Fagocitose De Células Apoptóticas Por Macrófagos Humanos Análise Por Citometria De Fluxo Células apoptóticas são fagocitadas pelos macrófagos humanos? Materiais Populações de • Macrófagos • Neutrófilos • Células apoptóticas Marcadores: • CMFDA (5-cloromethylfluorescein diacetate) • CD 14 • CD 15 • CD 16 • CD 62 Métodos Citometria de Fluxo Microscopia Fluorescência Problemas Lavagem dos macrófagos – perda de células Dificuldade na discriminação de células interiorizadas e periféricas Quantificação microscópica demorada e pode conter erros significativos Métodos Amostra em fases – Percoll • Sangue periférico • Células mononucleares • Células polimorfonucleares Separar os polimorfonucleares neutrófilos) • Ressuspender • Centrifugar • Incubar (95% Métodos Neutrófilos são marcados com CMFDA Macrófagos incubados com neutrófilos Promove-se a fagocitose Análise por citometria Resultados – CMFDA CMFDA marca os neutrófilos sem afectar o processo de apoptose. • • • Não altera a velocidade da fagocitose Não interfere na superfície da célula Não altera a viabilidade dos macrófagos Resultados – Fluorescência Duas populações distintas de neutrófilos • Uniformidade da marcação • Intensidade da fluorescência Resultados – Fagocitose R1 analisado por fotomicroscopia • 96% macrófagos fagocitaram. R2 e R3 percentagem reduzida (3%) Resultados – Taxa Fagocítica Variações da taxa de fagocitose com estímulos exteriores Resultados – Resposta Fagocítica Resposta fagocítica máxima demorada Subestimada Resultados – Lavagens Perda de células Diminuição da capacidade fagocítica Subestimada Discussão Apoptose e remoção das células apoptóticas é fundamental A quantidade de ensaios aumenta a hipótese de erros Discussão A citometria de fluxo é um importante mecanismo: • Na distinção das células interiorizadas, das • • • periféricas, Remoção do erro do observador, Elevado número de amostras, Não necessita de lavagens. Ciência Viva Sara Jorge Julho 2010