação entre as fosfatases ácidas bacterianas quase
completamente extirpou a atividade enzimática da P4, com exceção da
mutação Y122F. Dos mutantes remanescentes testados, apenas o mutante
5
Q39E conserva >1% de atividade do tipo selvagem (3,3%), enquanto os
mutantes duplos não possuem nenhuma atividade detectável.
Estes resultados indicam que a carga e a estrutura terciária
dentro das áreas de P4 conservadas entre as fosfatases ácidas bacterianas são
críticas para a função enzimática. Mesmo mudanças conservadoras, tais como
10 as mudanças de resíduos de Asp em resíduos de Glu, quase completamente
eliminaram a atividade enzimática quando as mudanças foram feitas nos
resíduos de Asp conservados.
Com exceção dos mutantes Y122F e Q39E, não foram
detectados mutantes com atividade enzimática apenas parcialmente reduzida.
15 Virtualmente todos as mutações quase completamente removeram a atividade.
A mudança de mutação F48 em um resíduo de cisteína ou serina também
reduziu a atividade enzimática.
EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE ANTI-SOROS CONTRA PROTEÍNAS
MUTANTES RLP4 LIPIDADAS.
20
As proteínas mutantes de P4 foram então ensaiadas quanto à
reatividade com anticorpos monoclonais (Mabs) e a capacidade de eliciar antisoros biologicamente ativos altamente titulados contra P4 do tipo selvagem.
A. Procedimentos de Imunização
Camundongos Swiss Webster fêmeas (6 a 8 semanas de idade)
25 foram subcutaneamente imunizados com 15 gg de proteína P4 do tipo
selvagem ou mutante misturados com 100 gg de adjuvante MPL ® em solução
salina ou PBS. A composição também continha timerosal a 0,01% como um
preservativo. As duas imunizações foram realizadas com quatro semanas de
distância, e a última sangria foi conduzida na sexta semana. Os soros da
58
•••
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• • ♦.•• •
•
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••• à• • •• •
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•••
semana zero e da semana seis foram analisados individualmente ou como
lagos por um ensaio ELISA e como combinações para a atividade bactericida.
B. Ensaio imunoabsorvente ligado a enzima.
Anticorpos anti-P4 (tipo selvagem e mutante) foram medidos
5 como segue. As placas foram revestidas com 1 gg/ml de P4 do tipo selvagem ou
12 gg/m1 de P4 mutante diluídos em PBS. Após unia incubação de 90 minutos/37
°C, as placas foram armazenadas em 4 °C até o dia seguinte. As placas revestidas
com P4 mutante foram bloqueadas com leite desnatado. Após a lavagem, uma
alíquota de 100 gl de soro, serialmente diluído até uma concentração final de 1:50
10 a 1:5.467.500 em PBS/Tween 20 0,05%, foi adicionada a cada reservatório, e foi
incubado por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e 100 gl
de anticorpo secundário (IgG anticamundongo de cabra conjugado a fosfatase
alcalina, diluído em 1:5.000 em PBS/Tween 20 a 0,05%) foram adicionados e
incubou-se por 2 horas em temperatura ambiente.
15
Após a lavagem, o anticorpo ligado foi detectado pelo substrato
pNPP (fosfato de p-nitrofenol) diluído em dietanolamina em 1 mg/ml. Depois
de uma hora, a cor amarela foi lida em 405 nm com uma referência de 650 nm.
Cada reação foi realizada em duplicata, e os resultados foram obtidos em
média. O título de anti-P4 de um soro foi calculado como a diluição do soro
20
dando uma absorbância de 0,1 sobre uma curva de parâmetro 4.
C. ELISA de Célula Completa.
A cepa de NTHi P860295 foi cultivada em placas de ágar de
chocolate por seis horas e colhida em PBS. A suspensão celular foi diluída até
uma O.D. de 0,2 determinada em 620 nm, e 75 gl foram dispensados em
25 placas NUNC polysorb. As placas foram secadas em 37 °C durante a noite e
mantidas em temperatura ambiente até o uso. Elas foram bloqueadas com
PBS/5% de leite desnatado e lavadas antes da adição de 100 gl de soro
diluído (serialmente diluído até uma concentração final ou de 1:36.450 ou
1.093.500 em PBS/1% Tween 20/5% de leite desnatado). Após uma
••
• • ••• • • •• e ••••• • .. • • •• •
•
•
•
••••
59
•
•
•
•
•
•
•
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•
•
9•
•
••
•
• •
• •
*5
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• •
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•• •
•
•
••
••
•
•
••
•
•
•
** •
•
•
•••
•
•
•
•••
incubação de uma hora/37 °C, as placas foram lavadas e incubadas por outra
hora a 37 °C com 100 III de anticorpo secundário (IgG anticamundongo de
cabra conjugado a fosfatase alcalina, diluído a 1:5.000 em PBS/0,1% Tween
20/5% de leite desnatado).
As placas foram novamente lavadas e os anticorpos ligados
5
foram detectados pelo substrato pNPP (fosfato de p-nitrofenol) diluído em
dietanolamina a 1 mg/ml. Depois de uma hora, a cor amarela foi lida em 405
nm com referência de 650 nm. Cada reação foi realizada em duplicata, e os
resultados foram obtidos em média. O título anti-célula completa de um soro
10
foi calculado como a diluição do soro dando uma absorbância de 0,1 sobre
uma curva de parâmetro 4.
A Tabela 4 ilustra os resultados do ELISA para os mutantes de
P4 não enzimaticamente ativos: P4-D184A, D185A e P4-D64A, D66A, que
continham mutações não conservadoras. Os dados de ELISA demonstraram
15 que estes sítios foram envolvidos na atividade enzimática e eram importantes
para a resposta imune. Os anticorpos produzidos contra estas proteínas
mutantes mostraram que as proteínas mutantes de P4 eliciaram títulos de
anticorpos significativamente menores contra rLP4 do tipo selvagem do que o
fizeram ou a P4 nativa ou rLP4 do tipo selvagem.
20 Tabela 4. Títulos de ELISA de GMT do Soro Direcionado Contra os
Mutantes de P4 Iniciais.
Imunógeno
Haemophilus P4
rLP4 tipo selvagem
rLP4-D184A, D185A
rLP4-D64A, D66A
Dose ,de
Proteína
(µg)
g)
5
5
5
5
Adjuvante
( min N
`" ----'
25
25
25
25
Título de ELISA vs. rLP4
,
Pré-imune (Dados
, AQ l o
pós-2°
l' -'
da combinação)
175.211 1.459.564
82
67.077
988.942
65
2.684
139.033
<50
261
46916
<50
..
A Tabela 5 relata os resultados do ensaio ELISA para as
proteínas mutantes de P4: (A35G, A37G), (A35T, A37T), (A35D, A37D) ou
(A35Q, A37Q). Como estabelecido acima, os genes transformados
25
codificando estas proteínas foram inseridos no vetor de expressão de
arabinose usado para rLP4 (pBAD18cam), expresso em BLR de E. coli,
•• • • • ••• • • •• •• • • • • •e • •
•
•• •à ••
•
•••
• • ••• ••• ••• • • •• •• • •• • • • •
•
•
••• •• • •• • • •• • • •• • •• ••
60
••••
••
•••
purificado e usado para imunizar camundongos. Os camundongos foram
imunizados com 5 Én de proteína P4 + MPL apropriada nas semanas O e 4. Os
animais foram sangrados na semana 6. Os dados na Tabela 5 são das
combinações de 5 camundongos na sangria da semana 6. Os títulos de
5 anticorpos de ELISA contra cada uma das proteínas P4 mutantes homólogas e
P4 do tipo selvagem foram determinados para cada anti-soro. Na tabela, ND
significa nenhum dado.
Cada uma das proteínas mutantes eliciou bons níveis de
anticorpos direcionados contra si próprias (a proteína homóloga). Nenhuma
10 das proteínas eliciou níveis comparáveis de anticorpos contra rLP4 do tipo
selvagem. Estes resultados não leva em conta a possibilidade de que as
proteínas mutantes de P4 não são bons imunógenos. Seus títulos contra a
proteína homóloga acham-se dentro da faixa normal esperada para uma P4
lipidada neste modelo.
15
Tabela 5. Resposta de ELISA a camundongos mutantes de rLP4 versus
proteínas mutantes de rLP4.
Título de ELISA de AntirLP4rLp4rLP4D64A,
A35N,
A35T,
D66A
A37N
A37T
113.618
6.877
9.582
ND
ND
ND
Testado
vs.
rLP4
rLP4
rLP4Dl 84A,
D185A
DLP4D64A,
D66A
rLr4A35N,
A37N
rLP4A35T,
A37T
rLP4A35Q,
A37Q
rLP4A35E,
A37E
300.956
3.838
rLP4Di84A,
D185A
172.866
45.909
135
ND
256
ND
7.190
ND
ND
25.758
ND
9.783
23.589
rLP4A35Q,
A37Q
11.432
ND
rLP4A35E,
A37E
20.955
ND
ND
ND
ND
208.373
ND
ND
ND
ND
ND
174.9341
ND I
ND
ND
ND
ND
ND
102.213
23.451
ND
ND
ND
ND
ND
425.840
61
•• • • • • •• ••• • IP S • qei S e •• •••
•
•••• • •• • ••
• •• • *3•• •• •••• ••
• ••••••WS
• ••••
•••
•
•
• •*• • • ••• ••• • • • •
•
••
•••
••
• •• •••
D. Ensaios bactericidas
O Ensaio de Anticorpos Bactericidas é uma medida
funcional para anticorpos contra NTHi e foi realizado como anteriormente
descrito por Green et al. 1991, citado acima. Resumidamente, a cepa de
5 NTHi P860295 foi cultivada em 37 °C durante a noite em caldo BHI-XV.
A cultura noturna foi diluída a uma densidade óptica de 30 Kletts em
caldo BHI-XV, medida em um fotômetro Klett-Sumerson em 660 nm. A
cultura foi incubada em 37 °C até a fase meio-log e diluída a 1:15.000 em
PCM (aproximadamente 1 a 2 x 10 5 cfu/ml). Os soros de camundongos
10 anti-P4 foram aquecidos a 55 °C por 30 minutos para remover a atividade
do complemento. Estes soros foram então diluídos em série em solução
salina tamponada com fosfato contendo CaC1 2 0,15 mM e MgC12 0,5 mM
(PCM).
O complemento humano fornecido pela Universidade de
15 Rochester foi adsorvido contra NTHi P860295 (Green, B. A. et al.,
1990 Infect. Immun., 58: 3272-3278). Em uma placa microtituladora de
96 reservatórios, 30 gl de PCM, 5 gl de antisoro de camundongo
diluído, 10 gl de NTHi diluído e 5 gl de complemento humano
adsorvido foram combinados e incubados em 37 °C por 30 minutos. As
20 reações foram interrompidas pela adição de 200 gl de PCM. Cinqüenta
gl de cada reservatório foram plaqueados sobre ágar de BHI-XV em
duplicada e incubados durante a noite em 37 °C. As colônias foram
contadas para se determinar os títulos bactericidas (a recíproca da mais
elevada diluição de anti-soro capaz de matar pelo menos 50% de
25
bactérias, em comparação com os controles do ensaio que não
continham anticorpos).
A Tabela 6 demonstra os títulos de BC dos anti-soros
produzidos contra P4-D184A, D185A e P4-D64A, D66A. Estes títulos
foram determinados e mostraram-se ser equivalentes àqueles eliciados por
•• ••
•••• • •••
•• • •• • ••••
e•
•
• •
•
•
•
• ••
•••
•
•
•••
•
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•
• • • •
•• •• ••
•• ••
••
••• •• • •• • • •• • • .. • ••
tó
•
62
•• ..• •
•
•
rLP4, dentro do erro do ensaio (Tabela 6 abaixo). Não houve nenhuma
correlação entre os títulos de BC e os títulos de ELISA para estes
mutantes.
Tabela 6. Atividade Bactericida dos Anti-soros Vs. Mutantes e P4 do Tipo
5
Selvagem
Soros a/
Sangria
Título de BC vs. NTHi
P860295
a/
anti-P4 nativo
Pós-2°
160
anti-rLP4 do tipo selvagem
Pós-2°
>320
Anti-rLP4-D184A, D 185A
Pós-2°
80
Anti-rLP4-D64A, D66A
Pós-2'
>32U
Fundo geral pré-imune
Pré-imune
<20
Anti-P860295 Núcleo Total
Pós-3°
>320
Fundo geral pré-imune
Pré-imune
<20
Fundo geral de soros de 10 camundongos.
A Tabela 7 relata os resultados de ensaios de BC quanto
aos soros de camundongos imunizados com as proteínas mutantes duplas:
(A35G, A37G), (A35T, A37T), (A35D, A37D) ou (A35Q, A37Q). Os
títulos de anticorpos bactericidas não se correlacionaram com os títulos de
10 ELISA contra P4 do tipo selvagem. Por exemplo, o mutante rLP4 A35N,
A37N não eliciou altos títulos de ELISA contra rLP4 do tipo selvagem,
mas eliciou bons títulos de anticorpos bactericidas contra NTHi. Assim,
nenhum destes mutantes foram considerados bons componentes
imunogênicos ou de vacina. De forma interessante, o soro anti-rLP4 não
15
reagiu muito fortemente contra a maioria dos mutantes, o que parece
indicar que o sítio enzimaticamente ativo também é imunodominante.
•••
••• lb • •• •••• •• • C •
••
• • • •• ••• •é• •• •• •• •••
••
•••• • ••
•
•
•
•••
•
63
ili
••
•
•• •• •
•• • • •• • • •• • • •• •
CG••
• ••• •
••
•• •••
e• •••
Tabela 7. Títulos de ELISA e de BC de Soros de Mutantes Anti-rLP4 e AntiP4.
ELISA vs. rLP4 tipo selvagem
Semana 6
Semana 4
Semana O
926.370
168.444
<50
Imunógeno
rLP4 F48C,
15vtg
rLP4,15Ng
rLP4 N218Q,
15).ig
rLP4 K161R,
15gg
rLP4-D184A,
D185A, 15gg
rLP4-D64A,
D66A 151.ig
rLP4-A35N,
A37N, 151.tg
rLP4-A35Q,
A37Q 15gg
rLP4-A35E,
A37E 15in
Soro de camundongo
pré-imune
rLP4, 151.1g
(controle positivo)
Título de BC vs. P860295
Ensaio 2
Ensaio 1
320
320
<50
<50
447.596
217.526
670.310
1.730.005
160
320
160
53
393.031
359.835
80
40
<50
81.847
83.045
40
20
<50
181.109
249.068
20
40
<50
16.903
14.597
320
80
<50
38.697
63.864
<20
80
<50
23.817
25.041
<20
40
ND
ND
ND
<20
<20
ND
ND
80
160
A Tabela 8 relata os resultados do ensaio de BC quanto às
proteínas lipidadas com as mutações simples: N218Q, K161R, D64E,
5 Y122F, D64N, D64E, F48C e Q39E, as quais foram purificadas das células
BLR de E. coli, e examinadas quanto à atividade enzimática. Quando as
proteínas foram usadas para imunizar camundongos, três mutantes
pareceram ter uma combinação de altos títulos de ELISA com altos títulos
de BC, sem nenhuma atividade enzimática detectável. Estas foram as
10 mutações F48C, N218Q e Q39E (Tabelas 7 e 8). Estas proteínas P4
mutantes tinham títulos de ELISA contra P4 do tipo selvagem equivalentes
à P4 do tipo selvagem, mas também tinham títulos bactericidas contra
NTHi.
64
••• • ••• •• •1J•• Cs 5.1 •
•
• •
•
• •
• •
11, •
ila•
•
• • •
•
•
•
•
•
••
•
•
•
•
•O
•••
••
• •• ••••
••••
••
• ••••• ••••• •••••Ilb •
•
•••
••
••
•• •••
Tabela 8. Títulos de ELISA e de BC de Proteínas P4 Mutantes
Título de IgG
Título de BC vs. P860295
rLP4-D64N
1.921.553-
20
rLP4-N218Q
1.475.833**
200
rLP4Y122F
1.106.822 *
40
rLP4D64E
988.016-
20
rLP4-039E
770.483-
320
rLP4-F48C
rLP4
687.742**
197.160**
240
160
rLP4-K161R
rLP4-D64A, D66A
rLP4-D184A, D185A
rLP4-A35Q, A37Q
186.394**
60
60.358**
33.185 *"'
30
14.331**
7.121**
4.322**
50
200
30
Mutante
rLP4-A35N, A37N
rLP4-A35E,A37E
* de soros reunidos de 10 camundongos
** GMT de soros individuais de 10 camundongos
30
EXEMPLO 6: MUTANTES DE TRUNCAÇÃO DE P4
Quatro proteínas variantes de P4 truncadas em vários pontos
no término C da seqüência do tipo selvagem foram construídas. Os
5 mutantes de truncação foram gerados por PCR do gene hel em pLP339.
Resumidamente, um iniciador homólogo à extremidade principal 5' do
gene hel e o sítio de ligação ribossômica foi sintetizado com um sítio Sphl
em sua extremidade 5'. Os iniciadores de 3' foram sintetizados, o que
mudou o resíduo após o ponto de truncação designado até um códon de
10 parada, mas foram homólogos ao gene hel nas extremidades 3' dos
iniciadores. A extremidade 5' do segundo iniciador também continha um
sítio Sacl. Os produtos da PCR foram clonados em pCR2.1-TOPO
(Invitrogen) e digeridos com Sphl-Sacl. Os fragmentos do gene hel foram
purificados e ligados em pBAD18Cam digerido com as mesmas enzimas.
15 Os clones positivos foram identificados e testados quanto à expressão.
Todas as construções expressaram proteínas P4 truncadas que foram
lipidadas em BLR de E. coli.
Especificamente, as proteínas variantes de P4 truncadas no
65
••• •••
••
• ••• •••• III •• ••• ••• • ••• • • •••
• • • • • •• ••••• •• •
• ••
••
• ••• •• ••• *****
• • •• • ••• •
• III• •• ••
•
••• ••
05
III
••
•
•
•••
resíduo 200 (isto é, contém os aminoácidos de 1 a 200 da SEQ ID NO: 3),
210, 221 e 232 foram geradas. Cada fragmento foi ensaiado quanto à
atividade de fosfatase usando-se o protocolo apresentado no Exemplo 4.
Todos os quatro fragmentos não tiveram nenhuma enzima detectável.
5 A seguir, os camundongos Swiss Webster foram imunizados
seguindo-se o protocolo do Exemplo 5A, exceto que 5 gg de proteína P4
truncada misturados com 25 p.g de MPL ® foram administrados. A Tabela 9
ilustra os resultados de um ELISA para os quatro fragmentos de P4 truncados
em comparação com rLP4 do tipo selvagem, onde o protocolo do Exemplo 5
10 foi seguido. O símbolo "rLP4-232" indica que a P4 recombinante foi truncada
no aminoácido 232 da SEQ ID NO: 3, e assim por diante. Os dados do ELISA
demonstraram que todos os quatros mutantes de truncação eliciaram níveis de
titulação úteis.
Tabela 9. Títulos de ELISA Anti-rP4 de Mutantes de Truncação de P4 em
15 Camundongos Swiss Webster
Imunógeno
Semana 0
Semana 4
Semana 6
rLP4/MPL®
53
155.797
1.477.755
RLP4-232/MPL®
<50
31.611
664.876
RLP4-221/MPL®
53
31 032
506 025
RLP4-200/MPL®
<50
66.125
888.795
RLP4-200/MPL®
62
11.936
631.073
A seguir, dois ensaios bactericidas foram conduzidos
seguindo-se o protocolo do Exemplo 5D. No primeiro ensaio, a proteína P4
truncada no aminoácido 210 foi comparada com a rLP4 do tipo selvagem e
várias variantes de P4 descritas acima, quando cada formulação incluía 15 gg
20 de proteína P4 misturada cor, 100 p.g de MPL ®, exceto quanto ao último
grupo, em que apenas 5 p.g de proteína rLP4 de um estudo anterior foram
incluídos como um controle positivo. Os dados do ensaio bactericida na
Tabela 10 indicaram que a proteína P4 truncada no aminoácido 210 eliciou
títulos de anticorpos bactericidas que foram estatisticamente significativos do
25
fundo. Nesta experiência, os títulos de BC50 de 80 ou mais foram
•••
• •
.•• • •
.
66
•
•••
..
•• • •• •• •• ••
•••• •••••• •••••• •• •• •••• ••••
•• • • • • ••
••
•
•
•
•
•
•
••
•
••• •• •• •• •• • •, •• •••
considerados como sendo significativamente diferentes do fundo (<20). O
Complemento usado foi UR8-96 humano adsorvido.
Tabela 10. Atividade Bactericida de Anti-soros vs. Mutantes, Truncação e P4
do Tino Selvagem
Soros de camundongo
Descrição
AG581 Semana 6
P860295
Ensaio 1
Ensaio 2
rLP4 F48-C
320
320
AG582 Semana 6
rLP4
160
160
AG583 Semana 6
rLP4 N218Q
320
80
AG584 Semana 6
rLP4 K161R
80
40
AG585 Semana 6
rLP4 D184A, D185A
40
20
AG586 Semana 6
rLP4 D64A, D66A
20
40
AG587 Semana 6
rLP4 A35N, A37N
320
80
AG588 Semana 6
rLP4-210
80
80
AG589 Semana 6
rLP4A35Q,A37Q
<20
80
AG590 Semana 6
rLP4 A35E, A37E
<20
40
Reunião da Semana O
Soro de camundongo pré-imune
<20
<20
(controle negativo)
AC443 Semana 6
rLP4
160
(controle positivo)
5
No segundo ensaio, as proteínas P4 truncadas nos
aminoácidos 200, 210, 221 e 232 foram comparadas com rLP4 do tipo
selvagem e várias variantes de P4 descritas acima, em que cada formulação
incluiu 5 !..tg de proteína P4 misturada com 25 gg de MPL ® (uma
quantidade sub-ótima), exceto quanto ao último grupo, em que 5 vtg de
10 proteína rLP4 mais 100 tg de MPL ® de um estudo anterior, foram
incluídos como um controle positivo. Os dados do ensaio bactericida na
Tabela 11 indicaram que a proteína P4 truncada nos aminoácidos 221 e 232
eliciou títulos de anticorpos bactericidas que foram estatisticamente
significativos do fundo, mesmo com a dose baixa de MPL ® . Nesta
15 experiência, os títulos de BC 50 de 80 ou mais foram considerados como
sendo significativamente diferentes do que aqueles da semana 0. O
Complemento usado foi UR8-97 humano adsorvido.
67
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o
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Tabela 11. Atividade Bactericida de Anti-soros vs. Mutantes, Truncações e P4
do Tipo Selvagem.
Soro de camundongo
AF208 Semana 6
AF209 Semana 6
AF21 O Semana 6
AF211 Semana 6
AF212 Semana 6
AF213 Semana 6
AF214 Semana 6
AF215 Semana 6
AF216 Semana 6
AF217 Semana 6
AF218 Semana 6
AF219 Semana 6
Reunião da Semana O
AC443 Semana 6
Descrição
rLP4
rLP4 D184A, D185A
rLP4 D64A, D66A
rLP4 A35N, A37N
rLP4 A35T, A37T
rLP4 A35Q, A37Q
rLP4 A35E, A37E
rLP4
rLP4-232
rLP4-221
rLP4-210
rLP4-200
Soro de camundongo pré-imune
(controle negativo)
rPL4
(controle positivo)
P860295
<20
80
<20
<20
20
40
40
<20
80
80
40
<20
<20
160
Em resumo, os resultados das mutações de P4 propostas
indicam que a separação do título de ELISA da atividade bactericida pode
5
significar que os sítios necessários para a atividade bactericida são distintos
das áreas essenciais para a atividade enzimática.
Todas as publicações citadas neste relatório descritivo ficam
aqui incorporadas como referência. Embora a invenção tenha sido descrita
com referência a uma forma de realização particularmente preferida,
10 observar-se-á que modificações podem ser feitas sem que se afaste do espírito
da invenção. Essas modificações intentam situar-se dentro do escopo das
reivindicações anexas.
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REIVINDICAÇÕES
1. Proteína variante de P4 de Haemophilus influenzae não
tipificável (NTHi), caracterizada pelo fato de que tem atividade enzimática
reduzida em comparação com a proteína P4 do tipo selvagem e que induz
5 anticorpo à proteína P4 do tipo selvagem e/ou que tem atividade bactericida
contra NTHi, em que a proteína variante de P4 tem uma mutação selecionada
do grupo consistindo de:
(a) uma mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO:
3, que é uma glutamina na proteína P4 do tipo selvagem;
10
(b) uma mutação no resíduo de aminoácido 48 da SEQ ID NO:
3, que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem;
(c) uma mutação no resíduo de aminoácido 64 da SEQ ID NO:
3, que é um ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem;
(d) uma mutação no resíduo de aminoácido 161 da SEQ ID
15
NO: 3, que é uma lisina na proteína P4 do tipo selvagem;
(e) uma mutação no resíduo de aminoácido 218 da SEQ ID
NO: 3, que é uma asparagina na proteína P4 do tipo selvagem;
(O mutações nos resíduos de aminoácido 35 e 37 da SEQ ID
NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem, em que as mutações
20
não sejam ácido glutâmico, glutamina ou treonina;
(g) mutações nos resíduos de aminoácido 64 e 66 da SEQ ID
NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
2. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 1,
25
caracterizada pelo fato de que tem uma mutação selecionada do grupo
consistindo de:
(a) um ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina no
resíduo 39 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(b) uma cisteína, serina ou outros aminoácidos que tenham
2
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grupos polares não carregados no resíduo 48 de aminoácido de SEQ ID NO:
3;
(c) uma asparagina, ácido glutâmico ou alanina no resíduo 64
de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(d) uma arginina no resíduo 161 de aminoácido de SEQ ID
5
NO: 3;
(e) uma glutamina, ácido aspártico ou ácido glutâmico no
resíduo 218 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(O uma asparagina nos resíduos 35 e 37 de aminoácido de
10 SEQ ID NO: 3;
(g) uma alanina, asparagina ou ácido glutâmico nos resíduos
64 e 66 de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
3. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 2,
15
caracterizada pelo fato de que é lipidada.
4. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 3,
caracterizada pelo fato de que ainda compreende um peptídeo de sinal
fundido ao término N da referida proteína variante de P4.
5. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 4,
20
caracterizada pelo fato de que o referido peptídeo de sinal consiste dos
aminoácidos de 1 a 20 de SEQ ID NO: 2.
6. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 2,
caracterizada pelo fato de que é não lipidada.
7. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 2,
25
caracterizada pelo fato de que é fundida em matriz com uma proteína
carreadora.
8. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 7,
caracterizada pelo fato de que referida proteína carreadora é selecionada do
grupo consistindo de uma proteína DnaK de E. coli, uma proteína GST, uma
3
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proteína 70 de choque térmico micobacteriana, um toxóide da difteria, um
toxóide do tétano, uma galactocinase, uma ubiquitina, um fator de pareamento
a, uma f3-galactosidase, e uma proteína NS-1 da influenza.
9. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
5
compreende a proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 1, e um
carreador farmaceuticamente aceitável.
10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
9, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.
11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
10
9, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um antígeno adicional de
H. influenzae ou um microorganismo outro que não H. influenzae.
12. composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
compreende a proteína variante de P4 como definida na reivindicação 2, e um
carreador farmaceuticamente aceitável.
15
13. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
12, caracterizada pelo fato de ainda compreender um adjuvante.
14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
12, caracterizada pelo fato de ainda compreender um antígeno adicional de H.
influenzae ou um outro microorganismo que não H. influenzae.
20
15. Proteína variante de P4 de Haemophilus influenzae não
tipificável (NTHi), caracterizada pelo fato de que tem atividade enzimática
reduzida em comparação com a proteína P4 do tipo selvagem e que induz
anticorpo à proteína P4 do tipo selvagem e/ou que possui atividade
bactericida contra NTHi, em que a proteína variante de P4 é um fragmento
25
tendo uma truncação na região de terminal carbóxi da proteína P4 do tipo
selvagem.
16. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 15,
caracterizada pelo fato de que é truncada de modo a conter os aminoácidos de
1 a 200, 1 a 210, 1 a 221 ou 1 a 232 da SEQ ID NO: 3.
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17. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 16,
caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma ou mais mutações
selecionadas do grupo consistindo de:
(a) uma mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO:
5
3, que é uma glutamina na proteína P4 do tipo selvagem;
(b) uma mutação no resíduo de aminoácido 48 da SEQ ID NO:
3, que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem;
(c) uma mutação no resíduo de aminoácido 64 da SEQ ID NO:
3, que é um ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem;
(d) uma mutação no resíduo de aminoácido 161 da SEQ ID
10
NO: 3, que é uma lisina na proteína P4 do tipo selvagem;
(e) uma mutação no resíduo de aminoácido 218 da SEQ ID
NO: 3, que é uma asparagina na proteína P4 do tipo selvagem;
(f) mutações nos resíduos de aminoácido 35 e 37 da SEQ ID
15
NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem, em que as mutações
não sejam ácido glutâmico, glutamina ou treonina;
(g) mutações nos resíduos de aminoácido 64 e 66 da SEQ ID
NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
20 18. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 16,
caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma ou mais mutações
selecionadas do grupo consistindo de:
(a) um ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina no
resíduo 39 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(b) uma cisteína, serina ou outros aminoácidos que tenham
25
grupos polares não carregados no resíduo 48 de aminoácido de SEQ ID NO:
3;
(c) uma asparagina, ácido glutâmico ou alanina no resíduo 64
de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
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(d) uma arginina no resíduo 161 de aminoácido de SEQ ID
NO: 3;
(e) uma glutamina, ácido aspártico ou ácido glutâmico no
resíduo 218 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(f) uma asparagina nos resíduos 35 e 37 de aminoácido de
5
SEQ ID NO: 3;
(g) uma alanina, asparagina ou ácido glutâmico nos resíduos
64 e 66 de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
10 19. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
compreende a proteína variante de P4 como definida na reivindicação 15, e
um carreador farmaceuticamente aceitável.
20. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
19, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.
15 21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
19, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um antígeno adicional de
H. influenzae ou um microorganismo que não H. influenzae.
22. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
compreende a proteína variante de P4 como definida na reivindicação 16, e
20
um carreador farmaceuticamente aceitável.
23. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
22, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.
24. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
22, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um antígeno adicional de
H. influenzae ou um microorganismo que não H. influenzae.
25. Molécula de nucleotídeo isolada, caracterizada pelo fato de
que compreende uma seqüência de ácido nucleico que é pelo menos 70%
homóloga a uma seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína
variante de P4 de NTHi que tem atividade enzimática reduzida em
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comparação com a proteína P4 do tipo selvagem e que induz anticorpo à
proteína P4 do tipo selvagem e/ou que tem atividade bactericida contra NTHi,
em que a proteína variante de P4 tem uma mutação selecionada do grupo
consistindo de:
5
(a) uma mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO:
3, que é uma glutamina na proteína P4 do tipo selvagem;
(b) uma mutação no resíduo de aminoácido 48 da SEQ ID NO:
3, que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem;
(c) uma mutação no resíduo de aminoácido 64 da SEQ ID NO:
10
3, que é um ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem;
(d) uma mutação no resíduo de aminoácido 161 da SEQ ID
NO: 3, que é uma lisina na proteína P4 do tipo selvagem;
(e) uma mutação no resíduo de aminoácido 218 da SEQ ID
NO: 3, que é uma asparagina na proteína P4 do tipo selvagem;
15
(f) mutações nos resíduos de aminoácido 35 e 37 da SEQ ID
NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem, em que as mutações
não sejam ácido glutâmico, glutamina ou treonina;
(g) mutações nos resíduos de aminoácido 64 e 66 da SEQ ID
NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem; e
20
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
em que a seqüência de ácido nucleico codifica pelo menos
uma das mutações de (a) a (g).
26. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
25
é pelo menos 80% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando uma
proteína variante de P4 de NTHi.
27. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
é pelo menos 90% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando uma
7
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proteína variante de P4 de NTHi.
28. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a referida seqüência de ácido
nucleico está sob o controle de seqüências reguladoras que dirigem a
5
expressão da variante de P4 em uma célula hospedeira.
29. Molécula de nucleotídeo isolada, caracterizada pelo fato de
que compreende uma seqüência de ácido nucleico que é pelo menos 70%
homóloga a uma seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína
variante de P4 de NTHi que tem atividade enzimática reduzida em
10 comparação com a proteína P4 do tipo selvagem e que induz anticorpo à
proteína P4 do tipo selvagem e/ou que tem atividade bactericida contra NTHi,
em que a proteína variante de P4 tem uma mutação selecionada do grupo
consistindo de:
(a) um ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina no
15
resíduo 39 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(b) uma cisteína, serina ou outros aminoácidos que tenham
grupos polares não carregados no resíduo 48 de aminoácido de SEQ ID NO:
3;
(c) uma asparagina, ácido glutâmico ou alanina no resíduo 64
20 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(d) uma arginina no resíduo 161 de aminoácido de SEQ ID
NO: 3;
(e) uma glutamina, ácido aspártico ou ácido glutâmico no
resíduo 218 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(f) uma asparagina nos resíduos 35 e 37 de aminoácido de
25
SEQ ID NO: 3;
(g) uma alanina, asparagina ou ácido glutâmico nos resíduos
64 e 66 de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g),
.
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em que a seqüência de ácido nucleico codifica pelo menos
uma das mutações de (a) a (g).
30. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
5
é pelo menos 80% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando uma
proteína variante de P4 de NTHi.
31. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
é pelo menos 90% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando uma
10
proteína variante de P4 de NTHi.
32. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a referida seqüência de ácido
nucleico está sob o controle de seqüências reguladoras que dirigem a
expressão da variante de P4 em uma célula hospedeira.
15
33. Molécula de nucleotídeo isolada, caracterizada pelo fato de
que compreende uma seqüência de ácido nucleico que é pelo menos 70%
homóloga a uma seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína
variante de P4 de NTHi que tem atividade enzimática reduzida em
comparação com a proteína P4 do tipo selvagem e que induz anticorpo à
20 proteína P4 do tipo selvagem e/ou que tem atividade bactericida contra NTHi,
em que a proteína variante de P4 é um fragmento tendo uma truncação na
região de terminal carbóxi da proteína P4 do tipo selvagem.
34. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
25
é pelo menos 70% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando o
fragmento da proteína P4 truncada de NTHi.
35. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
é pelo menos 80% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando o
•
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9
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fragmento da proteína P4 truncada de NTHi.
36. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico
é pelo menos 90% homóloga à seqüência de ácido nucleico codificando o
5
fragmento da proteína P4 truncada de NTHi.
37. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico
ainda codifica um fragmento de proteína P4 truncada tendo uma mutação
selecionada do grupo consistindo de:
10
(a) uma mutação no resíduo de aminoácido 39 da SEQ ID NO:
3, que é uma glutamina na proteína P4 do tipo selvagem;
(b) uma mutação no resíduo de aminoácido 48 da SEQ ID NO:
3, que é uma fenilalanina na proteína P4 do tipo selvagem;
(c) uma mutação no resíduo de aminoácido 64 da SEQ ID NO:
15
3, que é um ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem;
(d) uma mutação no resíduo de aminoácido 161 da SEQ ID
NO: 3, que é uma lisina na proteína P4 do tipo selvagem;
(e) uma mutação no resíduo de aminoácido 218 da SEQ ID
NO: 3, que é uma asparagina na proteína P4 do tipo selvagem;
20
(f) mutações nos resíduos de aminoácido 35 e 37 da SEQ ID
NO: 3, que são alanina na proteína P4 do tipo selvagem, em que as mutações
não sejam ácido glutâmico, glutamina ou treonina;
(g) mutações nos resíduos de aminoácido 64 e 66 da SEQ ID
NO: 3, que são ácido aspártico na proteína P4 do tipo selvagem; e
25
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g).
em que a seqüência de ácido nucleico codifica pelo menos
uma das mutações de (a) a (g).
38. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico
•••
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•
ainda codifica um fragmento de proteína P4 truncada tendo uma mutação
selecionada do grupo consistindo de:
(a) um ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina no
resíduo 39 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(b) uma cisteína, serina ou outros aminoácidos que tenham
5
grupos polares não carregados no resíduo 48 de aminoácido de SEQ ID NO:
3;
(c) uma asparagina, ácido glutâmico ou alanina no resíduo 64
de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(d) uma arginina no resíduo 161 de aminoácido de SEQ ID
10
NO: 3;
(e) uma glutamina, ácido aspártico ou ácido glutâmico no
resíduo 218 de aminoácido de SEQ ID NO: 3;
(f) uma asparagina nos resíduos 35 e 37 de aminoácido de
15 SEQ ID NO: 3;
(g) uma alanina, asparagina ou ácido glutâmico nos resíduos
64 e 66 de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e
(h) combinações de uma ou mais das mutações de (a) a (g),
em que a seqüência de ácido nucleico codifica pelo menos
20
uma das mutações de (a) a (g).
39. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que referida molécula é um vetor
plasmídico.
40. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é
25
transformada, transfectada ou transduzida com o vetor plasmídico como
definido na reivindicação 39.
41. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que é um vetor plasmídico.
42. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é
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1141.
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transformada, transfectada ou transduzida com o vetor plasmídico como
definido na reivindicação 41.
43. Molécula de nucleotídeo isolada de acordo com a
reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que é um vetor plasmídico.
5 44. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é
transformada, transfectada ou transduzida com o vetor plasmídico como
definido na reivindicação 43.
45. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
compreende uma molécula de nucleotídeo como definida na reivindicação 25,
10
e um carreador farmaceuticamente aceitável.
46. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
compreende uma molécula de nucleotídeo como definida na reivindicação 29,
e um carreador farmaceuticamente aceitável.
47. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que
15
compreende uma molécula de nucleotídeo como definida na reivindicação 33,
e um carreador farmaceuticamente aceitável.
48. Método para induzir uma resposta imune em um ser
humano contra H. influenzae não tipificável, caracterizado pelo fato de que
compreende as etapas de:
20
administrar ao referido ser humano uma quantidade eficaz da
composição imunogênica como definido na reivindicação 9.
49. Método para induzir uma resposta imune em um ser
humano contra H. influenzae não tipificável, caracterizado pelo fato de que
compreende as etapas de:
25
administrar ao referido ser humano uma quantidade eficaz da
composição imunogênica como definida na reivindicação 19.
50. Método para induzir uma resposta imune em um ser
humano contra H. influenzae não tipificável, caracterizado pelo fato de que
compreende as etapas de:
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administrar ao referido ser humano uma quantidade eficaz da
composição imunogênica como definida na reivindicação 45.
51. Método para induzir uma resposta imune em um ser
humano contra H. influenzae não tipificável, caracterizado pelo fato de que
5
compreende as etapas de:
administrar ao referido ser humano uma quantidade eficaz da
composição imunogênica como definida na reivindicação 46.
52. Método para induzir uma resposta imune em um ser
humano contra H. influenzae não tipificável, caracterizado pelo fato de que
10
compreende as etapas de:
administrar ao referido ser humano uma quantidade eficaz da
composição imunogênica como definida na reivindicação 47.
53. Método para produzir uma proteína variante de P4,
caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como
15
definida na reivindicação 40, sob condições adequadas para produzir a
proteína variante de P4 e recuperar a proteína variante de P4 da cultura.
54. Método para produzir uma proteína variante de P4,
caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como
definida na reivindicação 42, sob condições adequadas para produzir a
20
proteína variante de P4 e recuperar a proteína variante de P4 da cultura.
55. Método para produzir uma proteína variante de P4,
caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como
definida na reivindicação 44, sob condições adequadas para produzir a
proteína variante de P4 e recuperar a proteína variante de P4 da cultura.
25 56. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 1,
caracterizada pelo fato de que serve como uma proteína carreadora para outro
antígeno.
57. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 56,
caracterizada pelo fato de que é quimicamente conjugada a um polissacarídeo,
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oligossacarídeo, sacarídeo, lipopolissacarídeo, lipooligossacarídeo ou
lipossacarídeo.
58. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 56,
caracterizada pelo fato de que é fundida a uma proteína, polipeptídeo ou
5
peptídeo.
59. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 15,
caracterizada pelo fato de que serve como uma proteína carreadora para outro
antígeno.
60. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 59,
10
caracterizada pelo fato de que é quimicamente conjugada a um polissacarídeo,
oligossacarídeo, sacarídeo, lipopolissacarídeo, lipooligossacarídeo ou
lipossacarídeo.
61. Proteína variante de P4 de acordo com a reivindicação 59,
caracterizada pelo fato de que é fundida a uma proteína, polipeptídeo ou
15
peptídeo.
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RESUMO
"PROTEÍNA VARIANTE DE P4 DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE NÃO
TIPIFICÁVEL, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MOLÉCULA DE
NUCLEOTÍDEO ISOLADA, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODOS
5 PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM SER HUMANO
CONTRA H. INFLUENZAE NÃO TIPIFICÁVEL, E PARA PRODUZIR
UMA PROTEÍNA VARIANTE DE P4"
Uma proteína variante P4 que tem atividade enzimática
reduzida e que induz anticorpo à proteína P4 do tipo selvagem e/ou tem boa
10 atividade bacteriana contra H. influenzae não tipificável, é útil como um
componente ativo em uma composição imunogênica para seres humanos. Os
métodos de uso destas proteínas, e as composições contendo-as em
combinação com antígenos adicionais, também são fornecidas.