Preparação e caracterização de microesferas de copolímeros de

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS
DE COPOLÍMERO DE ÁCIDO LÁTICO E GLICÓLICO (PLGA)
CONTENDO SULFATO DE QUININA
LÚCIO FIGUEIRA PIMENTEL
Recife, 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS
DE COPOLÍMERO DE ÁCIDO LÁTICO E GLICÓLICO (PLGA)
CONTENDO SULFATO DE QUININA
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento
de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Federal de Pernambuco, como pré requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, na área de concentração em Controle e
Produção de Medicamentos.
Mestrando: Lúcio Figueira Pimentel
Orientadora: Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães - UFPE
Co-Orientadora: Profª. Drª. Vanessa Carla Furtado Mosqueira -UFOP
Recife, 2004
Dedico este trabalho
À minha mãe, Yêdda Figueira e meu
paidrastro Demóstenes Travessa, pelo exemplo
de vida, luta e vitórias conquistadas, pela
participação definitiva no meu caráter e
personalidade.
i
AGRADECIMENTOS
A Deus pela luz com a qual ilumina os caminhos que sigo em minha vida.
A minha orientadora Prof. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães, pela oportunidade, confiança,
orientações durante a realização deste trabalho, além da possibilidade de participação e
colaboração com o Grupo de Sistemas de Liberação Controlada e Vacinas (SLC).
A minha Co-orientadora Prof. Drª. Vanessa Carla Furtado Mosqueira, pelo valioso esforço na
orientação, pelo carinho e apoio na realização dos experimentos in vivo, durante o
desenvolvimento desta dissertação.
Aos professores do Programa de Pós-Graduacão em Ciências Farmacêuticas da UFPE, pela
possilidade de compartilhar seus conhecimentos e experiências durante a realização do Mestrado.
Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, e ao
Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior, responsável pelo setor de Bioquímica, onde foi
realizada a maior parte deste trabalho, pela oportunidade de participar de uma instituição que
contribui ativamente para o desenvolviento científico e tecnológico do nosso País.
Aos funcionários do LIKA, em especial, Moises, Otaviano da Costa, Oscar, Ilma e Conceição pela
contribuição no suporte técnico, necessário na realizaçãos das pesquisas.
Ao Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto pela obtenção de amostra inicial de sulfato de quinina, para a
realização dos estudos preliminares relacionados a este trabalho.
Ao Prof. Samuel do laboratório de Hematologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas pela
contribuição na realização de microfotografias.
A minha mãe Yedda Figueira e ao meu paidrastro Desmóstenes Travessa, pelos ensinamentos
ministrados ao longo da vida, pelo suporte e apoio dispensados, necessários para a concretização
de mais uma etapa de minha carreira profissional.
ii
Aos meus irmãos Fábio e Patrícia e família, pelas horas de ausência e saudade dos momentos
sinceros de amizade e fraternidade bem vividos, imprescidíveis para a realização desta caminhada.
Aos meus amigos próximos e distantes, com os quais conto nos momentos de alegrias e tristezas,
para apoio, diversão e companheirismo, em especial a Juliana Lima Meira, pelo carinho, respeito,
compreensão e companheirismo.
Aos meus amigos do SLC, pela amizade e colaboração mútuas no desenvolvimento de nossas
atividades, o carinho e respeito individual por cada um dos componentes, em especial a Agenor
Tavares Jácome Junior, pela ajuda essencial na realização desta dissertação.
Aos meus amigos do Setor de Bioquímica e aos demais colegas dos outros laboratórios do LIKA,
em especial, Luciana Duarte, Givanildo Oliveira, Luciana da Mata, Ian Porto, Danielly Brunesca,
Diego Albuquerque, pelo incentivo, divisão de espaço, material, apoio e a possibilidade de criação
de um ambiente de trabalho propício para o desenvolvimento de nossas capacidades e realizações.
Á Roseane Maria Ribeiro Costa e Jaqueline Rodrigues da Silva, pelas orientações recebidas no
início de minhas atividades junto ao SLC, pela amizade sincera e pelo carinho recebido.
Aos colegas do Mestrado, em especial Ivana Barroso, Lívia Barreto, Daniela Lordão, Janaína
Versiani, Francisco Mendonça Junior (Chico), Severinho Granjeiro (Ceará), Valderes Almeida,
Tereza Raquel Fernandes, Líbia Bentes, Ana Amélia Lira, Risonildo Cordeiro, Pedranne Barbosa,
Lisandra Gomes pela amizade, apoio, incentivo e ajuda e no esclarecimento das dúvidas inerentes
as dúvidas surgidas durante o desenvolvimento de nossas atividades.
Á Cristina Barros, Elaine Leite e Luciano Pinto, pelo valioso apoio na realização dos testes de
atividade antimalária e minha estada na cidade de Ouro Preto.
A todos que direta e indiretamente contribuiriam para a realização desta dissertação de Mestrado,
meu sincero agradecimento.
iii
SUMÁRIO
Agradecimentos
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas
Lista de Siglas
Resumo
Abstract
1.
INTRODUÇÃO .................................................................................................
1
2.
REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................
4
MALÁRIA .....................................................................................................
5
2.1.1.
Epidemiologia ...........................................................................................
6
2.1.2.
Indústria Farmacêutica e Malária .............................................................
8
2.1.3.
Agentes Terapêuticos da Malária .............................................................
9
QUININA .......................................................................................................
11
2.2.1.
Farmacocinética da Quinina .....................................................................
11
2.2.2.
Aplicações Terapêuticas ...........................................................................
12
2.2.3.
Mecanismo de Ação .................................................................................
13
2.2.4.
Toxicologia da Quinina ............................................................................
14
SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS (SLC) ..
14
2.3.1.
Mecanismos de Liberação do Fármaco de SLC .......................................
17
2.3.2.
Biomateria is para Sistemas de Liberação Controlada ..............................
18
2.1.
2.2.
2.3.
iv
2.3.3.
Poli(lático-co-glicólico) – PLGA .............................................................
19
MICROPARTÍCULAS ..................................................................................
21
2.4.1.
Aplicações Terapêuticas ...........................................................................
21
2.4.2.
Indústria Farmacêutica e SLC ..................................................................
21
MICROENCAPSULAÇÃO ...........................................................................
23
2.5.1
Métodos de Preparação de Microesferas ..................................................
23
2.5.1.1.
Métodos de Separação de Fases de Polímeros .........................................
24
2.5.1.2.
Métodos de Spray-Drying .........................................................................
24
2.5.1.3.
Métodos Utilizando Supercrítico ..................................................
25
2.5.1.4.
Jateamento Sob Pressão ...........................................................................
25
2.5.1.5.
Métodos de Trituração ..............................................................................
25
2.5.1.6.
Sistema de Recirculação Total (TROMS) ................................................
25
2.5.1.7.
Métodos de Evaporação e Extração de Solvente ......................................
26
2.5.1.8.
Emulsão Água em Óleo em Água (Emulsão Múltipla) ............................
27
OBJETIVOS ......................................................................................................
28
3.1.
Geral ...............................................................................................................
29
3.2.
Específicos ......................................................................................................
29
4.
ARTIGO I ..........................................................................................................
30
5.
CONCLUSÕES ..................................................................................................
58
6.
PERSPECTIVAS ...............................................................................................
60
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
62
2.4.
2.5.
3.
v
ANEXO I
Resumos enviados para Congressos
ANEXO II
Artigos Escritos
vi
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DA LITERATURA
Figura 1.
Ciclo evolutivo de Plasmodium spp. (Miller et al., 2002)
Figura 2. Número de casos de Malária e óbitos de todas as formas registradas no Brasil
6
7
nos anos de 1990 – 2001 (FUNASA, 2003).
Figura 3.
a) Estrutura molecular da Quinina. b) Microfotorafia de Cristais de Sulfato de
11
quinina (aumento 40 ×).
Figura 4. Perfil farmacocinético de doses múltiplas ou em sistema de liberação controlada
15
de fármacos (Brannon-Peppas, 1997).
Figura 5.
Estrutura molecular dos ácidos polilático e poliglicólico.
20
Photomicrographs of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres prepared
47
ARTIGO I
Fig. 1.
using multiple emulsion tequinique followed by solvent evaporation method,
with 25 mg quinine sulphate and 450 mg PLGA. a) SEM of microsphere (3500
×); b) SEM of microsphere surface (11000 ×); c) SEM of microsphere prepared
with 50 mg quinine sulphate and 450 PLGA (15500 ×), showed some crystals in
the surface of microsphere.
Fig. 2.
In vitro relese profile of quinine sulphate from PLGA microspheres. Error bars
48
represent mean ± standard deviation for n=3.
Fig. 3.
Antimalarial activity of free and microencapsulated quinine sulphate against
Plasmodium berghei-infected mice in a four-day-test. Mice were treated with 20
mg/kg/day-1 of quinine sulphate for four days with microspheres loaded with
49
vii
quinine sulphate (MS-QS) and quinine sulphate (QS) formulations. Untreated
control received saline and unloaded microspheres (MS). Each point represents
the mean ± standard deviation for ten mice.
Fig. 4.
Body weight (g) of mice infected P. berghei in four-day suppresive test, treated
with quinine sulphate microspheres PLGA by subcutaneous injection of 20
mg/kg/day-1 of quinine sulphate. Each point represents the mean ± S.D. for ten
mice.
50
viii
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DA LITERATURA
Tabela 1. Principais fármacos antimaláricos (James, 2002)
10
Tabela 2.
16
Principais Sistemas nanobiotecnológicos utilizados para o carreamento de
fármacos.
Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Microesferas.
22
ARTIGO I
Table 1
Formulation of quinine sulfate- loaded PLGA microspheres.
42
Table 2
Evaluation of the influence of the aqueous phase pH on the quinine sulphate
43
entrapment efficiency in PLGA microspheres.
Table 3
Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg
44
of polymer)
Table 4
Encapsulation efficienc y of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg
45
of polymer)
Table 5
RBC and MST of Swiss mice infected with P. berghei treated with PLGA
microspheres loaded with quinine sulphate.
51
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA
Bovine Serum Albumine (albumina sérica bovina)
CDR
Controlled Drug Release System (sistema de liberação controlada de fármacos)
CEC
Capillar Eletrochromatography (eletrocromatografia capilar)
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
EC
Eletroforese Capilar
HPLC
High Perfomance Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência)
HSA
Human Serum Albumine (albumina sérica humana)
MS
Microsphere (microesfera)
MST
Mean Survive Time (tempo de sobrevida médio)
Mw
Mass Weight (peso molecular)
PBS
Phosphate buffer saline (tampão fosfato salino)
PEG
Polyethylene Glycol (polietilenoglicol)
PGA
Ácido Poli- glicólico
PLA
Ácido Poli- lático
PLGA
Copolímero de ácido lático e glicólico
PVA
Poly vinyl alcohol (álcool polivinílico)
QS
Quinine sulphate (sulfato de quinina)
QS-MS
Quinine sulphate Microspheres (microesferas de sulfato de quinina)
RBC
Red Blood Cell (células vermelhas do sangue)
SD
Stardard Deviation (desvio padrão)
SEM
Scanning Electron Microscopy (microscopia eletrônica de varredura)
SFC
Supercritical Fluid Chromatography (Cromatografia de flúido supercrítico)
SLC
Sistema de Liberação Controlada
x
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
Siglas
FDA
Food and Drug Administration (Agência de Controle de Alimentos e Medicamentos
dos Estados Unidos)
FUNASA
Fundação Nacional de Saúde
GFATM
Global Fund to Figth AIDS, Tuberculose and Malaria (Fundo Global de combate a
AIDS, Tuberculose e Malária)
LIKA
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
MIM
Multilateral Initiative on Malaria (Iniciativas Multilaterais em Malária)
MMV
Medicines for Malaria Venture (Medicamentos para Malária)
RBM
“Roll Back Malaria” (Regressão da malária)
xi
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de novas formulações microencapsuladas
de sulfato de quinina, para utilização na terapia antimalárica. A caracterização físico-química destas
micropartículas, a avaliação da cinética de liberação in vitro, um estudo preliminar de estabilidade e
a avaliação da atividade antimalárica in vivo foram realizados. Microesferas de copolímero de ácido
lático e glicólico associada ao antimalárico sulfato de quinina (QS-MS) foram obtidas pelo método
de emulsão múltipla, seguido de evaporação do solvente. A morfologia das microesferas foi
avaliada por microscopia óptica e eletrônica de varredura. A formulação otimizada foi utilizada para
a determinação do perfil cinético de liberação pela técnica de dissolução das microesferas em um
meio tampão fosfato 7,4. Doseamentos por CLAE foram realizados para determinar o sulfato de
quinina. O estudo preliminar de estabilidade foi realizado pela medida da perda de sulfato de
quinina das microesferas ao longo do tempo, quando estocadas a 25ºC. A atividade antimalárica in
vivo foi avaliada em fêmeas de camundongos Swiss, infectados com Plasmodium berghei no teste
de supressão em 4 dias. Os animais foram tratados com sulfato de quinina livre e sulfato de quinina
microencapsulado nas microesferas. Um grupo de animais não tratados e um grupo de animais
tratados com microesferas placebo foram utilizados como controle. As microesferas de PLGA
contendo sulfato de quinina apresentaram formato esférico, com superfície lisa, homogeneas e
tamanho de partícula com diâmetro médio de 3,53 ± 1,53 µm. A eficiências de encapsulação foi de
50,34 ± 0,62%. As microesferas liofilizadas mostraram-se estáveis por 230 dias quando
armazenadas a 25ºC. O perfil cinético da liberação in vitro de sulfato de quinina microencapsulado
exibiu um comportamento bimodal. Uma rápida liberação inicial de 40% foi observada na primeira
hora, seguido de uma liberação gradual atingindo um máximo de 73% em 144 horas. Microesferas
de sulfato de quinina administradas pela via subcutânea em camundongos não foram capazes de
reduzir a infecção por P. berghei na dose de 20 mg/kg/dia, por 4 dias. Entretanto, uma dose de 120
mg/kg/dia foi utilizada e os primeiros resultados demonstram que esta dose pode ser utilizada para
determinar a atividade antimalárica da formulação. Uma formulação parenteral de sulfato de
quinina microencapsulada pode ser utilizada como uma estratégia para a obtenção de um sistema de
liberação controlada do fármaco para o tratamento da malária.
xii
ABSTRACT
The aim of this work is the development of new microencapsulated formulations of quinine
sulphate intended for the antimalarial therapy. The physicochemical characterization of these
microparticles, their in vitro kinetic release, preliminary stability study, and their in vivo
antimalarial activity were evaluated. The poly- lactide-co-glycolide microspheres associated with
quinine sulphate (QS-MS) were obtained through a multiple emulsion, followed by solvent
evaporation method. The morphology of the microspheres were evaluated by optical and scanning
electron microscopy. . The optimized formulation was used to determine the release kinetic profile
of quinine from the optimized formulation was determined by the dissolution technique with
phosphate buffer 7.4 medium. A High Performance Liquid Chromatography (HPLC) assay was
used to determine the quinine sulphate content. A preliminary stability studies was performed by
following the lost of quinine sulphate content in the microspheres at 25ºC. The in vivo antimalarial
activity was evaluated in female Swiss mice infected with Plasmodium berghei by the four-day
suppressive test. The animals were treated with free and quinine-sulphate- loaded microspheres. The
untreated animal group and a group treated with unloaded microspheres were used as a control. The
quinine-sulphate-loaded microspheres showed spherical shaped particles with a smooth surface,
homogeneity, and particle size with a mean diameter of 3.53 ± 1.53 µm. The encapsulation
efficiency was 50.34 ± 0.62%. Lyophilized microspheres presented stability over 230 days, when
stored at 25ºC. The in vitro release profile of quinine-sulphate- loaded microspheres exhibited a
bimodal behavior. A burst effect of 42% was observed in the first hour, followed by a gradual drug
release, achieving a release of 72% after 144 hours. Microspheres of quinine sulphate administered
by subcutaneous route in mice were not able to reduce the infection of P. berghei at dose of 20
mg/kg/day for four days. However, a dose of 120 mg/kg/day was used in the same test and the first
achievements shown that such a dose can used to investigate the antimalarial activity of
formulation. A parenteral formulation of quinine sulphate- loaded microspheres is therefore offered
as a strategy to achieve a controlled delivering for the malaria treatment.
INTRODUÇÃO
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
2
1. INTRODUÇÃO
A Malária é uma doença parasitária de grande impacto no mundo, sendo considerada um dos
maiores problemas de Saúde Pública, com 300 a 500 milhões de casos clínicos por ano no mundo e
com mais de um milhão de mortes. A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e
transmitida pela picada de mosquitos vetores em humanos, onde quatro espécies são responsáveis
pela infecção, P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (OMS, 1999; Krettli et al., 2001;
Gomes et al., 2001).
Assim a malária é um problema de saúde constante, devendo-se incentivar a pesquisa
contínua de novos fármacos com atividade antimalárica, técnicas de melhoria da ação terapêutica
das drogas já existentes, novos esquemas de tratamento, controle do vetor e desenvolvimento de
vacina. Além da garantia de uma farmacoterapia adequada, evita-se assim o aumento da resistência
aos inseticidas e fármacos já existentes.
O sulfato de quinina é o fármaco de escolha para a grande maioria de casos de malária
falciparum resistente a cloroquina, porém a quinina possui baixa margem de segurança terapêutica e
seu emprego como antimalárico geralmente está associado à elevada incidência de efeitos tóxicos, o
que limita o seu uso na terapêutica. Quando a quinina é administrada repetidamente em doses
terapêuticas plenas, pode ocorrer um grupo de sintomas típicos relacionados à dose, denominada
Chinchonismo (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000).
Promissores agentes terapêuticos com características restritivas que limitam seu uso podem
ter um melhor aproveitamento, se técnicas apropriadas de microencapsulação forem desenvolvidas
para sobrepor estes inconvenientes intrínsecos. Estas técnicas são normalmente utilizadas para
aumentar a estabilidade de materiais, reduzir os efeitos tóxicos ou aumentar a liberação do agente
para diferentes aplicações em vários campos da produção (Benoit et al., 1996; Santos e Castanho,
2002; Dunne et al., 2003).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
3
Sistemas de Liberação Controlada (SLC), podem ser definidos como aqueles nos quais o
agente ativo é liberado independentemente de fatores externos e com uma cinética bem estabelecida
(Baker, 1987). Entre as vantagens que os SLC podem oferecer, podemos citar o aumento da eficácia
terapêutica, liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis do fármaco com
faixas desejáveis e diminuição significativa da toxicidade (Brannon-Peppas, 1997; Durán e
Azevedo, 2002).
O
desenvolvimento
de
formas
farmacêuticas
de
liberação
controladas
por
microencapsulamento de sulfato de quinina, poderá permitir um melhor controle da cinética de
liberação do fármaco, resultando em níveis plasmáticos terapêuticos com baixas flutuações da
concentração do ativo e menor efeito tóxico, podendo consistir num passo importante para o
desenvolvimento de uma nova terapêutica antimalárica.
Esta Dissertação de Mestrado é constituída de uma revisão da literatura com tópicos sobre a
malária, sulfato de quinina, sistemas de liberação controlada e processos de obtenção de
micropartículas. Possui o artigo “IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE
SULPHATE-LOADED PLGA MICROSPHERES” escrito com base nos resultados obtidos no
trabalho científico realizado.
O artigo intitulado “NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE
DA MALÁRIA” foi submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. O referido artigo é
uma revisão da literatura, com abordagens sobre a malária, terapêutica atual e a aplicação da
nanotecnologia como ferramenta alternativa para o controle e combate da malária.
REVISÃO DA LITERATURA
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. MALÁRIA
A malária é uma doença causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida pela
picada de insetos vetores em humanos. A doença ocorre principalmente nos países tropicais, onde
quatro espécies infectam o homem, P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (Krettli et al.,
2001). É caracterizada por quadros de febre alta contínua (38,5 a 40,0ºC) ou em paroxismos febris
que apresentam quatro períodos sucessivos: o de frio, calor, de suor e apirexia (James e Leslie,
1996), acompanhada por cefaléia ocasional, náuseas, vômitos, astenia, fadiga e anorexia. (Gomes et
al., 2001).
Das espécies de Plasmodium existentes três ocorrem em humanos no Brasil: P. falciparum
causa a forma de malária mais severa, podendo ser rapidamente fatal se os indivíduos não forem
tratados. O P. vivax , registra o maior número de casos, causando cerca de 80% dos registros da
doença, de acordo com o Ministério da Saúde, com raros casos de morte. O P. malariae, o de menor
prevalência. Este protozoário causa uma malária fraca, mas pode causar nefrite fatal (Krettli et al.,
2001; James, 2002).
Os mosquitos vetores do Plasmodium spp pertencem ao gênero Anopheles (classe Insecta,
ordem Diptera, família Culicidade), onde apenas as fêmeas do mosquito têm o hábito hematofágico
tendo, portanto, capacidade de transmissão. Estas quando infectadas, ao picar o homem, durante o
repasto sanguíneo, inoculam na pele, os esporozoítos (forma infectante). O esporozoíto penetra a
pele, alcançando a corrente sanguínea, concentra-se no fígado e invade os hepatócitos. Nestas
células o esporozoíto multiplica-se em um processo conhecido como esquizogonia intra- hepática,
originando esquizontes teciduais ou hepáticos (forma evolutiva) ou diferenciam-se em merozoítos
(forma infectante de eritócidos). Os merozoítos ganham os capilares intra- hepáticos e na corrente
sanguínea invadem os eritrócitos, nos quais se transformam em trofozoítas (forma evolutiva), que
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
6
crescem e sofrem divisão nuclear, passando a esquizontes sanguíneos, que após nova divisão
(esquizogonia), originarão novos merozoítos que irão reiniciar o ciclo. Alguns merozoítos
diferenciam-se em gametócitos femininos e masculinos (forma reprodutiva), que amadurecerão e
irão contaminar a fêmea do Anopheles quando este picar o homem enfermo, onde seguirão o ciclo
evolutivo naquele inseto, até uma nova contaminação no homem (Figura 1) (Krettli e Miller, 2001;
Gomes et al., 2001).
Figura 1. Ciclo evolutivo de Plasmodium spp. (Miller et al., 2002)
2.1.1. Epidemiologia
A malária é uma protozoose com ocorrência em cerca de 103 países, estando expostas
próximo a 2,5 bilhões de pessoas no mundo, incidindo na maioria das regiões tropicais. É endêmica
no Sudoeste da Ásia, nas Américas Central e do Sul e na Oceania. Os países da África, a Índia e o
Brasil são os países com o maior números de casos no mundo (Krettli et al., 2001; Gome et al.,
2001).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
7
De acordo com dados da Fundação Nacional de Saúde, em 2000, registaram-se 613.239
casos da doença no País, sendo 99,4% destes na Amazônia Legal. Os estados com maior número de
casos foram: Pará (278.203), Amazonas (96.026), Maranhão (78.817) e Rondônia (54.074), os quais
contabilizaram 83% dos acometimentos de malária do país (FUNASA, 2001). As condições sócioeconômicas e ambientais da região amazônica favorecem a proliferação do mosquito e,
conseqüentemente, a exposição à contaminação de grandes contingentes populacionais (FUNASA,
2002a).
No Brasil o numero de casos de malária nos últimos 10 anos foi em média, pouco mais de
500 mil casos por ano, de acordo com dados do Ministério da Saúde, Fundação Nacional de Saúde e
Centro Nacional de Epidemiologia (Figura 2) (FUNASA, 2003).
Figura 2. Número de casos de Malária e óbitos de todas as formas registradas no Brasil nos anos de
1990 – 2001.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
8
A África Sub-Sahara, é a região onde são registrados o maior número de casos, com cerca
de 270 milhões de casos por ano, com quase um milhão de mortes, dos quais 5% são crianças com
menos de cinco anos de idade. Entretanto, acredita-se que este números possa estar subestimado,
devido ao registro de morte de crianças por infecções respiratórias, diarréia e má nutrição, que
tiveram seus quadros clínicos agravados pela malária concomitante (OMS, 1999).
2.1.2. Indústria Farmacêutica e Malária
A maioria das Indústrias Farmacêuticas não desenvolve pesquisa de novos fármacos contra a
malária ou de uma vacina. Estima-se que apenas três delas façam pesquisa em malária, devido ao
alto custo de investimento e baixa rentabilidade no desenvolvimento de novos agentes antimaláricos
(Dias, 2002; Sachs, 2002). De acordo com Trouiller e colaboradores, 2002, no período de 1975 a
1999, dos 1.393 novos compostos químicos comercializados no mundo, apenas 13 eram destinados
a doenças tropicais, sendo quatro destes com atividade antimalárica.
Algumas iniciativas estão sendo realizadas para o combate e controle da doença. Dentre as
mais significativas estão a da Organização Mundial de Saúde, que em 1998, criou o programa
Rolling Back Malaria (Recuar a Malária), que foi lançado em consórcio com o Banco Mundial,
Programa de Desenvolvimento das Nações Unidas e Fundo de Assistência Infantil das Nações
Unidas. Outras iniciativas para o descobrimento de novos fármacos, desenvolvimento de vacinas e
aumento do financiamento de ações de controle foram lançados. A Iniciativa Multilateral em
Malária - MIM em 1997, Medicamentos para Malária - MMV em 1999 e o Fundo Global de
combate aAIDS, tuberculose e malária - GFATM, lançado em janeiro de 2002 constituem alguns
programas de cotrole e combate a malária (Sachs, 2002).
A OMS recomenda um gasto mundial de pelo menos um bilhão de dólares por ano na
prevenção e combate a malária, sendo que a maioria deste valor, deveria ser aplicado na África.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
9
Estima-se ainda que somente na África os benefícios a curto prazo com o controle da malária
seriam entre 3 a 12 bilhões de dólares por ano (OMS, 2000).
No ano de 1999, o Governo Brasileiro destinou um investimento total da ordem de 145,7
milhões de reais em ações de combate a malária, com o objetivo geral de reduzir a magnitude da
doença em 50% até o ano de 2002 (FUNASA, 2002).
2.1.3. Agentes Terapêuticos da Málaria
Entre os agentes terapêuticos altamente eficazes com ação contra os parasitas da malária
estão a cloroquina, quinina, quinidina, mefloquina, halofantrina, pirimetamida, sulfonamidas,
sulfonas, tetraciclinas e primaquina. Os antimaláricos podem ser classificados pelo estágio do
parasita que afetam e o objetivo clínico correspondente ou mecanismo de ação (Tab. 1).
Das quatro espécies de parasitas que afetam o homem o Plamodium falciparum é o mais
perigoso. Este parasita tem mostrado a capacidade de desenvo lver resistência aos antimaláricos
atualmente utilizados. A cloroquina permanece como o antimalárico mais utilizado, porém tem
apresentado falhas contra a malária falciparum em muitas áreas tropicais do planeta (OMS, 1999).
Desde os primeiros registros de malária falciparum resistente a cloroquina no sudoeste da
África e na América do Sul a quase um século atrás, o problema da resistência dos Plasmodium à
fármacos tem sido considerado como o principal problema no controle da malária. A quinina é
atualmente reservada como um fármaco de segunda ou terceira escolha para a malária e o fármaco
de escolha nos casos de malária não grave ou complicada (Wongsrichanalai et al 2002 ; Sachs,
2002).
No Brasil, o Ministério da Saúde, através da FUNASA e seu programa de controle de
endemias, estabeleceu que para os casos de malária não grave ou complicada por P. falciparum
resistente a cloroquina, o tratamento será realizado com o uso de quinina em monoterapia ou em
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
10
associação com outros quimioterápicos como a doxiciciclina, tetraciclina, clindamicina e
primaquina (FUNASA, 2001).
Tabela 1. Principais fármacos antimaláricos (James, 2002)
Grupo de
Antimaláricos
4-Metanolquinolinas
Biguanidas
Principais
Fármacos
Alcalóides
Chinchona
Quinina
Quinidina
Meloquina
Cloroquina
Hidroxicloroquina
Amodiaquina
Primaquina
Tafenoquina
Proguanil
Diaminopiridinas
Pirimetamina
Diclorobenzilidinas
Hidroxinaftoquinonas
Lumefantrina
Atavaquona
9-fenantrenometano
Lactonas
Sesquiterpênicas
Sulfonamidas
Halofantrina
Artemisinina
seus derivados
Sulfodoxina
Sulfametopirazina
Tetraciclinas
Lincosamidas
Doxiciclina
Tetraciclina
Clindamicina
Sulfonas
Dapsona
4-Aminoquinolinas
8-Aminoquinolinas
Atividade
Esquizonticida sangüíneo de rápida ação. Alguma
atividade gametocida.
Esquizonticida sangüíneo.
Esquizonticida sangüíneo de rápida ação. Alguma
atividade gametocida.
Esquizonticida tecidual. Atividade gametocida e alguma
atividade em outros estágios do ciclo de vida do parasita.
Esquizonticida tecidual, esquizonticida sangüíneo de
ação lenta. Alguma ação esporocida. Inibidor da
dihidrofolato redutase.
Esquizonticida tecidual e esquizonticida sangüíneo de
ação lenta. Alguma ação esporocida. Inibidor da
dihidrofolato redutase. Usualmente utilizado com
antimaláricos que inibem diferentes estágios da folato
sintetase (sulfonamidas ou sulfonas) em combinações
sinérgicas.
Esquizonticida sangüíneo.
Esquizonticida sangüíneo, usualmente dado em
combinação com o proguanil.
Esquizonticida sangüíneo.
e Esquizonticida sangüíneo.
Esquizonticida sangüíneo. Inibidor da dihidropteroato e
folato sintase. Usualmente dado em combinação com a
pirimetamina.
Esquizonticida
sangüíneo,
alguma
atividade
esquizonticida tecidual.
Esquizonticida
sangüíneo,
alguma
atividade
esquizonticida tecidual.
Esquizonticida sangüíneo. Inibidor da folato sintetase.
Usualmente dado em combinação com a pirimetamida.
2.2. QUININA
A quinina é o principal alcalóide extraído das diversas espécies de chinchona, pertencentes à
família das rubiáceas, naturais da América do Sul. Com fórmula molecular C20 H24 N2 O2 (8α, 9R-6´-
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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metoxichinchonan-9-ol), (Figura 3A). Possui massa molecular de 324,42 g, ponto de fusão de 177
ºC, pKa 5,07 e 9,7 a 18ºC. Apresenta-se como cristais ortorrômbicos e luminescentes pela
cristalização com álcool. Sendo pouco solúvel em água, completamente solúvel em uma mistura de
etanol e clorofórmio (1:3), solúvel em álcool, benzeno, clorofórmio, éter e glicerol, porém é
insolúvel em éter de petróleo (Moffat et al., 1986; The Index Merck, 1996).
A quinina encontra-se sob a forma de base livre ou formando diversos sais, como sulfato,
bissulfato, bromidrato, dibromidrato, cloridrato, dicloridrato, carbonato, salicilato. O sulfato de
quinina com fórmula molecular (C 20 H24 N2 O2 )2 • H2 SO4 • 2 H2 O e massa molecular de 782,9 g,
apresenta-se como pó cristalino branco, inodoro ou cristais ortorrômbicos ou aciculares coloridos
(Figura 3B), com pKa de 4,1 e 8,5 a 20 ºC . Sua solubilidade aproxima-se à do alcalóide base
(Moffat et al., 1986; The Index Merck, 1996).
a)
b)
Figura 3. a) Estrutura molecular da Quinina. b) Microfotorafia de Cristais de Sulfato de quinina
(aumento 40 ×).
2.2.1. Farmacocinética da Quinina
A quinina e seus sais são rapidamente absorvidos quando administrados por via oral ou
intramuscular. No primeiro caso, a absorção ocorre principalmente a partir do intestino delgado
superior, com mais de 80% de absorção. As concentrações plasmáticas de pico são alcançadas em
aproximadamente 3 horas, com um volume aparente de 1,5 litro por quilograma em indivíduos
saudáveis, declinando com uma meia vida de aproximadamente 11 horas após a interrupção da
terapia (James e Leslie, 1996; James, 2002).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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A ligação protéica é de 70% em indivíduos sadios, mas pode aumentar para 90% em muitos
pacientes com malária. A farmacocinética da quinina é alterada significativamente com a infecção
malárica, o maior efeito está na redução do volume aparente de distribuição e da depuração
sistêmica (James e Leslie, 1996; James, 2002). A quinina é extensivamente metabolizada no fígado
através de enzimas presentes no sistema Citocromo P450, estando sujeita a reações de hidroxilação
nos anéis quinolínicos. É excretada na urina, e estima-se que 5 a 20% da dose administrada seja
excretada de forma inalterada (Vieira e Mídio, 2000).
2.2.2. Aplicações Terapêuticas
A atividade antimalárica da quinina está largamente descrita na literatura, com os primeiros
registros de uso datandos de mais de 350 anos, por um monge agostiniano de Lima no Peru, sendo
incluída somente em 1677 na “London Pharmacopoeia” como “Cortex peruanus” (James e Leslie,
1996; Foley e Tilley, 1998).
Age principalmente como esquizonticida sangüíneo, tem pouco efeito nos esporozoítos ou
formas pré-eritrocitárias dos parasitas. É gametocida para o P. vivax e o P. malariae, mas não para
o P. falciparum, não sendo utilizada para a profilaxia devido o seu espectro de atividade, porém é
utilizada como agente supressivo e terapêutico. Apesar de sua toxicidade potencial, a quinina
permanece como o esquizontocida sangüíneo prototípico para o tratamento supressivo e cura da
malária falciparum resistente a cloroquina e a múltiplos fármacos (James e Leslie, 1996).
De acordo com a literatura além da ação antimalárica, a quinina foi utilizada como
analgésico, antipirético, anestésico local e abortivo. Contudo diante da sua baixa margem de
segurança terapêutica, tais indicações tornaram-se obsoletas. Ainda existem relatos do uso para a
ativação da circulação cerebral e periférica em associação com a papaverina. (THE INDEX
MERCK, 1996; James e Leslie, 1996;Vieira e Mídio, 2000; James, 2002;).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
13
Segundo McCalley et al., (2002) a quinina também é utilizada na produção de bebidas
refrigerantes do tipo tônica, em concentrações variadas e com a função de conferir sabor amargo,
com esta mesma função, o alcalóide é utilizado em comprimidos de paracetamol para desencorajar
o uso inadequado e abusivo do medicamento. Sendo utilizada ainda como matéria prima para a
síntese de quinidina (antiarrítimico cardíaco e tratamento da fibrilação atrial).
Os alcalóides da chinchona, principalmente a quinina e a quinidina são utilizados como
seletores de troca iônica em diferentes técnicas de separação como a Cromatografia líquida de alta
performance (CLAE), Cromatografia em Fluído Super Crítico (SFC), Eletroforese Capilar (EC) e
Eletrocromatografia Capilar (CEC) (Franco et al., 2000).
A quinina produz o relaxamento dos músculos esqueléticos, aumentando o período de
refratividade por agir diretamente sobre a fibra muscular, diminuindo a excitabilidade da placa
terminal motora em uma ação semelhante ao curare, sendo assim relatado o uso na cãibra noturna
idiopática, provocando o alívio sintomático da miotonia congênita. No entanto, o seu uso é de
indicação restrita, pois pode causar uma alarmante angústia respiratória e disfagia em pacientes com
miastenia grave (Barajas-Lopes e Huizinga, 1989; James e Leslie, 1996).
2.2.3. Mecanismo de Ação
O mecanismo de ação da quinina, ainda não está totalmente elucidado, a teoria mais aceita é
baseada no fato da quinina por ser uma base fraca, concentrando-se nos vacúolos alimentares ácidos
do Plasmodium. Nestas organelas, a quinina inibi a atividade enzimática da heme polimerase,
responsável pela polimerização do grupo heme a hemozoína e dessa forma permite o acúmulo do
seu substrato tóxico, o heme. Ainda não foi estabelecido se o heme induz citotoxicidade por si só ou
em complexo com a quinina (Chou e Fitch, 1993; Vieira e Mídio, 2000).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
14
2.2.4. Toxicologia da Quinina
A quinina possui baixo índice terapêutico, seu emprego como antimalárico geralmente está
associado à elevada incidência de efeitos tóxicos. Quando a quinina é dada repetidamente em doses
terapêuticas plenas, pode ocorrer um grupo de sintomas típicos relacionados à dose, denominado
Chinchonismo (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000). O Chinchonismo é caracterizado por
zumbidos, audição abafada, cefaléia, náuseas e distúrbios visuais. Entretanto, quando a medicação é
continuada, ou após grandes doses únicas, podem aparecer manifestações gastrintestinais,
cardiovasculares e dérmicas (FUNASA, 2001). Os distúrbios gastrintestinais são proeminentes entre
eles a náusea, vômitos, dor abdominal e diarréia resultante da ação irritativa local da quinina, efeitos
dérmicos também podem ocorrer, a pele freqüentemente apresenta-se quente e vermelha. Erupções
aparecem com freqüência. Angioedema, especialmente da face, ocasionalmente é observado (James
e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000; James, 2002).
A literatura é unânime em caracterizar a hipoglicemia pelo uso de quinina, através de seu
poderoso efeito estimulante nas células β-pancreáticas. Esta complicação pode ser potencialmente
fatal na gravidez e na infecção grave. Outros efeitos colaterais estão associados ao sistema
cardiovascular, sendo citados a hipotensão ortostática, anormalidades na repolarização atrial,
taquicardia ventricular com evolução a fibrilação ventricular e óbito por parada cardíaca (James e
Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000; FUNASA, 2001; James, 2002).
2.3. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS (SLC)
Até agora, o uso de alguns interessantes e promissores agentes terapêuticos tem sido
limitado na clínica por causa de suas restritivas características físico-químicas, como a degradação
do agente terapêutico, baixa solubilidade, necessidade de freqüentes administrações, efeitos
colaterais inerentes a sua utilização em concentrações elevadas. É possível que estas substâncias
possam ter um melhor aproveitamento, se técnicas apropriadas de microencapsulação forem
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
15
desenvolvidas para sobrepor estes inconvenientes intrínsecos (Benoit et al., 1996; Santos e
Castanho, 2002).
As formas farmacêuticas convencionais como injetáveis ou sólidos orais possuem pouco
controle sobre o modo de liberação do agente terapêutico, as quais em muitas situações, podem
resultar em condições não previsíveis e às vezes, concentrações plasmáticas sub ou supraterapêuticas, podendo levar a efeitos adversos (Verma e Garg, 2001; Durán e Azevedo, 2002). Cada
fármaco possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ela é potencialmente tóxica e abaixo da
qual ela é ineficaz, o chamado índice terapêutico, os níveis plasmáticos são dependentes das doses e
dos intervalos de tempo em que são administrados. Este fato é problemático para os fármacos de
baixo índice terapêutico.
Os SLC promovem uma concent ração uniforme do agente terapêutico no sítio de absorção e
assim, permite a manutenção das concentrações plasmáticas na faixa terapêutica, minimizando os
efeitos adversos e reduzindo a freqüência de administração (Figura 4).
Figura 4. Perfil farmacocinético de doses múltiplas ou em sistema de liberação controlada de
fármacos (Brannon-Peppas, 1997).
Sistemas de Liberação Controlada podem ser definidos como aqueles nos quais o agente
ativo é liberado independentemente de fatores externos e com uma cinética bem estabelecida
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
16
(Baker, 1987). A liberação do agente ativo pode ser constante por um longo período, cíclica em um
longo período ou ainda ser condicionada para ser iniciada por evento predeterminado. Em qualquer
um dos casos, o propósito do controle da liberação do fármaco é alcançar uma terapia mais efetiva
enquanto se elimina o potencial de baixa ou superdosagem (Brannon-Peppas, 1997). Podem ainda
serem do tipo sítio direcionados, pela conjugação com anticorpos que possuem ação contra
componentes específicos do sítio alvo. (Torchilin et al., 2001). A Tabela 2 apresenta os principais
sistemas carreadores de fármacos.
Tabela 2. Principais Sistemas nanobiotecnológicos utilizados para o carreamento de fármacos.
Sistema
Lipossomas
Definição
Referência
São vesículas submicroscópicas, geralmente compostas
Gabriels e Plaizier-
por
bicamadas
lipídicas
(glicerofosfolipídios, Vercammen., 2003
principalmente a fosfatidilcolina) ao redor de um
compartimento aquoso e podem ser estabilizadas por
colesterol.
Microesferas
Micropartículas monolíticas ou matriciais com tamanhos
Ahsan et al., 2002
entre 1 a 1000 µm, com o fármaco adsorvido em suas
superfícies, dissolvido ou disperso na rede polimérica.
Microcápsulas
Micropartículas do tipo reservatório, com tamanhos entre Ahsan et al., 2002
1 a 1000 µm, onde o fármaco encontra-se encapsulado
em um núcleo.
Nanoesferas
Sistemas Coloidais matriciais submicrômicos, nos quais
Brigger et al., 2002
o fármaco encontra-se disperso ou dissolvido nas
partículas, geralmente composto de polímeros.
Nanocápsulas
Sistemas Coloidais vesiculares submicrômicos, em que o
fármaco está confinado em uma cavidade aquosa ou
oleosa,
estabilizada
polimérica.
por
uma
simples
membrana
Brigger et al., 2002
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
17
Um SLC ideal deve ser inerte, biocompatível, mecanicamente resistente, confortável para o
paciente, capaz de encapsular uma grande quantidade de fármaco, estar livre da possibilidade de
liberações acidentais, ser de simples administração, remoção, de fácil fabricação e esterilização. Em
conclusão os SLC representam um desenvolvimento relativamente novo e têm o objetivo de
prolongar e melhorar o controle da administração de fármacos (Durán e Azevedo, 2002; BrannonPeppas, 1997).
Entre as vantagens que os SLC podem oferecer, podemos citar o aumento da eficácia
terapêutica, liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis do fármaco com
faixas desejáveis, diminuição significativa da toxicidade, diminuição da instabilidade e
decomposição de fármacos sensíveis, possibilidade de direcionamento a alvos específicos,
possibilidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofilicas nos dispositivos,
menor necessidade de administrações, uso otimizado do fármaco e aumento da aceitação da terapia
pelo paciente (Brannon-Peppas, 1997; Durán e Azevedo, 2002).
2.3.1. Mecanismos de Liberação do Fármaco de SLC
Dependendo do tipo de polímero e planejamento de obtenção do dispositivo, diferentes
processos físico-químicos podem estar envolvidos no controle da liberação do fármaco. Existem
três mecanismos primários pelos quais agentes ativos podem ser liberados de um sistema: a difusão,
a degradação do sistema ou ainda a combinação destes.
A difusão ocorre quando o fármaco ou outro agente ativo passa através do polímero que
forma o dispositivo de liberação. A difusão pode ocorrer na escala macroscópica, através de poros
na matriz polimérica ou a um nível molecular, pela passagem entre as cadeias poliméricas (Schaefer
e Singh, 2002). A difusão do fármaco através da matriz polimérica, esta condicionada a outras
propriedades específicas da molécula do fármaco como coeficiente de difusibilidade no polímero,
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
18
solubilidade, tamanho da molécula, distribuição do fármaco na matriz polimérica e interações
específicas com o polímero (Ghaderi et al., 1996; Faisant et al., 2002).
Na degradação do sistema, a quebra de ligações éster por hidrólise, a solubilidade do
fármaco, taxa de difusão do fármaco, são fatores que influenciam no controle de liberação.
2.3.2. Excipientes para Sistemas de Liberação Controlada
O termo polímero refere-se a grandes moléculas (macromoléculas), caracterizadas pelo seu
tamanho, estrutura química e interação intra e intermoleculares. Possuem unidades ligadas por
covalência, repetidas regularmente ao longo da cadeia, denominados “monômeros”. Sua estrutura
depende do monômero ou monômeros utilizados em sua preparação. Quando apenas uma pequena
quantidade de unidades monoméricas estão juntas resulta em um polímero de baixo peso molecular
denominado oligômero (Stevens, 1999).
Os polímeros biodegradáveis são susceptíveis de degradação por processos biológicos
naturais, eliminando a necessidade de remoção dos mesmos. Assim estes polímeros são assim
designados por degradarem em meio aquoso como nos fluídos corpóreos, por hidrólise de suas
cadeias poliméricas em compostos biologicamente aceitáveis e progressivamente menores
metabolizáveis pelo organismo. (Brennon-Peppas, 1997; Giunchedi, et al., 1998).
Uma grande variedade de polímeros naturais e sintéticos biodegradáveis ou não foram
estudados para a liberação prolongada de fármacos ou direcionamento sítio específico. Entretanto,
apenas poucos destes são biocompatíveis. Polímeros naturais como a albumina sérica bovina
(BSA), a albumina sérica humana (HSA), o colágeno, a gelatina e a hemoglobina já foram
estudados para liberação de fármacos. Estes polímeros têm uso limitado, devido os altos custos e
pela variação de pureza, consequentemente, os polímeros sintéticos biodegradáveis vêm recebendo
uma significante atenção nesta área (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
19
Os polímeros biodegradáveis são conhecidos por sua biocompatibilidade e reabsorção por
mecanismos naturais, além de permitirem que as taxas de degradação e a taxa de liberação do
fármaco encapsulado possam sofrer manipulação pela variação da relação entre seus monômeros
(Brannon-Peppas, 1997; Jain, 2000).
Alguns destes materiais são frequentemente utilizados ou estudados para liberação de
fármacos
incluindo
o
álcool
polivinílico,
poliacrilamindas,
poli-alquil-α-cianoacrilatos,
polietilenoglicol, poli- metil- metacrilatos. Além destes, poliesters termoplásticos alifáticos como
polilático (PLA) o poliglicólico (PGA) e seus copolímeros, especialmente o poli- lático-co-glicólico
(PLGA) tem gerado um grande interesse devido as suas excelentes biocompatibilidade e
biodegradabilidade e terem sido aprovados pela Agência de Vigilância Sanitária Americana, a Food
and Drug Adminitration (FDA), para uso em liberação de fármacos. Vários dispositivos poliméricos
como microesferas, microcápsulas, nanopartículas, pellets, implantes e filmes têm sido formulados
usando este polímero para a liberação de uma variedade de classes de fármacos (Jain, 2000; Hans e
Lowman, 2002; Faisant et al., 2002).
2.3.3. Poli(lático-co-glicólico) - PLGA
Copolímeros são definidos como polímeros compostos de muitas unidades de monômeros e
são classificados em quatro tipos, de acordo com a disposição de seus monômeros: copolímeros
randômicos, copolímeros alternados, copolímeros enxertados e copolímeros em bloco (Kumar et
al., 2001).
Os copolímeros de PLGA são formados por unidades monoméricas de ácido polilático e
poliglicólico (Figura 5). Possuem propriedades desejáveis como, taxa constante de biodegradação,
morfologia, resistência mecânica, cristalinidade e geometria regular de cadeias individuais (Jain,
2000; Hans e Lowman, 2002; Cai et al., 2003). Os entendimentos das propriedades físicas,
químicas e biológicas dos polímeros são úteis na formulação de dispositivos de liberação
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
20
controlada. As várias propriedades do polímero e do fármaco encapsulado influenciam diretamente
em outros fatores como a seleção do processo de microencapsulação ou taxa de liberação do
fármaco do polímero (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002).
Figura 5. Estrutura molecular dos ácidos polilático e poliglicólico.
O ácido lático é mais hidrofóbico que o ácido glicólico e assim copolímeros de PLGA ricos
em ácido lático são menos hidrofílicos, absorvem menos água e assim degradam mais lentamente.
Polímero de PLGA contendo relações de 50:50 de ácido lático e glicólico são hidrolisados com
maior velocidade que aqueles que contém elevadas proporções de um dos monômeros (Jain, 2000).
A degradação da matriz de PLGA ocorre em meio através da quebra de ligações a uma taxa
uniforme. A maior parte da literatura indica que a biodegradação do PLGA não envolve nenhuma
atividade enzimática, sendo puramente por meio de hidrólise. O PLGA é biodegradado em ácido
lático e glicólico. O ácido lático entra no ciclo do ácido tricarboxílico e é metabolizado e
subseqüentemente eliminado do organismo como dióxido de carbono e água. O ácido glicólico é
excretato inalterado pelos rins ou entra no ciclo do ácido tricarboxílico, sendo eventualmente
eliminado como dióxido de carbono e água (Giunchedi, et al 1998; Jain, 2000).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
21
2.4. MICROPARTÍCULAS
Micropartículas podem ser definidas como formas de dosagem onde os dispositivos estão na
faixa de 1 a 1000 µm, e podem ser de dois tipos, as microcápsulas e as microesferas, os primeiros
são sistemas reservatórios micrométricos, onde é possível identificar um núcleo diferenciado, o qual
pode ser sólido ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma parede,
geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo, por outro lado as microesferas são
sistemas matriciais micrométricos, onde o fármaco encontra-se disperso ou solubilizado no interior
da matriz polimérica. Desde que micropartículas foram desenvolvidas para o controle da liberação
de fármacos após a sua administração oral, o desenvolvimento de micropartículas contendo
fármacos mostrou-se uma alternativa promissora para a redução da freqüência de administração
(Lamprecht, 2000; Ashan et al., 2002).
2.4.1. Aplicações Terapêuticas
Micropartículas de PLGA, em particular, são importantes sistemas de liberação de fármacos,
nos quais vários perfis de liberação podem ser obtidos pelo ajuste da composição do PLGA, seu
peso molecular, fármaco encapsulado, tamanho da microesfera. Alguns fármacos formulados em
dispositivos já foram introduzidos no mercado e muitos se encontram em ensaios clínicos
(Brannon-Peppas, 1995; Jain, 2000). Algumas destas aplicações estão listadas na Tabela 3.
2.4.2. Industria Farmacêutica e SLC
Atualmente, a Indústria Farmacêutica está presa entre a guerra de preços reduzidos e o
aumento dos custos na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. A magnitude dos custos e
o tempo de desenvolvimento para uma nova entidade química são muitos altos (aproximadamente,
500 milhões de dólares e de 10 a 12 anos) quando comparados aos requeridos para o
desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos (20 a 50 milhões de dólares e de 3 a 4
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
22
anos). De modo que estes novos sistemas podem proporcionar a uma molécula já existente uma
nova vida e com isso aumentar o seu valor comercial e competitividade, além de estender a validade
de sua patente.
Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Microesferas.
Agente Ativo
Polímero
Utilizado
Via de Adm.
-
Referência
5-fluorouracil
PLGA
Aciclovir
PDLLA e PLGA
Antígeno HS de Brucella ovis
PLGA, PCL
Camptotecina
PLGA
Injetável
Cidofovir
PLGA
Tópica
Darbeopoetin alfa
PLGA
-
Herberger et al., 2003
Diazepam
PLGA
Oral
Giunchedi et al., 1998
Desferrioxamina
PLGA
-
Schlicher et al., 1997
Etoposídio
PLGA
Injetável
Shaefer e Singh, 2002
Fentamil
PLGA
Injetável
Choi et al., 2002
Fisostigmina
PLGA
Oral
Chaw et al., 2003
Fosforilcolina
PLGA
Gentamicina
PLGA
Injetável
Peptídio gp120
PLGA
-
Cleland et al., 1997
Irpriflavona
PLGA
Oral
Perugini et al., 2003
Isoniazida
PLGA
Subcutânea
Dutt e Khuller, 2001
Levonorgestrel e etinilestradiol
PCL
Intramuscular
Merlasoprol
PCL
Oral
Nalbufina
PLGA
Injetável
Plasmídio de DNA
PLGA
Intramuscular
Rodamina B
PLG
Antígeno SPf66
Intravitral
Oral
Faisant et al., 2002
Conti et al., 1997
Murillo et al., 2002
Ertl et al., 1999
Santoyo et al., 2002
Mucosa Nasal Fattal et al., 2002
Blanco-Príeto et al., 2002
Dhanaraju et al., 2003
Gibaud et al., 2002
Liu at al, 2003
Del-Barrio et al., 2003
-
Berkland et al., 2001
PLGA
Intranasal
Carcaboso et al.,2004
Antígeno SPf66
PLGA
Oral
Carcaboso et al., 2003
Sulfasalazina e Betametasona
PLGA e PCL
Oral
Lamprecht et al., 2000
Sulfato de Salbutamol
(-) não informado.
PLGA
-
Erden et al., 1996
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
23
A venda de produtos de liberação controlada de fármacos foi avaliada em torno de 22
bilhões de dólares no mundo todo e espera-se que o seu crescimento no presente século, seja de 120
bilhões em 2007 (Verma e Garg, 2001). Algumas empresas desenvolveram inúmeras pesquisas
utilizando a nanobiotecnologia para a formulação de sistemas microparticulados, com a obtenção de
SLC patenteados e que já se encontram no mercado, são exemplos o Ceform da Fuisz Technology
Ltd., USA; Phamazone da Elan Corporation, ProLease e Medisorb da Alkermes Inc., USA;
Microsponge e Retino-A-Micro da Advanced Polymer Systens Inc., US A; Oligosphere da
Macromed, Inc. (Verma e Garg, 2001).
2.5. MICROENCAPSULAÇÃO
A microencpasulação de agentes bioativos envolve processos complexos que permitem
incorporar a um sistema contendo um agente ativo propriedades funcionais e “inteligentes” , como a
liberação controlada por uma condição ou um meio específico. Uma tecnologia de ponta como a
microencapsulação, tem grande valor estratégico para o País, por oferecer produtos com maior valor
agregado, levando ao aumento da competitividade da indústria na disputa de mercados nacionais ou
internacionais (Ré, 2000).
Técnicas de microencapsulação são normalmente utilizadas para aumentar a estabilidade de
materiais, reduzir os efeitos tóxicos ou aumentar a liberação do agente para diferentes aplicações
em vários campos da produção (Dunne et al., 2003). A incorporação de medicamentos já existentes
em novos sistemas de liberação pode significar o aumento de sua performance em termos de
eficiência, segurança e aceitação pelo paciente. (Benoit et al., 1996; Verma e Garg, 2001).
2.5.1 Métodos de Preparação de Microesferas
Microesferas podem ser preparadas por diferentes métodos. Estes foram desenvolvidos e
otimizados ao longo dos anos, entre estas técnicas podemos citar: a separação de fases,
Pimentel, L. F.
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emulsificação seguida de extração do solvente, técnicas utilizando spray drying; uso de fluído
supercrítico ou ainda métodos isentos do uso de solventes orgânicos. A escolha da técnica depende
da natureza do polímero, do fármaco, do fim a que se destina e da duração do tratamento.
Os métodos de microencapsulação empregados devem garantir a estabilidade e a atividade
biológica do agente ativo, ter elevada eficiência de encapsulação, reprodução da qualidade e perfil
de liberação, sob limites especificados (Jain, 2000).
Os métodos mais empregados para a preparação de microesferas poliméricas são a
separação de fases e as técnicas de remoção de solvente. Dependendo do modo como o solvente é
evaporado, este último pode ser subdividido em evaporação do solvente, extração do solvente,
spray-drying, ou ainda utilizando a tecnologia de fluído supercrítico. A evaporação de solvente é a
técnica mais utilizada para a preparação de micropartículas de poliesteres (Benoit et al., 1996;
Giunchedi et al., 1998; Herrmann e Bodmeier, 1998; Jain, 2000).
2.5.1.1. Métodos de Separação de Fases de Polímeros
Também conhecido como coacervação, é uma excelente técnica para o encapsulamento de
fármacos solúveis em água como peptídios, proteínas ou vacinas, também pode ser utilizado para
fármacos insolúveis em água. Este processo consiste na diminuição da solubilidade do polímero
encapsulante pela adição de um terceiro componente na solução orgânica contendo o polímero
dissolvido (Benoit et al., 1996).
2.5.1.2. Métodos de Spray-Drying
Nebulização ou spray drying é um método muito utilizado na indústria farmacêutica,
envolve condições brandas, pouca dependência dos parâmetros de solubilidade e altas taxas de
encapsulamento. O princípio consiste na nebulização ou atomização de uma solução (contendo o
Pimentel, L. F.
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25
fármaco a ser encapsulado) por ar comprimido ou nitrogênio através de um câmara de dessecação e
secagem através de uma corrente de ar quente (Conti et al., 1997).
2.5.1.3. Métodos Utilizando Fluído Supercrítico
A técnica de uso de fluídos em temperaturas e pressões que excedam o seu ponto crítico,
utilizado-os como meio extrativo, está bem demostrada. Em microencapsulação este método pode
ser utilizando, aspergindo-se uma solução orgânica contendo um princípio ativo em uma coluna
contendo fluído supercrítico, o solvente orgânico será extraído pelo fluído em condições
supercríticas, formado as microesferas (Benoit et al., 1996).
2.5.1.4. Injeção Sob Pressão
Berckland e colaboradores (2001) desenvolveram, um sistema relativamente simples que
provoca jatos sob pressão controlada de uma solução polimérica contendo o fármaco solubilizado
através de uma agulha, sob excitação acústica controlada, produzindo micropartículas de tamanho
uniforme com desvios de apenas 1,0 a 1,5 µm da média em 95% das microesferas.
2.5.1.5. Métodos de Trituração
A preparação de micropartículas sem o uso de solventes baseia-se em triturar partículas do
polímero. O polímero em pó sofre uma prévia fusão, seguida da redução do tamanho e pode ser
completada por um processo de esferonização, que consiste em promover o degaste das partículas
de modo a obter uma forma arredondada (Herrmann e Bodmeier, 1998).
2.5.1.6. Sistema de Recirculação Total (TROMS)
Este método evita o uso de técnicas agressivas de homogenização, podendo ser utilizado
para agentes que necessitem conservar a sua integridade estrutural. Utiliza um equipamento
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
26
composto por um sistema complexo de bombas, válvulas e agulhas que permite a injeção de uma
fase orgânica em uma aquosa, sob recirculação para obtenção de emulsões, as quais são
homogeneizadas, com subseqüente evaporação do solvente orgânico e formação das microesferas
(Del-Barrio et al., 2003).
2.5.1.7. Métodos de Evaporação e Extração de Solvente
De um modo geral, o polímero é dissolvido em um adequado solvente imiscível com a água,
o princípio ativo a ser encapsulado é então disperso ou dissolvido nesta fase orgânica para formar
uma suspensão ou solução. Esta é então emulsificada em uma fase contínua aquosa constituída de
um não solvente do polímero. Devendo ainda conter um tensoativo apropriado para estabilizar a
emulsão. No processo de homogeneização por agitação, o solvente evapora após difusão através da
fase contínua na interface água/ar. Quando a evaporação do solvente ocorre, as microesferas
tornam-se rígidas e podem ser resgatadas por filtração ou centrifugação, sendo ainda lavadas e secas
de modo adequado (O’Donnell e McGinity, 1997).
A formação das microesferas pode ser afetada por muitos fatores. Entre as principais
variáveis, estão a natureza e solubilidade do fármaco a ser encapsulado, a concentração,
a
composição, o peso molecular do polímero, a relação entre o polímero e o fármaco utilizada, a
solubilidade do fármaco, o solvente orgânico utilizado, concentração e a natureza do tensoativo
utilizado, a temperatura, a taxa de difusão, a velocidade de agitação usada no processo de
emulsificação, viscosidade e relação entre a fase dispersa e a contínua. Na emulsificação seguida de
evaporação do solvente, o uso de uma emulsão simples é mais apropriado para fármacos que são
insolúveis em água ou pouco solúveis em meio aquoso (Benoit et al., 1996; O’Donnell e McGinity,
1997; Jain, 2000).
Algumas estratégias permitem a redução da perda de princípio ativo e aumento da taxa de
encapsulação, como o uso de co-solventes, modificação química ou ainda ajuste de pH da fase
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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aquosa externa. Entretanto todas estas estratégias trazem alguns inconvenientes, sendo que para
agentes ativos solúveis em água o uso de emulsões múltiplas é a melhor alternativa para a obtenção
de microesferas (O’Donnell e McGinity, 1997, Jain, 2000).
2.5.1.8. Emulsão Água em Óleo em Água (Emulsão Múltipla)
Neste sistema, o princípio ativo pode ser incorporado em uma solução aquosa, a qual é
colocada em contato com a solução orgânica contendo o polímero para formar uma emulsão do tipo
água em óleo (W/O). Esta emulsão primária é então emulsificada em uma fase aquosa externa
levando a formação de uma emulsão múltipla do tipo água em óleo em água (W/O/W). A fase
orgânica irá atuar como uma barreira entre os dois compartimentos aquosos prevenindo a difusão do
fármaco para a fase aquosa externa. Esta emulsão é então submetida à remoção do solvente por
processos de evaporação do solvente. As microesferas solidificadas obtidas são então lavadas e
coletadas por filtração ou centrifugação. Estas são então secas sob condições apropriadas,
resultando no produto microsférico final (Ghaderi et al., 1996; Jain, 2000).
OBJETIVOS
Pimentel, L. F.
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3. OBJETIVOS
3.1. Geral
O presente trabalho visa o desenvolvimento de formulações microencapsuladas de sulfato de
quinina, para a sua utilização na terapia antimalárica.
3.2. Específicos
♦ Obter e caracterizar físico-químicamente microesferas de PLGA contendo sulfato de
quinina;
♦ Realizar um estudo preliminar de estabilidade das formulações
♦ Avaliar a cinética de liberação in vitro de sulfato de quinina microencapsulado;
♦ Determinar a atividade antimalárica in vivo de sulfato de quinina microencapsulado;
ARTIGO I
Pimentel, L. F.
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4. ARTIGO I
ATIVIDADE ANTIMALÁRICA IN VIVO DE MICROESFERAS DE PLGA
CONTENDO SULFATO DE QUININA
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Pimentel, L. F.
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32
IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE
SULPHATE-LOADED PLGA MICROSPHERES
Lúcio Figueira Pimentel1,2, Vanessa Carla Furtado Mosqueira3 , Nereide Stela Santos-Magalhães1,4*
1
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA), Recife, PE, Brazil
2
3
Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFPE)
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), Departamento de Farmácia, Ouro Preto, MG, Brazil
4
Departamento de Bioquímica (UFPE)
Keywords: Malaria; Plasmodium falciparum; Quinine sulphate; PLGA microspheres; Antimalarial
activity
* Corresponding author
Dr. Nereide Stela Santos Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos e Vacinas
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária,
50670-901, Recife, PE, Brazil
Tel: +55 81 21268484; Fax: +55 81 21268485
E- mail: [email protected]
Pimentel, L. F.
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Abstract
Quinine sulphate is the drug of choice for the treatment of the most cases of chloroquine resistant
falciparum malaria. However, the quinine has a low therapeutic index and its use at large dose is
usually associated with severe side effects, such as cinchonism. In order to circumvent this
drawback, quinine sulphate- loaded microspheres were prepared and the antimalarial activity was
investigated on mice infected with Plasmodium berghei. Quinine sulphate- loaded microspheres
prepared using the double emulsion technique presented spherical shaped particles ranging from
1.53 to 7.65 µm. The drug encapsulation efficiency attained 50.34 ± 0.62%. The in vitro release
profile of quinine sulphate from microspheres showed a bimodal behavior. A burst effect of 42%
was initial observed, followed by a gradual drug release achieving 72% within 144 h. Microspheres
administered in mice by subcutaneous route were at least as efficient as the free quinine sulphate
administered by s.c. injection at 20 mg/kg for four days. Nevertheless, no efficacy improvement
was achieved with microencapsulation of quinine sulphate. A parenteral microsphere-based
formulation of quinine sulphate is however feasible, which can ensue a potential strategy to achieve
a controlled therapeutic effect in the treatment of malaria.
Pimentel, L. F.
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1. Introduction
The malaria is a worldwide spread disease, which afflict and kill million people in the world.
Drug resistance is probably the major drawback to achieve a successful malaria control. Since the
emergence of multidrug-resistant falciparum malaria, the search for new antimalarial drugs and
more efficient treatments involving drugs combinations are urgently needed [1]. About 40% of the
world’s population lives in malaria-endemic areas [2]. Population of high contamination risk is that
living under poverty, isolation, and inadequate health services with delay in receiving appropriate
treatment [3]. The WHO estimates the prevalence of this disease in order of 300 million new
clinical cases per year and it is predicted that two million people will pass away each year due to
malaria [4]. Malaria is even believed as a major obstacle to the development and the economic
advancement of countries within the tropical Africa [3].
Plasmodium falciparum malaria causes annually hundred of thousand of death, and a large
proportion of morbidity [5,6]. P. falciparum is the most pathogenic among the four species that
infect humans, and is the principal cause of severe disease, since the other species of malaria rarely
cause death or persistent sequela [2]. It is encountered throughout the tropics, and has developed
resistance to almost all presently available drugs. Resistance has severely limited the use of
chloroquine for P. falciparum [7]. Chloroquine-resistance is widespread, however quinine has been
used to treat malaria for more than 350 years, and moderate resistance has only recently developed
in limited geographic areas [8,9]. Quinine is consequently an effective replacement for chloroquine
and remains a first- line drug for the treatment of falciparum malaria, including severe cases [7, 10].
Suggested regimens by WHO are based on quinine administered intravenously or intramuscularly
for the treatment of severe malaria in both children and adults [2, 11].
There are several pharmacological factors that may have contributed to the upholding
efficacy of the quinine. First, it quite often causes annoying side effects, so people are unlikely to
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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take the drug unless absolutely necessary. Second, quinine has a relatively short elimination halflife (11 hours) [12]. That requirement for repeated administrations, less probability of
subtherapeutic concentrations in the blood stream and little evolutionary selective resistance [8].
Quinine has a small therapeutic index, and its use is often associated with side effects such
as fever, confusion, respiratory arrest, and arrhythmias. Even standard doses produce symptoms of
“cinchonism,” i.e., tinnitus, giddiness, blurred vision. Hypoglycaemia and hypotension are further
more serious side effects of a rapid administration of quinine [13].
These constraints reduce the patient compliance and the usefulness of quinine in P.
falciparum treatment. In this way, a controlled release dosage forms may be valuable to improve the
efficacy of this drug by reducing the frequency of administrations and by decreasing plasma level
fluctuations [14]. Controlled delivery systems provide more uniform concentration of drug at the
absorption site and are able to maintain plasma concentration within the therapeutic range.
Simultaneously, they minimize side effects, and improve patient compliance to treatment. The
drugs associated to these formulations could present more suitable administration regimens and
habitually are less toxic when compared with the free drug administration [15].
A variety of synthetic biodegradable polymers have long been used to develop controlled
drug delivery systems. Biodegradable microspheres prepared from a copolymer of poly(lactic-coglycolic acid) (PLGA) have been used as oral or injectable drug delivery systems [15]. The
adjustable degradation rate of these biodegradable devices provides an efficient means to control
and prolong the release of encapsulation of a variety of compounds [16].
Ogawa et al., 1988 [17], developed a water- in-oil- in-water (w/o/w) emulsion technique to
encapsulate water soluble active agents with higher efficiency. Since then, several studies report on
the encapsulation of hidrophylic drugs into microspheres using this technique [13,18-22].
The water solubility property of quinine sulphate turn it into a actual candidate to be loaded
in microspheres prepared by the water-oil-water double emulsion method, which is suitable for
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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parenteral administration. It is expected that this kind of formulation could able to modify the
pharmacokinetics of the entrapped drug, producing sustained drug blood concentration.
An attempt was thus made in this study to develop and characterize a formulation of poly
(D,L-lactide)-co-glycolide microspheres containing quinine sulphate as a controlled release system
for the treatment of malaria. Their in vitro kinetic profile and their in vivo efficacy were evaluated
on mice infected with P. berghei using a four-day standard test.
2. Materials and Methods
2.1. Materials
Poly (D,L- lactide-co-glycolide) acid (PLGA) 50:50 (0.17 dl.g-1 ), was purchased from
Birmingham Polymers Inc. (Alabama, USA); Poly vinyl alcohol (PVA, MW. 30 000-70 000);
Polyethylene Glycol (PEG, mw. 4000), D (+) Trehalose dihydrate and standard quinine sulphate
were obtained from Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, USA). Quinine sulphate was obtained from
Henrifarma (São Paulo, Brazil). HPLC grade acetonitrile, analytical grade solvents and reagents
were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). Ultrapure water was obtained by a Milli-Q
purification System from Millipore (Molshein, France). Plamodium berghei strains were kindly
supplied by Dr. Érika Martins Braga, from the Department of Parasitology of the Federal University
of Minas Gerais, Brazil.
2.2. Methods
2.2.1. Preparation of empty and quinine sulphate–loaded PLGA microspheres
The microspheres were formulated according to the modified method previously described
[23], using the double emulsion solvent evaporation technique. Several batches were developed by
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
37
modifying the continuous phase pH, the polymer/drug ratio, and the solvent organic phase volume,
as an attempt to derive more stable formulations (Table1).
Briefly, PLGA (450 mg) was dissolved in methylene chloride (8, 10 or 12 ml) and
homogenized with several amounts of quinine sulphate (QS) (10, 25 or 50 mg) dissolved in
deionized water (five milliliters) with PEG 4000 (400 mg), using a mechanical homogenizer (UltraTurrax T25, Ika, Germany) at 8,000 rpm for 60 seconds in an ice bath, resulting in a simple
emulsion (w/o). The result ing emulsion was added to a continuous phase constituted of 50 ml PVA
solution (0.5% w/v) at pH (6, 8, 9 or 10) adjusted with diethylamine solution (10% w/v) and
emulsified at 8,000 rpm for 30 seconds, resulting in a double emulsion (w/o/w). This emulsion was
then stirred with a four-blade propeller (Mechanic stirrer RE 162/P, IKA, Germany) at room’s
temperature at 400 rpm for four hours to allow the solvent evaporation followed by the
microspheres formation. The microspheres were collected by centrifugatio n (Kubota KN-70
centrifuge, Japan) at 3,000 rpm for five minutes and washed three times with 20 ml of deionized
water. Microspheres were finally dispersed with 1.0 % threalose aqueous solution (w/v), which was
frozen overnight at –80ºC before lyphilisation (EZ-DRY, FTS System, New York, USA) operated
at 200 bars for 16 hours. Unloaded microspheres were prepared under the identical conditions. The
PLGA- microspheres were stored at 25ºC ± 2 ºC in vacuum desiccators.
2.2.2. Characterization of quinine sulphate-loaded microspheres
Morphological Analysis
The morphology of microspheres was analyzed by light microscopy (Olympus CH-2, USA)
to evaluate the microsphere homogeneity and the particle size. The average particle size was
visually determined by counting 200 microspheres. The shape and surface morphology of dried
microspheres were examined by scanning electron microscopy (SEM), using an electron
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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microscope (JSM-T200, JEOL, Japan). A sample of lyophilized microspheres was ressuspended in
distilled water to obtain a homogeneous suspension, dry in vacuum desiccators, and placed in a
surface of a metallic support, which was coated with colloidal gold using a sputter module in a
high- vacuum evaporator (JFC-1100, JOEL, Japan). Microspheres were then examined and
photographed under the microscope at 10 kV.
Quinine sulphate assay by HPLC Method
The Pharmacopoeia method [24] was adapted to quantify the quinine sulphate content using
a computer-assisted HPLC System (Shimadzu SCL-6B, Japan) composed of a UV/VIS detector and
manual injector with a 20 µl loop. The chromatographic run was performed using a µBondapack
C18 column (10 µm particle size, 125 Å porous size, 300 mm × 3.9 mm I.D. Waters, USA) and a
mobile phase of HPLC grade acetonitrile/ultrapure water (Milipore ultra pure water system) / 10%
diethylamine solution (w/v)/ 10% orthophosphoric acid solution (w/v) (80:16:2:2), pH adjusted to
2.6 with 10% orthophosphoric acid solution (w/v). Sample aliquots (20 µl) were injected and eluted
with the mobile phase at a flow rate of 1.5 ml.min–1 . The quinine sulphate peak was verified at a
wavelength of 250 nm (0.005 a.u.f.s.) with a retention time of about 4.5 min. The amount of quinine
sultafe into microspheres was determined through the standard calibration curve, which was
prepared for concentrations varying from 2.5 µg.ml–1 to 50 µg.ml–1 . A stocked standard solution (1
mg.ml–1 ) was prepared with ten milligrams of standard quinine sulphate in 50 ml of mobile phase.
Each experiment was performed in triplicate.
Content of quinine sulphate and encapsulation efficiency
Accurately weighed samples of loaded microspheres (5 mg) were dissolved in methylene
chloride (10 ml) under ultrasound agitation for 15 minutes with the aim of determining the drug
content after the dissolution of microspheres. One milliliter of resulting solution was diluted with
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
39
five milliliters of HPLC mobile phase, filtered through a 0.45 µm membrane filter (Millipore) and
injected into an HPLC system to obtain the drug concentration.
The entrapment efficiency was evaluated from the ratio of the quinine sulphate content into
the microspheres and the theoretical amount of this drug into microspheres, calculated by the
quinine sulphate amount used for preparation of microspheres.
Percentage entrapment efficiency (%) =
Quinine sulphate content into microspher es
× 100
Theoretica l content of QS into microspher es
Preliminary stability studies of quinine sulphate loaded-microspheres
A preliminary stability studies of quinine sulphate encapsulated into lyophilized PLGA
microspheres was performed by measuring the lost of quinine sulphate content in the microspheres
along the time, when the microspheres were stored at 25ºC. At pre-determined time intervals,
samples of microspheres were collected and morphological characteristics were observed. Assay by
HPLC method was used to determine the quinine sulphate content in the microspheres as above
described.
In vitro kinetic release of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres
The in vitro release profile of quinine sulphate from microspheres was determined along
with the procedure by Herrmann and Bodmeier, 1998 [14]. Drug- loaded PLGA microspheres (5
mg) were resuspended in five milliliters of 20 mM phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). The
tubes were incubated in a horizontal shaker with a water bath (Polytest 20, Bioblock Scientific
86507) at 37ºC ± 1ºC and shaken at 180 rev.min–1 with samples intervals (1, 24, 48, 72, 96, 120 and
144 hours). Samples of two milliliters of the dissolution medium were withdrawn and centrifuged at
2,800 rpm for five minutes in order to separate any microsphere present in the sample. The
supernatant was removed and the amount of quinine sulphate was measured by the above described
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
40
HPLC method. Assays were performed in triplicates and results were expressed in percentage of the
mean values and their corresponding standard deviations.
2.2.3. Antimalarial activity of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres
The in vivo antimalarial activity of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres was
determined by means of the "four-day suppressive test" described by Peters et al., 1975 [25]. Tests
were performed against Plasmodium berghei NK-65, which is sensitive to all current antimalarial
drugs and is characterized by a high mortality in mice, providing thus a suitable model to estimate
efficacy in reducing parasitemia. This strain was frozen stored in liquid nitrogen with glycerolyte. It
was also maintained through weekly blood passages in mice infected by intraperitoneal route (i.p.)
using the heparin as an anticoagulant in saline solution.
Female, seven week aged, adult Swiss albino mice weighing 27 ± 3 g from “Ouro Preto
Federal University animal facility” were inoculated by retro orbital route with 1×106 Plasmodium
berghei infected-red blood cells in 0.2 ml inoculum’s obtained from the donor mouse with rising
parasitaemia. Animals were firstly infected on the day namely zero (D+0), and were randomly
divided in four groups of ten animals per cage.
Two hours later, the treatment started with four consecutive daily doses of quinine sulphate
microspheres (20 mg/kg per day); or unloaded microspheres; quinine sulphate solution (20 mg/kg
per day) as a free drug. Untreated controls received 0.5 ml of saline (0.9%) by s.c. route. All
microspheres preparations were subcutaneously (s.c.) administered in 0.5 ml of suspens ion with
saline 0.9% and 0.1% Tween 80.
Thin blood smears were made from tail blood from untreated controls and from treated
animals on the days (D+4, D+6, D+8 and D+10), fixed with methanol, and stained with Giemsa.
Levels of parasitemia (the percentage of infected erythrocytes, ring stages and schizonts) were
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
41
microscopically determined (magnification 1,000×) by examining 3,000 cells. The percentage of
parasitemia suppression was calculated for each group in comparison with infected non treated
control group.
At days 5, 7 and 9, the red blood cell content (RBC) of treated animals was indirectly
estimated by hematocrit percentage and compared with the untreated groups. The parasitemia
levels, the variation in body weight from D0 to the D10, and the mean sur vival time were used to
evaluate the in vivo antimalarial activity.
2.2.4. Statistics
All erythrocyte counts and parasitemia levels are expressed as mean value ± S.D (n= number
of surviving mice at a determined time of treatment). The parasitemia data were analyzed by the
one-way ANOVA test. Mean survival times were compared using Student's t-test considering a
significance level of 5%.
3. Results and discussion
3.1. Preparation of quinine sulphate-loaded microspheres
Pre-formulation studies were performed to guide the choice of the concentrations of
constituents for obtaining stable formulation of quinine sulphate- loaded microspheres. The
preparations conditions of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres are listed in Tables 2 to 4.
The solvent evaporation method is a basic technique to prepare microspheres and involves
two major steps, namely the formation of stable droplets of the drug-containing polymer solution
and the subsequent removal of solvent from these droplets. Some factors can make hard this
manufacturing, such as the polymer concentration, the solvent nature, the phase volume ratio of
organic and aqueous phases, the continuous phase pH, the used stabilizer, the time and stirring
speed, etc. [15, 26, 27]. Some of these effects were investigated, but further information is required
to elucidate the complete processes of microspheres formation.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
42
Table 1
Formulation of quinine sulfate- loaded PLGA microspheres.
Formulations
Constituents
1
2
3
4
5
6
7
8
PLGA 50:50 (g)
450
450
450
450
450
450
450
450
Quinine sulphate (g)
25
25
25
25
50
10
25
25
PEG 4000 (mg)
400
400
400
400
400
400
400
400
PVA solution 0.5% (w/v) (ml)
50
50
50
50
50
50
50
50
pH of PVA solution 0.5%
6
9
10
11
10
10
10
10
Methylene choride (ml)
10
10
10
10
10
10
8
12
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
43
The effect of the pH of the aqueous phase on the second emulsification process was
examined (Table 2). It was observed that the pH of the external aqueous phase plays an important
role on the entrapment efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres. The alkaline pH of
the external phase raises the retention of drug in the internal aqueous phase during the
manufacturing of microspheres by the double emulsion method. This strategy was used in
accordance with Bodmeier and McGinity [27], to reduce drug loss in external aqueous phase. The
effect of the continuous phase pH in the encapsulation efficiency of the quinine sulphate in PLGA
microspheres was similar at pH 9 and 11, but increased at pH 10, achieving the highest
encapsulation rate (50.34 ± 0.62).
Table 2
Evaluation of the influence of the aqueous phase pH on the quinine sulphate entrapment efficiency
in PLGA microspheres.
pH of the aqueous
Quinine sulphate encapsulation rate (%)
continuous phase
6
30.57± 0.60
9
47.01 ± 0.33
10
50.34 ± 0.62
11
44.73 ± 2.86
Data: mean ± S.D. (standard deviation), n=3.
The low encapsulation efficiency could be explained by the hidrophilicity of quinine
sulphate, its affinity to the aqueous phase and a much higher tendency to diffuse into water phases.
Quinine has two basic nitrogen atoms of pKa approximately 4.3 and 8.5 (the quinoline nitrogen
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
44
having the lower basicity). The molecule is thus likely to be at least partially protonated over the
whole pH range between two and eight [28]. This effect allows decreasing the solubility of drug in
alkaline solutions, and subsequently limiting potential drug loss into the external PVA solution.
Previous investigations described that the loss of the encapsulated hydrophilic active agent
during the microspheres formatio n process essentially resulted from its diffusion in the inner water
phase to the outer water phase [29]. Furthermore, the entrapment efficiency can be affected by the
stability of o/w and w/o/w emulsions, the solvent removal rate, the interactions among drug,
polymer and solvent, and particle size [30].
Despite the fact of the quinine sulphate physicochemical properties include photo sensibility
and chemical instability, an encapsulation of (10, 25 or 50 mg) quinine sulphate was achieved into
microspheres prepared with 450 mg of PLGA and pH 10 of external aqueous phase. At the 1:18
drug-polymer ratio, the best quinine sulphate encapsulation efficiency (50.34 ± 0.62) and more
stable microspheres were attained for an initial payload of 25 mg of QS. The encapsulation
efficiency of the quinine sulphate into PLGA microspheres for different drug-polymer ratio is
presented in Table 4. The encapsulation efficiency decreases at higher quinine sulphate
concentrations achieving 41.2 for a 1:9 drug-polymer ratio.
Table 3
Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg of polymer)
Quinine sulphate amount (mg)
Encapsulation Efficiency (%)
10
43.41 ± 0.70
25
50.34 ± 0.62
50
41.21 ± 0.87
Data: mean ± S.D. (standard deviation), n=3.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
45
The influence of the solvent volume at a constant aqueous phase volume on the QS-MS
encapsulation efficiency was evaluated as shown in Table 3. Methylene chloride was used in the
organic phase because of its ease removal, and excellent ability to dissolve polymer and allow the
microspheres formation. The drug encapsulation efficiency decreased when eight or twelve
milliliters was used. This can probably be accounted for the primary emulsion instability and the
diffusion of quinine sulphate amount not emulsified to the external aqueous phase during the
solvent evaporation step, explaining the low encapsulation efficiency obtained. Some publications
have evaluated the relevance of the primary emulsification stage for increasing entrapment
efficiency and for controlling the internal structure of microparticles prepared using the (w/o/w)
emulsification solvent evaporation technique [30, 31].
Table 4
Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg of polymer)
Solvent volume (ml)
Encapsulation Efficiency (%)
8
36.95 ± 0.13
10
50.34 ± 0.62
12
41.40 ± 0.13
Data: mean ± S.D. (standard deviation), n=3.
When eight milliliters of methylene chloride was used, the higher polymer concentration
leaded to a less effective emulsifying process. This result is in accordance with those of Schlicher et
al., 1997 [32], who observed a decreasing in the encapsulation efficiency of a water soluble
antimalarial agent, after increasing the volume of the internal phase at a fixed polymer
concentration and volume (i.e. increasing the ratio of inner aqueous phase/organic phase in primary
emulsion). This effect takes place because the organic polymer phase acts as a diffusion barrier for
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
46
the drug between the internal and external aqueous phase. The thickness of this layer decreases with
increasing the volume of internal aqueous phase and leads to less stable w/o emulsions with larger
droplets of the internal aqueous phase [31]. The highest encapsulation rate (50.34 ± 0.62) was
achieved for microspheres prepared with 25 mg of quinine sulphate and ten milliliters of methylene
chloride.
Optimization studies resulted in a typical microsphere formulation prepared with 450 mg of
PLGA, 400 mg of PEG, 25 mg of quinine sulphate, 50 ml of 0.5% PVA solution with pH 10, and
10 ml of methylene crloride. The relative fairly small encapsulation efficiency achieved can be
attributed to the solubility of the quinine sulphate in the aqueous phase and the loss of quinine to the
external aqueous phase, where most of the drug was found.
3.2. Characterization of quinine sulphate-loaded microspheres
The characteristics of ressuspended lyophilized MS-QS were suitable for further
subcutaneous injection and the particles shown no aggregation. Lyophilized PLGA microspheres
containing quinine sulphate were evaluated vis-à-vis their morphological characteristics,
encapsulation efficiency and stability at long-term.
Lyophilized quinine sulphate- loaded PLGA microspheres presented initial macroscopic
aspect as a pastille, which release the powder with soft touch. Microscopic analysis showed
spherical shaped microspheres and the particle size analysis showed a homogeny population
distribution. A mean diameter of 3.53 ± 1.53 µm was estimated by particle counting.
Scanning electron microscopy (SEM) is an excellent tool for morphological observation of
microspheres. It is helpful not only to examine microspheres shape, but also to observe surface
characteristics. The microspheres obtained in this work were spherical, smooth and homogeneously
distributed. The microphotographs do not display any pores on microsphere surface. However,
some crystals were observed in microspheres surface prepared with more than 50 mg of quinine
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
47
sulphate, but this effect was not observed when microspheres were prepared with 25 mg of quinine
sulphate (Fig. 1).
The content of quinine sulphate was 26.6 µg/mg after microsphere preparation and this
content was roughly maintained (23.9 µg/mg, 90.2%) after 230 days of storage at 25ºC.
a)
b)
c)
Fig. 1. Photomicrograph of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres prepared using multiple
emulsion technique followed by solvent evaporation method, with 25 mg quinine sulphate and 450
mg PLGA. a) SEM of microsphere 3,500 ×; b) SEM of microsphere surface 11,000 ×; c) SEM of
microsphere prepared with 50 mg quinine sulphate and 450 PLGA 15,500 ×, shown some crystals
in the microsphere surface.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
48
In vitro kinetic release of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres
The in vitro release profile of quinine sulphate from PLGA particles (formulation 2)
presented a typical bimodal behavior, comprising an initial burst effect followed by a sustained
continuous phase. A large burst effect (42.6 ± 0.48%) occurs in the first hour (Fig. 2). This effect
could be attributed to the immediate dissolution and release of portion of the drug adsorbed at the
surface of microspheres. This burst step was followed by a slow and gradual release rate of quinine
Released quinine
sulphate (%)
sulphate reaching 72.2 ± 0.84 within 3 days.
100
80
60
40
20
0
0
24
48
72
96
120
144
Time (hours)
Fig. 2. In vitro release profile of quinine sulphate from PLGA microspheres. Error bars represent
the standard deviation for n=3 experiments.
3.3. Antimalarial activity of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres
The standard 4-day suppressive test was chosen in order to evaluate the activity of PLGA
microspheres loaded with quinine sulphate for the treatment of Plasmodium berghei- infected mice.
Four consecutive days subcutaneous treatment of 20 mg/kg/day was not able to reduce parasitemia
to low levels under our experimental conditions.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
49
A dramatic increase in the parasitemia was observed after six days of animal’s infection
(Fig. 3). Untreated control mice was highly parasitized (about 20%) by day 10 and died on days 10
to 19. The treatment with QS-MS was able to reduce parasitemia to low levels on day 10 (16.3 ±
8.2%) compared to the untreated control group (19.2 ± 7.1%). However, no significant difference
was found. The group treated with free quinine sulphate has lower parasitemia by day 10 (about
10%) and died on days 19 to 20. One-way ANOVA test for parasitemia data and shown a
significant difference between one of treatments (p<0.05). The Student’s t-test demonstrated there
is a statistically significant difference between the group treated with free quinine soleplate and the
other treatment groups.
% Parasitemia
25
Control
20
MS
15
MSQS
QS
10
5
0
2
4
6
8
10
Day
Fig. 3. Antimalarial activity of free and microencapsulated quinine sulphate against Plasmodium
berghei-infected mice in a four-day-test. Mice were treated with 20 mg/kg/day of quinine sulphate
for four consecutive days for both microsphe res loaded with quinine sulphate (MS-QS) and quinine
sulphate (QS) formulations. Untreated control received saline and unloaded microspheres (MS).
Each point represents the mean ± standard deviation. (n=10).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
50
The RCB (106 /µl) values were 8.65 ± 0.7 and 5.6 ± 2.04 on days 5 and 9, respectively for
MS-QS group and 8.63 ± 0.6 and 5.69 ± 1.3 for control group showing that treatment was not able
to reverse anemia. These results were analyzed by one-way ANOVA test and shown the ρ-value
was more than 0.05, thus, there is no statistically significant difference between treatment groups at
95% confidence level.
Animal body weight was roughly maintained in all groups during the treatment (Fig. 4). No
significant difference (p<0.05) was found when one-way analysis of variance was performed and
the effect of the treatments were evaluated. The decrease of animal body weight seems to be only
related to the infection development not to a potential toxicity of the microspheres.
30
Weight (g)
28
27
Control
MS
25
MSQS
QS
24
22
0
2
4
6
8
10
Day
Fig. 4. Body weight (g) of mice infected P. berghei in four-day suppressive test, treated with
quinine sulphate microspheres PLGA by subcutaneous injection of 20 mg/kg/day of quinine
sulphate. Each point represents the mean ± S.D. for ten mice.
MST obtained with the different groups ranged from 10 to 27 days. Mice treated with MSQS had a slightly extend mean survival time, with 60% of the mice living for more than 16 days
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
51
post-infection. The statistical analysis demonstrated no difference between MS-QS treatment and
the other evaluated treatments. Table 5 summarizes the results of RBC and MST test. Indeed, minor
variations were obtained with MS-QS.
Table 5
RBC and MST of Swiss mice infected with P. berghei treated with PLGA microspheres loaded
with quinine sulphate.
RBC (106 /µL)
MST
Treatment
Day 5
Day 7
Day 9
(days)
CONTROL
8.63±0.56
5.97±0.93
5.69±1.32
15.6±2.91
MS
9.02±0.97
6.87±0.89
4.68±0.68
18.20±3.68
MS-QS
8.65±0.7
7.72±2.92
5.61±2.04
16.5±2.55
QS
8.61±0.81
7.45±0.84
6.23±1.21
19.4±0.52
Mice were treated by s.c. route with 20 mg/kg/day in a four-day suppressive test;
RBC = red blood cells; MST = mean survival time.
Quinine sulphate-loaded PLGA microspheres at 20 mg/kg/day did not provide any
protection against P. berghei. The free quinine sulphate at the same dose was also unable to treat
animals or reduce parasitemia. However, it is interesting to note that on the day D+10, the QS
formulation was better in reducing parasitemia. Microspheres were conceived in this work so as to
prolong release of quinine in the body, and it should be expected that their effect in reducing
parasitemia would be retarded when compared with that of free quinine. In our experiments,
however, even free quinine was not able to diminish sanguine forms of P. berghei in the first hours
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
52
post-infection, which resulted in progress of the infection in contrast with our expectations of
arresting the growth of the murine infection. MS-QS in vitro release only 40% of drug in the first
hour and reduce even more the amount of quinine available to produce antimalarial effect. This fact
suggests that higher doses of quinine should be tested in further experiments to produce a decrease
of parasitemia in the first days after infection. Some evidence the effect of drug slow release from
microspheres during the infection could be remarked.
4. Conclusions
Quinine sulphate remains as a foremost active antimalarial agent against P. falciparum chloroquineresistant strains, but it presents a few side effects and short elimination half- life that obligate
repeated administrations. Biodegradable microspheres for controlled release of quinine sulphate
were successively prepared by w/o/w emulsion solvent evaporation process with stable and
spherical shaped particles with a mean diameter 3.53 µm ± 1.53. It was observed that the pH of the
external aqueous phase plays an important role on the entrapment efficiency of quinine sulphate
into PLGA microspheres. The alkaline pH of the external phase enhances the retention of drug in
the internal aqueous phase of microspheres preparation, so improving the encapsulation efficiency.
The drug release profile was investigated and a typical bimodal behavior was obtained, which
comprises an initial first burst effect followed by a sustained continuous phase characterizing a
controlled release system. The lyophilized PLGA-MS were very stable during 230 days concerning
their quinine sulphate content. No difference between the activity of MS-QS and free QS were
evidenced in a “four day standard test”, maybe due to the fact of such a low dose was enable to
arrest the development of infection. A better protocol will be adopted in further experiments in
order to address the formulations differences and the usefulness of the quinine microsphere system.
The results suggest that parenteral MS-based formulation of quinine sulphate is feasible and would
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
53
be offered as an alternative to obtain sustained release of quinine in the body, for the treatment of
malaria.
Acknowledgements
This work received partial support from the Brazilian National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq). NSSM is grateful to CNPq for research grant 479979/01-4.
NSSM and VCFM thanks CNPq and the Brazilian Research and Development Ministry
(Nanobiotechnology Network). Authors are also grateful to Dr. Érika Martins Braga for supplying
P. berghei NK65 strains.
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CONCLUSÕES
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
59
5. CONCLUSÕES
♦ Foram obtidas microesferas de PLGA contendo sulfato de quinina, com taxa de encapsulação de
50,34 ± 0,62, correspondente a concentração de 26,53 µg/mg e diâmetro médio de 3,53 ± 1,53
µm;
♦ As microesferas obtidas mostraram forma esférica e superfície lisa, com uma boa
homogeneidade e distribuição do tamanho das partículas;
♦ As microesferas de PLGA liofilizadas, contendo sulfato de quinina, mostraram-se estáveis, por
230 dias quando armazenadas a 25ºC, no estudo pré-liminar de estabilidade.
♦ O perfil cinético da liberação in vitro de sulfato de quinina a partir das microesferas de PLGA
apresentou comportamento bimodal, com uma rápida liberação inicial de 42% em uma hora,
seguido de liberação gradual, atingindo 72% de liberação em 48 horas.
♦ O sulfato de quinina microencapsulado adminsitrado na dose de 20 mg/Kg de peso do animal de
sulfato de quinina, não demonstrou proteção significativa contra a infecção de Plamodium
berghei em camundongos. Entretanto, um novo protocolo já esta sendo aplicado com dose de
120 mg/kg de peso do animal, com resultados preliminares que indicam a eficácia do sistema
em controlar a infecção induzida nos camundongos.
PERSPECTIVAS
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
61
6. PERSPECTIVAS
§
A realização de ensaios de atividade antimalárica das micropartículas com um protocolo
experimental que permita a utilização de diferentes doses para comparação dos resultados, com
a prioridade para a dose de 120 mg/kg de sulfato de quinina;
§
Realização de estudos de transposição industrial do sistema desenvolvido, com o
desenvolvimento de lotes de bancada, escala piloto e escala industrial.
§
O desenvolvimento de uma forma farmacêutica sólida oral (cápsula), utilizando as microesferas
desenvolvidas; validação da metodologia de análise e elaboração dos parâmetros de fabricação e
controle de qualidade do produto.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
Anexo I - Resumos enviados para Congressos
1. PIMENTEL, L.F., JÁCOME-JUNIOR A.T., SANTOS-MAGALHÃES N.S. Preparation and
Characterisation of Quinine Sulphate- loaded Microspheres. Durante o VII PHAMATEC – IV
ENEQ, João Pessoa, Paraíba, Brasil, Agosto/2003.
PIMENTEL, L.F., JÁCOME-JUNIOR A.T., SANTOS-MAGALHÃES N.S. Biodegradble Quinine
Sulphate- loaded Microspheres. Durante a 2ª Reunião da Rede de Nanobiotecnologia, Campinas,
São Paulo, Brasil, Outubro/2003.
3. PIMENTEL, L.F., MOSQUEIRA, V.C.F.,SANTOS-MAGALHÃES, N.S. Antimalarial Activity
of Quinine Sulphate-Loaded PLGA Microspheres. Durante a XXXIII Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular –SBBq, Caxambu, Minas Gerais, Brasil, Maio/2004.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
Category Code: DD
Preparation and Characterisation of Quinine Sulphate-loaded Microspheres
PIMENTEL, L.F. 1 , JÁCOME-JUNIOR A.T. 2 , SANTOS-MAGALHÃES N.S.1,2
1
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)-Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE, Av. Prof. Artur de
Sá, S/N, Cidade Universitária CEP 50670-901 Recife, Brasil.
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) - UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária
CEP 50670-901 Recife-PE, Brasil, e-mail:[email protected]
Introduction: The malaria is a world-wide spread
an external aqueous phase at pH 10.3. The elevated pH
tropical disease which, require update and more
of the external aqueous phase reduced the solubility of
efficient treatments. The WHO estimates the prevalence
quinine sulphate (pKa=8.5) in this phase, and, limiting
of this disease in order of 300 million new clinical cases
drug loss.
per year and it is predicted that 2 million people will die
Table 1. The effect of pH of the external aqueous phase
due to malaria each year [1]. Quinine sulphate is widely
on the entrapment of quinine sulphate into PLGA adopted as an anti-malarial agent to treat multi-drugmicrospheres.
resistant Falciparum malaria. However some side
effects have been reported. A variety of synthetic
Polymer
Aqueous
Particle
Encapsulation
biodegradable polymers have long been used to develop
phase pH
mean
rate
controlled drug delivery systems. The thermoplastic
diameter
(% ± SD%)
polymers such as polylactic (PLA), polyglycolic (PGA),
(µ m ±SD)
and especially poly lactic-co-glycolic (PLGA) have
PLGA 50/50
8.7
3.73 ± 1.69
47.0 ± 0.23
been the focus of interest due to their biocompatibility
PLGA 50/50
10.3
3.67 ± 1.59
56.3 ± 0.33
and biodegradability [2]. Controlled delivery systems
PLGA 50/50
11.1
3.20 ± 1.32
44.7 ± 2.02
provide more uniform concentration of drug at the
SD = standard deviation
absorption site. Therefore, they allow the maintenance
of plasma concentrations within the therapeutical range.
Simultaneously, they minimise side effects, reduce the
frequency of administration, and improve patient
compliance to treatment [3].
The goal of this work was to develop and characterise
PLGA -microspheres containing quinine sulphate, as a
controlled release system for the treatment of malaria.
Methods : The following chemicals were used: Poly
(lactic -co-glycolic acid)– (PLGA 50/50) (Birmingham
Figure 1. Microphotograph of the quinine sulphatePolymers, USA), polyethylene glycol– (PEG 4000)
loaded PLGA-microspheres (100 ×).
(Labsynth, Brazil), polyvinyl alcohol–(PVA 30/70)
(Sigma, USA), triethanolamine (Merck, Germany). All
Conclusions: Stable and spherical shaped quinine
others reagents were analytical grade. Quinine sulphatesulphate-loaded PLGA -microspheres were obtained
loaded microspheres were prepared by a double
with a mean diameter about 3.53 µm ± 1.53. It was
emulsion (W/O/W) solvent evaporation method. The
verified that the pH of the external aqueous phase play
influence of several preparation parameters, such as
an important role on the entrapment efficiency of
drug and polymer concentration, solvent volume, and
quinine sulphate into PLGA -microspheres. The alkaline
pH of aqueous phase were inves tigated. PEG and PVA
pH of the external phase promoted an improvement on
were used as stabilisers in the first emulsion and in the
the retention of quinine sulphate in the internal aqueous
external aqueous phase, respectively. The influence of
phase during the manufacturing of microspheres by the
the external phase pH on the encapsulation rate of
double emulsion method. Further studies are being
quinine sulphate was evaluated. The pH was varied
carried out to evaluate the in vitro anti malaria activity
from 8.7 to 11.1 by pH adjusting with triethanolamine.
of quinine sulphate-loaded microspheres.
The morphology and the mean diameter of particles
Acknowledgements. This work was supported by
were evaluated by optical microscopy. The content of
CNPq, MCT/CNPq Rede Nanobiotec and FACEPE.
quinine sulphate entrapped into microspheres was
assessed by UV-spectroscopy at 250 nm.
[1] Word Health Organization, The World Health
Results: Morphological observation of PLGA Report
1999.
Malaria.
[WWW]
microspheres containing revealed spherical shaped
URL:http://www.who.int [Accessed 14 may 2003].
particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The calculated
[2] Jain RA (2000). Biomaterials 21, 2475-2490.
mean diameter was 3.53 µm ± 1.53. The highest
[3] Verma RK, Garg Sanjay (2001). Pharmaceutical
encapsulation rate of quinine sulphate into PLGA Technology On-Line 25 (2), 1-14.
microspheres (56.28%±0.33%) was obtained by using
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
PREPARATION OF BIODEGRADABLE MICROSPHERES
LOADED WITH QUININE SULPHATE
Pimentel, L.F.1 , Jácome -Junior A.T.2 , Santos-Magalhães N.S.1,2
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)-Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE, Av. Prof. Artur de
Sá, S/N, Cidade Universitária CEP 50670-901 Recife, Brazil.
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) - UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária CEP
50670-901 Recife-PE, Brazil
email:[email protected]
1
ABSTRACT
Microspheres of Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA 50/50) containing quinine sulphate were prepared by a double
emulsion (W/O/W) solvent evaporation method. The morphology and particle size of microspheres were analyzed. The
influence of several preparation parameters on microspheres stability, such as drug and polymer concentration, solvent
volume, and pH of aqueous phase were investigated. Stable and spherical shaped quinine-loaded PLGA -microspheres
were obtained. With a highest entrapment effiency of 56.3 % ± 0.33.
INTRODUCTION
The malaria is a world-wide spread disease which, require update and more efficient treatments. The WHO estimates
the prevalence of this disease in order of 300 million new clinical cases per year and it is predicted that 2 million people
will die due to malaria each year1 . In Brazil more than 600,000 cases were registered in 2000, 99% being transmitted in
the Amazon region2 . Quinine sulphate (Fig.1), is widely adopted as an anti-malarial agent to treat multi-drug-resistant
Falciparum malaria. However some side effects have been reported. A variety of synthetic biodegradable polymers have
long been used to develop controlled drug delivery systems. The thermoplastic polymers such as polylactic (PLA),
polyglycolic (PGA), and copolymers as poly lactic-co-glycolic (PLGA) have been the focus of interest due to their
biocompatibility and biodegradability3 . Controlled delivery systems provide more uniform concentration of drug at the
absorption site. Therefore, they allow the maintenance of plasma concentrations within the therapeutical range.
Simultaneously, they minimize side effects, reduce the frequency of administration, and improve patient compliance to
treatment4 . The goal of this work was to develop and characterize PLGA -microspheres containing quinine sulphate, as a
controlled release system for the treatment of malaria.
EXPERIMENTAL METHODS
The following chemicals were used: Poly (lactic -co-glycolic acid)– (PLGA 50/50 inherent viscosity 0.44 dL g-1 )
(Birmingham Polymers, USA), polyethylene glycol– (PEG 4000) (Labsynth, Brazil), polyvinyl alcohol–(PVA 30/70)
(Sigma, USA), triethanolamine (Merck, Germany). All others reagents were analytical grade. Quinine sulphate-loaded
microspheres were prepared by a double emulsion (W/O/W) solvent evaporation method. Initially 5 ml of purified
water containing 400 mg polyethylene glycol and 25 mg quinine sulphate was emulsified under vigorous mechanical
stirring (8000 rpm, 1 min) into 10 ml dichlorometane (DCM) containing 450 mg of PLGA. This O/W emulsion was
them dispersed into 50 ml aqueous PVA solution (0.5% w/w) under vigorous stirring (8000 rpm, 30 sec). DCM was
removed at room temperature and mechanical stirring (400 rpm, 4 hours). After the solvent was removed, the
microspheres were formed. The influence of several preparation parameters, such as drug and polymer concentration,
solvent volume, and pH of aqueous phase on microsphere stability was investigated. PEG and PVA were used as
stabilisers in the first emulsion and in the external aqueous phase, respectively. The influence of the external phase pH
on the encapsulation rate of quinine sulphate was evaluated. The pH was varied from 8.7 to 11.1 by pH adjusting with
triethanolamine. The morphology and the mean diameter of particles were evaluated by optical microscopy. The content
of quinine sulphate entrapped into microspheres was assessed by UV-spectroscopy at 250 nm.
RESULTS AND DISCUSSION
Morphological observation of PLGA-microspheres containing quinine sulphate revealed spherical shaped particles
ranging from 1.53 to 7.65 µm. The mean diameter was 3.53 µm ± 1.53. The highest encapsulation rate of quinine
sulphate into PLGA-microspheres (56.28%±0.33%) was obtained by using an external aqueous phase at pH 10.3. The
elevated pH of the external aqueous phase reduced the solubility of quinine sulphate (pKa=8.5) in this phase, improving
drud entrapment and, limiting drug loss during microsphere preparation.
Images of Chemical structure of quinine sulphate (Fig.1).
Optical microscopy were obtained and showed Quinine sulphate incorporated into the particles (Fig.2).
Images of optical microscopy were obtained and showed Quinine crystals (Fig.3).
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
Table 1. The effect of pH of the external aqueous phase on the entrapment of quinine sulphate into PLGA microspheres.
Polymer
Aqueous
Particle mean diameter
Encapsulation rate
phase pH
(µm ±SD)
(% ± SD%)
PLGA 50/50
8.7
3.73 ± 1.69
47.0 ± 0.23
PLGA 50/50
10.3
3.67 ± 1.59
56.3 ± 0.33
PLGA 50/50
11.1
3.20 ± 1.32
44.7 ± 2.02
SD = standard deviation
CONCLUSION
Stable and spherical shaped quinine-loaded PLGA -microspheres were obtained with a mean diameter about 3.53 µm ±
1.53. It was verified that the pH of the external aqueous phase play an important role on the entrapment efficiency of
quinine sulphate into PLGA -microspheres. The alkaline pH of the external phase promoted an improvement on the
retention of drug in the internal aqueous phase during the manufacturing of microspheres by the double emulsion
method. Further studies are being carried out to evaluate the in vitro anti malaria activity of quinine-loaded
microspheres.
REFERENCES
1. Word Health Organization, The World Health Report 1999. Malaria. [WWW] URL:http://www.who.int [Accessed
14 may 2003].
2. Brazil – National Foundation of Health. [WWW] URL:http://www.funasa.gov.br [Accessed 04 may 2002
3. Jain RA. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)
devices. Biomaterials 21, 2475-2490, 2000.
4. Verma RK, Garg S. Drug delivery technologies and future directions. Pharmaceutical Technology On-Line 25 (2),
1-14, 2001.
ACKNOWLEDGEMENTS:
We acknowledged the financial support by CNPq, MCT/CNPq Rede Nanobiotec and FACEPE.
Fig. 1. Chemical structure of quinine sulphate
[Cinchonan-9-ol, 6´-methoxy -, (8α,9R)-, sulphate (2:1)]
Fig. 2: Microphotograph of the quinine
sulphate-loaded PLGA-microspheres (100 x).
Fig. 3. Microphotograph of
quinine sulphate (40 x)
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE-LOADED PLGA
MICROSPHERES
Pimentel, L.F.1,2 ; Mosqueira, V.C.F. 3 ; and Santos-Magalhães, N.S.1,2
1
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami – UFPE [email protected]; 2 PG em Ciênc.
Farmacêuticas – UFPE; 3 Depto. de Farmácia - UFOP
The aim of the present study was to evaluate the antimalarial activity of PLGA- microspheres
containing quinine sulphate in mice, which were infected with Plasmodium berghei. Quinine
sulphate- loaded PLGA microspheres (QS-MS) were prepared by the double emulsion (W/O/W)
solvent evaporation method. The morphology and the mean diameter of particles were evaluated by
optical microscopy. The content of quinine sulphate entrapped into microspheres was assayed by
HPLC. The in vitro kinetic profile study was investigated under sink conditions using a dyalisis
technique. The antimalarial activity of QS-MS was determined by the four-day test against P.
berghei ANKA NK65 strain. Two hours later, animals were randomly divided in 4 groups (n=10
animals) and treated with a sc single dose (0.5 ml) of 20 mg/kg per day of sulphate quinine during
four consecutive days. Control groups received saline (0.9%) or unloaded microspheres; treated
groups received QS-MS or a suspension of quinine sulphate in 0.1% Twen 80. The efficacy of the
treatment on the level of parasitemia, animals’ weight, and red blood counting (RBC) were
monitored. The QS-MS presented spherical shaped particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The in
vitro kinetic profile exhibited a maximum release of 44% within 96 h. A significant increase in the
parasitemia was observed only after 6 days of animal infection. The treatment with QS-MS was
able to reduce parasitemia to low levels on day 10 (11.5 ± 2.6%) in relation to the untreated control
group (18.1 ± 4.8%). However no significant difference was found between treatment with free and
encapsulated quinine sultafe. Animal weight body was maintained during the treatment (28 ± 4.2).
Nevertheless, a slightly reduction was observed on 10 days after infection whatever the treatment
(23.9 ± 2.9). The RCB (106 /µl) values were 8.62 ± 0.70 and 5.61 ± 2.04 on days 5 and 9,
respectively. Results suggest that QS-MS can be offered as an alternative to the treatment of
Falciparum malaria.
Supported by: CNPq, MCT/CNPq-Rede Nanobiotec and BNB.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
Anexo II – Artigos Escritos
1. NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE DA MALÁRIA
Lúcio Figueira Pimentel, Vanessa Carla Furtado Mosqueira, Nereide Stela Santos-Magalhães
Trabalho submetido a “Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas”
2. IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE- LOADED PLGA
MICROSPHERES
Lúcio Figueira Pimentel, Vanessa Carla Furtado Mosqueira, Nereide Stela Santos-Magalhães
Trabalho a ser submetido ao “European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics”
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
Artigo 1. NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE DA
MALÁRIA - RESUMO
Apesar de vivermos atualmente uma era de pleno desenvolvimento tecnológico e científico
a malária permanece como um dos maiores problemas de saúde a serem combatidos. As estratégias
modernas para o controle e combate a malária prevêem ações conjuntas, como o controle do inseto
vetor, diagnóstico rápido e preciso, garantia de uma terapêutica adequada, redução dos casos de
resistência, otimização dos agentes terapêuticos utilizados na atualidade, além do desenvolvimento
de novos agentes terapêuticos e vacinas. A nanobiotecnologia pode ser vista como a criação de
materiais funcionais, dispositivos e sistemas, através do controle da matéria na escala de
nanômetros. Estes novos materiais apresentam novos fenômenos e propriedades particulares que
permitem a aplicação nas áreas de biomedicina, genômica e o desenvolvimento de novos sistemas
terapêuticos. Os sistemas de liberação controlada de fármacos vêm recebendo atenção especial
nesta nova área de pesquisa com o desenvolvimento de estratégias para a veiculação de agentes
bioativos na forma de nanodispositivos, como lipossomas, micro e nanopartículas biodegradáveis,
microemulsões e dispositivos transdérmicos. Muitos nanossistemas já demonstraram a sua
utilidade na otimização de vacinas, inseticidas e quimioterápicos utilizados contra a malária. A
nanobiotecnlogia constitui-se, portanto, em uma alternativa promissora no controle e combate a
malária.
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
REVISTA BRASILEIRA DE CIÊNCIA FARMACÊUTICAS
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences
RECIBO
N° de Registro: 099/04
Acusamos o recebimento do trabalho para publicação na Revista
Brasileira de Ciências Farmacêuticas/ Brazilian Journal of Pharmaceutical
Sciences.
Autoria: PIMENTEL, L.F.; MOSQUEIRA, V.C.F.; SANTOS-MAGALHÃES, N. S..
Título do artigo: "Nanobiotecnologia aplicada ao controle e combate da malária "
São Paulo, 14 de dezembro de 2004
Editora Científica
Pimentel, L. F.
Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....
Artigo 2. IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE-LOADED
PLGA MICROSPHERES - ABSTRACT
Quinine sulphate is the drug of choice for the treatment of the most cases of chloroquine
resistant falciparum malaria However, the quinine has low therapeutic index and its use as an
antimalarial agent at large doses is usually associated with several side effects, such as cinchonism.
In order to circumvent this drawback, quinine sulphate loaded microspheres were prepared and the
antimalarial activity was investigated on mice infected with Plasmodium berghei. Quinine sulphateloaded microspheres prepared using the double emulsion technique presented spherical shaped
particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The drug encapsulation eficiency attained 50.34 ± 0.62%.
The in vitro release profile of quinine sulphate- loaded microspheres showed a bimodal behaviour. A
burst effect of 40% was initial observed, followed by a gradual drug release achieving 72% at 48 h.
Microspheres administered by subcutaneous route were at least as efficient as the free quinine
sulphate administered by sc injection at 20 mg/kg for four days. Nevertheless no efficacy
improvement achieved with microencapsulation of quinine sulphate. A parenteral microspherebased formulation of quinine sulphate is however feasible, which can ensue a potential strategy to
achieve a controlled therapeutic effect in the treatment of malaria.