INTERAÇÃO DE Leishmania amazonensis - início

Pós-Graduação em Patologia
1
RODRIGO TONIONI VIEIRA
INTERAÇÃO DE Leishmania amazonensis, Mycobacterium leprae e
Fusarium solani COM MACRÓFAGOS HUMANOS – PAPEL DO
ÓXIDO NÍTRICO E DERIVADOS SINTÉTICOS DE PIRIDINAS
Niterói
Agosto/2008
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
2
RODRIGO TONIONI VIEIRA
INTERAÇÃO DE Leishmania amazonensis, Mycobacterium leprae E
Fusarium solani COM MACRÓFAGOS HUMANOS –PAPEL DO
ÓXIDO NÍTRICO E DERIVADOS SINTÉTICOS DE PIRIDINAS
Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação em Patologia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre. Área de
concentração: Patologia Investigativa
Orientador:
Profa. Dra. Dilvani Oliveira Santos
Co-Orientador:
Dra. Rosa T. Pinho
Profa. Dra. Diana Bridon da Graça Sgarbi
Niterói
Agosto/2008
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
V
Vieira, Rodrigo Tonioni
Interação de Mycobacterium leprae, Leishmania
amazonensis e Fusarium solani com Macrófagos
Humanos – Papel do Óxido Nítrico e Derivados
Sintéticos de Piridinas./ Rodrigo Tonioni Vieira –
Niterói, 2008.
139 folhas
Dissertação de Mestrado (Patologia Investivativa Programa de Pós-Graduação em Patologia) Universidade Federal Fluminense
Orientador: Dilvani Oliveira Santos
Bibliografia: f.125
1 – Macrófagos. 2 – Mycobacterium leprae. 3 –
Leishmania amazonensis. 4 – Fusarium solani. 5 –
Óxido Nítrico. 6 – Piridinas, derivados.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
3
Pós-Graduação em Patologia
4
“Aprender é a Única Coisa de que a Mente Nunca se Cansa,
Nunca Tem Medo, e Nunca se Arrepende.”
Leonardo Da Vinci
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
5
À minha família que sempre me apoiou
dedico-lhes essa conquista com gratidão
Amo todos vocês!
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
6
Em Memória do meu Avô Dário
Que Sempre me Ensinou a Viver e
Sempre Deixará Saudades.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
7
AGRADECIMENTOS
Embora uma dissertação seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho individual,
há contribuições de naturezas diversas que não podem nem devem deixar de ser
ressaltadas. Por essa razão, expresso meus sinceros agradecimentos:
Primeiramente a Deus por ter permitido essa conquista.
Ao meu pai Ruy, minha mãe Maristela, e meu irmão Felipe que sempre foram minha
base. Agradeço por acreditarem em mim e nos meus sonhos, sempre com muito apoio,
incentivos e certezas de que nada seria impossível. Amo vocês.
À minha namorada Gisele Rodrigues, que sempre me “aturou” nos momentos difíceis
com muito carinho. Suas palavras de incentivo sempre me fizeram andar pra frente.
Obrigado pela paciência.
À professora Dilvani Oliveira Santos, pela orientação, confiança, por acreditar em
mim, e pelo incentivo ao longo dessa dissertação.
À Doutora Rosa Pinho, que me acolheu com muito carinho no Laboratório de
Imunologia da FIOCRUZ.
À Professora Diana Sgarbi, por toda consideração e confiança ao longo de todo
tempo de Iniciação Científica..... “Bonitinha”.
À Doutora Suzana Corte-Real e aos amigos do Laboratório de Ultra Estrutura –
Fiocruz, pela colaboração nos ensaios de microscopia eletrônica.
À Dra. Maria Cristina Pessolani e seu estudante Adriano, pela receptividade na
Hanseníase da FIOCRUZ, me ensinando a técnica de coloração do M. leprae em
macrófagos.
À Doutora Helena Castro pela sua inestimável colaboração, por examinar
previamente a dissertação com muita atenção e carinho, e com isso, ter contribuído muito
para o enriquecimento científico desse trabalho.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
8
Aos demais membros da banca por gentilmente terem aceito o convite para
examinar esse trabalho.
À Doutora Alice Bernardino e seu aluno Luis Pinho do Instituto de Química da UFF,
pelas moléculas para os testes biológicos.
Aos amigos Wellington e Ygor que sempre foram de grande ajuda com os
experimentos e ótimas companhias no almoço.
À professora Andrea Alice da Silva pelo carinho e ajuda com as fotografias.
Agradecimentos especiais aos grandes amigos de faculdade Alessandra Mendonça
e Leandro Pedrosa, pelas cervejas depois do serviço e pelo papo furado. E claro pelo apoio
e presença constante nessa etapa da minha vida.
Aos amigos Davidson Azevedo, Leonardo Rodrigues, Bianca Fraga, Ingrid Toledo e
demais amigos da Pós-Graduação em Química Orgânica da UFF pelos momentos de
descontração e diversão.
À nobre amiga Aline Scaramussa e demais amigos do Hospital da UFRJ, pelos
conselhos, amizade e companheirismo nos momentos de dificuldade.
À todos os amigos e professores da Pós-Graduação em Patologia por dividir alegrias
e desesperos, principalmente em semana de SAPRO.
À todos meus sinceros agradecimentos.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
LISTA DE ABREVIATURAS
ANFB – Anfotericina B
APCs – Células apresentadoras de antígenos
BCG – Bacilo de Calmette & Guérin
BHI – Infusão de cérebro e coração
CFU-GM – Unidades formadoras de colônia de granulócitos e monócitos
DMEM – Meio essencial mínimo de Dulbecco
DMSO - Dimetilsulfóxido
EC50 – Concentração inibitória do crescimento de 50%
eNOS - Enzima óxido nítrico sintase endotélial
FBS – Soro fetal bovino
F. solani - Fusarium solani
HPC - Hexadecilfosfocolina
IFN-γ - Interferon gama
IL - Interleucina
iNOS - Enzima óxido nítrico sintase indutível
LAM - Lipoarabinomannan
L. amazonensis - Leishmania amazonensis
LC – Leishmaniose Cutânea
L-NAME - N-nitro- L arginina-metil-éster
LTA – Leishmaniose Teguementar Americana
LV – Leishmaniose Visceral
MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão
MHC – Complexo principal de histocompatibilidade (Major histocompaibility complex)
M. leprae - Mycobacterium leprae
MO - Microscopia óptica
NAM - Nicotinamida
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
9 i
Pós-Graduação em Patologia
10
NK – Células Natural Killer
nNOS - Enzima óxido Nítrico Sintase neuronal
NO – Óxido nítrico
NOs – Enzima Óxido Nítrico sintase
PAM - Pamidronato
PAMPs – Pathogen-associated molecular pattern (moléculas associadas a patógenos)
PBMC – Peripheral Blood mononuclear cells
PC - Fosfatidilcolina
PCR – Reação da Polimerase em Cadeia
PRRs – Pattern recognition receptors ( receptores de reconhecimento)
RIS - Risedronato
RNS - Espécies ativas de nitrogênio
ROS - Espécies ativas de oxigênio
SA – Estearilamina
SAG – Antimônio gluconato de sódio
TAA – Ácido trans-acotínico
TGF-β - Fator de crescimento tumoral (Tumor Growth Factor)
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral (Tumor Necrosis Factor)
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
11
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Biópsia de pele de lesão cutânea isolada de paciente com lepra. Mycobacterium
leprae corados por Ziehl-Nielsen expressando a coloração rósea dos bacilos............................. 21
Figura 2: Lepra lepromatosa: o perfil de reposta imune é Th2 com a produção de IL-10 *,
que desativa macrófago inibindo a produção de Óxido nítrico (NO) e radicais livres (ROS). A
ausência de NO e ROS permite a infecção exuberante de macrófagos por M. leprae. ................. 22
Figura 3: Microscopia Óptica de macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de
sangue corados por GIEMSA. ...................................................................................................... 31
Figura 4: Síntese do Óxido Nítrico (MONCADA et al., 1991).................................................... 38
Figura 5: Conídios multiseptados de Fusarium corados por azul de algodão .............................. .48
Figura 6: A- Promastigotas de Leishmania amazonensis (x1000); B- Amastigota infectando
macrófago. (x1000)....................................................................................................................... 54
Figura 7: Ciclo de vida de Leishmania sp. causando leishmaniose (World Health
Organization - 2001). .................................................................................................................... 55
Figura 8: Microscopia óptica de macrófago humano derivados de monícitos isolados de
sangue periférico controle após 24 horas de cultura, coloração GIEMSA. .................................... 79
Figura 9: Microscopia
óptica da interação de M. leprae com macrófagos humanos derivados
N
de monócitos isolados de sangue periférico após 24 horas de incubação. Coloração por
Ziehl-Nielsen. 9a, macrófagos controle; 9b, macrófagos controle com L-NAME (20µM); 9c,
9d, Macrófagos em interação com M. leprae; 9e, 9f, Macrófagos em interação com M. leprae
na presença de L-NAME (20µM). N, núcleo. As setas apontam as micobactérias em cor
rósea. Barra: 10 µm ...................................................................................................................... 81
Figura 10: Microscopia Eletrônica de Transmissão da interação de Mycobacterium leprae
com macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24
horas de incubação, na ausência (10a) ou na presença de L-NAME (20µM) (10b). Setas
apontam os corpos lipídicos.......................................................................................................... 84
Figura 11: Microscopia Eletrônica de Transmissão da interação de Mycobacterium leprae
com macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24
horas de incubação na ausência de L-NAME (20µM) (11a e 11b). As setas pretas apontam
as micobactérias no interior do vacúolo endocítico ...................................................................... .85
Figura 12: Microscopia Eletrônica de Transmissão da interação de Mycobacterium leprae
com macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24
horas de incubação. Macrófagos em interação com M. leprae na presença de L-NAME
(20µM) (12a e 12b), as setas pretas apontam as micobactérias no interior dos vacúolos. N,
núcleo. *, Fusão de vacúolos. ....................................................................................................... 86
Figura 13: Microscopia óptica da interação de Leishmania amazonensis com macrófagos
humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24 horas de
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
12
incubação. Coloração por GIEMSA. 13a, macrófagos controle; 13b, macrófagos controle
com L-NAME (20µM); 13c, 13d, macrófagos em interação com L. amazonensis, as setas
pretas identificam a forma amastigota no interior de vacúolos endocíticos; 13e e 13f,
macrófagos em interação com L.amazonensis na presença de L-NAME (20µM), as setas
brancas apontam as formas amastigotas. N, núcleo. Barra:10µm. ............................................... 88
Figura 14: Microscopia óptica da interação de F. solani com macrófagos humanos
derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24 horas de incubação.
Coloração por GIEMSA. 14a, macrófagos controle; 14b, macrófagos controle com L-NAME
(20µM); 14c, 14d macrófagos em interação com F. solani, as setas pretas apontam os
conídios do fungo no interior de vacúolos endocíticos; 14e, 14f macrófagos em interação
com F.solani na presença de L-NAME (20µM). As setas brancas apontam vários conídios
do fungo no interior do macrófago. N, núcleo. Barra: 10µm. ......................................................... 90
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
13
iii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Dosagem da produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de
macrófagos (Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em
interação com M. leprae (Myc), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na
ausência ou presença L-NAME (20µM). ........................................................................... 92
Gráfico 2: Dosagem da produção de TGF-β no sobrenadante de cultura de
macrófagos (Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em
interação com Mycobacterium leprae (Myc), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de
incubação na ausência ou na presença de L-NAME (20µM) ........................................... .93
Gráfico 3: Dosagem da produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de macrófagos (Mac)
derivados de sangue periférico humano em interação com Mycobacterium leprae (Myc),
após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência ou na presença de L-NAME
(20µM). ......................................................................................................................................... 94
Gráfico 4: Dosagem da produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Leishmania amazonensis (Lei), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência
ou presença de L-NAME (20µM). ................................................................................................. 96
Gráfico 5: Dosagem da produção de TGF-β no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Leishmania amazonensis (Lei), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência
ou na presença de L-NAME (20µM).............................................................................................. 97
Gráfico 6: Dosagem da produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de macrófagos (Mac)
derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Leishmania amazonensis (Lei), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência
ou na presença de L-NAME (20µM).............................................................................................. 98
Gráfico 7: Dosagem da produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Fusarium solani (Fus) após 24, 48 e 72 horas de incubação na ausência ou na presença de
L-NAME (20µM)............................................................................................................................ 99
Gráfico 8: Dosagem da produção de TGF-β no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Fusarium solani (Fus) após 24, 48 e 72 horas de incubação na ausência ou na presença LNAME (20µM)............................................................................................................................. 100
Gráfico 9: Dosagem da produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano incubados com
Fusarium solani (Fus) após 24, 48 e 72 horas na ausência ou na presença de L-NAME
(20µM). ....................................................................................................................................... 101
Gráfico 10: Efeitos dos derivados
da
the
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina [50µM] na proliferação de Leishmania amazonensis após 24
horas de incubação na presença desses compostos. 1 Controle; 2 DMSO; 3 Glucantime ;
4 H ; 5 m-CH3; 6 p-CH3; 7 m-OCH3; 8 p-OCH3; 9 m-NO2 ; 10 p-NO2; 11 m-F ; 12 p-F ;
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
14
13 m-Br e 14 p-Br. Após esse tempo os parasitas foram quantificados em câmara de
Neubauer por microscopia óptica................................................................................................ 103
Gráfico 11: Curva dose-resposta dos derivados mais ativos da série 5-(4,5-diidro-1Himidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina para determinação do EC50 preparadas para o
cálculo de EC50. 3c (p – CH3)
e 3e (p – OCH3)
na proliferação de Leishmania
amazonensis após 24 horas de incubação dos parasitas. .......................................................... 104
Gráfico 12: Efeitos Citotóxicos dos derivados da piridina em macrófagos derivados
de monócitos do sangue periférico humano após 24 horas de incubação na
presença dos compostos teste [50µm]. 1 Controle; 2 DMSO ; 3 Glucantime ; 4 pCH3, 5 p-OCH3, 6 p-NO2 . Após esse tempo as células foram fixadas em
formaldeído 2% e coradas por GIEMSA. As células foram quantificadas por
microscopia óptica e os resultados expressos em % de citotoxicidade, conforme
descrito nos materiais e métodos.................................................................................... 105
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
15
iv
RESUMO
Estudo da interação de Mycobacterium leprae, Leishmania amazonensis e
Fusarium solani com Macrófagos humanos : Papel do óxido nítrico e derivados
sintéticos de piridinas
Os microorganismos têm co-existido com os seres humanos em relações que vão desde a
simbiose até o parasitismo. O mecanismo destas ações e as formas de afetá-las ainda são
alvo presente de estudos na atualidade. Biopatógenos tais como Mycobacterium leprae,
Leishmania amazonensis, e Fusarium solani são agentes etiológicos de algumas doenças
crônicas-infecciosas tais como lepra, leishmaniose cutâneo-difusa e fusariose,
respectivamente, que afetam várias partes do mundo. Deste modo, esses biopatógenos são
objetos de estudo sobre estas relações. O presente trabalho tem como objetivos (1)
investigar a interação de M. leprae, L. amazonensis e F. solani com macrófagos humanos,
enfatizando a importância do óxido nítrico (NO) na determinação do processo de infecção;
secreção de citocinas como TNF-α, TGF-β e IL-10; bem como possíveis alterações
morfológicas ocorridas na célula hospedeira; e (2) investigar o efeito de derivados de 5-(4,5diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina na proliferação de L. amazonensis,
com o objetivo de avaliar o potencial leishmanicida destes compostos. Assim, a primeira
parte deste trabalho que compreende o estudo do NO como agente efetor da morte de
biopatógenos causadores de lesões cutânea-difusa no hospedeiro foi realizada utilizando
ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e análise das características morfológicas do processo
de infecção foram feitas por Microscopia Óptica Convencional (MO) e Microscopia Eletrônica
de Transmissão (MET). Na segunda parte deste trabalho que aborda a procura de novos
fármacos com potencial, especificamente, leishmanicida e, desprovidos de citotoxicidade
para a célula hospedeira foram realizados ensaios utilizando-se L. amazonensis na forma
promastigota incubadas na presença de derivados de piridinas e analisados por MO.
Semelhantes ensaios foram realizados com macrófagos humanos para teste de citotoxidade
dos derivados de piridina. Glucantime foi usado como controle em todos os ensaios. O
resultado da primeira parte deste trabalho mostrou a endocitose de M. leprae, L.
amazonensis e F. solani pelos macrófagos humanos na análise da MO. No entanto, na
presença do inibidor de NO-sintase (L-NAME), a produção de NO foi inibida e,
consequentemente, a endocitose desses biopatógenos foi aumentada. Estes resultados são
a primeira evidência experimental da importância do NO como fator determinante de
manutenção de M. leprae, L. amazonensis e F. solani no interior do macrófago. A análise de
MET confirma os resultados obtidos pela MO, mostrando detalhes do vacúolo endocítico
com M. leprae em seu interior. Nossos resultados são pioneiros e sugerem a importância do
NO no processo de infecção de macrófagos humanos tanto por M. leprae, L. amazonensis
como F. solani demonstrando que células deficientes na sua produção são mais permissivas
ao processo de infecção por esses biopatógenos; Além disso, foram detectados índices
relevantes de produção de TNF-α, TGF-β e IL-10 por macrófagos incubados com os
biopatógenos. Os resultados da segunda parte desta dissertação mostrou que o
crescimento de L. amazonensis foi inibido por todos os compostos testados. No entanto, o
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
16
percentual maior de inibição de crescimento foi observado quando L. amazonensis foi
incubada com os compostos 3c e 3e que apresentam o grupo p-CH3 e p-OCH3,
respectivamente, e esses compostos apresentaram baixa citotoxicidade para macrófagos
em comparação com glucantime. O desenvolvimento de novos fármacos através do
desenho racional de novas drogas, usando derivados químicos da 5-(4,5-diidro-1Himidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina como novas alternativas para quimioterapia
para Leishmaniose cutânea pode ser bastante promissor de acordo com os resultados aqui
obtidos. Sendo assim, os derivados de piridinas podem ser potenciais candidatos para o
desenvolvimento de novas formas de tratamento para Leishmaniose cutânea.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
17
v
ABSTRACT
Study of the interaction of Mycobacterium leprae, Leishmania amazonensis e
Fusarium with human macrophages: Role of the Nitric Oxyde and sinthetic
derivates of pyridines.
Microorganisms are been lived with human beings in relationships which range from
symbiosis to parasitism. The mechanisms of these actions as well as the forms to affect
them are still today a strong target of studying. Biopathogens as Mycobacterium leprae,
Leishmania amazonensis and Fusarium solani are ethiologic agents of some chronicinfectious diseases as Leprosy, Cutaneous Leishmaniasis (CL) and Fusariosis, respectively,
which affect several areas in
the world. Thus, these biopathogens are subject of
investigation of these relationships. The aims of the present work are: (1) to investigate the
interaction of M. leprae, L. amazonensis and F. solani with human macrophages, emphasing
the relevance of NO in the process of infection; the secretion of cytokines as TNF-α, TGF-β
and IL-10; as well as possible morphological alterations displayed by the host cell; and (2) to
investigate
the
effect
of
derivates
of
5--(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4(phenylamino)thieno[2,3-b]pyridine in the proliferation of L. amazonensis, in order that new
drugs for the treatment of CL can be identified. So, the first part of this work related to the
study of Nitric Oxide (NO) as efector agent of the killing of biopathogens which cause
cutaneous lesions in the host, was made by using imunoenzimatic assays (ELISA). And the
morphological analyses of the proccess of infection were done through Optical Microscopy
(OM) and Transmission Electronic Microscopy (TEM). In the second part of this work
related to the search of new drugs with potential specifically antileishmanial, without citotoxity
for the host cell, the assays were done with L. amazonensis in the promastigote form,
incubated in the presence of piridines derivates and analysed by OM. Similar experiments
were done by using human macrophages to test the citotoxicity. Glucantime was used as
control in all assays. The results concerning to the first part of this work showed the
endocytosis of M. leprae, L. amazonensis and F. solani by human macrophages as observed
by OM. However, in the presence of the inhibitor of NO-synthase (L-NAME), the production
of NO was inhibited and, consequently, the mainteance of these biopathogens inside
macrophage was increased. These results were the first experimental evidence of the
relevance of NO as effective factor to permit the maintenance of M. leprae, L. amazonensis
and F. solani inside human macrophage. The MET analyses confirms the results obtained
with the OM, by showing details of the M. leprae in the endocytic vacuole inside the
macrophage. Our results suggest the importance of NO in the process of infection of human
macrophage by M. leprae, L. amazonensis and F. solani. Furthermore, high levels of TNF-α,
TGF-β and IL-10 production were detected by the macrophages infected by these
biopathogens. The results concerning to the second part of this work showed that the growth
of L. amazonensis was inhibit by all tested compounds. However, the highest inhibitor
effect of L. amazonensis growth was observed when this parasite was incubated with the 3c
and 3e compounds displaying the p-CH3 and p-OCH3 groups respectively and, showing a
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
18
very low citotoxicity for the human macrophages compared to the glucantime. The
development of new drugs through the racional design of new drugs, by using chemicals derived
of
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2--il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridine
as
new
alternatives for the treatment of CL may be quite promising according to the results
obtained here. Thus, the piridines derivated might be potentials candidates for the
development of new forms of treatment of CL.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
19
1. INTRODUÇÃO
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biopatógenos e Ativação
Celular (Labiopac-UFF) e no Laboratório de Imunologia Clínica da FIOCRUZ-RJ.
1.1 - Considerações gerais
A pele humana é constantemente exposta à diversos tipos de patógenos
devido ao seu contato diário com o microambiente. A observação que extensivas
infecções de pele são relativamente raras sugere a presença de um eficiente
sistema de defesa do hospedeiro na superfície da pele. Enquanto a função da
barreira física da epiderme era mencionada como a maior proteção contra infecções,
a recente descrição de receptores “Toll-like” (TLRs), peptídeos
antimicrobianos,
bem como a habilidade de algumas células em produzir óxido nítrico (NO) como
agente efetor da morte dos patógenos, estimula o estudo da interação de patógenos
de diferentes origens com células como, por exemplo, macrófagos (BLANCO et al.,
2008). O patógeno, então, para sobreviver nesse novo meio, necessitará adaptar-se
a diferentes fatores como temperatura corpórea, ao potencial de oxiredução e ao
ataque de células de defesa.
Nosso laboratório se caracteriza pelo estudo de Ativação Celular em
vários processos patológicos. E, mais recentemente, vêm se dedicando ao estudo
da interação de tripanossomatídeos monoxênicos com endosimbionte (Crithidia
deanei, Herpetomonas roitmani e Blastocrithidia culicis - tripanossomatídeos
anteriormente conhecidos apenas por albergar insetos) e, foi o primeiro
demonstrar,
experimentalmente,
a infecção
de
fibroblastos
de
derme
a
de
camundongo por essas espécies (SANTOS et al., 2004). A literatura cita a
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
20
importância dos tripanossomatídeos monoxênicos como supostos causadores de
lesões cutâneas oportunistas em pacientes aidéticos. E, mais recentemente, nosso
laboratório observou que o processo de infecção das células do vertebrado por
tripanossomatídeos monoxênicos está diretamente relacionado
à capacidade da
célula hospedeira em produzir óxido nítrico (NO). Fibroblastos produzem pouco NO
e, por isso, se deixam infectar. Diferentemente, macrófagos derivados de sangue
periférico humano apenas sofrem infecção quando tratados por inibidor de NO
sintase (enzima indutora de produção de NO).
A relação do efeito protetor do óxido nítrico (NO) agindo contra à infecção
também já foi cogitada em estudos de interação de Leishmania major (BOGDAN et
al., 2000) . BOGDAN e colaboradores se referem aos fibroblastos como verdadeiros
“esconderijos” de Leishmania sp. e, correlacionam este fato com a pouca produção
de NO observada dos fibroblastos. Nesse artigo os autores enfatizam o papel do
fibroblasto não somente no processo de infecção por L. major, mas também, como
célula importante no processo de recidiva da Leishmaniose. Além disso,
camundongos deficientes em NO mostraram maior suscetibilidade à L. major, T.
gondii e M. tuberculosis sugerindo um efeito protetor de NO contra esses patógenos
(GYURKO et al., 2003)
Mycobacterium leprae (Figura 1) outro patógeno causador de infecção
cutânea – lepra, também é objeto de estudo em nosso laboratório. E, nesse caso
específico, a literatura cita que o espectro imunológico de lepra (lepra tuberculóide e
lepra lepromatosa) é o resultado da ativação de resposta imune inata através de
TLRs , em adição à liberação de citocinas secretadas por macrófagos derivados de
monócitos e células dendríticas (SANTO, D. e CASTRO, H. 2007) (Figura 2).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
21
Figura 1: Biópsia de pele de lesão cutânea isolada de paciente com lepra.
Mycobacterium leprae corados por Ziehl-Nielsen expressando a coloração rósea
dos bacilos.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
22
B
*
Figura 2: Lepra lepromatosa: o perfil de reposta imune é Th2 com a produção de IL10 *, que desativa macrófago inibindo a produção de Óxido nítrico (NO) e radicais
livres (ROS). A ausência de NO e ROS permite a infecção exuberante de
macrófagos por M. leprae.
A ativação de macrófago potencializa a produção de citocinas com perfil
Th-1, como Interleucina –12 (IL-12) e IL-23. Este evento induz a produção de gama
interferon (IFN-γ) pelos linfócitos T que estimula o macrófago para produção de NO,
efetivando a ação micobactericida desta célula (HAGGE et al., 2004). Corrobora
com esses relatos, o fato de camundongos deficientes em NO não apresentam
função micobactericida (MAJ et al., 2003).
A
interação
desses
três
agentes
causadores
de
lesão
-
tripanossomatídeos monoxênicos com endosimbionte, L. amazonensis e M. leprae com as suas respectivas células hospedeiras,
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
têm em comum o fato de causar
Pós-Graduação em Patologia
23
infecção, no caso dos tripanossomatídeos monoxênicos; e de causar doença, no
caso de L. amazonensis e M. leprae,
em conseqüência à deficiência da resposta
imune celular, cujo denominador comum é o NO como agente efetor de morte do
patógeno.
Infecções cutâneas também podem ter como agente etiológico
algumas classes de fungos. Dentre eles, Fusarium solani que é um fungo
filamentoso, monomórfico, sapróbio e ubíquo na natureza. F. solani apresenta uma
grande importância econômica, uma vez que é fitopatógeno habitual e contamina
grande parte da produção mundial de alimentos. Além de ser um importante
produtor de micotoxinas. Ocasionalmente, estes fungos causam infecções
superficiais e subcutâneas em indivíduos normais, denominadas fusarioses. Mais
recentemente tem sido descritas, infecções graves por Fusarium em pacientes
imunodeprimidos, aumentando o interesse do estudo desse fungo como causador
de infecção oportunista (MONZÓN & TUDELA, 2001; LETSCHER-BRU et al., 2002).
Os
fungos
patogênicos utilizam
diferentes mecanismos
para se
estabelecer em um hospedeiro e causar a doença. As condições fornecidas pelo
hospedeiro, geralmente diferem muito do nicho ecológico do fungo. Para sobreviver
nesse novo meio, o fungo necessitará adaptar-se a temperatura corpórea, ao
potencial de oxi-redução, ao ataque de células fagocitárias, como por exemplo,
macrófagos. Portanto, a manifestação da doença está associada a vários fatores,
alguns de competência do hospedeiro, e outros de competência do fungo
(LETSCHER-BRU et al., 2002).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
24
. Tanto os macrófagos como os leucócitos polimorfonucleares apresentam
um papel essencial na eliminação de microorganismos. Tem sido constatado que os
polimorfonucleares inibem o crescimento das hifas, enquanto que os macrófagos
são capazes de impedir a germinação dos conídios e o crescimento das hifas
(NELSON et al., 1994 ; TZIANABOS et al., 2000; MONZÓN e TUDELA, 2001).
Tendo em vista os interesses do nosso laboratório na área de interação
de biopatógenos e hospedeiros, e formas de interferir no processo de infecção, esta
dissertação é subdividida em:
- Parte I, compreendendo o estudo do papel do óxido nítrico na interação
de M. leprae, L. amazonensis e F. solani (três biopatógenos de origens distintas mas
que têm como denominador comum, o fato de causarem lesões cutâneas) com
macrófagos humanos;
- Parte II, que compreende o estudo de derivados sintéticos de piridinas
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina) sobre a proliferação
de Leishmania amazonensis e macrófagos humanos, visando o desenvolvimento
de novos fármacos para o tratamento da Leishmaniose cutânea.
Justificativas:
1. Tendo em vista que NO é o principal agente efetor da morte de vários
agentes biológicos causadores de lesão no interior da célula hospedeira, a
investigação da relevância do papel do NO poderá contribuir de forma significativa
para pesquisa de novos agentes terapêuticos mais eficazes para o tratamento de
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
25
Lepra, Leishmaniose cutânea e Fusariose, tendo como alvo a ativação celular com
conseqüente indução de produção de NO.
2. O Tratamento da leishmaniose, ainda hoje, é a maior preocupação da
Organização Mundial de Saúde, devido ao seu potencial altamente citotóxico para
células hospedeiras, sendo uma das principais causas de abandono de tratamento.
E, por essa razão, fator relevante para impediência da erradicação da leishmaniose.
Sendo assim, o desenvolvimento de novos fármacos é bastante promissor,
contribuindo para o controle dessa endemia.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
26
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 - Introdução - Parte I
2.1.1 - Alguns aspectos relevantes sobre a resposta imune
Ao longo de sua história evolutiva, os animais multicelulares têm sido
infectados por microrganismos, desenvolvendo uma série de mecanismos de
defesa. Barreiras físicas e químicas, como a pele e superfícies mucosas, confinam
os microrganismos às superfícies externas do corpo e, quando os patógenos
conseguem romper essas barreiras, são localizados e destruídos pelo sistema
imunológico. Cujo objetivo é reconhecer agentes estranhos invasores, com o
potencial de causar doença (conhecido como patógeno), impedir sua disseminação
e, finalmente, eliminá-los do corpo (PARHAM, 2001). Graças a esse sistema, os
animais possuem a capacidade de resistir a quase todos os tipos de microrganismos
ou toxinas que tendem a danificar os tecidos e órgãos e ainda, freqüentemente, nos
proteger de infecções e de células cancerosas.
O organismo humano está continuamente exposto a microorganismos
que são inalados, ingeridos ou, entram, frequentemente em contato com a pele e
mucosas. A sobrevivência de organismos multicelulares em um mundo repleto de
microorganismos depende de um complexo sistema de defesa do hospedeiro,
envolvendo uma série de sistemas de interação entre células (PIVARCSI et al.,
2005).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
27
2.1.2 - Resposta Imune Inata - Mecanismos Não Específicos
A resposta imune contra infecções é iniciada através do reconhecimento
de moléculas microbianas por receptores do sistema imune inato. Se a epiderme
estiver exposta a injúrias, os patógenos invasores são eliminados primeiramente
pelo sistema inato, seguido de reações do sistema imune adaptativo (PIVARCSI et
al., 2005).
A produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS)
pelo macrófago representam o poder que essa célula tem na destruição de agentes
biológicos causadores de lesão.
Células da imunidade inata expressam uma grande variedade de
receptores de reconhecimento (“pattern recognition receptors (PRRs)”) como os
receptores “Toll-like (TLRs)” e receptores de manose que são ativados pelo
reconhecimento de componentes de membrana dos patógenos.
Os PRRs são específicos para moléculas associadas dos patógenos
(PAMPs - Pathogen-associated molecular pattern), que não apresentam muita
variabilidade com a classe dos microorganismos (JANEWAY et al., 2002). Entre os
PAMPs estão os Lipopolisacarídeos (LPS) das bactérias gram-negativas; Mannan e
Zimosan da parede celular das leveduras e o Lipoarabinomannan (LAM) da parede
celular das micobactérias (PIVARCSI et al., 2005).
Com o reconhecimento dos PAMPs pelos PRRs iniciam-se várias
respostas rápidas do sistema imune inato, como a fagocitose, a produção de
compostos antimicrobianos e mediadores inflamatórios, como citocinas e NO, que
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
28
agem matando o microorganismo e com a persistência dos agentes infecciosos,
tem-se início uma resposta imune mais eficiente, a resposta imune adaptativa
(PIVARCSI et al., 2005).
2.1.3 - Resposta Imune Adaptativa
A imunidade adaptativa tem suas respostas induzidas ou estimuladas
pela exposição à substâncias estranhas, consiste em reações antígeno-específicas
através de linfócitos T e B (ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
O primeiro passo crucial na imunidade adaptativa é a ativação e células T
"naives"
antígeno-específicas
pelas
células
apresentadoras
de
antígeno
especializadas (APCs). Isso ocorre nos tecidos linfóides e órgãos pelos quais
passam, constantemente, as células T "naives". A característica mais diferenciada
das células APCs é a manifestação de atividades co-estimuladoras, como as
moléculas B7-1 e B7-2 . Os três tipos de células que podem atuar como célula
apresentadora de antígeno profissional são os macrófagos, as células dendríticas
(também derivadas de monócitos) e as células B, cada uma com funções diferentes
na indução da resposta imune (ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
Os fagócitos, especialmente os macrófagos, respondem a citocinas
geradas pelos linfócitos. Os monócitos transformam-se em macrófagos se
estimulados por citocinas secretadas pelos linfócitos e, são atraídos por outras
citocinas e fatores liberados por células presentes em locais de infecção ativa
(ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
29
Os linfócitos são as células coordenadoras do sistema imunitário. No
entanto, todas as funções dos linfócitos dependem também de células não-linfóides,
as células acessórias, que não são específicas para antígenos diferentes. Os
fagócitos mononucleares, incluindo os macrófagos, as células dendríticas e várias
outras populações celulares como os granulócitos e mastócitos, funcionam como
células acessórias. Todo esse processo é controlado por mediadores químicos
liberados no local, entre eles moléculas importantes como TNF-α , TGF-β , IL-10,
entre outros. (ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
Os macrófagos secretam enzimas e radicais livres para destruir invasores
e células do hospedeiro se estimulados apropriadamente pelas citocinas liberadas
de forma localizada e controlada pelos linfócitos.
Os linfócitos são as únicas células imunocompetentes capazes do
reconhecimento específico de antígeno (PARHAM, 2001). São morfologicamente
homogêneos, mas consistem de subconjuntos distintos, que desempenham
diferentes funções e que podem ser distinguidos fenotipicamente. Linfócitos
T
funcionam como células auxiliares ("T helper" - Th) que com o auxílio de citocinas,
ativam o macrófagos para destruir os microrganismos fagocitados e estimulam a
produção de anticorpos por linfótitos B.
Os linfócitos T subtipo CD4 ainda podem ser divididos em Th1 e Th2
dependendo das citocinas secretadas, provocando respostas de ativação ou inibição
celular, respectivamente. Respostas mediadas por linfócitos Th1 produzem , entre
outras citocinas, Fator de Necrose Tumoral - TNF-α (Tumor Necrosis Factor),
responsável pela ativação dos macrófagos e, posterior fagocitose. Enquanto que
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
30
respostas mediadas por linfócitos Th2, produzem Fator de Crescimento Tumoral TGF-β (Tumor Growth Factor) e Interleucina-10 (IL-10), responsáveis pela inibição
da resposta celular (ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
Os linfócitos são células que reconhecem e respondem especificamente a
antígenos estranhos. No entanto, as fases de reconhecimento e ativação das
respostas imunes específicas, dependem de células do sistema inato não linfóides,
os fagócitos mononucleares, células dendríticas e outras populações celulares.
Estas células atuam de maneira não específica para antígenos diferentes. O sistema
mononuclear fagocítico é constituído de células que se originam na medula óssea,
são transportadas pela circulação sanguínea e se localizam em diversos tecidos.
Após a maturação e subsequente ativação, estas células assumem morfologia
variada, mas com uma função em comum, a defesa do organismo através da
fagocitose. O sistema mononuclear fagocítico é constituído de monoblastos,
promonócitos e monócitos na medula óssea, monócitos no sangue periférico e
macrófagos nos tecidos (LASSER, 1983; ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
2.1.4 - Macrófagos – Origem e Ativação
O monócito é uma das células do Sistema Mononuclear Fagocítico que
penetra no sangue periférico, depois de deixar a medula óssea, ainda indiferenciada.
Esta célula se fixa nos tecidos, amadurece e diferencia-se em macrófago (Figura 3)
(ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000). O macrófago foi descrito por Metchnikoff, no
final do século dezenove, como uma célula com capacidade fagocítica, e somente a
partir de estudos de Mackaness, nos anos 60, a atividade secretora dessa célula
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
31
adquiriu importância (NORTH, 1978). Os monócitos são células relativamente
grandes, que medem entre 25-50µm de diâmetro, com núcleo irregular, possuem um
ou mais nucléolos, cromatina pouco condensada, se diferenciando das demais
células
por
ter
um
citoesqueleto
bem
desenvolvido,
inúmeras
projeções
citoplasmáticas, grande número de lisossomos, áreas complexo de Golgi e
mitocôndrias (AUGER, ROSS, 1992). São o grupo mais importante de células
fagocitárias de longa vida, compreendendo a linhagem fagocítica mononuclear, que
inclui os monócitos sanguíneos, os fagócitos residentes nos tecidos ou fixados á
camada endotelial de capilares sanguíneos e os fagócitos circulantes – pulmonares
e peritoneais (ROITT, BROSTOFF, MALE, 1999).
Figura 3: Microscopia Óptica de macrófagos humanos derivados de monócitos
isolados de sangue corados por GIEMSA.
Ontogeneticamente, os macrófagos são originários de células precursoras
do saco vitelínico, migrando para o fígado, baço e medula óssea antes e logo após o
nascimento. Nos indivíduos adultos, os macrófagos têm origem em uma célula
pluripotente mielóide, presente na medula óssea, a partir da qual são originadas
diferentes células progenitoras, entre elas as “unidades formadoras de colônia” de
granulócitos e monócitos (CFU-GM) (ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000). As CFU-
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
32
GM dão origem aos pró-monócitos que já apresentam capacidade de pinocitose e
expressam uma série de receptores característicos de macrófagos. Os prómonócitos, por sua vez, dão origem aos monócitos, que saem da medula óssea e
ganham a circulação sanguínea. Os monócitos permanecem na circulação por cerca
de 1-3 dias, de onde migram para os diversos tecidos, onde se diferenciam e
formam uma população residente de macrófagos, com tempo de vida variando entre
2 e 4 meses (NELSON, et al., 1990; NEVEU, 1986). Após penetrar nos tecidos, os
macrófagos começam a aumentar de tamanho, e seu diâmetro pode aumentar até
cinco vezes, atingindo de 60 a 80µm. Verifica-se, também o desenvolvimento de
número extremamente grande de lisossomos no seu citoplasma, conferindo-lhe
aspecto de saco repleto de grânulos. Nesse estágio, tornam-se extremamente
capazes de combater agentes infecciosos nos tecidos.
Os
macrófagos
estão
envolvidos
em
diversos
processos
como
remodelamento tecidual durante a embriogênese, reparo de ferimentos, remoção de
células senescentes após injúrias ou infecções, hemopoiese e homeostase, além de
fornecer uma linha de defesa contra invasores microbiais e reconhecer e destruir
células tumorais (HONG et al., 2005).
Os macrófagos estão também envolvidos em todas as fases das
respostas imunes como anteriormente mencionado. Primeiro, eles atuam como um
mecanismo protetor rápido capaz de responder antes que ocorra a amplificação
mediada pela célula T. Posteriormente, os macrófagos podem tomar parte na
iniciação da ativação das células T através do processamento e da apresentação de
antígenos. Finalmente, eles são importantes como células inflamatórias, tumoricidas
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
33
e microbicidas na fase efetora da resposta celular, após a ativação mediada por
célula T (ROITT et al., 1999).
A idéia de que os macrófagos são importantes na resposta imune foi
reforçada nos anos 70 quando se descobriu que macrófagos apresentavam
moléculas do MHC classe II (Major Histocompatibility Complex Class II), que são
necessárias para o reconhecimento de antígenos pela célula T. Mais tarde,
descobriu-se que macrófagos podiam produzir moléculas solúveis ou citocinas,
chamadas de “fator de ativação de linfócito”, conhecidas agora por interleucina-1 (IL1), as quais podem levar a proliferação linfocitária, em parte pela estimulação de
outra citocina, a IL-2, de ativação de células T (WOOD et al., 1993). Entre as células
que comumente apresentam antígenos as células T, os macrófagos expressam um
baixo nível de moléculas da classe II, até que sejam estimuladas a fazê-lo pelo IFN-γ
ou por outras citocinas (ABBAS, LICHTMAN, POBER, 2000).
Macrófagos residentes são denominados aqueles que não sofreram
nenhum estímulo extracelular. Eles são células menores, quando comparadas à
células ativadas, com poucas projeções citoplasmáticas, localizados em diversos
tecidos saudáveis, incluindo os macrófagos do tecido conjuntivo (histiócitos), do
fígado (células de Kupffer), do pulmão (macrófagos alveolares), dos linfonodos,
baço, medula óssea, dos fluidos serosos (macrófagos pleurais e peritoneais), da
pele
(histiócitos
e
células
de
Langerhans),
entre
outros
(HALLIWELL,
GUTTERIDGE, 1999).
Macrófagos
ativados
caracterizam-se
por
apresentarem
diversas
alterações funcionais, bioquímicas e morfológicas. O termo "macrófago ativado" foi
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
34
introduzido por Mackaness, descrevendo mudanças que levavam o macrófago a
aumentar sua resistência a patógenos, inflamações e neoplasias (KLIMP, 2001). As
características dos macrófagos ativados foram muito bem definidas já em 1978, por
North e colaboradores (KARNOVSKY, LAZDINS, 1978; COHN, 1978). Estas células
têm sua atividade metabólica, motilidade e atividade fagocítica rapidamente
aumentadas. Os macrófagos ativados são maiores que os não ativados, possuem
maior habilidade para se aderir e se distribuir, maior capacidade de endocitose e
fusão de lisossomos com vacúolos endocíticos, aumento da expressão e secreção
de enzimas lisossomais e fatores de crescimento, aumento do consumo de oxigênio
e produção de grandes quantidades de intermediários reativos do oxigênio (ROS) e
do nitrogênio (RNS). Estas características lhes conferem eficiência na destruição de
patógenos e células tumorais (NORTH, 1978; LASSER, 1983; ERWIG et al., 1998;
KLIMP, 2001).
Os macrófagos podem exercer a função de defesa de maneira indireta,
em atividades anti-tumorais e microbicidas, através da secreção de citocinas ou
apresentação de antígenos, regulando o sistema imune (KLIMP et al., 2001). Uma
grande variedade de citocinas é secretada pelos macrófagos. As interleucinas IL-1,
IL-6, IL-8 e o fator de necrose tumoral (TNF) são secretadas por macrófagos,
modulam respostas imunes inatas e sinalizam linfócitos T, via IL-10, IL-12 e IL-18, a
iniciar respostas específicas contra patógenos intra e extracelulares. Os linfócitos T
por sua vez, liberam a principal molécula estimuladora de macrófagos, o IFN-γ
(MURTAUGH, FOSS, 2002). Os macrófagos podem ainda exercer a função de
defesa de maneira direta, envolvendo liberação de vários mediadores inflamatórios,
como o TNF-α, IL-1, eicosanóides, ROS e RNS. Os produtos de oxigênio e
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
35
nitrogênio produzidos pelos macrófagos, de ação citotóxica, incluem o peróxido de
hidrogênio (H2O2), o ânion superóxido (O2-), o radical hidroxil (OH-), o óxido nítrico
(NO) e o peroxinitrito (OONO-) (NATHAN 1987; VANE et al., 1994; KLIMP et al.,
2001; FORMAN, TORRES, 2001).
Espécies reativas do nitrogênio (RNS), como Óxido Nítrico (NO) e
peróxinitrito (ONOO-), também podem agir como segundo mensageiro modulador
das vias de sinalização redox em macrófagos podendo participar de processos
sinalizadores (FORMAN, TORRES, 2001). ROS e NO podem interagir de diferentes
maneiras e agir sinergicamente causando citotoxicidade. Os radicais NO e O2reagem para formar peroxinitrito (ONOO-), um poderoso oxidante o qual é capaz de
nitrar proteína, enfraquecendo, desse modo, a atividade de diferentes enzimas
mitocondriais, levando a uma diminuição nos níveis de energia (CADENAS,
CADENAS, 2002).
Para a proteção dos macrófagos contra esses produtos tóxicos, os
mesmos são estocados em vesículas, que podem ser colocados em contato com os
fagossomos, onde estará o material que foi ingerido (PLAYFAIR, 1995).
2.1.5 - Macrófagos: Sistema Endossomal e Apresentação de
Antígeno
Após o reconhecimento, os macrófagos internalizam, processam, digerem
e apresentam o antígeno aos linfócitos, que vão produzir moléculas que vão
desencadear respostas em outras células, inclusive nos macrófagos, ativando-os, ou
seja, potencializando sua ação (STITES, TERR, PARSLOW, 2000). O processo de
apresentação de antígeno envolve a ligação de peptídios antigênicos à moléculas
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
36
MHC II. Após a internalização dos antígenos por endocitose, complexos
peptídios/MHC
II
serão
formados
em
diversas
vesículas
do
sistema
endossomal/lisossomal, principalmente nos compartimentos tardios. Os fagossomas
por si só possuem pequena atividade microbicida, e participarão de um processo de
maturação que envolve uma série de complexos eventos de fusão de endossomas e
lisossomas para a formação de fagolisossomas. A maturação do fagossoma resulta
numa forte acidificação intravesicular, atividade proteolítica lisossomal e geração de
ROS (UNDERHILL, OZINSKY, 2002).
2.1.6 - Óxido Nítrico
Nos últimos anos vários estudos experimentais tem sido realizados
demonstrando as diversas funções e importantes papéis do óxido nítrico (NO).
Entretanto a definição do papel do NO hoje, retrata as importantes descobertas do
passado. Em 1818, Prout mensurou uma grande quantidade de nitrato em pacientes
febris. Esta nova área de descoberta teve uma pausa de 163 anos antes de ser
retomada, quando em 1981 Tannenbaum e colaboradores detectaram no balanço
nitrito/nitrato da urina de voluntários humanos, o aumento na excreção de óxidos de
nitrogênio nesses pacientes (GREEN et al., 1981).
Ainda em 1981, Green e colaboradores utilizaram ratos germ-free para
demonstrar que a fonte desses óxidos de nitrogênio era o hospedeiro e não a sua
flora (GREEN et al., 1981).
Trabalhando com camundongos tratados com lipopolisacarídeo (LPS) ou
infectados com o Mycobacterium bovis BCG (Bacilo de Calmette & Guérin), Stuehr e
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
37
Marletta, em 1985, identificaram o macrófago como sendo a célula produtora de NO
(STUEH, MARLETTA, 1985).
Em 1987, MIWA e colaboradores, provaram que o NO era uma molécula
importante como intermediária para o relaxamento de endotélios (MIWA et al.,
1987). No mesmo, ano Hibbs e colaboradores associaram esta molécula com a
morte de tumores. Enquanto outros autores atribuíram ao NO o papel principal no
controle do tônus vascular (HIBBS et al., 1987; PALMER et al., 1987; IGNARRO et
al., 1987).
O NO tem diversos papéis fisiológicos, incluindo: a) relaxamento do
músculo liso; b) inibição de agregação e adesão de plaquetas; e c) a morte de
patógenos (BROWN et al., 1998).
Em sistemas biológicos, o NO é sintetizado a partir da L-arginina por
indução de diferentes isoenzimas óxido nítrico sintase (NOS) (Figura 4). Duas
destas são constitutivamente expressas em células do endotélio vascular (eNOS ou
NOS tipo III) e em neurônios (nNOS ou NOS tipo I), enquanto que a expressão da
terceira isoenzima (iNOS ou NOS tipo II) é induzida, em uma variedade de células,
por moléculas produzidas por bactérias Gram-negativas (endotoxinas) e bactérias
Gram-positivas. eNOS e nNOS são, transitoriamente, ativadas em resposta ao
aumento intracelular dos níveis de cálcio e estão envolvidas na regulação das
funções fisiológicas, enquanto que iNOS é expressa e continua ativa durante
inflamações, onde está envolvida na defesa do hospedeiro contra patógenos. iNOS
tende a produzir altas concentrações de NO na célula, que possui um papel anti-
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
38
inflamatório, por suprimir infecções bacterianas e acentuar recrutamento de
leucócitos (CADENAS, CADENAS, 2002).
L-Arginina
L-Citrulina
+
NO
NO-sintase
_
L-NAME
Figura 4: Síntese do Óxido Nítrico (MONCADA et al., 1991).
Resultados de diversos experimentos indicam a possibilidade de que a
produção de NO em excesso, diminui a expressão da enzima iNOS para prevenir
autotoxicidade celular. Um possível mecanismo para esse “feedback” inibitório da
síntese da proteína iNOS pelo NO pode ser atribuído a fosforilação mediada por NO
de uma molécula regulatória chave na maquinária transducional (HAN et al., 2001).
O NO é uma molécula única, com propriedades neurotransmissoras e
com várias e importantes funções no organismo. Depois de produzido, o NO, de
natureza gasosa, se difunde rapidamente sem ser estocado, apresentando tempo de
meia vida curta e, por esta razão, a sua quantificação direta é muito difícil. Quando
gerado em alta concentração ele apresenta um importante papel na citotoxicidade e
inflamação (MONCADA et al., 1991).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
39
O NO escapa através da membrana celular podendo difundir-se pelas
proximidades podendo atravessar outras membranas celulares afetando outras
células sem a necessidade de receptores de superfície. Trata-se, portanto, de uma
molécula-sinal que pode ser liberada por uma célula, desde que esta apresente a
enzima NO-sintase (MONCADA et al., 1991).
Em macrófagos a NO-sintase é de forma induzida, ou seja, os
macrófagos não estimulados não apresentam essa enzima. No entanto, a ativação
celular dos macrófagos se acompanha com o aparecimento da enzima NO-sintase
induzida (iNOS) (MONCADA et al., 1991). E a produção de NO pelo macrófago
representa o poder que essa célula tem na destruição de agentes biológicos
causadores de lesão.
No sistema imunológico, um grande número de citocinas tem um
importante papel tanto no desenvolvimento de um sistema imunológico funcional
quanto na resposta do organismo contra infecções produzidas por diferentes
patógenos (HOLLOWAY, SHANNON, 2001). Dentre estas citocinas podemos citar:
TNF-α
α : está envolvido no processo de inflamação sistêmica e atua na
fase aguda da reação imunológica, modulando apoptose, proliferação celular,
diferenciação, inflamação e replicação viral. Ele participa na defesa do hospedeiro
contra patógenos, e modula a resposta imune por ativar a produção de outras
citocinas regulatórias como IL-1, IL-6, IFNs, fatores de crescimento e fatores
estimuladores de colônia de granulócito e monócitos (HONG et al., 2005).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
40
TGF-β : apresenta funções importantes no controle de proliferação e
diferenciação celular. Ele atua sobre o ciclo celular durante a apoptose e doenças
como o câncer, e induzindo ações de inibição da resposta imunológica. (DAOPIN et
al., 1992).
IL-10 : produzida por monócitos ativados, mastócitos e células B,
apresenta potente perfil antiinflamatório e desempenha múltiplas ações de inibição
das citocinas de ação pró-inflamatórias de monócitos e macrófagos ativados; além
da inibição tanto da proliferação das células B quanto da secreção de
imunoglobulinas.
2.1.7 - Interação de M. leprae com macrófagos e citocinas (TNF-α
α,
TGF-β e IL-10).
Componentes presentes na membrana de micobactérias, como o
lipoarabinomanan, foram descritos como sendo um importante indutor da liberação
de TNF-α pelas células do sistema fagocitário (MORENO et al., 1989).
Estudos envolvendo macrófagos e o Mycobacterium tuberculosis
demonstraram que essa bactéria é eliminada do organismo em ambientes com alta
concentração de TNF-α nas lesões da tuberculose. Estes dados sugerem que a
toxicidade desta bactéria está relacionada à produção de TNF-α liberado pela
própria célula fagocitária em resposta a componentes de membrana da micobactéria
(ex.: lipoarabanimanan). Assim o TNF-α parece estar intimamente ligado a
imunopatologia na tuberculose, sendo responsável pelo aparecimento de necrose
nas lesões dessa doença. Aparentemente a infecção por M. tuberculosis causa o
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
41
aumento da liberação e dos efeitos tóxicos do TNF-α em detrimento da eliminação
da bactéria no hospedeiro (FILLEY, ROOK, 1991 ; ROOK et al., 1990).
Em 1995 KHANOLKAR-YOUNG e colaboradores demonstraram que os
níveis de TNF-α mRNA e da proteína TNF-α encontram-se mais elevados em
episódios reacionais de nervos do que em episódios reacionais na pele. Em ambos,
os níveis de TNF-α mRNA encontram-se mais elevados que os da proteína TNF-α,
refletindo a rápida degradação dessa molécula na situação dinâmica da doença.
Esse tipo de episódio reacional que ocorre na lepra é um exemplo clássico de lesão
tecidual local gerada pela produção de TNF-α no local de infecção, demonstrando
que o TNF-α apresenta um papel importante na patologia de nervo e pele provocada
por M. leprae. A síntese local de TNF-α é então um componente crítico para o
isolamento da bactéria no local da lesão (BARNES et al., 1990; KHANOLKAR-YOUNG
et al., 1995).
A liberação de TNF-α apresenta um papel crucial para formação de
granuloma, contribuindo para proteção do organismo. Entretanto também é um
importante mediador da lesão tecidual local provocada por microorganismos. O
trabalho publicado por HAGGE e colaboradores em 2004 aponta que os níveis de
TNF-α estão aumentados em camundongos nu/nu infectados com M. leprae, de
forma análoga ao descrito por MOURA et al., 2007, e SARNO et al., 1991, que
encontraram um aumento na concentração de TNF-α no sobrenadante de cultura de
macrófagos de pacientes com hanseníase (KINDLER et al., 1989; ROOK, ATTIYAH,
1991 ; KANEKO et al., 1999 ; BEAN et al., 1999; HAGGE et al., 2004).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
42
TGF-β é outra importante molécula que atua como uma potente citocina
pró-inflamatória e imunosupressiva, tendo efeitos sobre o crescimento celular e a
diferenciação das células. TGF-β atua na supressão da resposta de células T,
inibindo a expressão tanto de IFN-γ como de IL-2, além de apresentar a habilidade
de inibir a atividade de macrófagos pela supressão da produção de ROS e de RNS,
entre eles o óxido nítrico, permitindo a progressão de algumas infecções
(WAKEFIELD et al., 1988 ; ESPEVICK et al., 1987; TSUNAWAKI et al., 1988 ; DING
et al., 1990; D'ANGEAC et al., 1991).
Em 2000, GOULART e colaboradores estudando cultura de macrófagos
humanos de pacientes com lepra concluiram que a concentração de TGF-β em
pacientes com o tipo lepromatoso da doença encontra-se mais elevado em
comparação com pacientes com a forma tuberculóide da hanseníase. Os autores
sugeriram então que o TGF-β estimula a resposta do tipo Th2 e efeitos
imunosupressivos na presença de M. leprae.
Esses resultados também foram observados
por KISZEWSKI e
colaboradores em 2003, onde a produção de TGF-β foi mais elevada em biópsias de
pele de pacientes com a forma lepromatosa da hanseníase, em comparação com a
forma tuberculóide. A menor expressão de TGF-β na forma tuberculóide da doença
poderia ser então o fator responsável pela indução da expressão de TNF-α e a
formação de fibrose.
IL-10 é uma citocina produzida por macrófagos com atividade antiinflamatória e imunosupressora potente, que apresenta um papel importante inibindo
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
43
as funções de APCs e a produção de citocinas por macrófagos e células dendríticas.
A IL-10 também reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias liberadas por
mastócitos, além de inibir as funções e a atividade de eosinófilos. Resultados
publicados por WU e colaboradores (2007), indicam uma associação entre o
aumento de liberação da citocina IL-10 com a diminuição de reações alérgicas,
devido a inibição de outros tipos celulares (MOORE et al., 2001 ; REDDY et al.,
2001; MOSSER 2003; AKDIS et al., 2004 ; VERRECK et al., 2004).
Entre outras funções, IL-10 inibe a expressão de moléculas de superfície
como MHC classe II, enzimas como a NO sintase (NOs), e diminui a expressão dos
receptores de TNF-α. Estudos têm demonstrado a IL-10 como um importante
regulador da inflamação em diversas doenças inflamatórias, incluindo a septicemia.
Em trabalho publicado por REDDY e colaboradores em 2001, foi demonstrado que a
inibição da função de macrófagos alveolares está ligada ao aumento de produção de
IL-10 pelas células do sistema imune (KASAMA et al., 1994; LEEUWENBERG et al.,
1994; STANDIFORD et al., 2000).
Em trabalho publicado por MOURA e colaboradores (2007), o aumento na
produção da citocina IL-10 foi observado no sobrenadante de cultura de células
isoladas de biópsia de pele de pacientes com lepra. Com este trabalho MOURA e
colaboradores demonstraram também uma menor produção de óxido nítrico nessas
culturas estimuladas com IL-10. Os resultados de aumento da produção de IL-10
foram confirmados e também apresentados por GOULART et al., 2000, e ADAMS et
al., 2001.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
44
2.1.8 - Interação de L. amazonensis com macrófagos e citocinas
(TNF-α
α, TGF-β e IL-10).
Os macrófagos desempenham um importante papel contra Leishmania,
tanto como principal célula hospedeira, quanto atuando na apresentação de
antígenos para as células T (ANTOINE et al., 1991; PRINA et al., 1993).
Os macrófagos produzem citocinas que direcionam a resposta para perfil
Th1 ou Th2, modulando a resposta imune e influenciando na sobrevivência do
parasita intracelular, além de NO e ROS que atuam de forma sinérgica e tóxica para
o parasita (GREEN et al., 1990; MAUEL et al., 1991; ASSREUY et al., 1994;
MOSSER et al., 1999).
Gomes e colaboradores investigaram a susceptibilidade de macrófagos
de camundongos CBA/J a infecção com L. amazonensis e L. major , demonstrando
um aumento na expressão de RNAm TNF-α no processo de infecção em
comparação com as culturas controle (GOMES et al., 2003).
A importância da citocina TNF-αna infecção por L. amazonensis ainda
não está completamente avaliada, sendo ainda o controle da leishmaniose uma
questão controversa (NASHLEANAS et al., 2000). Trabalhos citados na literatura
concluem que o aumento da atividade leishmanicida dos macrófagos acontece
devido ao aumento da produção de TNF-α, que atua dentre outras formas como
segundo mensageiro. Esse aumento da produção de TNF-α é responsável pela
ativação do macrófago e conseqüente morte do parasita intracelular (GOMES et al.,
2003 ; MARTIN et al., 1994 ; KAMIJO et al., 1994 ; THEODOS et al., 1991).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
45
Gomes e colaboradores investigaram também o papel das citocinas TGFβ e IL-10 que estão implicadas nas respostas com perfil Th2, no processo de
infecção de macrófagos de camundongos CBA/J com L. amazonensis. TGF-β é uma
potente citocina que suprime a expressão da enzima NO-sintase indutível (iNOS).
Os autores mostraram que a concentração de TGF-β e a expressão de RNAm TGFβ levemente aumentada nos sobrenadantes das culturas em comparação com as
culturas controle. Os estudos presentes na literatura mostram um efeito paradoxal
da citocina TGF-β, podendo atuar promovendo ou suprimindo o desenvolvimento de
resposta com perfil Th1 (SWAIN et al., 1991; BARRAL et al., 1993; SCHMITT et al.,
1994; HOEHN et al., 1995; BARRAL et al., 1995; GANTT et al., 2003).
Segundo Barral-netto e colaboradores citocinas como TGF-β , IL-10 e
IFN-γ, influenciam a replicação de Leishmania no interior de macrófagos (BARRALNETO et al., 1994). TGF-β é uma citocina multipotencial com diversos efeitos nas
células do sistema imune, incluindo a inibição da
ativação dos macrófagos. A
infecção de macrófagos com Leishmania induz a produção de TGF-β. Culturas de
macrófagos humanos e de camundongos tratados com TGF-β recombinante
apresentaram um aumento da replicação do parasita no interior das células. Da
mesma maneira, a administração de TGF-β exógeno in vivo promove a exacerbação
da infecção, tendo este um importante papel na modulação da resposta imune tanto
nos homens quanto em camundongos, e sendo, provavelmente, seu aumento, um
importante mecanismo de escape do parasita (BARRAL-NETTO et al.,1992).
Da mesma maneira Wilson e colaboradores demonstraram que os níveis
de TGF-β estavam aumentados no fígado de camundongos BALB/c durante a
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
46
infecção com L. chagasi (WILSON et al., 1998). Outros trabalhos mostraram ainda o
aumento na produção de TGF-β em cultura de macrófagos humanos em interação
com L. chagasi, fato que pode garantir a sobrevivência do parasita (GANTT et al.,
2003).
A expressão de RNAm IL-10 já foi detectada após 72 horas de infecção
de macrófagos de camundongos CBA/J com L. amazonensis e L. major (GOMES et
al., 2003). A expressão de RNAm IL-10 foi 3 vezes maior nas culturas de
macrófagos infectados com L. major do que com L. amazonensis. Observou-se que
no contexto de resposta Th2, nas células infectadas com L. amazonensis, a
produção de IL-10 pode exacerbar a infecção, concluindo-se que ambas as citocinas
TGF-β e IL-10 não são os fatores determinantes do processo de infecção. O
aumento na produção de IL-10 em células infectadas também foi observado em
trabalhos de outros autores (LI et al., 1996; BARRAL et al., 1993).
IL-10 foi relatada como sendo uma citocina Th2 na progressão da doença
na leishmaniose visceral (KARP et al., 1993), e que pode apresentar um importante
papel na susceptibilidade na leishmaniose visceral experimental, onde o aumento na
expressão de RNAm IL-10 nos tecidos, durante a infecção, aumenta a
susceptibilidade a doença (MELBY et al., 1998; GOTO et al., 2004).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
47
2.1.9 - Interação de F. solani com macrófagos e citocinas (TNF-α
α,
TGF-β e IL-10)
Tanto os macrófagos como os leucócitos polimorfonucleares apresentam
um papel essencial na eliminação de microorganismos. Tem sido constatado que os
polimorfonucleares inibem o crescimento das hifas, enquanto que os macrófagos
são capazes de impedir a germinação dos conídios e o crescimento das hifas
(NELSON et al., 1994; TZIANABOS, 2000 ; MONZÓN, TUDELA, 2001).
Ocasionalmente, Fusarium causa infecções superficiais e subcutâneas
em indivíduos normais, chamadas fusarioses, sendo classificadas no grupo das
hialohifomicoses.
Além
disso,
infecções
graves
causadas
por
esses
microorganismos em pacientes imunodeprimidos são cada vez mais freqüentes, e
por isso sua importância como fungo causador de infecção oportunista tem crescido
exponencialmente. O Fusarium está sendo atualmente classificado como novo
agente emergente causador de micoses superficiais e sistêmicas em pacientes com
déficit no sistema imunológico (SHAYKH et al., 1977; ANAISSIE et al., 1986;
ALVAREZ-FRANCO et al., 1992; GUARRO, GENÉ, 1995; VENDITTI et al., 1998;
GROLL, WALSH, 2001).
As características mais comuns encontradas nas lesões cutâneas
envolvendo Fusarium são o aparecimento disseminado de nódulos na pele,
fungemia, abrangendo diversos órgãos. O comprometimento da pele ocorre em
cerca de 80% dos casos de infecção disseminada, o que torna essas lesões de
extrema importância por estarem acessíveis para biópsia e cultura, permitindo o
diagnóstico da fusariose (NUCCI, ANAISSE, 2002). O fungo tem a capacidade de
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
48
invadir a parede do vaso sanguíneo, causando dano ao tecido e posterior necrose,
possivelmente mediada por TNF-α, sendo então disseminado pelo organismo
rapidamente. O tratamento e o prognóstico estão intimamente ligados ao grau de
invasão e ao estado imunológico do paciente infectado, estando mais susceptíveis
pacientes
imunocomprometidos,
como
portadores
do
HIV
e
pacientes
transplantados. O somatório desses fatores denota a importância da descoberta de
novos métodos de diagnóstico e tratamento da fusariose (ANAISSIE et al., 1986;
ANAISSIE et al., 1988; GUARRO, GENÉ, 1995; GUPTA et al., 2000; NUCCI,
ANAISSIE, 2007; KAUFFMAN, 2006).
Atualmente a identificação de membros do gênero Fusarium é baseada
nas características morfológicas da colônia e características microscópicas, na qual
se inclui a produção de macroconídios – conídios multiseptados em formato de foice
(Figura 5). A utilização de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) como método de
identificação desses fungos constitui uma maneira rápida, porém de elevado custo
para sua utilização na rotina laboratorial (SNYDER, HANSEN, 1940; HUE et al.,
1999).
Figura 5 - Conídios multiseptados de Fusarium corados por azul de algodão.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
49
Muitas espécies de Fusarium requerem condições específicas para
crescerem adequadamente enquanto outras sofrem mutação rapidamente. O que
explica a diversidade de classificações e espécies descritas por diversos autores
(NELSON et al., 1994; MONZÓN e TUDELA, 2001).
Algumas Fusarioses já foram descritas com alto índice de morbidade e
mortalidade, especialmente por insuficiência no diagnóstico, estando comumente
envolvida a espécie F. solani. Desde que a infecção por esse fungo pode ser
confundida com aspergilose, muitos pacientes são usualmente tratados com
anfotericina B, um agente com baixa atividade contra fusariose. Consequentemente,
o diagnóstico precoce da fusariose é de suma importância. Apesar do crescente
número de publicações a respeito de infecções fatais por esse fungo, o
conhecimento de sua patogênese é muito escasso. Também já foram descritos
casos de doença de base hematológica onde pacientes desenvolveram infecções
por Fusarium durante o curso da doença (ENGELHARD et al., 1993; VIVIANI et al.,
1991; UZUN et al., 1995; BOUTATI, ANAISSIE, 1997).
Estudos têm demonstrado que a micotoxina fumonisina produzida pela
espécie Fusarium moniliforme altera a proliferação e induz a apoptose e necrose em
diferentes tipos celulares em cultura, além de afetar o fígado e os rins de roedores.
Os resultados indicam que a micotoxina produzida pelo Fusarium provoca o
aumento da expressão do fator de necrose tumoral (TNF-α) nesses tecidos, uma
importante citocina pró-inflamatória, responsável pelo aparecimento da lesão celular
e dos efeitos tóxicos nas células animais (TOLLESON et al., 1996; DUGYALA et al.,
1998; CIACCI-ZANELLA, JONES, 1999; MOBIO et al., 2000; HE et al., 2001).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
50
Em trabalho publicado em 1999, por Lemmer e colaboradores
observaram também o aumento progressivo na expressão do gene de TGF-β no
fígado de camundongos infectados com F. moniliforme, um importante produtor da
micotoxina fumonisina indicando que este fungo é capaz de induzir o aumento da
produção desta citocina. O aumento na expressão de TGF-β pelos hepatócitos dos
camundongos parecia estar relacionado a apoptose e a fibrose observadas no tecido
hepático destes animais (SANDERSON et al., 1995; LEMMER et al., 1999).
Em 2002, Theumer e colaboradores demonstraram que o tratamento de
cobaias com a micotoxina fumonisina produzida por espécies do gênero Fusarium,
produziu a liberação de uma menor concentração da citocina IL-10 no sobrenadante
da cultura de macrófagos de camundongo. Esses resultados sugeriram que o
processo inflamatório em animais deficientes na produção de IL-10 pode ter uma
resposta imune descontrolada, e consequentemente pode produzir alterações
morfológicas em órgãos como o intestino dessas cobaias (CHEN, ZLOTNIK, 1991;
THEUMER et al., 2001).
Tomados juntos todos esses dados, mencionamos primeiramente que,
atividade antimicrobiana de alguns tipos celulares é atribuída à fagocitose e
produção de NO (CSATO et al., 1987; CSATO et al., 1990). NO é um radical livre e
tem pronunciada atividade antimicrobiana contra vírus, bactéria, protozoários e
fungos (DE GROOTE et al., 1995).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
51
2.2 - Introdução - Parte II
Observação relevante: Esta parte da dissertação se iniciou com um trabalho de
revisão recente publicado pelo nosso grupo, onde eu me insiro como co-autor
(Anexo 1):
SANTOS, D.O.; COUTINHO, C.E.R.; MADEIRA, M.F.; BERNARDINO, A.;
BOURGUIGNON, S.C.; TONIONI, R.; CORTE-REAL, S.; PINHO, R.; RANGEL, C.R.;
CASTRO, H.C. Leishmaniasis treatment - A challenge that remains: a review.
Parasitology Research. 103:1-10, 2008.
2.2.1 - Tratamento da Leishmaniose: ainda um desafio
Das doenças emergentes na atualidade, as causadas por protozoários
têm um papel de destaque. Dentre elas, a leishmaniose, cujo agente etiológico
pertence ao gênero Leishmania, tem apresentado um considerável grau de
morbidade e mortalidade. Esta doença afeta cerca de 12 milhões de pessoas em 88
países, principalmente nos trópicos e sub-trópicos e com incidência anual de
aproximadamente dois milhões de novos casos, estando cerca de 350 milhões de
pessoas
vivendo
em
áreas
endêmicas
(KUHLENCORD
et
al.,
1992;
MUKHOPADHYAY et al., 2000; DELORENZI et al., 2001; KAYSER et al., 2001;
WENIGER et al., 2001; WHO, 2001; TIUMAN et al., 2005).
A Leishmania é um protozoário que no hospedeiro mamífero é parasito
intracelular obrigatório e pode determinar patologias que variam da forma cutânea à
visceral, dependendo da espécie de Leishmania e da resposta imune do hospedeiro
(GREEN et al., 1990; KUHLENCORD et al., 1992; MANIERA et al.,1992; CORTEDissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
52
REAL et al., 1995; ESCOBAR et al., 2001; MURRAY et al., 2003; SERENO et al.,
2005; HESPANHOL et al., 2005).
A forma tegumentar ou Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) tem
aumentado nos últimos 20 anos em praticamente todos os estados brasileiros, tendo
ocorrido surtos epidêmicos nas regiões Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste e, mais
recentemente, na região amazônica, relacionados ao processo predatório de
colonização. Historicamente, a leishmaniose tegumentar americana tem sido uma
doença rural afetando fazendeiros, militares e outros habitantes ou trabalhadores de
áreas rurais contudo esse perfil epidemiológico tem se modificado sendo encontrada
transmissão da doença na interface entre regiões rurais e peri-urbanas entre
pessoas de todas as idades e ambos os sexos (DELORENZI et al., 2001; WENIGER
et al., 2001; GONTIJO et al., 2003; GONTIJO et al., 2004; PAL et al., 2004;
OLIVEIRA et al., 2004).
A leishmaniose pode ser causada por diversas espécies como L.
(Viannia) brasiliensis, L. (Viannia) guyanensis, L. (Viannia) naiffi, L. (Viannia) shawi,
L. (Viannia) lainsoni, L. (Leishmania) amazonensis, L. (L. mexicana), L. (V.)
panamensis, L. Pífanoi, L. lindenbergi, L. colombiensis e L. venezuelensis. As
espécies envolvidas na infecção dependem da distribuição geográfica e a patologia
se apresenta como ulcerações simples ou difusas na pele, principalmente na face,
levando à mutilação e desfiguração do indivíduo afetado. A doença pode regredir
espontaneamente ou evoluir, sendo assim necessária a implantação de um
tratamento (Grimaldi et al., 1991; Kreutzer, et al., 1991; Bonfante-Garrido et al.,
1992; Silveira et al., 2002; Sereno et al., 2005; Tempone et al., 2005).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
53
A Leishmaniose Visceral (LV) ou Calazar é mais grave que a
leishmaniose cutânea (LC) e pode ser causada por L. (Leishmania) donovani e L.
infantum (semelhante à Leishmania chagasi no Brasil). Estes agentes acometem
cerca de quinhentas mil pessoas por ano, com importantes focos na Índia, Sudão e
países Latino-Americanos. O
agente afeta principalmente fígado e baço,
determinando uma hepatoesplenomegalia e consequentemente perda de função,
além de outras alterações graves que podem ser fatais se um tratamento eficaz não
for estabelecido. Este quadro é mais grave em pacientes imunodeprimidos, como no
caso dos portadores do HIV e transplantados, nos quais a Leishmania se apresenta
como um importante agente oportunista, determinando formas clínicas incomuns e
resistentes aos tratamentos utilizados, o que também ocorre na forma tegumentar da
doença (COURA et al.,1987; SOONG et al., 1995; CARVALHO et al., 2000; DEY et
al.,2000; DESJEUX et al.,2001; ESCOBAR et al., 2001; WENIGER et al., 2001;
MURRAY et al., 2003; GONTIJO et al., 2004; CROFT et al., 2006).
A imunodepresssão devido a transplante de órgãos e a infecções virais
como, por exemplo, pelo HIV, têm levado a um número aumentado de casos de
leishmaniose visceral (LV) em países em que esta doença era rara como França,
Itália, Espanha e Portugal (DESJEUX et al., 2003). A imunossupressão, tanto em
pacientes com HIV, como a provocada pelos medicamentos utilizados no tratamento
de pacientes transplantados, podem exacerbar infecções ocultas ou alterar os
sintomas clínicos mais comuns associados com algumas espécies de Leishmania,
como L. (Viannia) braziliensis que pode causar infecções viscerais ou lesões de pele
disseminadas em pacientes HIV positivos. Os níveis de transmissão também podem
ser aumentados quando o inseto vetor se alimenta em pacientes imunodeprimidos
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
54
com elevada parasitemia (COURA et al., 1987; SILVA et al.,2002; MORALES et al.,
2003).
A transmissão da leishmaniose ocorre através de insetos hematófagos
vetores dos gêneros Phlebotomus, no velho mundo, e Lutzomyia, no novo mundo. A
Leishmania se replica no trato digestivo dos vetores e os parasitas são transmitidos
ao hospedeiro mamífero quando eles realizam o repasto sanguíneo. Nos vetores as
espécies de Leishmania se apresentam na forma promastigota, que têm forma
alongada, possuem flagelos e são extracelulares. Nos hospedeiros mamíferos as
Leishmanias se encontram na forma amastigota que é arredondada, e intracelular
(Figura 6) (CHANG et al., 1990; GREEN et al., 1990; WENIGER et al., 2001;
RITTING et al., 2000; GONTIJO et al., 2003).
A
B
Figura 6: A- Promastigotas de Leishmania amazonensis (x1000); B- Amastigota infectando
macrófago. (x1000).
A multiplicação destes parasitas ocorre no interior dos macrófagos, que
são seus principais alvos. Através da lise dos macrófagos e da refagocitose ocorre a
disseminação da Leishmania pelo organismo. Entretanto o estabelecimento da
doença depende do sucesso do parasito em se diferenciar para a forma amastigota
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
55
e se multiplicar no interior do macrófago (Figura 7) (BOGDAN, et al., 1996; CHANG
et al.,1990; KAYSER et al., SERENO et al., 2005).
Figura 7: Ciclo de vida de Leishmania sp. causando leishmaniose (World Health
Organization - 2001).
As drogas utilizadas atualmente para o tratamento das leishmanioses
ainda apresentam alguns problemas, seja por sua alta toxicidade com diversos
efeitos colaterais, e pela ocorrência de resistência por parte dos parasitos que vem
aumentando gradativamente ao longo dos anos, pela dificuldade de sua via de
administração ou pelo alto custo das composições que se encontram disponíveis
(YARDLEY et al., 2002; SINGH et al.,2004).
O tratamento primário para a leishmaniose consiste no uso de antimonial
pentavalente, existente sob as formas stibogluconado de sódio e antimoniato de Nmetilglucamina, que vêm sendo usados desde os anos 40 (BERMAN et al., 1988;
OLLIARO et al.,1993; RAHT et al., 1993).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
56
Em alguns casos, outras drogas, como a Pentamidina, Anfotericina B e
Paromomicina são utilizadas, como uma opção aos casos de resistência; porém,
estas possuem uma severa toxicidade para o hospedeiro. Recentemente, também
sido descritos casos de resistência à pentamidina. Além desses fatores, há ainda
dificuldades no tratamento de pacientes imunocomprometidos, como os portadores
de HIV, nos quais as drogas convencionais são menos eficazes, sendo necessárias
altas doses e tempo prolongado de tratamento para evitar recidiva (RAMOS et al.,
1990; KUHLENCORD et al., 1992; ESCOBAR et al.,2001; BRAY et al., 2003; ROSA
et al., 2003).
2.2.2 - Novas alternativas: Associação de drogas com lipossomas
Uma das alternativas utilizadas para reduzir os efeitos indesejáveis de
algumas drogas usadas no tratamento da Leishmaniose é a ligação destas a
lipossomos, pois reduz a toxicidade e aumenta a concentração nos tecidos e
consequentemente sua eficácia. Uma hipótese do mecanismo de ação destes
lipossomos contra o parasito seria a interação com sua membrana, inibindo o
consumo do oxigênio. Segundo Dey e colaboradores, lipossomos consistindo de
Estearilamina (SA) e Fosfatidilcolina (PC) que são citotóxicos para outras espécies
de protozoários quando testados em culturas de macrófagos e camundongos Balb/c
infectados com L. donovani, apresentaram não só citotoxidade contra ambas as
formas promastigotas e amastigotas, mas também efeito terapêutico para infecções
recentes e já estabelecidas, marcada redução dos parasitos no fígado e baço dos
camundongos infectados e significante redução da hepatoesplenomegalia, sem
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
57
causar efeitos tóxicos às células do hospedeiro (DEY et al., 2000; DESJEUX et al.,
2003; GONTIJO et al., 2003; ROSA et al., 2003).
A Anfotericina B, substância utilizada para o tratamento de pacientes com
calazar que são clinicamente resistentes à pentamidina, é um composto que se liga
preferencialmente ao ergosterol na membrana plasmática de Leishmania, porém de
forma menos extensa também ao colesterol nas células humanas levando a
formação efeitos tóxicos. Visando suplantar esses efeitos tóxicos existem no
mercado algumas formulações associando anfotericina B a lipídios (Ambisome, o
Abelcet e o Amphotec), porém estes medicamentos possuem um custo de produção
elevado, dificultando sua utilização em países mais pobres (GOLENSER et al.,
1999).
Há estudos que visam o desenvolvimento de métodos mais baratos de
produção destas drogas como o de Larabi e colaboradores que testaram uma
formulação com uma composição lipídica semelhante à do Abelcet, porém, com
forma e tamanho diferentes, o que pode influenciar a liberação e atuação da droga
no organismo, além de um processo de produção mais simples e barato. Eles
observaram que a nova formulação foi 27% mais eficaz e menos tóxica que o
Abelcet in vivo e in vitro. A mesma formulação foi menos eficaz que o Ambisome, no
entanto, o seu custo de produção é bem menor do que o desta droga, sendo uma
opção de tratamento menos onerosa. Estes resultados mostram que a inclusão de
drogas como a Anfotericina B ou mesmo a Pentamidina nestas vesículas pode ser
uma alternativa no tratamento da Leishmaniose pela atuação sinérgica destas
substâncias (LARABI et al., 2003).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
58
Estes mesmos lipossomos também podem ser utilizados em combinação
com o Antimônio Gluconato de Sódio (SAG) para aumentar sua eficácia como
descrevem Pal, Ravindran e Ali, que testaram a combinação PC-AS + SAG, em
dose única, contra a infecção de L. donovani em macrófagos in vitro e observaram
uma eficácia maior do que a monoterapia com SAG (Antimônio Gluconato de Sódio).
Em camundongos verificaram ainda que a combinação reduziu os parasitos em 98%
no fígado e 97% no baço, contra 76 e 65% da monoterapia, sem apresentar efeitos
tóxicos e que três meses após o tratamento eliminou totalmente os parasitos dos
órgãos analisados morfologicamente (PAL et al., 2004).
Segundo Golenser e colaboradores a conjugação também pode ser feita
com um carreador polimérico, com o mesmo objetivo de redução da toxicidade e
melhora do efeito da droga, só que através do aumento da solubilidade na água, do
tempo de circulação no organismo e acúmulo nos tecidos lesados que são
promovidos por este tipo de conjugação. Eles observaram que a associação da
Anfotericina B com o Arabinolactam, um polissacarídeo solúvel em água, foi mais
eficaz no tratamento de infecção recente e já estabelecida por L. infantum e L. major
quando comparada às drogas com conjugação lipídica. As vantagens desta
associação descritas por estes autores incluem estabilidade física e química quando
liofilizada ou em solução, e facilitação nos processos de esterilização por filtração,
liberação da droga na circulação e eliminação pelo organismo, além da possibilidade
de administração pelas vias intravenosa e subcutânea (GOLENSER et al., 1999).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
59
2.2.3 - Novas Drogas Derivadas de Microrganismos e Plantas
Outros pesquisadores têm buscado na natureza, novas alternativas para
o tratamento da leishmaniose, visto que esta sempre foi uma importante fonte de
drogas para o tratamento de diversas patologias. Assim busca-se melhor efeito e
menor toxicidade nas substâncias derivadas de microorganismos ou plantas,
baseadas principalmente na sua utilização por pessoas que vivem em áreas
endêmicas e utilizam os seus extratos no tratamento das lesões. Weniger e
colaboradores testaram extratos de plantas nativas da costa pacifica colombiana
utilizadas popularmente para o tratamento de leishmaniose pela população local, e 4
das cinco espécies testadas (80%) foram ativas in vitro a 100 µg/mL contra formas
promastigotas de Leishmania e mostraram boa atividade contra amastigotas de
L.(V.) panamensis (KAYSER et al., 2001; SILVA et al., 2002; WENIGER et al.,
2001).
A afidicolina, um metabólito isolado do fungo Nigrospora sphaerica, que é
descrita como tendo ação de inibição da divisão celular por atuar impedindo a
função da DNA polimerase, foi testada contra promastigotas e amastigotas de L.
donovani (KAYSER et al., 2001). Os autores do trabalho observaram em seus
estudos que dos 18 compostos formulados a partir deste metabólito somente três
apresentaram boa toxicidade contra os parasitos resistentes, se comparados a
outras drogas como Anfotericina B e Miltefosina. Os compostos apresentaram
também moderada toxicidade para os macrófagos utilizados no experimento, mas
continuam ainda assim, como uma alternativa de tratamento (KAYSER et al., 2001).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
60
Outras substâncias isoladas do fungo Hipocrella bambusae, os pigmentos
Hipocrelins A e B que são utilizados na Medicina Tradicional Chinesa no tratamento
de outras doenças, foram testados por Ma et al contra L. donovani. Foi observado
por estes autores, nos testes in vitro, que o Hipocrelin A apresentou potente
atividade contra o parasito, inclusive sendo mais eficaz que a Anfotericina B e a
Pentamidina, enquanto o Hipocrelin B apresentou atividade moderada, destacando
estes compostos como possíveis alternativas no tratamento da leishmaniose (MA et
al., 2004).
Em relação aos derivados de plantas, que estão entre os agentes mais
ativos contra diversos tipos de infecção, uma substância que está sendo pesquisada
é o Nerolidol, presente em óleos essenciais oriundos de algumas espécies. Atribuise a este, ação inibitória sobre as etapas iniciais na síntese de Ergosterol e Dolicol,
importantes na constituição da membrana do parasito (DELORENZI et al., 2001)
Arruda e colaboradores testaram o Nerolidol em seus experimentos, e observaram
que este reduziu a síntese de ergosterol e dolicol pelos parasitos, apresentando
efeito satisfatório in vitro contra promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, L.
chagasi e L. brasiliensis. Além disso, também observaram eficácia no tratamento de
camundongos
infectados,
quando
a
administração
foi
realizada
por
via
intraperitoneal. Já na aplicação tópica os efeitos não foram satisfatórios e após o
término do tratamento houve recidiva das lesões, indicando que o uso desta
substância deve ser prolongado. Outras drogas já existentes possuem o mesmo
mecanismo de ação do Nerolidol, porém agem nas etapas finais do processo e
algumas espécies de Leishmania podem utilizar os esteróides do hospedeiro sendo
então, estas drogas, ineficazes (DELORENZI et al., 2001; ARRUDA et al., 1995).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
61
Outro exemplo da pesquisa envolvendo derivados de plantas contra a
leishmaniose é a utilização do extrato do Tanacetum parthenium, pertencente à
Família Asteraceae, que na medicina popular é utilizada no tratamento de várias
moléstias. Tiuman e colaboradores testaram, in vitro, o extrato desta planta puro e
diluído em alguns solventes contra promastigostas e amastigotas de L.
amazonensis. Estes autores observaram que o extrato puro e a fração diluída em
solventes apresentaram ótimo efeito, reduzindo em até 84% a internalização dos
parasitos em macrófagos, além disso, não apresentou efeitos tóxicos para as células
do hospedeiro quando comparado com outras drogas utilizadas no tratamento da
leishmaniose. Os autores observaram ainda, que dentre os solventes utilizados, o
diclorometano foi o mais eficaz, inclusive com melhores resultados do que o extrato
puro da planta (TIUMAN et al., 2005).
A ação do óleo essencial extraído da Croton cajucara, uma planta
utilizada na medicina popular Brasileira para o tratamento de desordens
gastrointestinais e com relatos de efeitos antiinflamatórios, contra promastigotas e
amastigotas de L. amazonensis por Rosa e colaboradores. Este óleo é rico em
Linalol, um álcool terpênico presente também em outras espécies de plantas. Os
autores observaram que mesmo em doses baixas, tanto o extrato quanto o Linalol
isolado foram capazes de matar 100% dos parasitos sem causar toxicidade. Além
disso, quando macrófagos foram pré-tratados com o óleo houve redução da
associação dos parasitos a estas células e aumento da produção de óxido nítrico,
que tem papel importante no combate à infecção (ROSA et al., 2003).
Encontrada no Brasil e em outros países da América do Sul, a Peschiera
australis foi analisada quanto aos seus componentes e testada in vitro contra
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
62
promastigotas e amastigotas de L. amazonensis (DELORENZI et al., 2001). Os
autores observaram em seus experimentos que o extrato desta planta inibiu o
crescimento de promastigotas em 100%. A diluição deste extrato com solventes
gerou três frações diferentes, sendo a composta por clorofórmio a mais eficaz contra
amastigotas em culturas e macrófagos, tanto em doses únicas como múltiplas,
reduzindo a infecção em até 99%. O alcalóide Indólico é o componente ao qual é
atribuída a ação anti-leishmania do extrato, que apresentou ótima atividade contra
amastigotas e principalmente contra promastigotas, sendo esta substância e seus
derivados um agente promissor no tratamento da leishmaniose (DELORENZI et al.,
2001).
2.2.4 - Desenvolvimento Racional de Fármacos
A
Química
Medicinal,
ciência
responsável
pelo
processo
de
desenvolvimento de novos fármacos, vêm ganhando impulso graças a recentes
avanços tecnológicos, principalmente nas áreas de biologia estrutural, molecular e
química computacional. Hoje o desenvolvimento racional de fármacos é uma
realidade, abrindo novas perspectivas quanto à descoberta de novas drogas ou
buscando o melhoramento daquelas existentes (LIÑARES et al., 2006; LIMA et al.,
2005).
A técnica consiste em modificações estruturais de uma molécula inicial
(chamada de composto líder), que pode ser natural ou sintética, visando a obtenção
de uma série de compostos derivados. Em seguida, testes farmacológicos são
realizados tanto in vitro quanto in vivo para determinar quais dos novos compostos
apresentam a atividade desejada sobre o alvo terapêutico escolhido. Nesse
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
63
processo, são fundamentais o conhecimento das propriedades físico-químicas,
estruturais e de interação entre o composto líder e seu alvo farmacológico (visando a
manutenção das características medicinais iniciais), além da intuição química do
químico medicinal (BARREIRO et al., 2002; LIÑARES et al., 2006).
Uma vez definido o alvo farmacológico e o composto líder a ser
trabalhado, várias estratégias de modificação molecular podem ser aplicadas.
Dentre elas, destacam-se a simplificação molecular
_
que permite a obtenção de
compostos estruturalmente mais simples a partir de protótipos ativos mais
complexos - e o bioisosterismo – que é a substituição de trechos, radicais ou mesmo
átomos de uma molécula por outros, de modo a obter derivados que possam
apresentar atividades farmacoterapêuticas mais atraentes (LIÑARES et al., 2006;
LIMA et al., 2005).
O desenvolvimento de inibidores específicos como de atividade
metabólica torna possível o controle de parasitas diminuindo os efeitos colaterais no
hospedeiro. Os avanços recentes em bioquímica de parasitas patogênicos, incluindo
a descoberta de novas organelas, podem atuar juntos para um melhor tratamento da
leishmaniose. O sucesso da quimioterapia em leishmaniose durante os últimos 21
anos tem sido baseado na reformulação e pesquisa de um desenho racional de
fármacos, bem como em um melhor entendimento da imunologia da doença. As
duas esperanças de desenho racional de fármacos da década de 80 –
pirazolopiridinas (alopurinol e derivados) que alteram a biossíntese de ácidos
nucléicos e os inibidores da C14-α demetilase e síntese de esterol (azóis
antifúngicos – cetoconazol, itraconazol) – tiveram uma eficácia decepcionante,
apesar de suas propriedades farmacocinéticas (TEMPONE et al., 2005).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
64
Os ensaios requeridos para o processo de descoberta de novas drogas
para leishmaniose foram revisados por Croft e colaboradores. Os ensaios para
descoberta de drogas anti-leishmania in vitro incluem teste de atividade da droga
contra o estágio extracelular do protozoário (promastigota); teste de drogas contra
espécies de Leishmania utilizando como células hospedeiras macrófagos peritoniais
de camundongo ou monócitos humanos transformados em macrófagos bem como
em culturas axênicas de amastigotas. Ensaios in vivo nos permitem entender
questões acerca do mecanismo de absorção da droga (via de administração) e
distribuição (diferentes sítios de infecção, metabolismo, excreção e indicação de
toxicidade em nível do organismo) (CROFT et al., 2006).
2.2.5 - Novas Drogas de Origem Sintética
Uma droga sintética muito pesquisada no tratamento da leishmaniose é a
Hexadecilfosfocolina (HPC ou Miltefosina), que originalmente foi desenvolvida para o
tratamento do câncer. Atribui-se a esta substância na atuação contra Leishmania a
propriedade de estimular o sistema hematopoiético e imune do hospedeiro com
ativação de células T, macrófagos e aumento da produção de interferon gama, além
de sua ação ser direta sobre o parasito. No entanto, como desvantagens, existem
relatos de casos de teratogenicidade que podem estar relacionados à utilização do
HPC, além do risco de rápido desenvolvimento de resistência por parte do parasito
se utilizada sozinha (ESCOBAR et al., 2001).
Escobar e colaboradores compararam a ação do HPC com o
stibogluconato e verificaram independência do HPC das células B e T para a ação
anti-leishmania, em contrapartida a imunodependência do stibogluconato. Nos
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
65
camundongos imunodeficientes o HPC teve efeitos satisfatórios e similares ao de
camundongos normais contra Leishmania, o que não ocorreu com o stibogluconato,
indicando sua independência da resposta imune do hospedeiro, similar ao que
observado em macrófagos in vitro (ESCOBAR et al., 2001). Kuhlencord e
colaboradores em seus estudos, verificaram que o HPC apresentou boa distribuição
no organismo por via oral, e que comparado ao stibogluconato, foi mais eficaz na
redução de parasitos no baço, fígado e medula óssea, onde outras drogas têm
dificuldade de agir. Apesar de alguns efeitos colaterais, estes resultados
caracterizam o HPC como uma alternativa para o tratamento de pacientes
portadores de HIV. Além disso, a possibilidade de administração por via oral facilita
o seu uso, apresenta boa distribuição e com isso diminui o seu custo (ESCOBAR et
al., 2001; KUHLENCORD et al., 1992).
A nicotinamida (NAM) também tem seu mecanismo de ação contra
Leishmania ligado à inibição de uma enzima da família das deacetilases,
prejudicando a produção de uma proteína chamada S1R2, que tem grande
importância na sobrevivência do parasito na forma amastigota como descrito por
Sereno e colaboradores, que em seus estudos observaram que a NAM inibiu o
crescimento de amastigotas em culturas no interior de macrófagos infectados,
porém, não produziu efeito contra promastigotas de L. infantum e L. amazonensis.
Estes efeitos foram obtidos sem a ocorrência de citotoxidade e podem ser obtidos
usando a molécula por via oral e associada a outras drogas anti-leishmania, o que a
caracteriza como uma boa escolha para o tratamento da leishmaniose (SERENO et
al., 2005; SILVA et al., 2002).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
66
Kar e colaboradores estudaram os efeitos do Ácido Trans-Acotínico
(TAA), um inibidor da enzima aconitase, contra L. donovani, devido à sua ação sobre
a oxidação dos ácidos graxos que têm grande importância no fornecimento de
energia para o desenvolvimento do parasito. Eles observaram que o TAA inibiu o
crescimento de promastigotas in vitro e a multiplicação de amastigotas em
macrófagos e em hamsters infectados sem apresentar toxicidade para as células do
hospedeiro, além disso, quando associado a outras drogas, o TAA agiu
sinergicamente, reduzindo as dosagens necessárias para obtenção do efeito (KAR
et al., 1993).
Recentemente drogas que já são utilizadas no tratamento de outras
patologias também estão sendo testadas no tratamento da leishmaniose, como é o
caso do Risedronato (RIS) e o Pamidronato (PAM), pertencentes à classe dos
bifosfonatos e utilizadas no tratamento de distúrbios ósseos (TEMPONE et al.,
2005). Estas drogas foram testadas em camundongos infectados com L. donovani e
L. mexicana e apresentaram redução acima de 99% dos parasitos no fígado destes
animais sem apresentar efeitos tóxicos. Segundo Tempone et al, as quinolonas e
seus derivados também têm apresentado efeitos contra protozoários, inclusive a
Leishmania. Eles utilizaram em seus experimentos quatro compostos derivados das
Quinolonas compararando sua ação com a da Pentamidina e observaram que todos
eles apresentaram maior eficácia e menor toxicidade contra promastigotas de L.
chagasi com doses menores. Contudo, somente um dos compostos elaborados
mostrou eficácia sem efeitos tóxicos, matando 100% das amastigotas no interior de
macrófagos (TEMPONE et al., 2005).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
67
2.2.6 - Tratamento e o Sistema Imune
Uma alternativa no tratamento da Leishmaniose é a associação de drogas
a algumas citocinas que possuem efeito imunoestimulante, com o intuito de
aumentar a resposta imune pela ativação de macrófagos, a produção de óxido
nítrico e outros mecanismos para eliminar a infecção, devido ao papel importante do
sistema imune do hospedeiro e seus componentes na resposta a este tipo de
infecção (SHAPIRO et al., 1991). Murray e colaboradores testaram este mecanismo
em camundongos infectados com L. donovani através da associação de Anfotericina
B (ANFB) com alguma destas citocinas, e observaram que apesar desta droga ter
ação direta sobre os parasitos e ser independente da imunidade do hospedeiro, a
combinação foi mais eficaz do que a monoterapia, inclusive com redução da dose da
ANFB. O uso de ANFB associado a IL-12, anticorpos anti CD40 e anti IL-10
aumentou a morte dos parasitos para 82%, 84% e 56%, respectivamente (MURRAY
et al., 2003; SHAPIRO et al., 1991; TIUMAN et al., 2005).
O desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose, usando parasitos
atenuados, mortos ou rompidos, através do isolamento e purificação de antígenos
ou de parasitos encapsulados em lipossomos, tem sido amplamente pesquisada.
Soong e colaboradores, utilizando os antígenos P4 e P8 isolados de amastigotas de
L. pifanoi para imunizar camundongos infectados, verificaram que o P8,
administrado com um adjuvante (C. parvum), conferiu proteção completa contra a
infecção com L. pifanoi, além de proteção cruzada à L. amazonensis, enquanto P4
só protegeu os animais infectados contra L. pifanoi (SOONG et al.,1995). A
imunização de camundongos contra L. donovani usando um promastigota atípico
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
68
UR6 na forma viva, centrifugada, morta e tratada com formol, apresentaram,
respectivamente, 91, 99, 88 e 93% de redução da parasitemia no baço e fígado dos
animais inoculados. Foi observado ainda uma variação dos resultados dependendo
da forma de aplicação, concluindo-se que a via subcutânea foi a mais eficaz e sem a
necessidade de adjuvantes (MUKHOPADHYAY et al., 2000).
Desde a descoberta das primeiras drogas para o tratamento da
Leishmaniose (antimoniais pentavalentes) até o presente, a procura de substâncias
com
potencial leishmanicida, sem efeitos tóxicos e, capazes de
superar a
emergência de cepas resistentes ao tratamento ainda permanecem um grande
desafio e o estudo de novas moléculas ativas e fármacos continuam sendo ainda de
grande interesse para o tratamento da leishmaniose.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
69
3. Objetivos
3.1 - Parte I: Investigar a importância do NO na determinação do processo de
interação de M. leprae, L. amazonensis e F. solani, através do tratamento da célula
hospedeira com inibidor de NO-sintase (L-NAME).
3.1.1- Estudar características morfológicas do processo de infecção à nível de
microscopia óptica convencional e eletrônica de transmissão.
3.1.2- Investigar a produção de citocinas (TNF-α, TGF-β e IL-10) pelo macrófago
durante o processo de infecção.
3.2 - Parte II: Investigar o potencial leishmanicida
piridinas
da
série
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina
sobre a forma promastigota de L. amazonensis.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
de derivados sintéticos de
Pós-Graduação em Patologia
70
4. Materiais e Métodos
4.1 – Cultura de Células
4.1.1 - Processamento de Macrófagos
As células utilizadas foram obtidas do concentrado de leucócitos (buffycoat) de doadores normais voluntários, cedidas pelo Serviço de Hemoterapia do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ). Conforme o protocolo
aprovado pelo Cômite de Ética em Pesquisa CEP CMM-HUAP nº191/07, CAAE
nº0158.258.000-07.
A separação das células foi feita através da técnica utilizando gradiente
de Ficoll-Hypaque (Hystopaque, Sigma), cuja mistura de polissacarídeos neutros
hidrofílicos de alta densidade, se dissolve em solução aquosa e forma um gradiente
com a densidade específica de d=1,077, responsável pela separação das células.
Adiciona-se 35mL de sangue puro a igual volume de gradiente de FicollHypaque (35mL). Centrifuda-se a amostra pó 30 minutos, 1500rpm em temperatura
de 21ºC.
Após a centrifugação das células com o gradiente de Ficoll-Hypaque
ocorre a formação de fases bem visíveis, onde na fase superior fica o plasma e seus
constituintes solúveis, na interface as células mononucleares do sangue periférico
(PBMCs), em seguida o Ficoll-Hypaque e após os eritrócitos e granulócitos que
ficam sob a forma de um sedimento celular no fundo do tubo.
O anel contendo as células mononucleares (PBMCs) é retirado e lavado
três vezes por centrifugação a 1500rpm, 400g, por 15 minutos com solução salina
tamponada de PBS, pH 7,2 - 7,4. O objetivo da lavagem é a retirada no
sobrenadante do restante das plaquetas e o gradiente de Ficoll-Hypaque, que se
mantido torna-se tóxico para as células.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
71
Ao final do processo de lavagem, o pellet formado por PBMCs é
ressuspenso em 5mL de meio de cultura DMEM, homogeneizado, quantificado em
Câmara de Neubauer e
plaqueado 106 células mononucleares/poço, em meio
DMEM na ausência de soro, em Labteks de 8 poços durante 1 hora para adesão dos
monócitos. Após esse tempo, o sobrenadante (linfócitos) foi retirado, as células
aderentes lavadas 2x com PBS. Adiciona-se meio de cultura DMEM contendo 10%
de soro humano comercial às células, que são incubadas a 37ºC, atmosfera de 5%
de CO2 durante 10 dias para que ocorra a diferenciação dos monócitos em
macrófagos.
4.2 – Procedência dos Biopatógenos
4.2.1 – Mycobacterium leprae
Os Mycobacterium leprae utilizados neste projeto são bacilos inativados
por radiação, ou seja, mortos porém mantendo ainda integridade de características
morfológicas e antigênicas. O M. leprae foi gentilmente doado pelo Doutor John
Spencer da Universidade do Colorado – EUA, cuja pesquisa é fonte da procedência
mundial da bactéria para fins de pesquisa.
4.2.2 – Leishmania amazonensis
Os parasitos utilizados nas infecções foram obtidos a partir de culturas de
Leishmania amazonensis da cepa MHOM/BR/77/LTB0016 doadas pela Dra. Suzana
Corte-Real, Ultraestrutura/Fiocruz – RJ. As culturas eram mantidas em meio líquido
Schnaider, que mimetiza o microambiente do inseto Phlebotomus, promovendo a
replicação dos parasitas. As culturas foram centrifugadas e lavadas com meio de
cultura DMEM, quantificadas em câmara de Neubauer, e reservadas para infecção.
4.2.3 – Fusarium solani
As amostras do fungo Fusarium solani (doados pela Profa. Diana Sgarbi,
Micologia/UFF) são provenientes de lesão cutânea de pacientes atendidos pelo
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
72
serviço de micologia do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense. Os
fungos foram isolados, identificados e classificados pela Professora Jussara
Schiwind Pedroso Stussi, sendo mantida cultura primária em terra estéril a
temperatura de aproximadamente 4ºC.
Para os estudos foram realizados repiques para tubos de ensaio
contendo meio de Sabouraud a partir da cultura primária, que foram mantidos à
temperatura ambiente por sete dias para que ocorresse o crescimento do micélio
fúngico. Os esporos foram então carreados a partir dos tubos de ensaio com solução
salina de PBS, quantificados em câmara de Neubauer, e reservados para infecção
dos macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humano.
4.3 – Interação entre Macrófagos Humanos e Patógenos
Os ensaios de interação dos Biopatógenos foram realizados em triplicatas
e avaliados após 24 horas de interação, comparando-se macrófagos tratados e não
tratados com L-NAME, na presença ou ausência dos biopatógenos:
- Macrófagos
- Macrófagos + L-NAME
- Macrófagos + L-NAME + Biopatógeno
- Macrófago + Biopatógeno
4.3.1 - Mycobacterium leprae
Os macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humano
foram previamente tratados com L-NAME (20µM) (inibidor da enzima iNO-sintase)
durante 1 hora antes da infecção, com a finalidade de se invetigar o papel do NO no
processo de interação. A interação dos macrófagos com a micobactéria foi feita
adicionando-se 20µg/mL de M. Leprae as células e incubando-se por um período de
3 horas em estufa a 37° C com atmosfera de 5% CO2. As células foram então
lavadas 3 vezes com tampão PBS pH 7,2 - 7,4 para remoção dos bacilos que não
foram fagocitados e mantidas por mais 24 horas em estufa a 37° C com 5% CO2. Os
sobrenadantes das culturas foram então reservados para as dosagens de citocinas
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
73
(TNF-α, TGF-β e IL-10) e estocadas à -2ºC para posterior análise imunoenzimática
das citocinas (ELISA). As células foram fixadas em paraformaldeído 4% e coradas
pelo método de Ziehl-Neelsen para observação em microscopia óptica (Olympus
Bx41).
4.3.2 - Leishmania amazonensis
Uma hora antes da infecção, os macrófagos derivados de monócitos do
sangue periférico humano foram previamente tratados com L-NAME 20µM, que
funciona como inibidor da enzima iNO-sintase, com a finalidade de se investigar o
papel do NO no processo de infecção.
A infecção dos macrófagos com L. amazonensis foi feita na proporção
10:1 incubando-se as células por um período de 3 horas em estufa a 37° C com
atmosfera de 5% CO2. Após o tempo de infecção, as células foram lavadas 3 vezes
com tampão PBS pH 7,2 - 7,4 para remoção dos parasitas extracelulares e mantidas
por mais 24 horas em estufa a 37° C com 5% CO2. Os sobrenadantes das culturas
foram então reservados para as dosagens citocinas (TNF-α, TGF-β e IL-10) e
estocadas à -2ºC para posterior análise imunoenzimática das citocinas (ELISA). As
células são
fixadas em metanol e coradas pelo método de GIEMSA para
observação em microscopia óptica.
4.3.3 - Fusarium solani
Uma hora antes da infecção os macrófagos derivados de monócitos do
sangue periférico humano foram previamente tratados com L-NAME 20µM (inibidor
da iNO-sintase), com a finalidade de se invetigar o papel do NO no processo de
infecção. A infecção dos macrófagos com F. solani foi feita na proporção 10:1
(esporo do fungo/célula). Os esporos de F. solani retirados em suspensão dos tubos
de cultura foram incubados com os macrófagos por um período de 3 horas em
estufa a 37° C com 5% CO2. Após o tempo de infecção as células foram lavadas 3
vezes com tampão PBS pH 7,2 - 7,4 para remoção de todos esporos extracelulares
e mantidas por mais 24 horas em estufa a 37°C com 5% CO2. Os sobrenadantes
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
74
das culturas foram, então, reservados para as dosagens citocinas (TNF-α, TGF-β e
IL-10) e estocadas à -2ºC para posterior análise imunoenzimática das citocinas
(ELISA). As células foram fixadas em metanol e coradas pelo método de GIEMSA
para observação em microscopia óptica.
4.4 - Microscopia Eletrônica
A fixação foi realizada em glutaraldeído 2,5% diluído em tampão de
cacodilato 0,1M, pH 7,2 durante 1 hora. Após a fixação as células foram lavadas
com tampão e pós-fixadas por 30 minutos em tetróxido de ósmio 0,1% (p/v) (OsO4
diluído em tampão de cacodilato 0,1M, pH 7,2). As amostras foram, então,
desidratadas em concentrações graduais de acetona e embebidas em resina de
PolyBed. As seções ultra-finas foram obtidas com a utilização do ultramicrótomo
Reichert OmU3. O microscópio Eletrônico de Tranmissão Zeiss EM-10C foi operado
a 80kV para observação das amostras.
4.5 - Detecção de Citocinas
Os sobrenadantes das células infectadas e os controles não infectados
(macrófago e macrófago + L-NAME) foram avaliados quanto a produção de citocinas
como TNF-α, TGF-β e IL-10, em diferentes tempos de interação: 24, 48, 72, 96, 120
horas. Para isso os sobrenadantes foram testados com anticorpos específicos
utilizando-se testes imunoenzimáticos ELISA (R&D, Abingdon, UK) segundo as
instruções do fabricante. Os resultados foram obtidos através de Leitor de Elisa à
570 nm.
4.6 – Teste do Potencial Leishmanicida dos Derivados Piridínicos
4.6.1 – Procedência dos Derivados Piridínicos
Os
derivados
químicos
da
série
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-
(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina foram sintetizados e fornecidos pela Profa. Alice
Bernardino e Dr. Luís Pinheiro (Instituto de Química/UFF). Tratando-se de produtos
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
75
inéditos e primeiramente testados.
Compostos testados
(3a) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3b) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(3`-metilfenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3c) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(4`-metilfenflamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3d) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(3`-metoxifenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3e) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(4`-metoxifenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3f) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(3’-nitrofenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3g) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(4’-nitrofenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3h) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(3’-fluorofenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3i) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(4’-fluorofenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3l) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(3’-bromofenilamino)tieno[2,3-b]piridina,
(3m) 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(4’-bromofenilamino)tieno[2,3-b]piridina.
4.6.2 – Preparação dos Derivados Piridínicos
Todos os derivados de 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino) tieno [2,3b]piridina foram diluídos em solução estoque de dimetilsulfóxido (DMSO) (50µM). A
concentração final de DMSO adicionado as culturas não superou 1% (v/v) e não
apresentou efeito sobre a morfologia ou proliferação dos parasitas.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
76
4.6.3 - Cultura de L. amazonensis
Os parasitos utilizados nas infecções foram obtidos a partir de culturas de
Leishmania
amazonensis
doadas
pela
Dra.
Suzana
Corte-Real,
Ultraestrutura/Fiocruz – RJ. As culturas eram mantidas em meio líquido Schnaider,
que mimetiza o microambiente do inseto Phlebotomus, promovendo a replicação dos
parasitas. As culturas foram centrifugadas e lavadas com meio de cultura DMEM,
quantificadas em câmara de Neubauer.
4.6.4 - Avaliação Anti-leishmania das Drogas
Formas promastigota de L. amazonensis na concentração de 3x106
células/mL foram incubadas por 24 – 72 horas em meio de BHI fresco suplementado
com 10% de FBS na ausência e na presença de 50µM de derivados da 5-(4,5-diidro1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina. Glucantime 50µM foi usado como
controle positivo. Foram realizadas culturas controle não tratadas, com ou sem o
diluente DMSO. O efeito de inibição do crescimento foi quantitativamente monitorado
após 24 horas a 28ºC, pela contagem direta dos parasitas em câmara de Neubauer
utilizando microscopia óptica para observação (Olympus B x 41).
4.6.5 – Avaliação da EC50 de Derivados Piridínicos
Diluições
seriadas
dos
derivados
da
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-
(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina foram preparadas para o calculo de EC50. As formas
promastigotas de L. amazonensis (3x106 células/mL) foram incubadas com diluições
seriadas das drogas (6,25 , 12,5 , 25 , e 50µM) por um período de 24 horas, 28ºC. A
densidade celular foi determinada pela contagem direta em câmara de Neubauer. A
EC50 foi obtida pelos gráficos produzidos pelo programa Microcal Origin.
4.6.6 - Teste de citotoxicidade em cultura de células humanas
Os efeitos da citotoxicidade dos compostos piridínicos foram determinados
em cultura de macrófagos humanos isolados de células mononucleares de sangue
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
77
periférico. Inicialmente, células mononucleares sanguineas foram purificados com
gradiente de Ficoll-Hypaque, e depois, os monócitos obtidos por adesão (106
células/mL), foram mantidos à 37ºC, em LabTech  (Life technologies) de 8 poços
durante 7 dias, contendo meio de DMEM (Dulbecco’s modified minimum essential
médium - Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro
humano e tampão HEPES (Sigma) em 5% CO2 para adesão e completa
diferenciação dos monócitos em macrófagos. Após a diferenciação, os compostos
diluídos em 100% de DMSO (v/v) foram adicionados às culturas de macrófagos
(50µM) em duplicatas. Depois de 24 horas de incubação, as células tratadas e nãotratadas foram lavadas duas vezes com solução de PBS e fixadas com 2% de
formaldeído em PBS durante 15 minutos, sendo coradas com GIEMSA. A
quantificação dos macrófagos foi realizada pela contagem randômica de 100
campos utilizando microscópio óptico (Olympus B x41). Por serem células
aderentes, o número de macrófagos corados representa diretamente o número de
células vivas. Nossos resultados são expressos na forma de percentagem de
citotoxicidade, onde:
%citotoxicidade = [(Cel.tratadas com as drogas – nº cel. controle) / nº cel. controle] x 100
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
78
5. Resultados
5.1 - Parte I – Importância do NO na Interação de Biopatógenos com
Macrófagos Humanos
Os experimentos realizados nesta parte do trabalho tiveram como objetivo
avaliar a ação dos patógenos L. amazonensis, M. leprae e F. solani sobre
macrófagos humanos, na presença de inibidores da iNO sintase observando-se
possíveis alterações morfológicas nas células e produção das citocinas TNF-α, TGFβ e IL-10, investigando a importância do NO no processo de infecção.
Avaliação por Técnicas de Microscopia
Nossos resultados através da microscopia óptica, mostram que os
macrófagos derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano
apresentam citoplasma expandido, com muitas projeções em sua membrana
citoplasmática, e um núcleo volumoso (Figura 8).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
79
Figura 8: Microscopia óptica de macrófago humano derivados de monícitos isolados
de sangue periférico controle após 24 horas de cultura, coloração GIEMSA.
5.1.1 – Efeitos de inibidores da enzima NO sintase (L-NAME) Sobre
a Interação de M. leprae com macrófagos humanos
Os macrófagos foram incubados com o M. leprae na presença ou
ausência de L-NAME (20µM) que inibe competitivamente a enzima NO-sintase,
responsável pela produção de óxido nítrico pela célula.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
80
A morfologia dos macrófagos controle na ausência e na presença do LNAME permanecem inalteradas, como mostradas nas Figuras 9a e 9b,
respectivamente. Os macrófagos foram capazes de endocitar o M. leprae (setas
pretas) na ausência de L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-éster - Sigma) (20µM)
(Figuras 9c e 9d). A análise das micrografias 9e e 9f mostram maior endocitose de
micobactéria nos macrófagos tratados com L-NAME (20µM), logo incapazes de
produzir óxido nítrico (setas brancas), demonstrando a importância da produção de
óxido nítrico durante o processo de infecção (Figura 9).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
9a
81
9b
N
9c
N
9d
N
9e
9f
Figura 9: Microscopia
óptica da interação de M. leprae com macrófagos humanos derivados
N
de monócitos isolados de sangue periférico após 24 horas de incubação. Coloração por
Ziehl-Nielsen. 9a, macrófagos controle; 9b, macrófagos controle com L-NAME (20µM); 9c,
9d, Macrófagos em interação com M.leprae; 9e, 9f, Macrófagos em interação com M.leprae
na presença de L-NAME (20µM). N, núcleo. As setas apontam as micobactérias em cor
rósea. Barra: 10 µm.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
82
A análise ultra-estrutural de macrófagos humanos derivados de monócitos
isolados de sangue periférico revelou a presença de organelas características
desta células como várias
mitocôndrias, retículo endoplasmático, complexo de
Golgi, núcleo (N) apresentando cromatina periférica condensada, corpos lipídicos
(setas brancas) distribuídos no citoplasma e prolongamentos citoplasmático (Figura
10a).
Em macrófagos humanos incubados com L-NAME (20µM) foi observado
retículo endoplasmático, núcleo característico deste tipo celular e prolongamentos
citoplasmáticos. A presença nestas células de muitos grânulos enzimáticos
distribuídos por todo o citoplasma, diminuição de corpos lipídicos (setas brancas) e
poucas mitocôndrias, caracteriza morfologicamente macrófagos inibidos para a
produção de óxido nítrico (Figura 10b). Nota que estas alterações não foram
observadas por microscopia óptica, devido ao baixo poder de resolução.
Na ausência de LNAME (20µM), os macrófagos humanos em interação
com M. leprae, apresentaram vacúolos endocíticos pequenos contendo M. leprae
(seta preta), grande quantidade de grânulos enzimáticos distribuídos por todo o
citoplasma,
mitocôndrias,
núcleo
característico
de
macrófagos,
retículo
endoplasmático rugoso e prolongamentos citoplasmáticos (Figura 11).
A Figura 12 apresenta o macrófago inibidos com L-NAME (20µM) para
produção de óxido nítrico em interação com o M.leprae (setas pretas). Observa-se o
envoltório nuclear normal, e presença de grande quantidade de prolongamentos
citoplasmáticos. O macrófago apresenta poucas vesículas de lipídios e uma
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
83
endocitose mais pronunciada quando comparada ao macrófago ativado em
interação com o M. leprae (Figura 11).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
84
10a
N
10b
N
Figura 10: Microscopia Eletrônica de Transmissão da interação de Mycobacterium leprae
com macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24
horas de incubação, na ausência (10a) ou na presença de L-NAME (20µM) (10b). Setas
apontam os corpos lipídicos.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
85
11a
N
11b
N
Figura 11: Microscopia Eletrônica de Transmissão da interação de Mycobacterium leprae
com macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24
horas de incubação na ausência de L-NAME (20µM) (11a e 11b). As setas pretas apontam
as micobactérias no interior do vacúolo endocítico.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
86
12a
12b
N
*
Figura 12: Microscopia Eletrônica de Transmissão da interação de Mycobacterium leprae
com macrófagos humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24
horas de incubação. Macrófagos em interação com M. leprae na presença de L-NAME
(20µM) (12a e 12b), as setas pretas apontam as micobactérias no interior dos vacúolos. N,
núcleo. *, Fusão de vacúolos.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
87
5.1.2 – Efeitos do inibidor da enzima NO sintase (L-NAME) (20µM)
na Interação da L. amazonensis com macrófagos humanos
Os macrófagos aderentes cultivados em meio DMEM com 10% de soro
humano
para
interação
com
L.
amazonensis,
não
mostraram
alterações
morfológicas significativas, seja o grupo macrófago humano controle (Figura 13a) ou
o macrófago controle inibido com L-NAME (20µM) (Figura 13b). As Figuras 13c e
13d mostram os macrófagos infectados com L. amazonensis na ausência de LNAME, que apresentam um nível menor de endocitose de parasitas quando
comparados com macrófagos tratados por L-NAME (20µM) (Figuras 13e e 13f). Os
macrófagos na ausência de L-NAME mostram nítida formação de vacúolos
endocíticos indicados com a seta preta na Figura 13c e 13d.
.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
13a
88
13b
N
N
13d
13c
N
13e
13f
N
Figura 13: Microscopia óptica da interação de Leishmania amazonensis com macrófagos
humanos derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24 horas de
incubação. Coloração por GIEMSA. 13a, macrófagos controle; 13b, macrófagos controle
com L-NAME (20µM); 13c, 13d, macrófagos em interação com L.amazonensis, as setas
pretas identificam a forma amastigota no interior de vacúolos endocíticos; 13e e 13f,
macrófagos em interação com L.amazonensis na presença de L-NAME (20µM), as setas
brancas apontam as formas amastigotas. N, núcleo. Barra:10µm.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
89
5.1.3 – Efeitos do inibidor da enzima NO sintase (L-NAME) (20µ
µM)
na Interação da Fusarium solani com macrófagos humanos
Os macrófagos aderentes foram incubados por 24 horas com os conídeos
de F. solani. Após este tempo, as células foram fixadas em metanol e coradas pelo
método de GIEMSA para observação em microscopia óptica como descrito na seção
de materias e métodos (Figura 14).
Conforme descrito anteriormente com os resultados obtidos por
microscopia óptica, para as interações de macrófagos com M. leprae e L.
amazonensis, o grupo de macrófagos controle com e sem L-NAME (20µM)
permaneceram com a morfologia inalterada (Figura 14a e 14b respectivamente). As
Figuras 14c e 14d mostram a interação de macrófagos com F. solani na ausência de
L-NAME, ou seja, macrófagos ativados, e estes apresentam menor quantidade de F.
solani em seu inteior. A seta preta na Figura 14c indica um único conídio endocitado
no interior do vacúolo endocítico.
As Figura 14e e 14f apresentam a interação de macrófagos humanos com
F. solani na presença de L-NAME (20µM). Observa-se uma quantidade maior de
conídios endocitados, apresentando uma endocitose mais significativa das células
incapazes de produzir óxido nítrico.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
14a
90
14b
N
N
14d
14c
N
14e
14f
N
Figura 14: Microscopia óptica da interação de F. solani com macrófagos humanos
derivados de monócitos isolados de sangue periférico após 24 horas de incubação.
Coloração por GIEMSA. 14a, macrófagos controle; 14b, macrófagos controle com L-NAME
(20µM); 14c, 14d macrófagos em interação com F. solani, as setas pretas apontam os
conídios do fungo no interior de vacúolos endocíticos; 14e, 14f macrófagos em interação
com F.solani na presença de L-NAME (20µM). As setas brancas apontam vários conídios
do fungo no interior do macrófago. N, núcleo. Barra: 10µm.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
91
5.2 – Avaliação por Dosagem de Citocinas
Para dosagem de citocinas TNF-α, TGF-β e IL-10, os sobrenadantes
das culturas de células sob interação com biopatógenos, e tratamento com inibidores
da iNOs (L-NAME 20µM) foram submetidos a testes imunoenzimáticos com kits
comerciais de ELISA. Todas as dosagens foram realizadas juntamente com seus
respectivos controles positivo e negativo de infecção como descrito na seção de
materiais e métodos.
5.2.1 – Dosagem de TNF-α
α, TGF-β e IL-10 em sobrenadante de
cultura de macrófagos incubados com M. leprae
O gráfico 1 mostra a cinética de produção de TNF-α nos 5 diferentes
tempos de interação de macrófagos com M. leprae. A produção de TNF-α em
macrófagos em interação com M. leprae aumenta fortemente nas primeiras 24 horas
de incubação das células com as micobactérias (Gráfico 1). Esses valores
decrescem até as 96 horas de infecção e aumentam, novamente, após 120 horas de
interação da célula com o patógeno. De forma importante não se observa variação
na produção de TNF-α entre macrófagos ativados pelo biopatógeno na presença ou
ausência de L-NAME para produção de óxido nítrico.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
92
TNF-alfa - Mycobacterium leprae
TNF-alfa (pg/mL)
60
50
40
30
20
10
Ma
c
+L M
Ma
c+ M NA ac 2
LN ac ME 4h
AM +M 2
E+ yc 4h
M y 24
c2 h
Ma
4h
c+ M
Ma
LN ac
c+ M A 4
LN ac ME 8h
AM +M 4
E+ yc 8h
M y 48
c4 h
Ma
8h
c+ M
Ma
LN ac
c+ M A 7
LN ac ME 2h
AM +M 7
E+ yc 2h
M y 72
c7 h
Ma
2h
c+ M
Ma
LN ac
c+ M A 9
LN ac ME 6h
AM +M 9
E+ yc 6h
M y 96
c9 h
Ma
6h
c
M
+
Ma
L
c+ M N A ac 1
LN ac M E 20
AM + M 1 h
E+ yc 20h
My 12
c 1 0h
20
h
0
Gráfico 1: Dosagem da produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de
macrófagos (Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em
interação com M. leprae (Myc), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na
ausência ou presença L-NAME (20µM).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
93
A análise do gráfico 2 mostra que a interação de M. leprae com
macrófagos humanos provoca o aumento da produção de TGF-β. Esse aumento é
maior em macrófagos ativados pelo M. leprae sem tratamento com L-NAME (20µM)
no tempo de 24 horas. No entanto, a produção de TGF-β decresce com o decorrer
do tempo de incubação, voltando a subir após 120 horas de interação célulapatógeno quando o L-NAME não consegue mais interferir no processo.
TGF-beta Mycobacterium leprae
TGF-beta (pg/mL)
100
75
50
25
Ma
c+
Ma
c+ M LN Mac
LN a AM 2
AM c+M E 4h
E+ yc 24h
My 2 4
c2 h
Ma
4h
c+ M
Ma
L
c+ M N ac
LN a AM 4
AM c+M E 8h
E+ yc 48h
My 4 8
c4 h
Ma
8h
c+ M
Ma
c+ M LN ac
A
LN a M 7
AM c+M E 2h
E+ yc 72h
My 7 2
c7 h
Ma
2h
c+ M
Ma
c+ M LN ac
LN a AM 96
AM c+M E h
E+ yc 96h
My 9 6
Ma
c9 h
c+
6h
Ma
c+ M LN Mac
LN a AM 1
AM c+M E 20h
E+ yc 120
My 1 2 h
c 1 0h
20
h
0
Gráfico 2: Dosagem da produção de TGF-β no sobrenadante de cultura de
macrófagos (Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em
interação com Mycobacterium leprae (Myc), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de
incubação na ausência ou na presença de L-NAME (20µM).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
94
O gráfico 3 apresenta a produção de IL-10 na interação de macrófagos
humanos com M. leprae. Nas primeiras 24 horas de interação dos macrófagos com
o M. leprae, observa-se um ligeiro aumento na concentração de IL-10 em
comparação com os macrófagos controle na ausência e na presença de L-NAME.
Com o decorrer do período de incubação, esses valores se tornam praticamente
constantes. Notar que mesmo nos ensaios controle observamos a produção de IL10.
IL-10 Mycobacterium leprae
IL-10 (pg/mL)
125
100
75
50
25
Ma
Ma
c
+ M
c+ M LNA ac 2
L N ac M 4h
AM +M E 2
E+ yc 4h
My 24
c2 h
Ma
4h
c
Ma
+ M
c+ M LNA ac 4
L N ac M 8h
AM +M E 4
E+ yc 8h
My 48
c4 h
Ma
8h
c+ M
Ma
L
a
N
c+ M A c 7
L N ac M 2h
AM +M E 7
E+ yc 2h
My 72
c7 h
Ma
2h
c+ M
Ma
L
a
c+ M NA c 9
L N ac M 6h
AM +M E 9
E+ yc 6h
My 96
c9 h
Ma
6h
c
+L Ma
Ma
c+ M NA c 1
LN ac M 20
AM +M E 1 h
E+ yc 20h
My 12
c 1 0h
20
h
0
Gráfico 3: Dosagem da produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de macrófagos (Mac)
derivados de sangue periférico humano em interação com Mycobacterium leprae (Myc),
após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência ou na presença de L-NAME
(20µM).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
95
5.2.2 – Dosagem de TNF-α
α, TGF-β e IL-10 em sobrenadante de
cultura de macrófagos incubados com L. amazonensis
As dosagens das citocinas foram realizadas em tempos de interação
de 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Estabelecendo assim gráficos de cinética de produção
das citocinas durante o processo de interação.
O gráfico 4 apresenta os resultados da cinética de produção de TNF-α
em macrófagos infectados e não infectados (controles) por L. amazonensis em
tempos de interação de 24, 48, 72, 96 e 120 horas.. As primeiras 24 horas de
infecção são acompanhadas com um aumento significativo na produção de TNF-α
pelos macrófagos interagidos com L. amazonensis, tanto na presença quanto na
ausência de L-NAME. Esses valores decrescem até as 96 horas de infecção e
aumentam novamente após 120 horas de incubação.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
96
TNF-alfa - Leishmania
35
TNF-alfa (pg/mL)
30
25
20
15
10
5
Ma
c+ M
Ma
c+ MLNA ac
LN a M 2 4
AM c+L E 2 h
E+ ei 4h
Le 24h
i2
Ma
4h
c+ M
Ma
c+ MLNA ac
LN a M 4 8
AM c+L E 4 h
E+ ei 8h
Le 48h
i4
Ma
8h
c+ M
Ma
L
c+ M NA ac
LN a M 7 2
AM c+L E 7 h
E+ ei 2h
Le 72h
i7
Ma
2h
c+ M
Ma
LN a
c+ M A c
LN a M 9 6
AM c+L E 9 h
E+ ei 6h
Le 96h
Ma
i9
c
6h
+L M
Ma
a
N
c+ M A c
LN a M 12
AM c+L E 1 0h
E+ ei 20h
Le 120
i1 h
20
h
0
Gráfico 4: Dosagem da produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Leishmania amazonensis (Lei), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência
ou presença de L-NAME (20µM).
TGF-α apresenta um papel fundamental no desenvolvimento e na
fisiologia de diversas espécies animais, modulando a ativação celular e controlando
a iniciação e a resolução de respostas inflamatórias, sendo uma citocina de inibição
da resposta imune celular (PADGETT, REISS, 2007.)
A análise dos sobrenadantes das culturas de células demonstrou um forte
aumento na produção da citocina TGF-β nas primeiras 24 horas de interação dos
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
97
macrófagos humanos com L. amazonensis, como apresentado no gráfico 5. Durante
as primeiras 24 horas de interação os níveis de TGF-β encontram-se aumentados
mas esse efeito é diminuído quando comparados aos macrófagos em interação e
tratados L-NAME, cuja produção de óxido nítrico está comprometida.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ma
c+ M
Ma
L
c+ M NA ac 2
LN a ME 4h
AM c+L 2
E+ ei 4h
Le 24h
i2
Ma
4h
c+ M
Ma
LN a
c+ M A c 4
LN a ME 8h
AM c+L 4
E+ ei 8h
Le 48h
i4
Ma
8h
c+ M
Ma
LN a
c+ M A c 7
LN a ME 2h
AM c+L 7
E+ ei 2h
Le 72h
i7
Ma
2h
c+ M
Ma
LN a
c+ M A c 9
LN a ME 6h
AM c+L 9
E+ ei 6h
Le 96h
Ma
i9
6h
c
+L M
Ma
a
N
c+ M A c 1
LN a ME 20
AM c+L 1 h
E+ ei 20h
Le 120
i1 h
20
h
TGF-beta (pg/mL)
TGF-beta Leishmania amaz.
Gráfico 5: Dosagem da produção de TGF-β no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Leishmania amazonensis (Lei), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência
ou na presença de L-NAME (20µM).
A produção de IL-10 que é uma citocina inibitória da resposta celular se
mostrou ligeiramente aumentada em macrófagos humanos em interação com L.
amazonensis (gráfico 6). Os valores de produção de IL-10 se mostraram levemente
aumentados em macrófagos interagidos com L. amazonensis e inibidos com LNAME quando comparados na ausência de L-NAME nas primeiras 24 horas de
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
98
interação célula-patógeno. Entretanto a concentração de IL-10 permanece
praticamente constante com o decorrer do tempo de interação.
IL-10 (pg/mL)
125
IL-10 Leishmania amaz.
100
75
50
25
Ma
c
Ma
c
+L M
N a
+ L M A M c 24
N A ac+ E h
ME Le 24h
+L i 24
ei h
Ma
24
h
c
+L M
Ma
a
N
c+ M A c 4
LN a ME 8h
AM c+L 4
E + ei 8h
Le 48h
i4
Ma
8h
c+ M
Ma
LN a
c+ M A c 7
LN a ME 2h
AM c+L 7
E + ei 2h
Le 72h
i7
Ma
2h
c+ M
Ma
LN a
c+ M A c 9
LN a ME 6h
AM c+L 9
E + ei 6h
Le 96h
Ma
i9
6h
c
+L M
Ma
a
c+ M N A c 1
LN a ME 20
AM c+L 1 h
E + ei 20h
Le 120
i1 h
20
h
0
Gráfico 6: Dosagem da produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de macrófagos (Mac)
derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Leishmania amazonensis (Lei), após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de incubação na ausência
ou na presença de L-NAME (20µM).
5.2.3 – Dosagem de TNF-α
α, TGF-β e IL-10 em sobrenadante de
cultura de macrófagos incubados com F. solani
O gráfico 7 apresenta a cinética de produção da citocina TNF-α em
cultura de macrófagos interagidos com F. solani na ausência ou na presença de LNAME (20µM). A análise das primeiras 24 horas demonstrou um proeminente
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
99
aumento na produção de TNF-α em macrófagos na presença do fungo em
comparação com os controles. Resultado similar foi observado com os macrófagos
interagidos com o F. solani e inibidos com L-NAME, logo incapazes de produzir NO.
Da mesma forma que ocorreu no resultado da interação de macrófagos com os
outros biopatógenos estudados nesta dissertação, após 24 horas de incubação,
observou-se uma diminuição da concentração de TNF-α produzido no sobrenadante
das culturas.
TNF-alfa (pg/mL)
60
TNF-alfa - Fusarium
50
40
30
20
10
Ma
c+ M
L ac
Ma
c+ M NAM 24
LN ac E h
A M + F 24
E+ us 2 h
Fu 4h
s2
4h
Ma
c+ M
L ac
Ma
c+ M NAM 48
LN ac E h
A M + F 48
E+ us 4 h
Fu 8h
s4
8h
Ma
c+ M a
L
Ma
c
c+ M NAM r.72
LN ac E h
A M + F 72
E+ us 7 h
Fu 2h
s7
2h
0
Gráfico 7: Dosagem da produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Fusarium solani (Fus) após 24, 48 e 72 horas de incubação na ausência ou na presença de
L-NAME (20µM).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
100
A produção de TGF-β por macrófagos humanos em interação com F.
solani apresentou algumas alterações, como demonstrado pelo gráfico 8. A
produção de TGF-β por macrófagos interagidos com F. solani e inibidos pelo LNAME é menor nas primeiras 24 horas de interação em comparação com as células
na ausência de L-NAME. E com o decorrer do tempo de interação os valores de
produção de TGF-β decrescem em comparação com os valores no tempo inicial.
TGF-beta (pg/mL)
50
TGF-beta Fusarium solani
40
30
20
10
Ma
c
+L Ma
Ma
N c
c + M AM 2 4 h
LN ac E
AM +Fu 24
E+ s 2 h
Fu 4h
s2
4h
Ma
c+ M
L N ac
Ma
c + M AM 4 8 h
LN ac E
AM +Fu 48
E+ s 4 h
Fu 8h
s4
8h
Ma
c+ Ma
L N cr
Ma
c + M A M .7 2 h
LN ac E
AM +Fu 72
E+ s 7 h
Fu 2h
s7
2h
0
Gráfico 8: Dosagem da produção de TGF-β no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano em interação com
Fusarium solani (Fus) após 24, 48 e 72 horas de incubação na ausência ou na presença LNAME (20µM).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
101
O gráfico 9 apresenta os valores de produção de IL-10 em cultura de
macrófagos incubados com F. solani na ausência ou na presença de L-NAME.
Nossos resultados mostraram um discreto aumento na produção da citocina IL-10
em macrófagos ativados por F. solani inibidos quanto a produção de óxido nítrico (na
presença de L-NAME) em interação com o fungo. Esses valores também se mantêm
praticamente constantes com o decorrer do tempo de interação. Notar a produção
espontânea de IL-10 no controle.
IL-10 Fusarium solani
IL-10 (pg/mL)
125
100
75
50
25
Ma
Ma
c+
cr
.7
LN
AM 2h
Ma
M
E
c+
a
72
LN c+F
h
us
AM
72
E+
h
Fu
s7
2h
Ma
c+ Mac
LN
4
AM 8h
Ma
M
E
a
c+
48
LN c+F
h
us
AM
48
E+
h
Fu
s4
8h
Ma
c+ Mac
LN
2
AM 4h
Ma
M
c+
ac E 24
+
LN
h
AM Fus
24
E+
h
Fu
s2
4h
0
Gráfico 9: Dosagem da produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de macrófagos
(Mac) derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano incubados com
Fusarium solani (Fus) após 24, 48 e 72 horas na ausência ou na presença de L-NAME
(20µM).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
102
5.3 - Teste do Potencial anti-leishmania de compostos da série 5(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina
5.3.1 - Atividade Anti-leishmania
Os efeitos dos novos compostos relatados derivados da 5-(4,5-diidro-1Himidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina sobre a viabilidade da L. amazonensis
na forma promastigota foi testado, analisando-se sua atividade potencial antileishmania. Glucantime 50µM foi usado como controle positivo apresentando 73,9%
de efeito inibitório. De um total de onze compostos testados, dez compostos
apresentaram significante atividade antileshmania (>50%) após 24 horas de
incubação, incluindo o composto não substituído no anel fenila (gráfico 10). Apenas
o derivado contendo bromo como substituinte apresentou uma baixa atividade antileishmania (<52%) tanto na porção meta como em para quando comparados com o
derivado não-substituído. Em todos os outros compostos substitutos com CH3,
OCH3, NO2 e F, foi observada uma mudança significativa no perfil de atividade
envolvendo a posição do substituinte no anel fenila. Os derivados substituídos na
posição para foram os que apresentaram maior atividade (p-CH3 = 88,1% e p-OCH3
= 88,7%), sendo que o derivado m-F, não continuou sendo testado devido a
quantidade de amostra ser insuficiente.
A maior atividade antileishamania foi
encontrada para os derivados 3c (p-CH3) e 3e (p-OCH3). Os valores de
concentração inibitória 50% (EC50) dos compostos foram determinados (29,49µM e
32,23µM respectivamente), e se mostraram menores que o da droga controle
Glucantime (EC50=163,7 µM) (gráfico 11). Se mostram potenciais protótipos para a
descoberta de novas formas de tratamento para leishmaniose.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
103
Células/mL (x107)
1,2
Células/mL
(x107)
1,0
0,8
0,6
7
0,4
0,2
0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Compostos
Teste
Tested
Compounds
Compostos Teste
Gráfico 10: Efeitos dos derivados
da
the
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina [50µM] na proliferação de Leishmania amazonensis após 24
horas de incubação na presença desses compostos. 1 Controle; 2 DMSO; 3 Glucantime ;
4 H ; 5 m-CH3; 6 p-CH3; 7 m-OCH3; 8 p-OCH3; 9 m-NO2 ; 10 p-NO2; 11 m-F ; 12 p-F ;
13 m-Br e 14 p-Br. Após esse tempo os parasitas foram quantificados em câmara de
Neubauer por microscopia óptica.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
104
E C 5 0 : p - C H 3 : 2 9 ,4 9 µ M
E C 5 0 p - O C H 3: 3 2 ,2 3 µ M
m ic r o m o la r
p – CH3
p – OCH3
Células/mL (x105)
7
Células/mL
(x105)
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
[ ] µM
Gráfico 11: Curva dose-resposta dos derivados mais ativos da série 5-(4,5-diidro-1Himidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina para determinação do EC50 preparadas para o
cálculo de EC50. 3c (p – CH3)
e 3e (p – OCH3)
na proliferação de Leishmania
amazonensis após 24 horas de incubação dos parasitas. EC50 Glucantime = 163,7 µM.
5.3.2- Teste de Citotoxicidade
Os
efeitos
dos
derivados
da
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-
(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina foram testados sobre macrófagos derivados de
monócitos isolados do sangue periférico humano.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
105
Os compostos da série que apresentaram maior atividade anti-leishmania
3c (p – CH3) , 3e (p – OCH3) e 3g (p – NO2), foram testados para efeito citotóxico
sobre macrófagos humanos ( gráfico 12, compostos 4 (p – CH3) 5 (p – OCH3) e 6 (p
– NO2)). Os resultados obtidos foram expressos como percentual de citotoxicidade.
Glucantime foi usado como controle.
50
45
% Citotoxicidade
40
% Citotoxicidade
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Compostos
Teste Teste
Compostos
Gráfico 12: Efeitos Citotóxicos dos derivados da piridina em macrófagos derivados
de monócitos do sangue periférico humano após 24 horas de incubação na
presença dos compostos teste [50µm]. 1 Controle; 2 DMSO ; 3 Glucantime ; 4 pCH3, 5 p-OCH3, 6 p-NO2 . Após esse tempo as células foram fixadas em
formaldeído 2% e coradas por GIEMSA. As células foram quantificadas por
microscopia óptica e os resultados expressos em % de citotoxicidade, conforme
descrito nos materiais e métodos.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
106
6. Discussão
6.1 – Parte I – Importância do NO na Interação de Biopatógenos
com Macrófagos Humanos
Aspectos relacionados a ativação de macrófago foram elucidados por
estudos como os realizados por Mackaness dos anos 60 (MACKANESS et al.,
1964). Estudando a infecção de camundongo com M. bovis bacilo Calmette-Guerin
(BCG) ou Listeria monocytogenes, os autores observaram que a atividade
antimicrobiana aumentava dependendo do estímulo, mas de modo antígeno
específico. Desde então, outros relatos mostraram que a ativação macrofágica
depende de diversas moléculas, especificamente, oriundas de linfócitos T “helper” -1
ativados e células “natural killer” (NK), (ex.:IFN-y) e a rede de citocinas (ex.: IL-12 e
IL-18) produzidas pelas células apresentadoras de antígenos (APCs) (STENGER,
ROLLINGHOFF, 2001).
Macrófagos como células do “sistema fagocítico mononuclear” têm
acentuada heterogeneidade fenotípica e, como resultado de diferenciação celular,
vasta distribuição tecidual e, de respostas a vários estímulos endógenos e exógenos
(STENGER, ROLLINGHOFF, 2001). À despeito da migração constitutiva e induzida,
o impacto sobre
a diferenciação macrofágica com interação com várias outras
células hospedeiras através de moléculas e agentes exógenos deve ser
considerado. Essas moléculas ligantes precisam ser reconhecidas por diversos
receptores de membrana plasmática, resultando em endocitose, sinalização
intracelular e mudanças complexas na ativação e repressão de gens o que as torna
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
107
importantes para o processo como um todo. Sendo assim, estando os macrófagos
envolvidos em quase todas as fases da resposta imune e, como principal célula
efetora, capaz de responder aos mais variados agentes, até mesmo antes que
ocorra a amplificação da resposta imune mediada por célula T, o nosso projeto teve
como foco principal a interação de macrófagos humanos com diferentes
biopatógenos, como M. leprae, L. amazonensis e F. solani
na presença e na
ausência do inibidor de NO-sintase (L-NAME).
Nossos resultados iniciais mostraram o macrófago ativado, com
citoplasma expandido, mais espraiado, apresentando muitas projeções filiformes em
sua membrana citoplasmática, com aumento na capacidade de adesão e de se
espalhar sobre o substrato, no número de fagossomos e vesículas endocíticas e um
núcleo volumoso. Nossas observações estão de acordo com os relatos de North e
colaboradores, que ilustram as alterações mofológicas do macrófago após processo
de ativação celular (NORTH et al., 1978).
Em resposta a estímulos celulares, os macrófagos são ativados, o que
lhes permite, entre outras funções, adquirir uma grande capacidade de matar
microrganismos e algumas células tumorais. Isso pode ocorrer através de
mecanismos oxigênio ou nitrogênio dependentes, nos quais espécies reativas do
oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS) são produzidos (MACMIKING,
NATHAN,
1997; CADENAS, CADENAS, 2002). Estes produtos difusos e de vida curta tem
papéis na defesa antimicrobiana definido e sinalizada na célula (HAN et al.;2001).
ROS e NO podem interagir de diferentes formas e, agir sinergisticamente,
causando citotoxicidade. Os radicais gerados reagem como um poderoso agente
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
108
oxidante, o qual é capaz de nitrar proteínas, comprometendo a atividade de
diferentes enzimas mitocondriais e causar peroxidação de membranas fosfolipídicas,
alterando a fluidez de membranas biológicas e causando a perda da integridade
celular (CADENAS, CADENAS, 2002).
Macrófagos podem executar sua função endocítica de forma direta,
envolvendo a liberação de produtos como radicais de oxigênio e nitrogênio ou pela
liberação de citocinas que são prejudiciais aos microrganismos. Eles podem ainda
ter uma ação indireta nestas atividades pela secreção de citocinas, como TNF-α,
TGF-β e IL-10, as quais sinalizam para outras células como os linfócitos T.
Posteriormente, os macrófagos podem tomar parte na iniciação da ativação das
células T, através do processamento e da apresentação de antígenos. Assim
regulam o sistema imunitário e se envolvem no processo infeccioso, na modulação
das resposta imunológica e na inflamação (HONG, et al.; 2005; UNANUE et al.;
1987).
6.1.1 - Efeitos do L-NAME na Interação de M. leprae com
macrófagos humanos
Macrófagos ativados e neutrófilos expressam a enzima sintetase induzida
do NO (iNOS) em várias situações patológicas como Tuberculose, Malária,
Leishmaniose, Infecções do trato respiratório e urinário, doenças autoimunes e
inflamatórias crônicas (KRONECKE et al., 1998). A iNOS é a enzima responsável
pela produção do NO por macrófagos ativados. No entanto, o papel microbicida do
NO na Lepra tem sido pouco investigado. NO é altamente instável e se transforma
em nitritos/nitratos e a literatura cita apenas alguns poucos trabalhos de investigação
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
109
sobre seu papel nessa patologia (RADA, et al.; 2003; NOSAKI et al.; 1997;
KHANOLAR–YOUNG et al.; 1998).
Nossos resultados mostraram que na presença do inibidor de NO sintase
(L-NAME) os macrófagos apresentaram maior capacidade endocítica evidenciada
pelo aumento de M. leprae em seu interior. Esses resultados indicam a importância
do NO para a manutenção deste biopatógeno no interior da célula hospedeira. No
caso específico da interação de M. leprae com macrófagos humanos, que é uma
característica importante na patogênese da Lepra, o NO pode desempenhar um
papel importante na resposta imune do hospedeiro, onde a produção elevada desta
molécula estaria envolvida na morte do M. leprae. Por questões de biosegurança
(lepra é uma patologia que ainda hoje se desconhece o mecanismo de transmissão),
a maior parte dos resultados obtidos na pesquisa sobre interação celular na lepra ,
foram obtidos com M. leprae irradiado , gentilmente fornecido pelo Dr. John Spencer
da Colorado University, USA, cuja pesquisa é fonte da procedência mundial de M.
leprae irradiado para fins de pesquisa. Assim, neste estudo com o M. leprae só
podemos nos referir a endocitose e não, a sobrevivência da bactéria, no interior do
macrófago, uma vez que essa se encontrava na forma irradiada, ou seja, morta. De
qualquer forma, mesmo incubado com M. leprae “morto”, os macrófagos humanos
não tratados foram incapazes de digeri-los.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
110
6.1.2 - Efeitos do L-NAME na Interação de L. amazonensis com
macrófagos humanos
Em relação ao papel do NO na interação de L. amazonensis com
macrófagos humanos, nossos resultados mostram além da endocitose, a
sobrevivência do parasita no interior do macrófago humano, a despeito da alta
concentração intracelular de NO, após processo de ativação macrofágica causado
por esse biopatógeno. Uma vez que o protozoário usado neste trabalho, estava vivo
e biologicamente ativo, podemos mencionar o termo “sobrevivência” do protozoário
no interior da célula estudada.
Os macrófagos desempenham um importante papel contra Leishmania,
tanto no sentido de ser a principal célula hospedeira quanto atuando na
apresentação de antígenos para as células T (ANTOINE et al, 1991; PRINA et al.;
1993). Eles produzem citocinas que direcionam a resposta para perfil Th1 ou Th2,
modulando a resposta imune e influenciando na sobrevivência do parasita
intracelular incluindo a produção de NO e ROS que atuam de maneira sinérgica
(MOSSER et al., 1999; MAUEL et al., 1991; ASSREUY et al., 1994; GREEN et al.,
1990).
A literatura cita alguns trabalhos que mostram que a imunidade contra
Leishmania major
observada em camundongos é caracterizada pela intensa
produção de IFN-γ para morte desses parasitas (LOUIS et al.; 1998). O IFN-γ ativa a
NO sintase -2 estimulando a produção de NO que são tóxicos para L. major
(ASSREUY et al.; 1994).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
111
Por outro lado, a Leishmania tem desenvolvido mecanismos de escape
para sobreviver no interior de um meio intracelular completamente hostil como o dos
macrófagos , permitindo a sobrevivência desse protozoário mesmo na presença de
uma resposta
imune celular eficiente. Dentre estas estratégias de escape se
encontra a supressão de NO sintase 2 (PROUDFOOT et al.; 1996).
Observamos nos nossos resultados que os macrófagos humanos
apresentam uma maior quantidade de amastigotas de L. amazonensis em seu
interior, ou seja, uma endocitose mais proeminente quando ocorre a interrupção da
produção de óxido nítrico pelo tratamento com L-NAME.
Esta maior endocitose em macrófagos tratados por L-NAME, é a
evidência indireta da importância da produção de NO para o estabelecimento do
processo de infecção no macrófago por este biopatógeno.
6.1.3 - Efeitos do L-NAME na Interação de F. solani com macrófagos
humanos
F. solani é um fungo emergente em infecções oportunistas principalmente
em pacientes imunodeprimidos ou com déficit no sistema imunológico devido ao
tratamento medicamentoso aplicado à pacientes recém transplantados (SHAYKH et
al., 1977; ANAISSIE et al., 1986; ALVAREZ-FRANCO et al., 1992; GUARRO et al.,
1995; VENDITTI et al., 1998; GROLL et al., 2001).
Como descrito em 2002 por Nucci e colaboradores um dos aspectos mais
freqüentes em infecções causadas por Fusarium é o desenvolvimento de lesões de
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
112
pele com o aparecimento disseminado de nódulos na pele, fungemia, com o
envolvimento de diversos órgãos, o que pode estar associado a menor resposta
imunológica em pacientes imunodeprimidos (GUARRO et al., 1995; NUCCI et al.,
2002).
A análise dos resultados obtidos da interação de F. solani com
macrófagos humanos demonstra que a maior endocitoce ocorre em macrófagos
tratados com L-NAME apontando a importância do NO neste processo de infecção.
Os nossos resultados sobre interação de Fusarium com macrófagos estão de acordo
com TZIANABOS (2000) e MONZON e colaboradores (2001), que relataram que
tanto macrófagos como os leucócitos polimorfonucleares apresentam um papel
essencial na eliminação de microorganismos, visto que inibem o crescimento das
hifas (NELSON et al., 1994; TZIANABOS et al., 2000; MONZÓN, TUDELA, 2001).
Os macrófagos incubados na ausência de L-NAME, ou seja, macrófagos
capazes de produzir NO, apresentaram uma menor endocitose além de uma menor
germinação dos conídios quando comparados aos macrófagos inibidos (Figura 14),
o que ressalta a importância da produção de NO para o estabelecimento do
processo de infecção causada por este fungo.
6.1.4 - Produção de citocinas (TNF-α
α, TGF-β e IL-10) por
macrófagos humanos incubados com biopatógenos
O crescimento dos patógenos intracelulares depende, não somente, da
produção de NO pelo macrófago como também da secreção de citocinas, através
da resposta imune celular. As citocinas são um importante grupo de proteínas que
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
113
funcionam como comunicadores intercelulares. Em geral, elas agem localmente, por
interação com receptores específicos presentes na membrana citoplasmática das
próprias células que as produzem ou de outros tipos celulares (HOLLOWAY,
SHANNON, 2001). Estas moléculas têm como principais funções: regular a duração
e a intensidade das respostas especificas; recrutar células efetoras para as áreas
onde se desenvolvem respostas imunológicas; e induzir a geração e maturação de
novas células a partir de seus precursores (HONG et al., 2005).
6.1.4.1 - Mycobacterium Leprae
6.1.4.1.1 – Nível de TNF –α
α
A dosagem de TNF-α nos sobrenadantes das culturas revelou uma maior
produção desta citocina nos macrófagos incubados com a bactéria. Como citado por
MORENO e colaboradores (1989) a exposição dos fagócitos à componentes de
membrana da micobactéria é o fator que induz essa maior liberação de TNF-α no
meio de cultura (MORENO et al.,1989). Esses dados estão de acordo com os
encontrados na literatura onde uma maior concentração de TNF-α foi encontrada em
células infectadas com micobactéria (ROOK et al., em 1990 ; FILLEY et al., em 1991
; SARNO et al., 1991 ; KHANOLKAR-YOUNG et al., em 1995 ; HAGGE et al., 2004 ;
e MOURA et al., 2007). Além disso, monócitos isolados de sangue periférico de
pacientes lepromatosos com Eritema nodoso (episódio reacional da lepra) também
secretam maior quantidade de TNF-α quando comparados a indivíduos normais
(ROOK et al., 1990; FILLEY et al., 1991; SANTOS et al., 1993).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
114
Na Lepra, um modelo hipotético para a interação entre células
dendríticas, macrófagos e células T tanto para a lepra tuberculóide como para lepra
lepromatosa foi proposto pelo nosso grupo (SANTOS, et al., 2007). Esse modelo
aborda, inicialmente, o perfil de resposta do Th-1 encontrado na forma tuberculóide
de lepra, onde os macrófagos infectados por M. leprae expressam MHC-II, CD80 e
CD86 sobre a superfície da célula e secretam TNF-α, IL-6, IL-1, IL-12 e IL-18. As
citocinas IL-12 e IL-18 agiriam sinergisticamente sobre os linfócitos T, levando à
secreção de IFN-γ. Além disso, células dendríticas (DCs) estimuladas por M. leprae
secretariam níveis consideráveis de IL-12 e IFN-γ, em resposta a uma produção
menos pronunciada de IL-12 pelo macrófago estimulado pelo M. leprae.
Consequentemente, tanto IL-12 quanto IFN-γ (produzido principalmente pela DC)
agiriam, sinergisticamente, sobre a célula T para induzir secreção de IFN-γ e dessa
forma, os macrófagos (sem expressão DC-SIGN) poderiam ser ativados para
produzirem ROS e NO, levando à morte da bactéria que é observada na forma
tuberculóide da lepra.
Na lepra lepromatosa, diferentemente da lepra tuberculóide, o baixo nível
ou mesmo falta de expressão de algumas moléculas sinalizadoras do sistema
imune, aparentemente justifica a resposta imune defeituosa da célula T observada
nessa forma de doença. Neste modelo, para lepra lepromatosa, a IL-4 secretada
pela célula Th-2 poderia induzir a expressão DC-SIGN no macrófago e, portanto,
aumentar a entrada de M. leprae nessa célula através da cascata DC-SIGN.
Simultaneamente, a IL-10 produzida pelo macrófago poderia converter DCs em
macrófagos permitindo a entrada ilimitada de M. leprae nessa célula, e mantendo,
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
115
consequentemente, a replicação ativa da bactéria dentro do macrófago (SANTOS,
et al., 2007).
6.1.4.1.2 – Nível de TGF-β
β
TGF-β é uma citocina conhecida por inibir a iNOS induzida por TNF-α e
IFN-γ. Esta citocina se encontra elevado na lepra lepromatosa e em baixo nível em
pacientes com reação do tipo I (KHANOLKAR-YOUNG, LOCK-WOOD, 1998).
Os resultados da produção de TGF-β nos sobrenadantes de cultura de
macrófagos, obtidos neste trabalho, na ausência e na presença de M. leprae
encontram-se elevados, sendo que na presença de L-NAME ocorre uma diminuição
dos níveis de TGF-β. Resultado esse que está de acordo com os dados publicados
na literatura por GOULART e colaboradores, 2000 e KISZEWSKI e colaboradores,
2003, onde macrófagos de camundongos incubados com o M. leprae produzem
uma maior concentração de TGF-β (GOULART et al., 2000; KISZEWSKI et al.,
2003).
6.1.4.1.3 – Nível de IL-10
A literatura (GOULART et al., 2000 ; ADAMS et al., 2001 ; e por MOURA
et al.,2007) descreve um aumento na produção de IL-10 em culturas de células em
interação com M. leprae.
A avaliação do nível de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de
macrófagos incubados com M. leprae realizados neste trabalho mostrou uma
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
116
elevação ainda nas células controle (com ausência de M. leprae) (Gráfico 8), o que
dificultou a análise dos resultados e indica a necessidade de testes com células de
outros doadores.
6.1.4.2 - Leishmania amazonensis
6.1.4.2.1 – Nível de TNF-α
α
Nossos resultados das dosagens de TNF-α no sobrenadante das culturas
demonstram um acentuado aumento na produção de TNF-α por macrófagos
incubados com L. amazonensis, não havendo diferença para células na ausência ou
na presença de L-NAME (Gráfico 4) . Esses resultados corroboram com os dados da
literatura, onde camundongos e células de cultura infectados com Leishmania
promovem o aumento da expressão de RNAm TNF-α (GOMES et al., 2003;
NASHLEANAS et al., 2000; MARTIN et al., 1994; KAMIJO et al., 1994; THEODOS et
al., 1991).
6.1.4.2.2 - Nível de TGF-β
β
Gomes e colaboradores (2003) investigaram o papel das citocinas TGF-β
e IL-10 implicadas nas respostas com perfil Th2, no processo de infecção de
macrófagos de camundongos CBA/J com L. amazonensis. Eles observaram que
TGF-β suprime a expressão da enzima NO-sintase indutível (iNOS), enquanto a
concentração desta citocina e a expressão de RNAm nos sobrenadantes das
culturas se mostraram aumentadas em comparação com os valores da
concentração de TGF-β nas culturas controle (GOMES et al., 2003).
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
117
No nosso trabalho, as dosagens de TGF-β dos sobrenadantes da cultura
de macrófagos humanos com L. amazonensis, também apresentaram um aumento
da concentração de TGF-β em comparação com as culturas controle. Os
macrófagos capazes de sintetizar NO apresentaram a produção de TGF-β maior
que os macrófagos incapazes de sintetizar NO. Esse resultado está de acordo com
os trabalhos encontrados na literatura, onde células infectadas produzem uma maior
liberação de TGF-β quando comparadas aos seus respectivos controles (SWAIN, et
al., 1991; BARRAL, et al., 1993; SCHMITT, et al., 1994; BARRAL, et al., 1995;
WILSON, et al., 1998; GANTT, et al., 2003).
6.1.4.2.3 – Nível de IL-10
Trabalhos publicados na literatura citam um aumento na expressão de
RNAm IL-10 em cultura de macrófagos de camundongos em interação com L.
amazonensis (MELBY et al., 1998; GOMES et al., 2003). Esse aumento na produção
de IL-10 em células infectadas também foi observado por BARRAL, 1993 e LI e
colaboradores,1996 (BARRAL et al., 1993; LI et al., 1996).
De forma similar, nossos resultados de dosagens de IL-10 apresentam
um discreto aumento na produção de IL-10 em macrófagos incubados com L.
amazonensis tanto na ausência como na presença de L-NAME.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
118
6.1.4.3 - Fusarium solani
6.1.4.3.1 – Nível de TNF-α
α
Anaissie e colaboradores (1986) demonstraram que o F. solani tem a
capacidade de invadir a parede do vaso sanguíneo de pacientes imunodeprimidos,
causando dano ao tecido e posterior necrose. Essa invasão possivelmente é
mediada pela indução da liberação de TNF-α no local, ocorrendo então a
disseminação do fungo pelo organismo (ANAISSIE
et al., 1986). Os nossos
resultados obtidos com a incubação de F. solani com macrófagos humanos
demonstraram uma intensa elevação na produção de TNF-α nas primeiras 24 horas
de incubação. Nos macrófagos inibidos com LNAME a concentração de TNF-α foi
discretamente menor do que em macrófagos não tratados (Gráfico 7). Esse
resultado corrobora com os dados encontrados na literatura que citam outro fungo
da mesmo gênero – F. moniliforme – como indutor do aumento da expressão do
gene de TNF-α em macrófagos de camundongo e em células de linhagem desses
animais (TOLLESON et al., 1996; DUGYALA et al., 1998; CIACCI-ZANELLA et
al.,1999; MOBIO et al., 2000; HE et al., 2001).
6.1.4.3.2 - Nível de TGF-β
β
Nossos resultados demonstraram um discreto aumento na produção de
TGF-β em macrófagos incubados com F. solani, sendo essa produção diminuída em
macrófagos tratados com L-NAME. Estes resultados são análogos à trabalhos
encontrados na literatura relatando um aumento da expressão de TGF-β, como por
exemplo, os artigos científicos publicados por Lemmer e colaboradores (1999) e por
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
119
Sanderson e colaboradores (1995) que detectaram o aumento da expressão de
TGF-β em células hepáticas de camundongos submetidas a micotoxina fumonisina
produzida por F. moniliforme, fungo do mesmo gênero ao utilizado em nossos
experimentos (SANDERSON et al., 1995; LEMMER et al., 1999).
6.1.4.3.3 - Produção de IL-10
O trabalho publicado por Theumer e colaboradores (2002) demonstrou
que o tratamento de cobaias com a micotoxina fumonisina produzida por espécies
do gênero Fusarium produz a liberação de uma menor concentração da citocina IL10 no sobrenadante da cultura de macrófagos de camundongo (THEUMER et al.,
2002). De forma diferente, os resultados encontrados nos nossos experimentos
mostraram um leve aumento na concentração de IL-10 no sobrenadante da cultura
de macrófagos incubados com F. solani tanto na ausência quanto na presença de LNAME. Contudo, uma vez que o controle (macrófago sem F. solani) também se
encontra aumentado para produção de IL-10, isso indica a necessidade de repetição
dos ensaios.
Em conjunto, nossos resultados demonstram que macrófagos humanos
foram capazes de produzir NO em resposta a incubação seja por M. leprae, L.
amazonensis ou F. solani. Esses dados foram evidenciados de forma indireta, uma
vez que na presença de inibidor de NO sintase (L-NAME), observamos uma maior
quantidade desses biopatógenos no interior dessas células.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
120
6.2 – Parte II – Teste do Potencial anti-leishmania de compostos da
série 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina
Várias pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de se desenvolver
novos protocolos e medicamentos para o tratamento da leishmaniose. Nos dias
atuais, a situação se encontra mais crítica em pacientes imunodeprimidos, onde a
Leishmania aparece como um importante agente oportunista (COURA et al., 1987;
SOONG et al., 1995; CARVALHO et al, 2000; DESJEUX, ALVAR, 2003). No caso de
pacientes imunodeprimidos, existem formas clínicas incomuns e resistência ao
tratamento atualmente utilizado, por exemplo na forma tegumentar da doença (DEY
et al., 2000).
A imunodepressão causada por infecções virais (ex: HIV), aumenta o
número de casos relatados de leishmaniose visceral (VL) em países onde a doença
era considerada rara, como França, Itália, Espanha e Portugal (Desjeux, Alvar,
2003). Evidências epidemiológicas indicam que dentro desse grupo, a transmissão
ocorre principalmente devido ao compartilhamento de seringas contaminadas pelos
usuários de drogas. Outra razão para o aumento de casos de leishmaniose, envolve
o número maior de transplantes de órgãos, que necessita de uso contínuo de
medicamentos
imunodepressores,
o
que
eleva
o
risco
para
o
paciente
consideravelmente. As manifestações clínicas da leishmaniose podem resultar da
ativação de infecções ocultas em pacientes recentemente transplantados com
órgãos contaminados ou com alta susceptibilidade à transmissão natural da doença
(BERMAN, 1988; MURRAY et al., 2003). Além das infecções ocultas, a
imunodepressão pode alterar os sintomas clínicos mais comumente associados a
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
121
algumas espécies de Leishmania, como por exemplo Leishmania (viannia)
braziliensis, que pode causar infecção visceral (SOONG et al., 1995) ou lesão de
pele disseminada (COURA et al., 1987) em pacientes com HIV positivo. Os níveis de
transmissão também podem ser aumentados quando o inseto vetor se alimenta em
indivíduos imunocomprometidos com elevada parasitemia (MORALES et al., 2003).
Atualmente, existem diferentes drogas para o tratamento da leishmaniose
incluindo: a) Antimoniais que não foram aprovados pelo Food nad Drugs
Administration – EUA (FDA); b) Pentostan, permitido pelo CDC (Center for Disease
Control and Prevention – Atlanta) e usado principalmente em países de língua
inglesa; c) Glucantime, que é utilizado no Brasil dentre outros países da América
Latina. De acordo com a OMS, a eficiácia da terapia envolvendo glucantime varia de
acordo com o protocolo de tratamento aplicado e com a área geográfica onde esse
medicamento está sendo utilizado (CARVALHO et al., 2000).
As diferentes respostas clínicas para tratamento da leishmaniose visceral,
leishmaniose cutânea e leishmaniose tegumentar americana usando antimoniais
pentavalentes, são um problema para o processo de cura em pacientes com
leishmaniose. Dentre estes problemas, estão incluídos, a acumulação da droga nos
tecidos como o fígado e o baço, como também mialgia, pancreatite, arritmia cardíaca
e hepatite, que podem acarretar na diminuição ou na suspensão do tratamento, e
podem provocar o aparecimento de resistência aos compostos do tratamento
(CROFT et al., 2006; ESCOBAR et al., 2001).
Nossos
resultados
com
a
série
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-
(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina mostram os compostos 3c (p-CH3) e 3e (p-OCH3)
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
122
como sendo os mais ativos apresentando atividade anti-leishmania, com um perfil
mais significativo que o glucantime e, com menor citotoxicidade para célula
hospedeira. Sugerindo assim, que o perfil menos polar destes substituintes sejam
importantes para a ação destas moléculas sobre o parasita. O tratamento primário
contra
a
leishmaniose
incluem
antimoniais
pentavalentes,
principalmente
stibogluconato de sódio e formas do antimoniato N-metilglucamine, utilizados desde
1940 (BERMAN et al., 1988; OLLIARO et al., 1993; RAHT et al., 2003). Em alguns
casos, outras drogas como as pentamidinas, anfotericina B e paramomicina são
utilizadas como segunda opção em casos de resistência, apesar dos seus elevados
efeitos tóxicos para os pacientes (RAMOS, 1990; KUHLENCORD et al., 1992;
ESCOBAR et al., 2001; BRAY et al., 2003; ROSA et al., 2003). Recentemente, a
resistência à pentamidina foi descrita na literatura (BRAY et al., 2003) assim como
as
dificuldades
de
tratamento
de
pacientes
imunodeprimidos,
onde
os
medicamentos convencionais são menos eficazes, sendo necessária a implantação
de um tratamento com doses mais elevadas e, por um período de tempo mais
prolongado (ESCOBAR et al., 2001). A série da 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina se apresenta como uma nova classe promissora de
compostos protótipos para o tratamento da leishmaniose. Sendo os compostos 3c
(p-CH3) e 3e (p-OCH3) as moléculas mais promissoras para o início deste estudo.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
123
7. CONCLUSÕES
7.1 - Parte I - Importância do NO e citocinas na Interação de
Biopatógenos com Macrófagos Humanos
1. A permanência seja de M. leprae, L. amazonensis ou F. solani no
interior de macrófagos humanos é favorecida pela inibição de NO. Sendo assim, NO
pode ser um alvo importante para o controle das infecções causadas por estes
biopatógenos. Drogas que aumentam a produção de NO podem ser promissoras no
tratatamento e erradicação destas patologias.
2. Quanto a secreção de citocinas na interação desses biopatógenos com
macrófagos humanos, nossos resultados demonstraram a produção das citocinas
como TNF-α, TGF-β e em menor grau de IL-10 por macrófagos humanos após
ativação, seja por M.leprae, L. amazonensis ou F. solani. Além disso, observamos
que a secreção tanto de TNF-α, TGF-β como IL-10 parece ser independente da
produção de NO, visto que após o tratamento com o inibidor de NO (L-NAME), os
biopatógenos ainda foram capazes de estimular a produção dessas citocinas
quando comparados ao controle, o que sugere o envolvimento de outras vias de
produção de citocinas nesse mecanismo. Tomados juntos nossos resultados são
relevantes, pois macrófagos são células importantes nos eventos iniciais das
infecções cutâneas como Lepra, Leishmaniose e Fusariose que poderão modular o
tipo de resposta imune celular, com ação protetora no caso de T helper -1, ou
promovendo a doença no caso de T helper -2.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
124
3. Como TNF-α é um potente ativador de macrófago, estímulos químicos,
que , juntamente com os biopatógenos fossem introduzidos
nas células
hospedeiras, poderiam sinergizar para o aumento do nível de NO e, desta forma
promover a morte dos biopatógenos estudados.
4. Como IL-10 e TGF-β desativam macrófago, derivados químicos que
inibem a produção destas citocinas , poderiam ser usados para aumentar o nível
intracelular de NO e causar a morte desses biopatógenos.
5. A produção de TNF-α , IL-10 e TGF-β por macrófagos infectados pelos
biopatógenos aqui estudados, parece não ter sido diminuída pela inibição de NO
(como visto pelo tratamento das células com L-NAME), sugerindo que, embora,
estas citocinas modulem a produção de NO, este radical, por sua vez, não interfere
na produção dessas citocinas.
7.2 - Parte II - Teste do Potencial Anti-leishmania dos compostos da
série 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina
Dos 11 compostos avaliados quanto ao potencial leishmanicida, apenas
os derivados 3c e 3e da série 5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3b]piridina mostraram-se ativos para L. amazonensis, apresenando EC50 de 29,49µM
e 32,23µM, respectivamente, mostrando-se promissores para o desenvolvimento de
novos fármacos.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
125
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; POBER, J.S. Imunologia Celular e Molecular, 3ª ed., Editora
Revinter, Rio de Janeiro, 2000.
ADAMS, L.B.; SCOLLARD, D.M.; RAY, N.A . The study of Mycobacterium leprae infection in
interferon-gamma gene-disrupted mice as a model to explore the immunopathologic
spectrum of leprosy. J Infect Dis. 185(1):1–8, 2001.
AKDIS, M.; VERHAGEN, J.; TAYLOR, A. Immune responses in healthy and allergic
individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and
T helper 2 cells. J Exp Med. 199:1567-1575, 2004.
ALVAREZ-FRANCO, M.; REYES-MUJICA, M.; PALLER, A.S. Cutaneous Fusarium infection
in an adolescent with acute leukemia. Pediatr. Dermatol. 9:62-65, 1992.
ANAISSIE, E.J.; BODEY, G.P.; RINALDI MG. Emerging fungal pathogens. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 8(4):323-30, 1989.)
ANAISSIE, E.J.; Opportunistic mycoses in the immunocompromised host: Experience at a
cancer center and review. Clin Infect. Dis. 14:43, 1992
ANAISSIE, E.; KANTARJIAN, H.; JONES, P.; BARLOGIE, B.; LUNA, M.; BODEY, G.
Fusarium, a newly recognizedfungal pathogen in immunosuppressed patients. Câncer.
57:2141-2145, 1986.
ANAISSIE, E.; KANTARJIAN, H.; HOPFER, R.; ROLSTON, K.; FAINSTEIN, V.; BODEY, G.
The emerging role of Fusarium infections in patients with cancer. Medicine. 67(2):77-83,
1988
ANTOINE, J.C.; JOUANNE, C.; LANG, T.; PRINA, E.; CHASTELLIER, C.; FREHEL, C.
Localization of major histocompatibility complex class II molecules in phagolysosomes of
murine macrophages infected with Leishmania amazonensis. Infect. Immun. 59:64–775,
1991.
ARRUDA, D.C.; DALEXANDRI, F.L.; KATZIN, A.M.; ULIANA, S.R.B. Anti-leishmanial
activity of terpene nerolidol. Antimicrob Agents Chemother. 49:1679–1687, 1995.
ASSREUY, J.; CUNHA, F.Q.; EPPERLEIN, M. Production of nitric oxide and superoxide by
activated macrophages and killing of Leishmania major. Eur. J. Immunol. 24:672–676,
1994.
AUGER, M.J.; ROSS, J.A. The biology of the macrophages. In: The natural immune
system: the macrophage. Eds. C.E. Lewis & J.O.D. McGee, IRL Press, Oxford, New York,
Tokio, p.1-57, 1992.
BARNES, P.F.; FONG, S.J.; BRENNAN, P.J.; TWOMEY, P.E.; MAZUMDER, A.; MODLIN,
R.L. Local production of tumour necrosis factor and IFN--y in tuberculous peritonitis. J
Immunol. 145:149-5, 1990.
BARRAL, A.; BARRAL-NETTO, M;. YONG, E.C.; BROWNELL, C.E.; TWARDZIK, D.R.;
REED, S.G. Transforming growth factor b as a virulence mechanism for Leishmania
braziliensis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3442, 1993.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
126
BARRAL-NETTO, M., BARRAL, A;. BROWNELL, C.E.; SKEIKY, Y.A.W.; ELLINGSWORTH,
L.R.; TWARDZIK, D.R.; REED S.G. Transforming growth factor-b in leishmanial infection: a
parasite escape mechanism. Science. 257:545, 1992.
BARRAL-NETTO, M.; BARRAL, A. Transforming growth factor-beta in tegumentary
leishmaniasis. Braz J Med Biol Res.27(1):1-9, 1994.
BARRAL, A.; TEIXEIRA, M.; REIS, P.; VINHAS, V.; COSTA, J.; LESSA, H.; BITTENCOURT,
A.L.; REED, S.; CARVALHO, E.M.; BARRAL-NETTO, M. Transforming Growth Factor- β in
Human Cutaneous Leishmaniasis. American journal of Pathology. 147(4):147,1995.
BARREIRO, E.J. Estratégia de Simplificação Molecular no Planejamento Racional de
Fármacos: A Descoberta de Novo Agente Cardioativo. Química Nova. 25(6):1172-1180,
2002.
BEAN, A.G., ROACH, D.R.; BRISCOE, H.; FRANCE, M.P.; KORNER, H.; SEDGWICK, J.D.;
BRITTON, W.J. Structural deficiencies in granuloma formation in TNF gene-targeted mice
underlie the heightened susceptibility to aerosol Mycobacterium tuberculosis infection, which
is not compensated for by lymphotoxin. J. Immunol. 162:3504, 1999.
BERMAN, J.D. Chemotherapy for leishmaniasis: biochemical mechanisms, clinical efficacy
and future strategies. Rev Infect Dis. 10:560–586, 1988.
BLANCO, P.; PALUCKA, A.K.; PASCUAL, V.; BANCHEREAU, J. Dendritic cells and
cytokines in human inflammatory and autoimmune diseases. Cytokine Growth Factor Rev.
19(1):41-52, 2008.
BONFANTE-GARRIDO, R.; MELÉNDEZ, E.; BARROETA, S.; DE ALEJOS, M.A.; MOMEN,
H.; CUPOLILLO, E.; MCMAHON-PRATT, D.; GRIMALDI, G.JR. Cutaneous leishmaniasis in
western Venezuela caused by infection with Leishmania venezuelensis and L. braziliensis
variants. Trans R Soc Trop Med Hyg. 86(2):141-8, 1992.
BOGDAN, C.; GESSNER, A.; SOLBACH, W.; ROLLINGHOFF, M. Invasion, control and
persistence of leishmania parasites. Curr Opin Immunol. 8:517–525, 1996.
BOISSEAU-GARSAUD, A.M.; CALES-QUIST, D.; DESBOIS, N.; JOUANNELLE, A.;
PRATLONG, F.; DEDET, J.P. A new case of cutaneous infection by a presumed
monoxenous trypanosomatid in the island of Martinique (French West Indies). Trans. Roy.
Soc. Trop. Med. Hyg., 94:51–52, 2000.
BOSCH, U.; MIROCHA, C.J. Toxin Production by Fusarium Species from Sugar Beets and
Natural Occurrence of Zearalenone in Beets and Beet Fibers Applied And Environmental
Microbiology. 58(10):3233-3239, 1992.
BOUTATI, I.E.; ANAISSIE, E.J. Fusarium, a significant emerging pathogen in patients with
hematologic malignancy: Ten years experience at a Cancer Center and implications for
management. Blood. 90(3):999-1008 , 1997
BRAY, P.G.; BARRETT, M.P.; WARD, S.A.; KONING, H.P. Pentamidine uptake and
resistance in pathogenic protozoa: past, present and future. Trends Parasitol. 19:232–239,
2003.
BROWN, G.C.; FOXWELL, N.; MONCADA, S. Transcellular regulation of cell respiration by
nitric oxide generated by activated macrophages.FEBS Letters, v. 439, p. 321-324, 1998
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
127
CADENAS, S.; CADENAS, A. M. Flighiting the stranger-antioxidante protection against
endotoxin toxicity. Toxicology. 27:45-63, 2002.
CARVALHO, P.B.; ARRIBAS, M.A.G.; FERREIRA, E.I. Leishmaniasis. What do we know
about its chemotherapy? Braz J Pharm Sci. 36:69–96, 2000.
CHANG, K.P. CELL BIOLOGY OF LEISHMANIA. In: Wyler DW (ed) Modem parasite
biology cellular, immunological and molecular aspects. Freeman, New York, pp 79–90,
1990.
CHEN, W.F.; ZLOTNIK, A. IL-10: a novel cytotoxic T cell differentiation factor. J. Immunol.
147:528–534, 1991.
CIACCI-ZANELLA, J.R.; JONES, C. Fumonisin B1, a mycotoxin contaminant of cereal
grains, and inducer of apoptosis via the tumor necrosis factor pathway and caspase
activation. Food Chem. Toxicol. 37:703–712, 1999.
CORTE-REAL, S.; SANTOS, C.B.; MEIRELLES, M.N.L. Differential expression of the
plasma membrane Mg2+ ATPase and Ca2+ ATPase activity during adhesion and
interiorization of Leishmania amazonensis in fibroblasts in vitro. J Submicrosc Cytol
Pathol. 27(3):359–366, 1995.
COURA, J.R.; GALVÃO-CASTRO, B.; GRIMALDI, J.G. Disseminated American cutaneous
leishmaniasis in a patient with AIDS. Mem Inst Osw Cruz. 82:581–582, 1987.
COHN, Z. A. The activation of mononuclear fagocytes: fact, fancy, and future. The Jounal of
Immunology. 121(3):813-816, 1978.
CROFT, S.L.; SEIFERT, K.; YARDLEY, V. Current scenario of drug development for
leishmaniasis. Indian J Med Res 123(3):399–410, 2006.
CSATO, M. ANNA, KENDERESSY, S.Z. DOBOZY, A. Enhancement of Candida albicans
killing activity of separated human epidermal cells by ultraviolet radiation. British Journal of
Dermatology. 116(4):469–475, 1987.
CSATO, M; KENDERESSY, A.S; JUDAK, R; DOBOSY, A. Inflammatory mediators are
involved in the Candida albicans killing activity of humam epidermal cells. Arch. Dermatol.
Res. 282(5):348-50, 1990.
D'ANGEAC, A.D.; DORNAND, J.; EMONDS-ALT, X.; JULLIEN, P.; GARCIA-SANZ, J.A.;
ERARD, F. Transforming growth factor type beta 1 (TGF-beta 1) downregulates interleukin-2
production and up-regulates interleukin-2 receptor expression in a thymoma cell line. J Cell
Physiol. 147:460-9, 1991.
DAOPIN, S.; PIEZ, K.; OGAWA, Y.; DAVIES, D. Crystal structure of transforming growth
factor-beta 2: an unusual fold for the superfamily. Science. 257:369–73, 1992.
DEDET, J. P.; RYTER, A..; VOGT, E.; HOSLI, P.; PEREIRA DA SILVA, L.. Uptake and
killing of Leishmania mexicana amazonensis amastigotes by human skin fibroblasts. Ann.
Trop. Med. Parasitol. 77:35–44, 1983.
DEDET, J.P.; ROCHE, B.; PRATLONG, F.; CALES-QUIST, D.; JOUANNELLE, J.;
BENICHOU, J.C.; HUERRE, M. Diffuse cutaneous infection caused by a presumed
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
128
monoxenous trypanosomatid in a patient infected with HIV. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.,
89:644–646, 1995.
DEJARDINS, A.E.; MANANDHAR, H.K.; PLATTNER, R.D.; MANANDHAR, G.G.; POLING,
S.M.; MARAGOS, C.M. Fusarium species from nepalase rice and production of mycotoxins
and gibberellic acid by selected species. Applied and Environmental Microbiology.
66(3):1020-1025, 1999.
DELORENZI, J. C.; ATTIAS, M.; GATTASS, C.; ANDRADE, M.; REZENDE, C.; PINTO, A.
C.; HENRIQUES, A. T.; BOU-HABIB, D. C.; SARAIVA, E. M. B. Anti-leishmanial Activity of
na Índole Alkaloid from Peschiera australis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
45(5):1349-1354, 2001.
DESJEUX, P.; ALVAR, J. Leishmania/HIV. Co-infections: epidemiology in Europe. Ann Trop
Med Parasitol. 97(1):3–15, 2001.
DESJEUX, P.; ALVAR, J. Leishmania/HIV. Co-infections: epidemiology in Europe. Ann Trop
Med Parasitol. 97(1):3–15, 2003.
DEY, T.; ANAM, K.; AFRIN, F.; ALI, N. Antileishmanial activities of stearylamina-bearing
liposomes. Antimicrob Agents Chemother. 44(6):1739–1742, 2000.
DE GROTTE, M.A; FANG, F.C. NO inhibitions: antimicrobial properties of nitric oxide. Clin
Infect Dis. 21(2):162-5, 1995.
DING, A.; NATHAN, C.F.; GRAYCAR, J.; DERYNCK, R.; STUEHR, D.J.; SRIMAL, S.
Macrophage deactivation factor and transforming growth factors -b1- b2, and -b3 inhibit
induction of macrophage nitrogen oxide synthesis by IFN-g. J Immunol. 145:940-4, 1990.
DUGYALA, R.R.; SHARMA, R.P.; TSUNODA, M.; RILEY, R.T. Tumor Necrosis Factor-a as a
Contributor in Fumonisin B1 Toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics. 285:317–324, 1998.
ENGELHARD, D.; ELDOR, A.; POLACHECK, I.; HARDAN, I.; BEN-YEHUDA, D.;
AMSELEM, S.; SALKIN, I.F.; LOPEZ-BERESTEIN, G.; SACKS, T.; RACHMILEW-ITZ, E.A.;
BARENHOLZ, Y. Disseminated visceral fusariosis treated with Maramphotericin B–
phospholipid complex. Leuk Lymphoma. 9:385, 1993.
ESCOBAR, P.; YARDLEY, V.; CROFT, S. L. Activities of Hexadecylphosphocholine
(Miltefosine), Ambisome, and Sodium Stibogluconate (Pentostam) against Leishmania
donovani in immunodeficient scid Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
45(6):1872-1875, 2001.
ESPEVICK, T.; FIGARI, I.S.; SHALABY, M.R.; LACKIDES, G.A.; LEWIS, G.D.; SHEPARD,
H.M.; PALLADINO, M.A. Inhibition of cytokine productions by cyclosporine A and
transforming growth factor beta. J Exp Med. 166:571-6, 1987
FILLEY, E.A.; ROOK, G.A.W. Effect of Mycobacteria on Sensitivity to the Cytotoxic Effects
of Tumor Necrosis Factor. Infection And Immunity, 59(8):2567-2572, 1991.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
129
FORMAN, J. H.; TORRES, M. Redox signaling in macrophages. Molecular Aspects of
Medicine. 22:189-216, 2001
GANTT, K.R.; SCHULTZ-CHERRY, S.; RODRIGUEZ, N.; JERONIMO, S.M.B.;
NASCIMENTO, E.T.; GOLDMAN, T.L.; RECKER, T.J.; MILLER, M.A.; WILSON, M.E.
Activation of TGF- β by Leishmania chagasi: Importance for Parasite Survival in
Macrophages. The Journal of Immunology. 170:2613–2620, 2003.
GANTT, K.R.; GOLDMAN, T.L.; MILLER, M.A.; MCCORMICK, M.A.; JERONIMO, S.M.B.;
NASCIMENTO, E.T.B.; BRITIGAN, E.; WILSON, M.E. Oxidative responses of human and
murine macrophages during phagocytosis of Leishmania chagasi. J. Immunol. 167:893,
2001..
GEUZE, H.J. The role of endosomes and lysosomes in MHC class II functioning.
Immunology Today. 19(6):282-2871, 1998.
GOLENSER, J.; FRANKENBURG, S.; EHRENFREUND, T.; DOMB, A.J. Efficacious
treatment of experimental leishmaniasis with amphotericin b-arabinogalactan water-soluble
derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 43(9):2209–2214, 1999.
GOMES, I.N.; CALABRICH, A.K.F.C.; TAVARES, R.S.; WIETZERBIN, J.; FREITAS, L.A.R.;
VERAS, P.S.T. Differential properties of CBA/J mononuclear phagocytes recovered from an
inflammatory site and probed with two different species of Leishmania. Microbes and
Infection. 5:251–260, 2003.
GONTIJO, B.; CARVALHO, M.L.R. Leishmaniose Tegumentar Americana. Revista de
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 36(1):71-80, 2003.
GONTIJO, C.M.F.; MELO, M.N. Leishmaniose Visceral no Brasil: Quadro Atual, Desafios e
Perspectivas. Rev Bras Epidemiol. 7(3):338–349, 2004.
GOTO, H.; LINDOSO, J.A.L. Immunity and immunosuppression in experimental visceral
leishmaniasis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 37:615-623, 2004.
GORDON, S. et al. Plasma membrane receptors of the mononuclear phagocyte system.
Journal Cell Science, 45(9):1-26, 1988.
GOULART, I.M.B.; MINEO, J.R.; FOSS, N.T. Production of transforming growth factor-beta 1
(TGF-b1) by blood monocytes from patients with different clinical forms of leprosy. Clin Exp
Immunol. 122:330-334, 2000.
GREEN LC, DELUZURIAGA KR, WAGNERDA, RAND W, ISTFAN N, YOUNG VR,
TANNENBAUM SR. Nitrate biosynthesis in man. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:7764–68,
1981.
GREEN, L.C.; TANNENBAUM, S.R.; GOLDMAN, R. Nitrate synthesis in the germfree and
conventional rat. Science. 212:56–68, 1981
GREEN, S.J.; MELTZER, M.S.; HIBBS, J.B.; NACY, C.A. Activated macrophages destroy
intracellular Leishmania major amastigotes by an L-arginine-dependent killing mechanism. J.
Immunol. 144:278–283, 1990.
GRIMALDI, G. JR.; MC-MAHON-PRATT, D.; SUN, T. Leishmaniasis and its etiologic agents
in the New World: an overview. Prog Clin Parasitol. 2:73–118, 1991.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
130
GROLL, A.H.; WALSH, T.J. Uncommon opportunistic fungi: new nosocomial threats. Clin.
Microbiol. Infect. 7(2):8–24, 2001.
GUARRO, J.; GENÉ, J. Opportunistic fusarial infections in humans. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis. 14(9):741-54, 1995.
GUPTA, A.K.; BARAN, R.; SUMMERBELL, R.C. Fusarium infections of the skin. Curr Opin
Infect Dis. 13(2):121-128, 2000.
GYURKO, R.; BOUSTANY, G.; HUANG, P.L.; Mica lacking inducible nitric oxide synthase
demonstrate impaired killing of Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (9):4917-24,
2003.
HAGGE, D.A.; RAY, N.A.; KRAHENBUHL, J.L.; ADAMS, L.B. An In Vitro Model for the
Lepromatous Leprosy Granuloma: Fate of Mycobacterium leprae from Target Macrophages
after Interaction with Normal and Activated Effector Macrophages. The Journal of
Immunology. 172: 7771–7779, 2004.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free radicals reactive species and toxicology. Free
radicals in biology and medicine. 77:544-616, 1999.
HAN, Y.; KWON, Y.; CHUNG, H.; LEE, S.; SIMMONS, R.L.; BILLIAR, T. R.; KIM, Y.
Antioxidant enzymes suppress nitric oxide production through the inhibition of NF-kB
activation: role of H2O2 and nitric oxide in inducible nitric oxide synthase expression in
macrophage. Nitric oxide: biology and Chemistry. 5:504-513, 2001).
HE, Q.; RILEY, R.T.; SHARMA, R.P. Fumonisin-Induced Tumor Necrosis Factor-a
Expression in a Porcine Kidney Cell Line Is Independent of Sphingoid Base Accumulation
Induced by Ceramide Synthase Inhibition. Toxicology and Applied Pharmacology.
174:69–77, 2001.
HESPANHOL, R.C.; SOEIRO, M.N.C.; CORTE-REAL, S. The expression of mannosereceptor in skin fibroblast and their involvement in Leishmania (L.) amazonensis invasion. J
Histochem Cytochem 53(1):35–44, 2005.
HIBBS, J.B.JR.; TAINTOR, R.R.; Vavrin, Z. Macrophage cytotoxicity: role of Larginine
deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite. Science 235:473–76, 1987
HOEHN, P.; GOEDERT, S.; GERMANN, T. Opposing effects of TGFbeta 2 on the Th1 cell
development of naive CD4+ T cells isolated from different mouse strains. J. Immunol.
155:3788–3793, 1995.
HOLLOWAY, A.F.; SHANNON, M.F. Regulation of cytokine gene transcription in the immune
system. Molecular Immunology. 38:567-580, 2001.
HONG, S.; JEONG, H.; CHUNG, H.; KIM, H; CHAE, H.; SHIN, T.; SEO, Y., KIM, H. An
herbal formula, Herbkines, enhances cytokines production from immune cells. Journal of
Ethnopharmacology. 98:149-155, 2005.
HOPKINS, C.R. Intracellular routing of transferrin and transferrin receptors in epidermoid
carcinoma A431 cells. Cell. 35:321-330, 1983.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
131
HUE, F.X.; HUERRE, M.; ROUFFAULT, M.A.; BIEVRE, C. Specific detection of Fusarium
species in blood and tissues by a PCR technique. J.Clin.Microbiol. 37: 2434-2438, 1999.
IGNARRO, L.J.; BUGA, G.M.; WOOD, K.S.; BYRNS, R.E.; CHAUDHURI, G.
Endotheliumderived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric
oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:9265–69, 1987
JONES, D.B.; FORSTER, R.K.; REBELL, G. Fusarium solani keratitis treated with natamycin
(pimaricin):18 consecutive cases. Arch. Ophthalmol. 88:147, 1972.
JONES, D.B. Pathogenesis of bacterial and fungal keratitis. Trans. Ophthalmol. Soc. U. K.
98:367-371, 1978.
KAMIJO, R.; HARADA, H.; MATSUYAMA, T.; Requirement for transcription factor IRF-1 in
NO synthase induction in macrophages; Science. 263:1612–1615,1994.
KANEKO, H., YAMADA, H.; MIZUNO, S.; UDAGAWA, S.; KAZUMI, T.; SEKIKAWA, K.;
SUGAWARA, K. Role of TNFα in Mycobacterium-induced granuloma formation in TNF-α
deficient mice. Lab. Invest. 79:379, 1999.
KHANOLKAR-YOUNG, S.; RAYMENT, N.; BRICKELLT, P.M.; KATZ, D.R.;
VINAYAKUMART, S.; COLSTON, M.J.; LOCKWOOD, D.N.J. Tumour necrosis factor-alpha
(TNF-a) synthesis is associated with the skin and peripheral nerve pathology of leprosy
reversal reactions. Clin Exp Immunol. 99:196-202, 1995.)
KAR, S.; KAR, K.; BHATTACHARYA, P.K.; GHOSH, D.K. Experimental visceral
leishmaniasis: role of trans-aconitic acid in combined chemotherapy. Antimicrob Agents
Chemother. 37(11):2459–2465, 1993.
KARNOVSKY, M.L.; LAZDINS, J.K. Biochemical criteria for activated macrophages. The
Jounal of Immunology. 121(3):809-813, 1978.
KARP, C.L.; EL-SAFI, S.H.; WYNN, T.A.; SATTI, M.M.; KORDOFANI, A.M.; HASHIM, F.A.;
HAG-ALI, M.; NEVA, F.A.; NUTMAN, T.B.; SACKS, D.L. In vivo cytokine profiles in patients
with kala-azar. Marked elevation of both interleukin- 10 and interferon-gamma. Journal of
Clinical Investigation. 91:1644-1648, 1993.
KASAMA, T.R.; STRIETER, M.; LUKACS, N.W.; BURDICK, M.D.; KUNKEL, S.L. Regulation
of neutrophil-derived chemokine expression by IL-10. J. Immunol. 152:3559–3569, 1994.
KAUFFMAN, C.A. Fungal Infections. Proc. Am. Thorac. Soc. 3:35–40, 2006.
KAYSER, O.; KIDERLEN, A. F.; BERTELS, S.; SIEMS, K. Antileishmanial Activities of
Aphidicolin and its Semisynthetic Derivatives. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
45(1):288-292, 2001.
KILLISCH, I. et al. Characterization of early and late endocytic compartments of the
transferrin cycle Transferrin receptor antibody blocs erytroid differenciation by trapping the
receptor in the early endosome. J. Cell Sci. 103:211-232, 1992.
KINDLER, V., SAPPINO, A.P.; GRAU, G.E.; PIGUET, P.F.; VASSALLI, P. The inducing role
of tumour necrosis factor in the development of bactericidal granulomas during BCG
infection. Cell. 56:731-40, 1989.)
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
132
KIRYU, H. Invasion and survival of Fusarium solani in the dexamethasone-treated cornea of
rabbits. J. Med. Vet. Mycol. 29:395-406, 1991.
KISZEWSKI, C.A.; BECERRIL, E.; BAQUERA, J.; AGUILAR, L.D. Expression os tranforming
growth factor-b isoforms and their receptors in lepromatous and tuberculoid leprosy.
Scandinavian Journal of Immunology. 57:279-285, 2003.
KLIMP, A.H. A potencial role of macrophage activation in the treatment of cancer. Critical
Reviews in Oncology / Hematology. 5:483-525, 2001.
KORNFELD, S.; MELLMAN, I. The biogenesis of lysosomes. Annu. Rev. Cell Biol. 5:483525, 1989.
KREUTZER, R.D.; CORREDOR, A.; GRIMALDI, G.JR.; GROGL, M.; ROWTON, E.D.;
YOUNG, D.G.; MORALES, A.; MCMAHON-PRATT, D.; GUZMAN, H.; TESH, R.B.
Characterization of Leishmania colombiensis sp. n (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), a
new parasite infecting humans, animals, and phlebotomine sand flies in Colombia and
Panama. Am J Trop Med Hyg. 44(6):662-75, 1991.
KRONECKE, K.D.; FCHSEL, K.; KOLB-BACHOFEN, V. Inducible nitric oxide synthase in
human diseases. Clin. Exp. Immunol. 113:147-156, 1998.
KUHLENCORD, A.; MANIERA, T.; EIBL, H.; UNGER, C. Hexadecylphosphocholine: Oral
Treatment of visceral Leishmaniasis in Mice. Antimicrobial Agents and Chemoterapy.
36(8):1630-1634, 1992.
LASSER, A. The mononuclear phagocytic system: a review. Human Pathology. 14(2):108125, 1983.
LEEUWENBERG, J.F.T.; JEUNHOMME, M.; BUURMAN, W.A. Slow release of soluble TNF
receptors by monocytes in vitro. J. Immunol. 152: 4036–4043, 1994
LEMMER, E.R.; HALL, P.M.; OMORI, N.; OMORI, M.; SHEPHARD, E.G.; GELDERBLOM,
W.C.A.; CRUSE, J.P.; BARNARD, R.A.; MARASAS, W.F.O.; KIRSCH, R.E.;
THORGEIRSSON, S.S. Histopathology and gene expression changes in rat liver during
feeding of fumonisin B1, a carcinogenic mycotoxin produced by Fusarium moniliforme.
Carcinogenesis. 20(5):817–824, 1999.
LARABI, M.; YARDLEY, V.; LOISEAU, P.M.; APPEL, M.; LEGRAND, P.; GULIK, A.;
BORIES, C.; CROFT, S.L.; BARRATT, G. Toxicity and antileishmanial activity of a new
stable lipid suspension of amphotericin B. Antimicrob Agents Chemother. 47(12):3774–
3779, 2003.
LETSCHER-BRU, V.; CAMPOS, F.; WALLER,J.; RANDRIAMAHAZAKA,R.; CANDOLF, E.;
HERBRECHT, R. Successful outcome of treatment of a disseminated infection due to
Fusarium dimerum in a leukemia patient. Journal of Clinical Microbiology. 40(3):11001102, 2002.
LI, J.; SCOTT, P.; e FARRELL, J.P. In Vivo Alterations in Cytokine Production following
Interleukin-12 (IL-12) and Anti-IL-4 Antibody Treatment of CB6F1 Mice with Chronic
Cutaneous Leishmaniasis. Infection And Immunity. 64(12):5248–5254, 1996.
LIMA, L.M.; BARREIRO, E.J. Bioisosterism: a useful strategy for molecular modification and
drug design. Curr Med chem. 12(1):23–49, 2005.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
133
LINARES, M.J.; CHARRIEL, G.; SOLÍS, F.; RODRIGUEZ, F.; IBARRA, A.; CASAL, M.
Susceptibility of Filamentous Fungi to Voriconazole Tested by Two Microdilution Methods.
Journal Of Clinical Microbiology. 43(1):250–253, 2005
LIÑARES, G.E.; RAVASCHINO, E.L.; RODRIGUEZ, J.B. Progresses in the field of drug
design to combat tropical protozoan parasitic diseases. Curr Med Chem. 13:335–360, 2006.
LOUIS, J.; HIMMELRICH, H. LAUNOIS P. Regulation of protective immunity
Leishmania major in mice. Curr. Opin. Immunol. 10:459-64, 1998.
against
LUDWIG, T.; GRIFFITHS, G.; HOFLACK, B. Distribution of newly synthesized lysosomal
enzymes in the endocytic pathway of normal rat kidney cells. J. Cell Biol. 115:1561-1572,
1991.
MA, G.; KHAN, S.I.; JACOB, M.R.; TEKWANI, B.L.; LI, Z.; PASCO, D.S.; WALKER, L.A.;
KHAN, I.A.; Antimicrobial and antileishmanial activities of hipocrellins A and B. Antimicrob
Agents Chemother. 8(11):4450–4452, 2004.
MACKANESS e cols. J. Exp. Med. 120:105, 1964.
MACMIKING, J.; NATHAN. C. Nitric Oxide and macrophage function. Annu. Rev. Immunol.
15:323-50, 1997
MARTIN, E.; NATHAN, C.; XIE, Q.W. Role of interferon regulatory factor 1 in induction of
nitric oxide synthase. J. Exp. Med. 180:977–984, 1994.
MAUEL, J.; CORRADIN, S.B.; BUCHMULLER ROUILLER, Y. Nitrogen and oxygen
metabolites and the killing of Leishmania by activated murine macrophages. Res. Immunol.
142:577–580, 1991.
MELBY, P.C.; YANG, Y.Z.; CHENG, J.; ZHAO, W. Regional differences in the cellular
immune response to experimental cutaneous or visceral infection with Leishmania donovani.
Infection and Immunity. 66:18-27, 1998.
MIWA M, STUEHR DJ, MARLETTA MA, WISHNOK JS, TANNENBAUM SR. Nitrosation of
amines by stimulated macrophages. Carcinogenesis. 8:955–58, 1987
MOBIO, T.A.; ANANE, R.; BAUDRIMONT, I.; CARRATU, M.; SHIER, T.W.; DANO, S.D.;
UENO, Y.; CREPPY, E.E. Epigenetic properties of fumonisin B1: Cell cycle arrest and DNA
base modification in C6 glioma cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 164:91–96, 2000.
MOHACEK-GROSEV, V.; BOZAC, R.; PUPPELS, G.J. Vibrational spectroscopic
characterization of wild growing mushrooms and toadstools. Spectrochim. Acta Part A. Mol.
Biomol. Spectrosc. 57(14):2815-2829, 2001.)
MONCADA, S.; PALMER, R.M.J.; HIGGS, E.A.; Nitric oxide: Physiology, pathophysiology
and pharmacology. Pharmacol. Rev. 43:109-142, 1991.
MONZÓN, A. and TUDELA, J.L.R. 2001. Infecciones causadas por el gênero Fusarium.
Boletin CCS (Control de Calidad SEIMC): Revisiones temáticas: Micologia. Sociedad
Española
de
Enfermedades
Infecciosas
y
Microbiología
Clínica.
http://www.seimc.org/control/revi_mico/fusrium.htm (acessado em março de 2006.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
134
MOORE, K.W.; WAAL MALEFYT, R.; COFFMAN, R.L.; O'Garra, A. Interleukin-10 and the
interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol. 19:683-765, 2001.
MOURA, D.F.; TELES, R.M.B.; RIBEIRO-CARVALHO, M.M.; TELES, R.B.; SANTOS,
I.M.C.F.; FERREIRA, H.; FULCO, T.O.; NERY, J.A.C.; SAMPAIO, E.P.; SARNO, E.N. Longterm culture of multibacillary leprosy macrophages isolated from skin lesions: a new model to
study Mycobacterium leprae–human cell interaction. British Journal of Dermatology.
157:273–283, 2007.
MORENO, C., TAVERNE, J.; MEHLERT, A.; BATE, C.A.; BREALEY, R.J.; MEAGER, A.;
ROOK, G.A.W.; PLAYFAIR, J.H.L. Lipoarabinomannan from Mycobacterium tuberculosis
induces the production of tumour necrosis factor from human and murine macrophages.
Clin. Exp. Immunol. 76:240-245, 1989.
MOSSER, D.M.; KARP, C.L. Receptor mediated subversion of macrophage cytokine
production by intracellular pathogens. Curr. Opin. Immunol. 11:406–411, 1999.
MOSSER, D.M. The many faces of macrophage activation. Journal of Leukocyte Biology.
73:209-212, 2003.
MORALES, P.; TORRES, J.J.; SALAVERT, M.; PEMAN, J.; LACRUZ, J.; SOLE, A. Visceral
leishmaniasis in lung transplantation. Transplant Proc. 35:2001–2003, 2003.
MOURA, D.F.; TELES, R.M.B.; RIBEIRO-CARVALHO, M.M.; TELES, R.B.; SANTOS,
I.M.C.F.; FERREIRA, H.; FULCO, T.O.; NERY, J.A.C.; SAMPAIO, E.P.; SARNO, E.N. Longterm culture of multibacillary leprosy macrophages isolated from skin lesions: a new model to
study Mycobacterium leprae–human cell interaction. British Journal of Dermatology.
157:273–283, 2007.
MUKHOPADHYAY, S.; BHATTACHARYYA, S.; MAJHI, R.; DE, T.; NASKAR, K.
MAJUMDAR, S.; ROY, S. Use of Attenuated Leishmanial Parasite as an Immunoprophylactic
and Immunotherapeutic Agent against Murine Visceral Leishmaniasis. Clinical and
Diagnostic Laboratory Immunology. 7(2):233-240, 2000.
MURRAY, H.W.; BROOKS, E.B.; DEVECCHIO, J.L.; HEINZEL, F.P. Immunoenhancement
Combinet with Amphotericin B as Treatment for Experimental Visceral Leishmaniasis.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47(8):2513-2517, 2003.
MURTAUGH, M.P.; FOSS, D.L. Inflammatory cytokines and antigen presenting cell
activation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 87:109-121, 2002.
NASHLEANAS, M.; SCOTT, P. Activated T cells induce macrophages to produce NO and
control Leishmania major in the absence of tumor necrosis factor receptor p55. Infect.
Immun. 68:1428–1434, 2000.
NATHAN, C.F. Secretory products of macrophages. J. Clin. Invest. 79:319-326, 1987.
NEELY, N.A.; ORLOFF, M.M. Survival of some medically important fungi on hospital, fabrics
and plastics. Journal of Clinical Microbiology. 39(9):3360-3361, 2001.
NELSON, D.J.; JOW, F. Whole-cell currents in macrophage: Human monocytesderived
macrophages. J. Membr. Biol., v. 117, p. 29-44, 1990
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
135
NELSON, P.E.; DIGNANI, M.C.; ANAISSIE, E.J. Taxonomy, Biology, and Clinical Aspects of
Fusarium Speciest. Clinical Microbiology Reviews. 7(4):479-504,1994.
NEVEU,P.J. The mononuclear phagocyte system. Bull. Inst. Pasteur, 84:24- 66, 1986
NOSAKI, Y.; HASEGAWA, Y.; SHIMOKATA, K. Mechanism of nitric oxide-dependent killing
of M. bovis BCG in human alveolar macrophages. Infect. Immunity. 65:3644-3647, 1997.
NUCCI, M.; ANAISSIE, E. Cutaneous Infection by Fusarium Species in Healthy and
Immunocompromised Hosts: Implications for Diagnosis and Management. Clinical
Infectious Diseases. 35:909–20, 2002
NUCCI, M.; ANAISSIE, E. Fusarium Infections in Immunocompromised Patients. Clinical
Microbiology Reviews. 20(4):695-704, 2007.
O’DONNELL, K.; SARVER, B.A.J.; BRANDT, M.; CHANG, D.C.; NOBLE-WANG, J.; PARK,
B.J.; SUTTON, D.A.; BENJAMIN, L.; LINDSLEY, M.; PADHYE, A.; GEISER, D.M.; WARD,
T.J. Phylogenetic Diversity and Microsphere Array-Based Genotyping of Human Pathogenic
Fusaria, Including Isolates from the Multistate Contact Lens-Associated U.S. Keratitis
Outbreaks of 2005 and 2006. Journal Of Clinical Microbiology. 45(7):2235–2248, 2007.
OLLIARO, P.L.; BRYCESON, A.D.M. Practical progress and new drugs for changing
patterns of leishmaniasis. Parasitol Today. 9:323–328, 1993.
OLIVEIRA, C.C.; LACERDA, H.G.; MARTINS, D.R.; BARBOSA, J.D.; MONTEIRO, G.R.;
QUEIROZ, J.W.; SOUSA, J.M.; XIMENES, M.F.; JERÔNIMO, S.M. Changing epidemiology
of American cutaneous leishmaniasis (ACL) in Brazil: a disease of the urban–rural interface.
Acta Trop. 90(2):155–162, 2004.
PADGETT, R.W.; REISS, M. TGF-α superfamily signaling: notes from the desert.
Development. 134:3565-3569, 2007.
PALMER, R.M.J.; FERRIGE, A.G.; MONCADA, S. Nitric oxide release accounts for the
biological activity of endotheliumderived relaxing factor. Nature. 327:524–26, 1987.
PAL, S.; RAVINDRAN, R.; ALI, N. Combination therapy using sodium antimony gluconate in
stearylamine-bearing liposomes against established and chronic Leishmania donovani
infection in BALB/c mice. Antimicrob Agents Chemother. 48(9):3591–3593, 2004.
PARHAM, P. O sistema imune, Artmed Editora, 2001
PIVARCSI, A; NAGY, I; KEMENY, l. Innate immunity in the skin: How keratinocytes fight
against pathogens, Current immunology reviews, 2005, 1, 29-42
PLAYFAIR, J. Infection and Immunity. Oxford University Press Inc., New York, 1995.
POOLE, B.; OHKUMA, S. Effect of weak bases on the intralysosomal pH in mouse peritoneal
macrophages. J. Cell Biol. 90:665-669, 1981.
PRINA, E.; JOUANNE, C.; LEAO, S.S.; SZABO, A.; GUILLET, J.G.; ANTOINE, J.C. Antigen
presentation capacity of murine macrophages infected with Leishmania amazonensis
amastigotes. J. Immunol. 151:2050–2061, 1993.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
136
PROUDFOOT, L.; BRIMACOMBE, J.S. Regulatin of the expresion of nitric oxide synthase
and leishmanicidal activity by glicoconjugates of Leishmania lipophosphoglycan in murine
macrophages. Proc. Natl. acad. Sci. USA. 93:10984-9, 1996.
QUIDING-JARBRINK, M.; SMITH, D.A.; BANCROFT, G.J. Production of Matrix
Metalloproteinases in Response to Mycobacterial Infection. Infection And Immunity.
69(9):5661–5670, 2001.
RADA, E.; MARZAL, M.; CONVIT, J. Incremento de NO em el suero y sobrenadantes de
cultivo de células monocleares de pacientes com la enfermedad de Hansen em estado
raectional tipo II. Invest. Clin. 44(2):129-136, 2003.
RAHT, S.; TRIVELLIN, A.; IMBRUNITO, T.R.; TOMAZELA, D.M.; JESUS, M.N.; MARZAL,
P.; JUNIOR, H.F.A. Tempone, A.G. Antimoniais Empregados no Tratamento da
Leishmaniose: Estado de Arte. Quim Nova. 26:550–557, 1993.
RAMOS, H.; MILHAUD, J.; COHEN, B.E.; BOLARD, J. Enhanced action of anphotericin B on
Leishmania mexicana resulting from heat transformation. Antimicrob Agents Chemother.
34(8):1584–1589, 1990.
REDDY, R.C.; CHEN, G.H.; NEWSTEAD, M.W.; MOORE, T.; ZENG, X.; TATEDA, K.;
STANDIFORD, T.J. Alveolar Macrophage Deactivation in Murine Septic Peritonitis: Role of
Interleukin 10. Infection And Immunity. 69(3):1394–1401, 2001.
RITTING, M.G.; BOGDAN, C. Leishmania host–cell interaction: complexities and alternative
views. Parasitol Today. 16:292–297, 2000.
ROITT, I.; BROSTOFF, J.; MALE, D. Imunologia, 5ªed., Editora Manole Ltda., São Paulo,
1999.
ROOK, G.A.W.; TAVERNE, J.; MORENO, C. The role of tumour necrosis factor in the
pathogenesis of tuberculosis and leprosy, and the relationship between tissue-damaging
pathology. Tubercle. 72:13-20, 1990.
ROOK, G.A.W.; ATTIYAH, R. Cytokines and the Koch phenomenon. Tubercle. 72:13-20,
1991.
ROSA, M.S.S.; MENDONÇA-FILHO, R.R.; BIZZO, H.R.; RODRIGUES, I.A.; SOARES, R.M.;
PADRÓN, T.S.; ALVIANO, C.S.; LOPES, A.H.C.S. Antileishmanial activity of a linalool-rich
essential oil from Cróton cajucara. Antimicrob Agents Chemother. 47(6):1895–1901, 2003.
SANDERSON, N.; FACTOR, V.; NAGY, P.; KOPP, J.; KONDAIAH, P.; WAKEFIELD, L.;
ROBERTS, A.B.; SPORN, M.B. Hepatic expression of mature transforming growth factor b1
in transgenic mice results in multiple tissue lesions. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 92:2572–
2576, 1995.
SANTOS, D.O.; BOURGUIGNON, S.C.; CASTRO, H.C.; SILVA, J.S.; FRANCO, L.S.;
HESPANHOL, R.; SOARES, M.J.; CORTE-REAL, S. Infection of Mouse Dermal Fibroblasts
by the Monoxenous Trypanosomatid Protozoa Crithidia deanei and Herpetomonas roitmani,
J. Eukaryot. Microbiol., 51(5):570–574, 2004.
SANTOS, D.O.; MIRANDA, A.; SUFFYS, P.; BOURGUIGNON, S.C.; RODRIGUES, C.R.;
CASTRO, H.C. Current understanding of Dendritic cells and their co-stimulatory molecules
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
137
as a key in generating efficient T cell responses in Lepromatous Leprosy.. Current
Immunology Review. 3:77-85, 2007.
SANTOS, D.O.; SUFFYS, P.; SARNO, E. In vitro TNF alpha production by mononuclear cells
from lepromatous leprosy patients and from patients with erythema nodosum leprosum.
Clinical Immunology And Immunopathology. 67(3):199-203, 1993.
SANTOS, D.O; et al. Evaluation of chemiluminescence, procoagulant activity and antigen
presentation by monocytes from lepromatous leprosy patients with or without reactional
episodes. Lep. Ver. 65, 88-99, 1994.
SARNO E.N.; GRAU G.E.; VIEIRA L.M. .Serum levels of tumour necrosis factor-alpha and
interleukin-1 beta during leprosy reactional states. Clin Exp Immunol. 84:103–8, 1991.
SCHMITT, E.; HOEHN, P.; HUELS, C.; T helper type 1 development of naïve CD4+ T cells
requires the coordinate action of interleukin-12 and interferon-gamma and is inhibited by
transforming growth factorbeta. Eur. J. Immunol. 24:793–798, 1994.
SERENO, D.; ALEGRE, A.M.; SILVESTRE, R.; VERGNES, B.; OUAISSI, A. in Vitro
Antileishmanial Activity of Nicotinamide. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
49(2):808-812, 2005.
SHAPIRO, T.A.; WERE, J.B.; DANSO, K.; NELSON, D.J.; DESJARDINS, R.E.; PAMPLIN,
C.L. Pharmacokinetics and metabolism of allopurinol riboside. Clin Pharmacol Ther.
49(5):506–514, 1991.
SHAYKH, M.; SOLIDAY, C.; KOLAITUKUDY, P.E. Proof for the Production of Cutinase by
Fusarium solani f.pisiduring Penetration into Its Host, Pisum sativum. Plant Physiol. 60:170172, 1977.
SILVA, M.H.C.; QUELUZ, T.H.A.T. Macrófagos pulmonares. Journal Pneumology.
22(1):45-8, 1996.
SILVA, E.S.; PACHECO, R.S.; GONTIJO, C.M.; CARVALHO, I.R.; BRAZIL, R.P. Visceral
leishmaniasis caused by Leishmania (Viannia) braziliensis in a patient infected with human
immunodeficiency virus. Rev Inst Med Trop São Paulo. 44:145-149, 2002.
SILVEIRA, F.T.; ISHIKAWA, E.A.; DE SOUZA, A.A.; LAINSON, R. An outbreak of cutaneous
leishmaniasis among soldiers in Belém, Pará State, Brazil, caused by Leishmania (Viannia)
lindenbergi n. sp. A new leishmanial parasite of man in the Amazon region. Parasite.
9(1):43-50, 2002.
SINGH, S.; SIVAKUMAR, R. Challenges and new discoveries in the treatment of
leishmaniasis. J Infect Chemother. 10(6):307–315, 2004.
SNYDER, W.C.; HANSEN, H.N. The species concept in Fusarium. Am. J. Bot. 27:64-67,
1940.)
SOONG, L.; DUBOISE, S.M.; KIMA, P.; MCMAHON-PRATT, D. Leishmania pifanoi
amastigote antigens protect mice against cutaneous leishmaniasis. Infection and Imunnity.
63(9):3559–3566, 1995.
STANDIFORD, T.J. Anti-inflammatory cytokines and cytokine antagonists. Curr. Pharm.
Des. 6:633–649, 2000.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
138
STEIN, D.K.; SUGAR, A.M. Fungal infections in the promised host. Diagn Microbiol Infect
Dis. 12:221, 1989.)
STENGER ,S & ROLLINGHOFF, M. Ann. Rheuma. Dis. 60:43-46, 2001.
STITES, D.P.; TERR, A.I.; PARSLOW, T.G. Imunologia Médica, Guanabara Koogan, Rio
de Janeiro, 2000.
STUEHR DJ, MARLETTA MA. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages
produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 82:7738–42, 1985
SWAIN, S.L.; HUSTON, G.; TONKONOGY, S.; WEINBERG, A. Transforming growth factorbeta and IL-4 cause helper T cell precursors to develop into distinct effector helper cells that
differ in lymphokine secretion pattern and cell surface phenotype. J. Immunol. 147:2991–
3000, 1991.
TEMPONE, A.G.; SILVA, A.C.M.P.; BRANDT, C.A.; MARTINEZ, F.S.; BORBOREMA,
S.E.T.; SILVEIRA, M.A.B.; ANDRADE H.F. Sinthesis and Antileishmanial Activities of Novel
3-Substituted Quinolones. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49(3):1076-1080,
2005.
THEODOS, C.M.; POVINELLI, L.; MOLINA, R.; SHERRY, B.; TITUS, R.G. Role of tumor
necrosis factor in macrophage leishmanicidal activity in vitro and resistance to cutaneous
leishmaniasis in vivo, Infect. Immun. 59:2839–2842, 1991.
THEUMER, M.G.; LOPEZ, A.G.; MASIH, D.T.; CHULZE, S.N.; RUBINSTEIN, H.R.
Immunobiological Effects of Fumonisin B1 in Experimental Subchronic Mycotoxicoses in
Rats. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9(1):149–155, 2002.
TJELLE, T.E.; BRECH, A.; JUVET, L.K.; GRIFFITHS, G.; BERG, T. Isolation and
characterization of early endosomes, late endosomes and terminal lysosomes: their role in
protein degradation. Journal of Cell Science. 109:2905-2914, 1996.
TIUMAN, T. S.; NAKAMURA, T. U.; CORTEZ, D. A .G.; FILHO, B. P. D.; DIAZ, J. A. M.;
SOUZA, W.; NAKAMURA, C. V. Antilheishmanial Activity of Parthenolide, a Sesquiterpene
lactone Isolated from Tanacetum parthenium. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
49(1):176-182, 2005.
TOLLESON, W.H.; MELCHIOR, W.B.; MORRIS, S.M.; MCGARRITY, L.J.; DOMON, O.E.;
MUSKHELISHVILI, L.; JAMES, S.J.; HOWARD, P.C. Apoptotic and anti-proliferative effects
of fumonisin B1 in human keratinocytes, fibroblasts, esophageal epithelial cells and
hepatoma cells. Carcinogenesis. 17:239–249, 1996.
TSUNAWAKI, S.; SPORN, M.; DING, A.; NATHAN, C. Deactivation of macrophages by
transforming growth factor-b. Nature. 334:260-2, 1988.
TZIANABOS, A.O. Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents structural
aspects and biologic function. Clinical Microbiology Reviews. 13(4):523-533, 2000.
UNANUE, E.R.; ALLEN, P.M. The basis for the immunoregulatory role of macrophages and
other accessory cells. Science. 236:551-557, 1987.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
139
UNDERHILL, D.M.; OZINSKY, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu.
Rev. Immunol., v.20, p.825-852, 2002.
UZUN, O.; ANAISSIE, E.J. Antifungal prophylaxis in patients with hematological
malignancies: A reappraisal. Blood. 86:2063, 1995.
VANE, J.R. et al. Inducible isoforms of ciclooxigenases and nitric oxide synthase in
inflamation. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2046-2050, 1994.
VENDITTI, M.; MICOZZI, A.; GNTILE, G. Invasive Fusarium solani infections in patients with
acute leukemia. Ver. Infect. Dis. 10:650-653, 1998.)
VERRECK, F.A.; BOER, T.; LANGENBERG, D.M. Human IL-23-producing type 1
macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to
(myco)bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 101:4560–5, 2004.
VIVIANI, A.M.; COFRANCESCO, E.; BOSCHETTI, C.; TORTORANO, A.M.; CORTELLARO,
M. Eradication of Fusarium infection in a leukopenicpatient treated with liposomal
amphotericin B. Mycoses. 34:255, 1991.
WAKEFIELD, L.M.; THOMPSON, N.L.; FLANDERS, K.C.; O'CONNOR-MCCOURT, M.D.;
SPORN, M.B. Transforming growth factor-beta: multifunctional regulator of cell growth and
phenotype. Ann NY Acad Sci. 551:290-7, 1988.
WENIGER B, ROBLEDO S, ARANGO GJ, DEHARO E, ARAGON R, MUNOZ V, CALLAPA
J, LOBSTEIN A, ANTON R. Antiprotozoal activities of Colombian plants. J Ethnopharmacol.
78(2-3):193-200, 2001.
WHO (2001) Tropical disease research: progress 1999–2000. World Health Organization,
Geneva.
WILSON, M.E.; YOUNG, B.M.; DAVIDSON, B.L.; MENTE, K.A.; MCGOWAN, S.E. The
Importance of TGF-b in Murine Visceral Leishmaniasis. The Journal of Immunology.
161:6148–6155, 1998.
WOOD, K.J., AUSTYN, J.M. Principles of celular and molecular immunology. Oxford
University press Inc, New York, 1993.
WU, K.; BI, Y.; SUN, K.; WANG, C. IL-10-Producing Type 1 Regulatory T Cells and Allergy.
Cellular & Molecular Immunology. 4(4):269-275, 2007.
YARDLEY, V.; KHAN, A.A.; MARTIN, M.B.; SLIFER, T.R.; ARAÚJO, F.G.; MORENO, S.N.J.;
DOCAMPO, R.; CROFT, S.L.; OLDFIELD, E. In vivo activities of farnesyl pyrophosphate
synthase inhibitors against Leishmania donovani and Toxoplama gondii. Antimicrob Agents
Chemother. 46(3):929–931, 2002.
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
140
Índice
Lista de Abreviaturas ............................................................................................................... i
Lista de Figuras ....................................................................................................................... ii
Lista de Gráficos...................................................................................................................... iii
Resumo .................................................................................................................................. iv
Abstract ................................................................................................................................... v
1. Introdução .......................................................................................................................... 19
1.1 Considerações gerais ............................................................................................. 19
2. Revisão da Literatura ........................................................................................................ 26
2.1 - Introdução - Parte I............................................................................................. 26
2.1.1 - Alguns aspectos relevantes sobre a resposta imune ................................... 26
2.1.2 - Resposta Imune Inata - Mecanismos Não Específicos ................................ 27
2.1.3 - Resposta Imune Adaptativa......................................................................... 28
2.1.4 - Macrófagos – Origem e Ativação................................................................ 30
2.1.5 - Macrófagos: Sistema Endossomal e Apresentação de Antígeno................. 35
2.1.6 - Óxido Nítrico............................................................................................... 36
2.1.7 - Interação de Mycobacterium leprae com macrófagos e citocinas (TNF-α,
TGF-β e IL-10)........................................................................................................ 40
2.1.8 - Interação de Leishmania amazonensis com macrófagos e citocinas (TNFα, TGF-β e IL-10) ................................................................................................... 44
2.1.9 - Interação de Fusarium solani com macrófagos e citocinas (TNF-α, TGF-β
e IL-10)................................................................................................................... 47
2.2 - Introdução - Parte II............................................................................................ 51
2.2.1 - Tratamento da Leishmaniose: ainda um desafio ......................................... 51
2.2.2 - Novas alternativas: Associação de drogas com lipossomas ....................... 56
2.2.3 - Novas Drogas Derivadas de Microrganismos e Plantas .............................. 59
2.2.4 - Desenvolvimento Racional de Fármacos..................................................... 62
2.2.5 - Novas Drogas de Origem Sintética.............................................................. 64
2.2.6 - Tratamento e o Sistema Imune.................................................................... 67
3. Objetivos ............................................................................................................................ 69
4. Materiais e Métodos........................................................................................................... 70
4.1 – Cultura de Células ............................................................................................. 70
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
141
4.1.1 - Processamento de Macrófagos ................................................................... 70
4.2 – Procedência dos Biopatógenos ....................................................................... 71
4.2.1 – Mycobacterium leprae................................................................................. 71
4.2.2 – Leishmania amazonensis ........................................................................... 71
4.2.3 – Fusarium solani .......................................................................................... 71
4.3 – Interação entre Macrófagos Humanos e Patógenos ....................................... 72
4.3.1 - Mycobacterium leprae ................................................................................. 72
4.3.2 - Leishmania amazonensis ............................................................................ 73
4.3.3 - Fusarium solani ........................................................................................... 73
4.4 - Microscopia Eletrônica ...................................................................................... 73
4.5 - Detecção de Citocinas ....................................................................................... 74
4.6 – Teste do Potencial Leishmanicida dos Derivados Piridínicos ....................... 74
4.6.1 – Procedência dos Derivados Piridínicos....................................................... 74
4.6.2 – Preparação dos Derivados Piridínicos ........................................................ 75
4.6.3 - Cultura de Leishmania................................................................................. 76
4.6.4 - Avaliação Anti-leishmania das Drogas......................................................... 76
4.6.5 – Avaliação da EC50 de Derivados Piridínicos .............................................. 76
4.6.6 - Teste de citotoxicidade em cultura de células humanas .............................. 76
5. Resultados ......................................................................................................................... 78
5.1 - Parte I – Importância do NO na Interação de Biopatógenos com
Macrófagos Humanos ................................................................................................ 78
5.1.1 – Efeitos de inibidores da enzima NO sintase (L-NAME) na Interação de M.
leprae com macrófagos humanos .......................................................................... 79
5.1.2 – Efeitos do inibidor da enzima NO sintase (L-NAME) na Interação da L.
amazonensis com macrófagos humanos .............................................................. 87
5.1.3 – Efeitos do inibidor da enzima NO sintase (L-NAME) na Interação da F.
solani com macrófagos humanos .......................................................................... 89
5.2 – Avaliação por Dosagem de Citocinas ............................................................. 91
5.2.1 – Dosagem de TNF-α, TGF-β e IL-10 em sobrenadante de cultura de
macrófagos incubados com M. leprae. ................................................................... 91
5.2.2 – Dosagem de TNF-α, TGF-β e IL-10 em sobrenadante de cultura de
macrófagos incubados com L. amazonensis. ......................................................... 95
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
142
5.2.3 – Dosagem de TNF-α, TGF-β e IL-10 em sobrenadante de cultura de
macrófagos incubados com F. solani...................................................................... 98
5.3 - Teste do Potencial Anti-leishmania de compostos da série 5-(4,5-diidro-1Himidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina ....................................................... 102
5.3.1 - Atividade Anti-leishmania ............................................................................ 102
5.3.2- Teste de Citotoxicidade ................................................................................ 104
6. Discussão........................................................................................................................... 106
6.1 – Parte I – Importância do NO na Interação de Biopatógenos com
Macrófagos Humanos ................................................................................................ 106
6.1.1 - Efeitos do L-NAME na Interação de M. leprae com macrófagos
humanos ................................................................................................................ 108
6.1.2 - Efeitos do L-NAME na Interação de L. amazonensis com macrófagos
humanos ................................................................................................................ 110
6.1.3 - Efeitos do L-NAME na Interação de F. solani com macrófagos
humanos ............................................................................................................... 111
6.1.4 - Produção de citocinas (TNF-α, TGF-β e IL-10) por macrófagos humanos
incubados com biopatógenos ................................................................................. 112
6.1.4.1 - Mycobacterium Leprae ............................................................................ 113
6.1.4.1.1 – Nível de TNF –α ................................................................................ 113
6.1.4.1.2 – Nível de TGF-β ................................................................................. 115
6.1.4.1.3 – Nível de IL-10 ................................................................................... 115
6.1.4.2 - Leishmania amazonensis ......................................................................... 116
6.1.4.2.1 – Nível de TNF-α .................................................................................. 116
6.1.4.2.2 - Nível de TGF-β................................................................................... 116
6.1.4.2.3 – Nível de IL-10 .................................................................................... 117
6.1.4.3 - Fusarium solani ........................................................................................ 118
6.1.4.3.1 – Nível de TNF-α .................................................................................. 118
6.1.4.3.2 - Nível de TGF-β................................................................................... 118
6.1.4.3.3 - Produção de IL-10 .............................................................................. 119
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira
Pós-Graduação em Patologia
143
6.2 – Parte II – Teste do Potencial anti-leishmania de compostos da série
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina ........................... 120
7. Conclusões ........................................................................................................................ 123
7.1 - Parte I - Importância do NO e citocinas na Interação de Biopatógenos
com Macrófagos Humanos....................................................................................... 123
7.2 - Parte II - Teste do Potencial Anti-leishmania dos compostos da série
5-(4,5-diidro-1H-imidazol-2-il)-4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina ............................ 124
8. Referências Bibliográficas ................................................................................................ 125
Anexos.................................................................................................................................... 140
Dissertação de Mestrado
Rodrigo Tonioni Vieira