Estudo in vivo do efeito agudo da espironolactona e - nupeb

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Estudo in vivo do efeito agudo da
espironolactona e eplerenona em ratos
submetidos à isquemia cardíaca
Gabriela de Cássia Sousa Amancio
Ouro Preto
2013
GABRIELA DE CÁSSIA SOUSA AMANCIO
Estudo in vivo do efeito agudo da espironolactona
e eplerenona em ratos submetidos à isquemia
cardíaca
Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Dr. Mauro César Isoldi
Co-orientadora: Dra. Andrea Grabe Guimarães
Ouro Preto
2013
Dedico este trabalho à minha mãe Cristina, meus irmãos
Geisa e Guilherme e ao Igor, que sempre me ajudaram,
apoiaram e incentivaram.
AGRADECIMENTOS
À Deus por guiar e proteger o meu caminho.
À minha mãe Cristina pelo amor incondicional, pelos conselhos e por nunca medir
esforços para que eu realize meus sonhos.
Aos meus irmãos Guilherme e Geisa pelo carinho e companheirismo. Geisa (Faela),
obrigada por tudo que você sempre fez por mim aqui em Ouro Preto!
Ao Igor por ser meu amigo, pela paciência e pelo apoio, principalmente nesses últimos
dias. Te amo!
À toda minha grande e querida família meus avós, tios e primos pelo carinho e pelo
apoio sempre.
Aos meus amigos Elisa, Caio, Mari, Denise, Diguin e Betinha obrigada pela amizade e
por compartilhar comigo momentos de alegria!
Ao Prof. Dr. Mauro César Isoldi pela orientação desde a iniciação científica, confiança e
ensinamentos. Todos esses anos de trabalho no Laboratório foram muito importantes
para minha carreira científica e sempre serei grata por tudo isso.
À Profª Drª Andrea Grabe Guimarães, sem o seu apoio nada disso seria possível.
Obrigada pela boa vontade, pelas correções e direcionamentos, e pela oportunidade de
cursar o doutorado.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Hipertensão UFOP, Maria Andrea, Thalisson,
Rosana, Everton, Rodrigo, Grazi, Uberdan, Renato, Carol e Gabi Hermont pela amizade
e a troca de experiências.
Milla, Carol e Gabi Juninha, vivemos muitos momentos juntas e vou sentir falta da
nossa convivência diária. Obrigada pela amizade, companhia e apoio sempre!
Ana Cláudia e Deborah, parte deste trabalho também é de vocês. Obrigada por tudo!
Pelos fins de semana de trabalho, pelas análises intermináveis do ECG... Vocês foram
fundamentais para a realização deste projeto!
Aos colegas e amigos do Laboratório de Farmacologia experimental do CiPharma,
Dani, Carol, Kamila, Quênia, Thales, Mariana e Gisele. Obrigada por me acolherem!
Quando cheguei não tinha experiência alguma com as metodologias que iria utilizar e
todos direta e indiretamente me ajudaram.
Ao Prof. Dr. Wanderson pela paciência e ajuda com as análises histológicas.
Ao Centro de Ciência Animal da UFOP e todos os seus funcionários pelo cuidado com
os animais.
Aos professores do NUPEB pelos ensinamentos e a todos os funcionários pela
dedicação.
À Fapemig pelo financiamento do projeto e a Capes pela concessão da bolsa de estudo.
Ainda que eu tivesse o dom de profetizar o conhecimento de todos os
mistérios e de toda a ciência, ainda que eu tivesse toda fé a ponto de
transportar montes, se não tivesse o Amor, eu nada seria.”
(Apóstolo Paulo, na carta I aos Coríntios)
RESUMO
O aumento dos níveis plasmáticos de aldosterona após infarto do miocárdio (IM)
está relacionado com a piora do prognóstico da doença e contribui para patogênese da
insuficiência cardíaca.
O tratamento do IM com antagonistas de receptores
mineralocorticoides (MR) da aldosterona, espironolactona e eplerenona, têm reduzido a
remodelação do ventrículo esquerdo e a morte súbida. Entretanto, existem evidências
clínicas e experimentais de que a cardioproteção promovida por esses antagonista pode
ser em parte independente do bloqueio da ação da aldosterona. O objetivo do presente
estudo foi avaliar comparativamente os efeitos cardioprotetores da espironolactona e
eplerenona em um modelo agudo de isquemia cardíaca em ratos. Ratos machos wistar,
submetidos a adrenalectomia lateral ou não foram tratados, via oral, com
Espironolactona 20mg/kg ou Eplerenona 10mg/kg, na presença e na ausência de um
antagonista de receptor GR (Mifepristona 20mg/kg) e submetidos a isquemia cardíaca.
O sinal de ECG em ratos anestesiados foi obtido antes e após a ligadura coronária
esquerda, durante 1 hora. A área sob a curva do segmento ST do ECG, um parâmetro
que indica isquemia do miocárdio, foi significativamente menor para a espironolactona
(53.9.3 ± 13,07) e eplerenona (31,3 ± 10,08) de animais tratados em comparação com os
animais de controle (179,4 ± 32,3). Mifepristona (76,6 ± 14,54) não foi capaz de alterar
os efeitos de espironolactona. Estes resultados sugerem que doses baixas de
espironolactona e eplerenona são cardioprotetoras mesmo quando os níveis de
aldosterona não estão aumentados e que este efeito não é dependente da ativação dos
receptores GR.
Palavras-chave: Espironolactona, Eplerenona, cardioproteção, adrenalectomia.
viii
ABSTRACT
The increasing plasma levels of aldosterona after myocardial infarction (MI) is
related to its prognostic aggravation and contributes to the cardiac failure pathogenesis.
The
MI treatment
with
the
mineralocorticoid
receptors
(MR)
antagonists,
spironolactone and eplerenone, can reduce the left ventricular remodeling and sudden
death occurrence. However, clinical and experimental evidences demonstrated that this
cardioprotection could be in part independent of the aldosterone inhibition. The
mechanisms activated by these two drugs in the heart remain unknown. Spironolactone
also presents glucocorticoid receptors (GR) affinity, which also shows cardioprotective
properties. The objective of the present work was to evaluate the cardioprotective
effects of spironolactone and eplerenone in a model of acute cardiac ischemia in rats.
Male Wistar rats were first subjected to adrenalectomy and received by oral route
20mg/kg of spironolactone or 10mg/kg eplerenone in the presence and in the absence of
mifepristone (20mg/kg), a GR receptor antagonist. The ECG signal was obtained in
anaesthetized rats before and after the left coronary ligature, during 1 hour. The area
under the curve of the ST segment of ECG, a parameter that indicates myocardial
ischemia, was significantly smaller for the spironolactone (53.9.3±13.07) and
eplerenone (31.3±10.08) treated animals compared to the control animals (179.4 ±
32.3). Mifepristone (76.6±14.54) was not able to alter the effects of spironolactone.
These results suggest that low doses of spironolactone and eplerenone are
cardioprotective even when plasma levels of aldosterone are not augmented and that this
effect is not dependent of GR receptors activation.
Keywords: Espironolactone, Eplerenone, cardioprotection, adrenalectomy.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Elementos de um eletrocardiograma normal ..................................................22
Figura2: Sequência de alterações do ECG no IAM .......................................................23
Figura 3: Estrutura química da espironolactona ............................................................28
Figura 4: Estrutura química da eplerenona ....................................................................28
Figura 5: Fluxograma da divisão dos grupos experimentais .........................................39
Figura 6: Procedimento experimental ...........................................................................41
Figura 7: Área sob a curva ST-T ...................................................................................44
Figura 8: Taxa de mortalidade por grupo experimental .................................................48
Figura 9: Valores absolutos de PA e FC dos animais tratados com Espironolactona
20mg/kg e Eplerenona 10mg/kg submetidos à isquemia cardíaca .................................49
Figura 10: Valores absolutos de PA e FC dos animais tratados com Mifepristona
20mg/kg submetidos à isquemia cardíaca ......................................................................50
Figura 11: Exemplos de alterações eletrocardiográficas pós-ligadura. Derivação II ....51
Figura 12: Imagem representativa do registro dos ECGs após a ligadura da coronária 52
Figura 13: Variação da área sob a curva ST-T do ECG dos animais tratados com
Espironolactona 20mg/kg e Eplerenona 10mg/kg submetidos à isquemia cardíaca ......53
Figura 14: Variação da área sob a curva ST-T do ECG dos animais tratados com
Mifepristona 20mg/kg e Espironolactona 20mg/kg submetidos à isquemia cardíaca ....55
x
Figura 15: Dosagem sérica da aldosterona .....................................................................56
Figura 16: Histologia do coração de animais tratados com Espironolactona 20mg/kg e
Eplerenona 10mg/kg submetidos a ligadura da coronária esquerda................................58
Figura 17: Histologia do coração de animais tratados com Mifepristona 20mg/kg e
Espironolactona 20mg/kg e submetidos à ligadura da coronária esquerda .....................60
xi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Critérios para o diagnóstico de isquemia aguda do miocárdio. ....................25
Quadro 2: Divisão dos grupos experimentais. ..............................................................38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Propriedades farmacocinéticas e usos clínicos da espironolactona e
eplerenona .......................................................................................................................30
Tabela 2: Mortalidade por grupo experimental ..............................................................47
Tabela 3: Percentual de animais que apresentaram necrose cardíaca ...........................57
Tabela 4: Percentual de animais que apresentaram necrose cardíaca (Grupo
adrenalectomizado) .........................................................................................................59
xii
LISTA DE SIGLAS
11β-HSD2 – enzima 11β-desidrogenase
ACTH – hormônio adrenocorticotrófico
AMPc –monofosfato cíclico de adenosina
ATP – trifosfato de adenosina
AV – átrio-ventricular
DAG – diacilglicerol
ECA – enzima conversora de angiotensina
ECG – eletrocardiograma
EPHESUS – Eplerenone Heart failure Survival Study
EROs - espécies reativas de oxigênio
FC – frequência cardíaca
GMPC – monofosfato cíclico de guanosina
GR – receptor glicocorticoide
HE – hematoxilina e eosina
IAM – infarto agudo do miocárdio
IC – Insuficiência cardíaca
IP3 – trifosfato de inositol
KATP – canais de potássio sensíveis a ATP
kg – quilograma
mg – miligramas
MR – receptor mineralocorticoide
NaCl – cloreto de sódio
NADPH – nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidreto
xiii
PA – Pressão arterial
PAD – pressão arterial diastólica
PAS – pressão arterial sistólica
PI3-quinase – fosfatidilinositol 3-quinase
PKC – proteína quinase C
PTPm – poro de permeabilidade transitória mitocondrial
RALES – Randomized Aldosterone Evaluation Study
SA – sinoatrial
SRAA – sistema- renina- angiotensina- aldosterona
Supra de ST – supradesnivelamento do segmento ST
xiv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................................19
1.1.1 Infarto agudo do miocárdio ...................................................................................19
1.1.2 Aspectos fisiopatológicos .......................................................................................20
1.2 O ELETROCARDIOGRAMA ..................................................................................21
1.2.1 Alterações do Eletrocardiograma no Infarto do miocárdio ....................................22
1.3 ALDOSTERONA E SEUS EFEITOS DELETÉRIOS SOBRE O SISTEMA
CARDIOVASCULAR ....................................................................................................25
1.4 ANTAGONISTAS DE RECEPTORES MR DA ALDOSTERONA .......................27
1.4.1 Efeitos cardioprotetores dos antagonistas de MR independentes da aldosterona ..32
1.5 RECEPTORES GLICOCORTICOIDES .................................................................33
2. OBJETIVOS .............................................................................................................35
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................37
3.1 Animais .....................................................................................................................37
3.2 Fármacos e tratamento ..............................................................................................37
3.3 Procedimentos cirúrgicos ..........................................................................................41
3.4 Adrenalectomia bilateral............................................................................................42
3.5 Dosagem aldosterona sérica ......................................................................................42
3.6 Eletrocardiograma e Pressão arterial ........................................................................43
3.6.1 Determinação da área sob a curva ST-T ................................................................43
3.7 Análise histológica ....................................................................................................................... 45
3.8 Análise estatística .....................................................................................................45
xv
4. RESULTADOS ..........................................................................................................47
4.1 Taxa de mortalidade .................................................................................................47
4.2 Avaliação da pressão arterial e frequência cardíaca .................................................48
4.3 Avaliação do ECG .....................................................................................................53
4.3.1 Área sob a curva ST-T ............................................................................................54
4.5 Dosagem da aldosterona sérica ................................................................................59
4.6 Análise histológica ....................................................................................................60
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................64
6. CONCLUSÃO ..........................................................................................................72
7. REFERÊNCIAS ........................................................................................................74
ANEXOS ........................................................................................................................76
xvi
INTRODUÇÃO
1.
INTRODUÇÃO
1.1 INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO
O infarto agudo do miocárdio (IAM) está entre as principais causas de morte e
morbidade em todo mundo. Dados da Organização Mundial de Saúde estimam que
aproximadamente 7,3 milhões de pessoas morrem todos os anos em decorrência de
doenças coronarianas (WHO, 2011). No Brasil, segundo o DataSUS, no ano de 2010,
ocorreram 99.955 mortes devido a doenças isquêmicas do coração (BRASIL, 2011).
Os fatores de risco associados a doenças cardiovasculares são hipercolesterolemia,
hipertensão, diabetes, tabagismo, sedentarismo, má alimentação, uso excessivo do
álcool, predisposição genética, idade avançada, sexo e fatores sociais como pobreza e
baixa escolaridade (WHO, 2011).
A principal causa de doenças isquêmicas cardíacas e de infarto do miocárdio é a
aterosclerose, uma doença crônica onde ácidos graxos e colesterol são depositados
progressivamente no endotélio das artérias formando placas que as tornam irregulares e
estreitam o lúmen, dificultando a passagem do sangue (WHO, 2011). As placas
ateroscleróticas podem se romper e formar um coágulo ou trombo de sangue obstruindo
o fluxo sanguíneo das artérias causando isquemia. Outras causas menos comuns de
isquemia incluem espasmos coronarianos, embolia coronária e obstrução de vasos
normais sem placa aterosclerótica (Burke et al, 2007).
As síndromes coronarianas são classificadas em angina instável, infarto do
miocárdio sem elevação do segmento ST e infarto do miocárdio com elevação do
segmento ST. A isquemia causada pela oclusão total e permanente de uma artéria
coronária acompanhada por uma alteração no eletrocardiograma (ECG), o
supradesnivelamento do segmento ST (supra de ST), pode causar morte progressiva das
células cardíacas, caracterizando o infarto do miocárdio com elevação de ST. Oclusões
parciais e/ou intermitentes, geralmente, não são acompanhadas por supra de ST, no
entanto podem causar necrose celular, nestes casos desenvolve-se um infarto do
miocárdio sem elevação do ST. Quando a isquemia é menos acentuada e não há
indícios de necrose, a síndrome clínica é denominada de angina instável (National
Clinical Guideline Centre UK, 2010).
19
1.1.2 Aspectos fisiopatológicos
O infarto do miocárdio pode ser definido como morte de cardiomiócitos devido ao
desequilíbrio prolongado entre o suprimento de sangue e a demanda de oxigênio do
miocárdio, causado pela obstrução parcial ou total de um ou mais ramos das artérias
coronárias (Thygesen et al 2012).
A isquemia causa uma série de alterações metabólicas e funcionais nas células
cardíacas. Além da diminuição da oferta de O2, a disponibilidade de outros nutrientes
bem como a eliminação de metabólitos fica prejudicada. Ocorre rápida depleção de
ATP, o metabolismo aeróbio é interrompido e inicia-se a glicólise anaeróbica. Esta por
sua vez, promove acúmulo de íons H+ e acidose do tecido. Na tentativa de estabilizar o
pH, são ativados mecanismos intracelulares que culminam no aumento das
concentrações de cálcio na matriz mitocondrial e espécies reativas de oxigênio (EROs),
prejudicando a produção de energia. Consequentemente, ocorre abertura de poros de
permeabilidade transitória (PTPm) na mitocôndria que levam a morte celular (Chiong
et al, 2009).
A morte das fibras musculares se inicia em aproximadamente 20 min após a
isquemia e é categorizada patologicamente como necrose de coagulação ou em banda de
contração, que evolui por oncose e em menor grau por apoptose. Necrose completa de
todas as células em risco requer pelo menos 2- 4 h. Esse tempo pode variar dependendo
da presença de circulação lateral a zona isquêmica, da oclusão da coronária ser
permanente ou intermitente, da sensibilidade dos miócitos à isquemia e da demanda
individual de oxigênio e nutrientes do miocárdio (Thygesen et al 2007). Em modelos
animais de isquemia cardíaca o tempo para o desenvolvimento completo de necrose é
menor, variando entre 30 e 90 minutos em ratos (Jugdutt et al, 1993).
A isquemia cardíaca pode levar o indivíduo à morte logo na fase aguda do infarto,
devido a incapacidade do coração em bombear sangue adequadamente e a presença de
arritmias cardíacas (Jugdutt, 2012). Quando a lesão é menos acentuada, o miocárdio
remanescente sofre alterações anatômicas e funcionais que prejudicam a função
contrátil do coração e progressivamente levam à insuficiência cardíaca. Entre as
alterações estão remodelação da matriz extracelular, hipertrofia dos miócitos, dilatação
ventricular e acúmulo de colágeno na área infartada (Sutton e Sharpe, 2000), a esse
conjunto de alterações dá-se o nome de remodelamento cardíaco.
20
1.2 O ELETROCARDIOGRAMA
O diagnóstico do IAM é feito com base nos sintomas clínicos, alterações do ECG,
na elevação de marcadores bioquímicos de necrose e exames de imagem. Tendo em
vista que os sintomas clínicos são muito variados e a elevação dos biomarcadores se
inicia cerca de 6 h após os primeiros sintomas de infarto, o ECG ainda é o principal
instrumento utilizado no diagnóstico do IAM (Pesaro et al, 2004).
O ECG além de ser um método rápido e de baixo custo, permite identificar a área
relacionada ao infarto e prever o tamanho da área lesada, além de auxiliar na escolha da
terapia mais adequada para cada caso (Zimetbaum et al, 2003).
O ECG é composto por ondas, segmentos e intervalos, que representam as fases
do ciclo cardíaco, período entre o início de um batimento cardíaco e o início do
próximo. Um ciclo cardíaco se inicia quando um potencial de ação é gerado no nodo
sinoatrial (SA). O potencial de ação corresponde a oscilação do potencial de membrana
da célula, onde há inversão da polaridade da membrana (despolarização) e retorno à
linha de base (repolarização) devido a passagem seletiva de íons Na+, K+, Ca+2 pela
membrana (Farraj et al, 2011).
A partir do nodo SA o impulso nervoso se propaga através dos feixes intermodais
até as fibras musculares atriais, promovendo a contração dos átrios. Em seguida, o
impulso atinge o nodo atrioventricular (AV), a condução nesta região é mais lenta, o
que permite que o sangue chegue aos ventrículos antes que eles entrem em sístole. Do
nodo AV o impulso atinge o feixe de His, desce por seus ramos até as fibras de
purkinje, e se estende a todas as fibras ventriculares, ocasionando a contração
ventricular (Feldman e Goldwasser, 2004).
Todas essas fases do ciclo cardíaco podem ser registradas no ECG (Figura 1). A
onda P corresponde a despolarização dos átrios. O complexo QRS corresponde a
despolarização ventricular. A onda de repolarização atrial é encoberta pelo complexo
QRS, e não pode ser visualizada no ECG. A onda T representa a repolarização
ventricular. Entre o complexo QRS e a onda T observa-se o segmento isoelétrico ST.
Este pode sofrer supradesnivelamento ou infradesnivelamento em casos de infarto
agudo do miocárdio, característica que será abordada com mais detalhes a seguir.
21
Figura 1: Elementos do eletrocardiograma normal. Onda P, despolarização atrial; Complexo
QRS, despolarização ventricular; Segmento ST, intervalo entre o final da despolarização e o
início da repolarização ventricular; Onda T, repolarização ventricular.
Fonte: (http://www.research.chop.edu)
1.2.1 Alterações do Eletrocardiograma no infarto do miocárdio
No ECG, as alterações após a isquemia do miocárdio ocorrem principalmente no
segmento ST e na onda T. Em isquemias agudas, onde há bloqueio total de um ou mais
ramos das coronárias, ocorre aumento da amplitude da onda T, seguida de supradesnível
de ST, e desaparecimento da onda S do complexo QRS (Figura 2) Birnbaum et al,
2003). O supradesnível de ST em duas derivações contíguas determina o diagnóstico do
infarto do miocárdio (Zimetbaum et al, 2003). As alterações no ST e onda T
representam a fase mais aguda do IAM e duram apenas algumas horas ou no máximo 2
a 3 dias (Mansur et al, 2005), após esse período o segmento ST volta ao ponto
isoelétrico do ECG e a onda T pode ou não se tornar invertida. No final do processo
isquêmico, quando ocorre necrose total das células em risco, a área afetada se torna
eletricamente inativa e ondas Q patológicas (Figura 2) são observadas no ECG (Bueno
et al, 2011).
22
Figura 2: Sequência de Alterações do ECG no IAM: 1. Aumento da amplitude da onda T; 2.
Elevação do segmento ST; 3. Elevação do segmento ST e desaparecimento da onda S; 4. ST
começa a retornar ao ponto isoelétrico e onda T invertida; 5. ST normal e onda T invertida; e 6.
Onda Q patológica. Fonte: (http://www.nottingham.ac.uk)
A depressão de ST também é uma característica de isquemia do miocárdio,
geralmente ocorre em situações onde há bloqueio parcial do fluxo coronário. Nestes
casos, além do infradesnivelamento de ST também pode ocorrer depressão da onda T,
ou mesmo não haver nenhuma alteração de repolarização. Em todas essas condições, é
observável aumento nos níveis séricos de marcadores de necrose (National
Clinical Guideline Centre UK, 2010).
O quadro 1 lista os critérios determinados pelos Comitês da Sociedade de
Cardiologia Européia e do Colégio Americano de Cardiologia (The Joint European
Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee) para o diagnóstico
da isquemia aguda do miocárdio que pode ou não levar ao infarto (Thygesen et al
2007).
O ECG também permite determinar a topografia do infarto. Existe uma grande
correlação entre a presença de alterações em determinadas derivações e o local do
infarto. Por exemplo, infartos anteriores relacionam-se a alterações nas derivações
precordiais (V1-V6), enquanto infartos inferiores promovem alterações nas derivações
bipolares DII, DIII e aVR (Resende et al, 2011). Quando há oclusão do ramo distal da
coronária esquerda também pode ocorrer elevação de ST em DII (Alzand et al, 2011).
23
Quadro 1: Critérios para o diagnóstico de isquemia aguda do miocárdio.
Manifestações
Características
Elevação de ST
≥ 0.2 mV homem em V2-V3
≥ 0.15 mV mulher em V2-V3
≥0.1 mV outras derivações
Depressão de ST e alterações na
onda T
Depressão de ST ≥ 0.05 mV
Inversão de da onda T ≥ 0.1 mV e
razão entre onda R e S (R/S) > 1.
Fonte: Adaptado de Thygesen et al 2007
Além do diagnóstico do IAM a elevação do segmento ST também pode ser
utilizada para estimar a área do infarto. Para isso foram desenvolvidos modelos
matemáticos que permitem quantificar as alterações eletrocardiográficas e relacioná-las
ao tamanho da área lesada. Dentre eles podemos citar o escore de Aldrich, que se trata
de uma equação matemática que leva em consideração o número de derivações com
supradesnivelamento de ST e a amplitude do ST de cada uma delas (Aldrich et al,
1988). O escore de Aldrich é o mais utilizado, no entanto ele possui algumas limitações
e tem baixa correlação com outros marcadores de necrose. Recentemente, foi
desenvolvido um escore que leva em consideração a área sob a curva do segmento STT, que inclui na análise a onda T. Este apresentou maior correlação com a troponina T
(marcador bioquímico de necrose), que o escore de Aldrich (Resende et al, 2011).
Em estudos pré-clínicos, a elevação do ST pode ser utilizada para validar a
ligadura correta da artéria coronária e para predizer a severidade do infarto em modelos
animais de infarto do miocárdio (Preda e Burlacu et al 2010). A atenuação da elevação
do segmento ST é um marcador de pré-condicionamento isquêmico (Cohen et al, 1997)
e portanto, um marcador de proteção cardíaca. Experimentalmente, a atenuação do ST
tem sido utilizada como critério para avaliar o efeito de fármacos e do condicionamento
isquêmico na isquemia cardíaca.
24
1.3
ALDOSTERONA E SEUS EFEITOS DELETÉRIOS SOBRE O SISTEMA
CARDIOVASCULAR
Aldosterona é um hormônio mineralocorticoide e um dos efetores finais do sistema
renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), sistema hormonal que desempenha papel
fundamental no controle da pressão arterial (PA). Em resposta a diminuição do volume
intravascular e/ou redução de sódio da mácula densa, o rim secreta renina que é
produzida nas células justaglomerulares da arteríola aferente dos rins. A renina hidrolisa
o angiotensinogênio em angiotensina I e no pulmão, esta é convertida em angiotensina
II pela enzima conversora de angiotensina (ECA). A angiotensina II por sua vez, atua
nas células musculares lisas causando vasoconstrição, e nas glândulas adrenais
estimulando a produção de aldosterona (Connel e Davies, 2005).
A aldosterona regula a homeostase de água e eletrólitos nos rins, promovendo
reabsorção de sódio e excreção de potássio nas células epiteliais do néfron distal, do
cólon e glândulas sudoríparas (Maron et al, 2010). A retenção de sódio causada pela
ação da aldosterona promove aumento do volume sanguíneo e, consequentemente,
aumento da PA.
A aldosterona é sintetizada a partir do colesterol nas células glomerulosas do
córtex das glândulas adrenais por uma série de reações enzimáticas, catalisadas por
desidrogenases e oxidases de função mista pertencentes, em sua maioria, à superfamília
do citocromo P450 (Connel e Davies, 2005). Os principais reguladores da biossíntese da
aldosterona são angiotensina II, concentrações extracelulares de potássio e o hormônio
adrenocorticotrófico (ACTH) (Muller, et al 1987; Quinn e Williams, 1988). A síntese
de aldosterona também ocorre em tecidos como coração, cérebro, rins e vasos (Takeda
et al., 1995; Silvestre et al., 1998). A adrenal, no entanto, é a maior fonte da aldosterona
circulante (Connel e Davies, 2005).
A ação da aldosterona sobre as células epiteliais do néfron é mediada por um
receptor localizado no citoplasma (perinuclear) na sua forma inativa denominado
receptor mineralocorticoide (MR). A aldosterona é lipossolúvel e, portanto atravessa
facilmente as membranas celulares. No citoplasma a aldosterona se liga ao MR, e o
complexo receptor-hormônio se transloca para o núcleo e ativa a transcrição de
proteínas específicas envolvidas no transporte de sódio e potássio (Funder et al, 1997).
25
O MR pertence a um subgrupo de receptores esteroides do qual também fazem
parte os receptores glicocorticoides, androgênicos e progestagênicos. Estes receptores
fazem parte de uma superfamília de receptores nucleares ativados por ligante (Fuller et
al, 1991). Receptores MR são os únicos entre os receptores nucleares que possuem dois
ligantes fisiológicos, aldosterona e glicocorticoides – cortisol em humanos ou
corticosterona em roedores (Funder et al 2010). Ambos se ligam com similar afinidade
ao MR. Nas células epiteliais, a enzima 11β-desidrogenase tipo 2 (11β-HSD2) cliva os
glicocorticoides
em
metabólitos
inativos
cortisona
e
11-deoxicorticosterona,
respectivamente, facilitando o acesso da aldosterona ao MR (Gualupo et al, 2012).
A aldosterona também possui efeitos que são independentes dos receptores MR,
são denominados, efeitos não-genômicos da aldosterona. Esses efeitos seriam mediados
por um receptor de membrana, ainda não conhecido, que ativaria vias de transdução de
sinais levando ao aumento de cálcio intracelular, diacilglicerol (DAG), trifosfato de
inositol (IP3), AMPc e ativação da proteína cinase C (PKC) (Chun et al, 2006). Os
mecanismos da ação não-genômica da aldosterona bem como o seu significado
fisiológico e patofisiológico ainda não foram completamente elucidados.
Além dos efeitos fisiológicos sobre as células epiteliais no néfron, a aldosterona
possui um papel importante na fisiopatologia de doenças cardiovasculares. Estudos têm
demonstrado a importância da ativação de receptores MR no desenvolvimento e
progressão da insuficiência cardíaca (IC), principalmente sobre a remodelação
ventricular e fibrose após o infarto do miocárdio.
No sistema cardiovascular os receptores MR da aldosterona são expressos no
endotélio, músculo liso vascular, cardiomiócitos e fibroblastos (Galuppo et al, 2012).
Os níveis circulantes de aldosterona, bem como a sua biossíntese estão aumentados em
situações patológicas como o IM e a IC (Francarrolo et al, 2003; Guder et al, 2007;
Mizuno et al, 2001). Os níveis de expressão dos receptores MR também são elevados na
IC (Messaoudi et al, 2012).
Níveis elevados de aldosterona estão associados à hipertrofia cardíaca e fibrose, e
esses efeitos são independentes da PA e dos níveis de potássio (Weber et al, 1991;
Wilke et al, 1996). Além disso, a aldosterona estimula a agregação de plaquetas e causa
disfunção endotelial (Rocha et al, 2001). A ativação inapropriada de receptores MR
causa disfunção endotelial e prejudica a reatividade vascular, em parte por prejudicar a
capacidade antioxidante vascular aumentando o estresse oxidativo, e também por limitar
a biodisponibilidade de óxido nítrico (Leopold et al, 2007; Favre et al. De 2011). A
26
aldosterona aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, aumentando a
atividade e a expressão da NADPH oxidase no endotélio vascular e nos miócitos
cardíacos (Rude et al, 2005; Iglarz et al, 2005).
Níveis elevados de aldosterona também estão associados a incidência de arritmias
ventriculares e atriais (Wei et al, 2010). Pacientes com hiperaldosteronismo primário
apresentam maior risco de desenvolver arritmias cardíacas graves e fibrilação atrial.
(Catena et al, 2008) A superexpressão de receptores MR no coração de camundongos
causou arritmias ventriculares severas (Ouvrard-Pascaud et al, 2005).
Estudos recentes em camundongos com deleção genética para receptores MR
demonstraram que a ausência desses receptores melhora o remodelamento cardíaco pósinfarto do miocárdio protegendo contra complicações crônicas, como remodelamento da
matriz extracelular, hipertrofia dos miócitos e dilatação do ventrículo, em parte por
prevenir a expressão de genes associados à hipertrofia e fibrose (Fraccarollo et al, 2011;
Frantz et al, 2009).
Devido aos efeitos deletérios da ativação dos receptores MR no coração o bloqueio
farmacológico desses receptores é uma alternativa terapêutica importante no tratamento
de pacientes pós-infarto do miocárdio e com IC crônica. Estudos clínicos vêm
demonstrando que antagonistas de MR reduzem a mortalidade e a morbidade de
pacientes com IC sistólica crônica e disfunção do ventrículo esquerdo (Pitt et al, 1999;
Pitt et al, 2003; Zannad et al, 2010).
1.4
ANTAGONISTAS DOS RECEPTORES MR DA ALDOSTERONA
Os
principais
antagonistas
farmacológicos
de
MR
disponíveis
são
a
espironolactona e a eplerenona. As características farmacocinéticas destes dois fármacos
estão resumidas na Tabela 1.
A espironolactona (Figura 3), princípio ativo do medicamento Aldactone©, é um
antagonista competitivo não seletivo do receptor MR da aldosterona. Possui estrutura
química de C24H3204S e peso molecular igual a 416,57g. É praticamente insolúvel em
água e solúvel em benzeno, clorofórmio, acetato de etila e etanol absoluto. Sua fórmula
é muito similar a da progesterona e por isso também possui moderada atividade
antiandrogênica e progestogênica (Delyane et al, 2000). No fígado, é rapidamente
27
metabolizada em metabólitos ativos. Os principais deles são canrenoato de potássio e a
canrenona, (Karim et al., 1976).
Figura 3: Estrutura química da espironolactona.
Fonte: Kolkhof et al, 2011.
A eplerenona, princípio ativo do medicamento Inspra©, é um antagonista seletivo
para os receptores MR. Sua fórmula foi derivada da espironolactona, através da
introdução de uma ponte 9α, 11α-epoxi e pela substituição do grupo 17α-tioacetil por
um grupo carbometoxi (Delyane et al, 2000). Estas características lhe confere maior
seletividade ao receptor MR. Possui fórmula química de C24H30O6 e peso molecular
igual a 414,5 g. É insolúvel em água e solúvel em dimetilsulfóxido e não possui
metabólitos ativos. (Figura 4).
Figura 4: Estrutura química da eplerenona
Fonte: Kolkhof et al, 2011.
28
Tabela 1. Propriedades farmacocinéticas e usos clínicos da espironolactona e eplerenona.
Espironolactona
Eplerenona
73% (aumenta com a
comida)
90% ligado a proteínas
69%
Propriedades farmacocinéticas
Absorção
Distribuição
Metabolismo
Meia-vida
50% ligado a proteínas
Fígado e rins (metabólitos
ativos)
Fígado
1.3-1.4h
Metabólitos: 13.8-22h
4-6h
50-100mg/dia
50mg (2vezes ao dia)
25mg-50mg/dia
25mg-50mg/dia
Uso clínico
Hipertensão
Insuficiência cardíaca
Fonte: Nappi e Sieng, 2011.
A eplerenona possui baixa afinidade por receptores esteroides. In vitro sua
afinidade é cerca de 20 vezes menor que a espironolactona para receptores MR
(Struthers et al, 2008), no entanto, por possuir maior seletividade por receptores MR,
possui bioatividade semelhante a espironolactona in vivo. A dose de eplerenona
necessária para inibir a ligação da aldosterona ao receptor MR in vivo, é cerca da
metade da dose necessária para a espironolactona (de Gasparo et al, 1987).
Além disso, a eplerenona não apresenta efeitos colaterais tão intensos quanto a
espironolactona. Devido a sua ação antiandrogênica e progestogênica, a espironolactona
pode causar ginecomastia, impotência e ciclos menstruais anormais (Delyane et al,
2000). O índice de ginecomastia em pacientes tratados com espironolactona é
aproximadamente 9% (Pitt et al, 1999), enquanto que para a eplerenona o índice é em
torno de 0,5%. (Pitt et al, 2003).
Outro efeito colateral causado por ambos os antagonistas de MR é a
hipercalemia, definida como o aumento sérico de potássio acima de 6 nmoL/L (Pitt et
al, 2006). A hipercalemia aumenta o risco de incidência de arritmias cardíacas graves,
pois os níveis elevados de potássio alteram a função eletrofisiológica dos miócitos, por
afetar a geração e a propagação do impulso nervoso ( Almukdad, 2007). Tanto a
espironolactona quanto a eplerenona podem aumentar os níveis séricos de potássio, de
uma forma dose-dependente (Sica et al, 2005). No entanto, quando os pacientes
29
recebem doses adequadas do medicamento e são devidamente monitorados, os efeitos
colaterais são minimizados.
Quanto ao bloqueio da ação do receptor MR, os dois antagonistas possuem
eficiência similar (Chatterjee et al, 2012). A espironolactona e a eplerenona exercem seus
efeitos benéficos sobre o coração prevenindo o remodelamento e a fibrose, melhorando os
parâmetros hemodinâmicos e a resposta inflamatória.
Estudos clínicos têm demonstrando que ambos os antagonistas de MR são eficazes no
tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca pós-infarto do miocárdio. Em dois grandes
estudos clínicos - RALES (The Randomized Aldactone Evaluation Study) e EPHESUS
(Eplerenone Post-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and Survival
Study) a espironolactona e a eplerenona reduziram a morbidade e a mortalidade de pacientes
com IC sistólica crônica e disfunção ventricular esquerda pós-infarto do miocárdio,
respectivamente (Pitt et al., 1999; Pitt et al., 2003). Recentemente, foi demonstrado que a
eplerenona também tem efeitos benéficos no tratamento de pacientes com IC leve
(Zannad et al, 2010).
Estudos pré-clínicos demonstram que o tratamento de longo prazo com
eplerenona promove melhoria da função ventricular bem como melhoria da função
vascular em ratos cronicamente infartados, em parte por modular efeitos antiinflamatórios. (Fraccarollo et al., 2003; Fraccarollo et al., 2008). O bloqueio de MR por
eplerenona também preveniu o estresse oxidativo e melhorou a disfunção endotelial
numa fase inicial pós-infarto do miocárdio em ratos que apresentavam níveis elevados
de aldosterona no sangue (Sartório et al, 2007).
A espironolactona também apresentou efeitos positivos no IM de ratos,
prevenindo o remodelamento cardíaco e a apoptose celular e inibindo o aumento da
expressão de receptores MR e da enzima 11β-HDS2 (Takeda et al, 2007). Em ratos
cronicamente infartados, a espironolactona melhorou a função sistólica e diastólica do
ventrículo esquerdo, reduziu a fibrose e os níveis de noradrenalina no tecido cardíaco
(Cittadini et al, 2003). A espironolactona também é capaz de bloquear a síntese de
colágeno ativada pela aldosterona (Brilla et al, 2000).
Embora todos esses estudos tenham descrito as propriedades cardioprotetoras de
antagonistas de MR sobre os danos cardíacos causados pelo IM, sobretudo limitando os
efeitos deletérios da aldosterona, existem evidências de que a cardioproteção promovida
por antagonistas de MR pode ser em parte, independente do bloqueio da ação da
aldosterona.
30
1.4.1 Efeitos cardioprotetores dos antagonistas de MR independentes da
aldosterona
Nos estudos clínicos RALES e EPHESUS foi observado que uso de
bloqueadores de MR em pacientes com IC teve efeitos benéficos mesmo entre aqueles
que apresentavam níveis normais de aldosterona circulante, evidenciando que a ação
cardioprotetora desses fármacos ocorre na ausência de níveis anormais deste hormônio
mineralocorticoide (Pitt et al., 1999; Pitt et al., 2003).
Mihailidou e colaboradores (2009) utilizando modelo de isquemia e reperfusão
revelou que baixas doses de espironolactona reduziram a área infartada e a apoptose
celular no coração de ratos perfundidos com aldosterona ou cortisol. No entanto, a
espironolactona quando perfundida sozinha foi capaz de reduzir significativamente a
área necrosada e este efeito protetor persistiu em ratos adrenalectomizados . Este estudo
fornece evidências claras de que o mecanismo protetor da espironolactona não é
dependente da presença de aldosterona endógena.
Os mecanismos envolvidos nessa ação de antagonistas de MR ainda não são
conhecidos. Além disso, não existem estudos que avaliem comparativamente a
espironolactona e a eplerenona. Os estudos EPHESUS e RALES não podem ser
comparados diretamente, pois foram realizados em populações distintas e em regimes
posológicos diferentes. Nenhum estudo, até momento, avaliou se a eplerenona, assim
como a espironolactona, possui ação cardioprotetora independente do bloqueio da ação
da aldosterona. Seria de grande relevância avaliar tais propriedades.
31
1.5
RECEPTORES GLICOCORTICOIDES
Outro ponto importante a ser investigado é interação de antagonistas de MR com
receptores glicocorticóides (GR). A espironolactona possui afinidade por receptores
GR, o que resulta numa atividade agonista ou antagonista sobre os glicocorticóides.
(Couette et al, 1992).
Glicocorticóides vêm sendo apontados como cardioprotetores em modelos de
isquemia em ratos e em humanos. No sistema cardiovascular, receptores GR são
expressos, na parede dos vasos sanguíneos e no miocárdio (Walker, 2007). O efeito
benéfico dos glicocorticóides tem sido atribuído principalmente à sua capacidade em
limitar a resposta inflamatória aguda associada ao IAM (Tokudome et al, 2009).
Os receptores GR são receptores citosólicos, ativados por ligante, e pertencem a
mesma família de receptores esteroides dos receptores mineralocorticoides da
aldosterona. Esses dois tipos de receptores possuem alta homologia e são co-expressos
de uma forma muito íntima nas células dos seus tecidos alvos, como células epiteliais,
neurônios e cardiomiócitos (Farman et al, 2001). Além disso, compartilham ligantes
comuns. O cortisol (ou corticosterona, em roedores) é o ligante endógeno de
receptores GR, mas também pode se ligar, com afinidade similar, aos receptores MR.
Na ausência da enzima 11β-HSD2, (enzima que cliva os glicocorticoides em formas
inativas) e em situações onde há alteração do estado redox celular, glicocorticoides
podem ativar receptores MR e mediar efeitos pró-inflamatórios em resposta ao infarto
do miocárdio (Funder et al, 2005; Mihailidou et al, 2009). Nos cardiomiócitos a
enzima 11β-HSD2 é expressa em baixíssimas concentrações.
Independentemente da redundância funcional com receptores mineralocorticoides,
estudos têm demonstrado que ativação de receptores GR no coração protege contra os
danos causados pelo infarto do miocárdio. Glicocorticoides atenuam as interações
celulares entre leucócitos e células endoteliais e reduzem a produção e libertação de
citocinas e mediadores inflamatórios (Cronstein et al, 1992; Radomski et al, 1990).
Além de seus efeitos genômicos, estudos têm demonstrado efeitos não genômicos de
glicocorticoides e estes estão associados a sua ação cardioprotetora (Pitzales et al,
2002), como por exemplo, o aumento da atividade da enzima óxido nítrico sintase
endotelial (Hafezi-Moghadan et al, 2002). Além disso, foi demonstrado que a
dexametasona, um potente agonista de receptores GR, protegeu contra morte celular
32
causada pela isquemia e reperfusão em camundongos, por promover ativação da
enzima prostaglandina D sintase tipo lipocalina (PGDS-L), responsável pela síntese da
prostaglandina D2 (PGD2) (Tokudome et al, 2009). Um estudo recente demonstrou
que ativação de receptores GR protege contra a isquemia cardíaca por ativar a
expressão de BcL-xL (Xu et al, 2011). Clinicamente, a administração de
glicocorticoides reduziu as taxas de mortalidade de pacientes, quando utilizado nos
primeiros dias após o infarto do miocárdio (Guigliano et al, 2003).
Apesar do papel de receptores GR na função cardíaca ser controversa,
glicocorticoides são geralmente considerados hormônios cardioprotetores.
Além
disso, os efeitos deletérios descritos para o cortisol são mediados por receptores MR,
enquanto a ativação de receptores GR parece estar relacionada a uma ação
cardioprotetora.
Assim, a hipótese de que os efeitos cardioprotetores da espironolactona possam
ser mediados por receptores GR explicaria, pelo menos em parte, porque a
espironolactona protege contra os danos da isquemia cardíaca, mesmo na ausência da
aldosterona.
Devido a todas essas evidências de que a ação dos antagonistas de MR no coração
ocorre independentemente do bloqueio da ação da aldosterona. E devido as escassez de
estudos que avaliem tais propriedades. A proposta do nosso estudo foi avaliar de uma
forma comparativa o efeito da espironolactona e eplerenona numa fase aguda da
isquemia cardíaca e investigar uma possível interação dos efeitos da espironolactona
com a ativação de receptores GR. Para isso, avaliamos o efeito da espironolactona e
eplerenona no coração de ratos adrenalectomizados e não adrenalectomizados
submetidos à isquemia cardíaca.
33
OBJETIVOS
2. OBJETIVO GERAL
Comparar os efeitos agudos da espironolactona e da eplerenona sobre a isquemia
do miocárdio em ratos normais e adrenalectomizados.
2.1 Objetivos específicos
1. Avaliar o efeito da espironolactona e da eplerenona sobre a elevação do
segmento ST do eletrocardiograma em ratos normais e adrenalectomizados,
submetidos à ligadura de coronária.
2. Avaliar o efeito da espironolactona e da eplerenona sobre a necrose tecidual de
ratos normais e adrenalectomizados, submetidos à ligadura de coronária.
3. Avaliar o efeito da espironolactona sobre a elevação do segmento ST do
eletrocardiograma de ratos normais e adrenalectomizados, submetidos à ligadura
de coronária, na presença do antagonista de receptor glicocorticoide (GR),
mifepristona.
4. Avaliar a ação da espironolactona sobre a necrose tecidual em ratos normais e
adrenalectomizados, submetidos à ligadura de coronária, na presença do
antagonista de receptor glicocorticoide (GR), mifepristona.
35
MATERIAIS E MÉTODOS
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
Este projeto foi submetido à aprovação pelo Comitê de Ética de Uso Animal da
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). (Protocolo nº 2011/88). Os animais foram
tratados de acordo com as diretrizes do National Institute of Health, que dispõe sobre o
cuidado, manipulação e utilização de animais na pesquisa.
Os
experimentos
foram
realizados
no
Laboratório
de
Farmacologia
Experimental, Centro de Ciências Farmacêuticas (CiPharma) e no Laboratório de
Hipertensão, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP.
3.1 Animais
Foram utilizados 160 ratos Wistar machos (200 a 250 g) provenientes do
Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram mantidos em
caixas de polipropileno com livre acesso a ração e água, em ambiente com ciclos claro e
escuro de 12 horas.
3.2 Fármacos e Tratamento
Os fármacos Espironolactona, Eplerenona e Mifepristona foram obtidos da
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). As doses utilizadas foram definidas baseado em
estudos prévios descritos na literatura, sendo para Espironolactona 20mg/kg (Silvestre
et al, 1999); Eplerenona 10mg/kg (Kobayashi et al, 2006) e Mifepristona 20mg/kg
(Bobryshev et al, 2009). As soluções estoques de espironolactona e mifepristona foram
preparadas com etanol e eplerenona com dimetilsulfóxido.
As soluções dos fármacos e soluções controle foram administradas por via oral
(gavagem) em dose única 30 minutos antes da indução da anestesia e 1 hora antes da
ligadura da coronária. No Quadro 1 e a Figura 5 estão listados os grupos experimentais.
Os animais foram divididos em dois grandes grupos, em um deles os animais tiveram as
glândulas adrenais removidas - adrenalectomia bilateral e o outro não.
37
Quadro 1: Divisão dos grupos experimentais.
1. Glândulas Adrenais intactas
2. Adrenalectomizados
1.1 Controle: cirurgia fictícia
2.1 Controle: cirurgia fictícia
1.2 Sem tratamento (IAM)
2.2 Sem tratamento (IAM)
1.3 Espironolactona
2.3 Espironolactona
1.4 Eplerenona
2.4 Eplerenona
1.5 Mifepristona
2.5 Mifepristona
1.6 Mifepristona + Espironolactona
2.6 Mifepristona + Espironolactona
38
Figura 5: Fluxograma indicando os grupos experimentais. Os animais do grupo à esquerda
foram submetidos à adrenalectomia bilateral para remoção das glândulas adrenais.
39
3.3 Procedimentos cirúrgicos
Os ratos foram anestesiados com uma mistura de ketamina (75 mg/kg) e xilazina
(10 mg/kg) via intraperitonial (i.p), traqueostomizados, e conectados a um respirador
para pequenos roedores (SAR-840, USA) para permitir ventilação artificial com ar
ambiente (volume de 1,5-2,5 ml/ciclo e freqüência de 45-50 ciclos/min).
A artéria e veia femoral foram cateterizadas com cânulas confeccionadas a partir
da conexão de 15 cm de polietileno PE50 a 4 cm de polietileno PE10, preenchida com
solução fisiológica (NaCl 0,9%) e heparina (100U.I/ 0,1mL), para obtenção do sinal da
pressão arterial (PA) e administração de fármacos, respectivamente. Brometo de
pancurônio (1mg/kg),via intravenosa (i.v.), foi utilizado como relaxante muscular para
auxiliar na ventilação mecânica.
Após esses procedimentos, agulhas hipodérmicas foram posicionadas para
obtenção do eletrocardiograma (ECG) na derivação periférica DII. Durante e após o
procedimento de ligadura da coronária o ECG foi continuamente registrado.
O método utilizado na indução da isquemia foi a ligadura da coronária esquerda
descendente, adaptado do descrito por SELYE et al, 1960 e FISHBEIN et al., 1978. Foi
realizada toracotomia esquerda entre o quarto e quinto espaços intercostais, o coração
foi exposto e removido da cavidade torácica para permitir o acesso à artéria coronária
descendente esquerda. Um fio de sutura foi passado ao redor da artéria e amarrado,
causando a oclusão do vaso. O grupo cirurgia fictícia foi submetido ao mesmo
procedimento, porém sem proceder a ligadura. Foram considerados os animais que
apresentaram elevação do segmento ST e aumento da amplitude da onda T do ECG. Ao
final de 1 hora após a ligadura, os animais foram eutanasiados e o coração removido
para posterior análise histológica. O protocolo experimental está esquematizado na
figura 6.
40
A
A
B
C
Figura 6: Protocolo experimental. Os animais foram mantidos em anestesia e ventilação
mecânica durante todo o procedimento experimental. A) Grupo tratado com espironolactona
20mg/kg B) Grupos tratado com eplerenona 10mg/kg, C) Grupos tratado com mifepristona
20mg/kg (um grupo foi tratado apenas com mifepristona e outro com Mifepristona e
espironolactona). Os animais adrenalectomizados foram submetidos aos mesmos protocolos
experimentais descritos em A, B e C. A cirurgia de adrenalectomia foi realizada 48h antes.
41
3.4 Adrenalectomia bilateral
Um dos grupos experimentais foi submetido à adrenalectomia bilateral. Os
animais foram anestesiados com ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) i.p. Após
tricotomia na região lombar, foi realizada incisão longitudinal da pele e músculo,
obtendo-se uma abertura de aproximadamente dois (2) centímetros. A glândula adrenal,
que se encontra inserida na gordura perirenal próxima ao pólo cranial do rim, foi então
retirada. Em seguida, os planos incisados foram suturados. Após o procedimento os
animais foram colocados em caixas em decúbito ventral com acesso livre a ração e água
contendo NaCl 0,9%. As caixas foram colocadas em elevação na porção cranial do
corpo dos animais em relação à porção caudal. Após a cirurgia, os animais foram
tratados com um anti-inflamatório e analgésico, Banamine® (princípio ativo flunixina),
na dose 1mg/kg/dia (Intervet/ Matercorp, Rio de Janeiro, RJ). Após um período de
recuperação de 48 horas, os animais foram submetidos ao protocolo experimental
descrito na figura 6. Ao final do experimento, amostras de sangue foram coletadas para
dosagem dos níveis séricos de aldosterona.
3.5 Dosagem da aldosterona sérica
Amostras de sangue foram coletadas da aorta abdominal e centrifugadas em
1500g durante 15 minutos. Após a centrifugação o soro (sobrenadante) foi pipetado em
alíquotas de aproximadamente 1 ml e congelado. As amostras de soro foram
encaminhadas a um laboratório de análises clínicas onde foi feita a dosagem da
aldosterona por um teste radioimunológico.
42
3.6 Análise do Eletrocardiograma e Pressão Arterial
Para a obtenção dos sinais do ECG e PA foi utilizado um sistema de
condicionadores de sinais, desenvolvido no Departamento de Engenharia Elétrica da
Universidade Federal de Minas Gerais. Os sinais obtidos desse sistema foram
amostrados em tempo real a uma freqüência de 1200 Hz por uma placa conversora
analógico-digital de 12 bits de resolução (Daqboard 2000, USA). Foram registradas as
derivações bipolares DI, DII e DIII. Para a análise da PA sistólica (PAS), diastólica
(PAD) e freqüência cardíaca (FC) foram extraídos segmentos de 2 segundos nos
tempos: antes da ligadura (controle), 1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30, 35, 40, 45, 50, 55 e 60
minutos após a ligadura.
3.6.1 Determinação da área sob a curva do ST-T
A partir do sinal do ECG foi obtido ainda o parâmetro da área sob a curva ST-T,
como descrito por Mansur et al, 2006. No sinal da derivação II, uma linha horizontal
(vermelha) foi traçada entre o início da inclinação da onda S e o final da onda T, quando
esta atinge o ponto isoelétrico (Figura 7). Para essa análise foi utilizado o programa
Analyzer 7.0/ Hemolab Data Acquisition software 14.2, desenvolvido pelo Prof. Harald
Stauss da Universidade de Iowa (http://www.harald.nxserve.net/HemoLab/HemoLab.html).
43
Figura 7: Área sob a curva do segmento ST-T do ECG. Exemplo da seleção da área para o
cálculo por planimetria. A) ECG antes da ligadura; B) ECG após a ligadura.
44
3.7 Análise histológica
Ao término dos experimentos os animais foram eutanasiados e submetidos a
necropsia para a coleta do coração. Os órgãos foram fixados em solução de formol 10%
tamponado e acondicionados em recipiente protegido da luz. Para a preparação das
lâminas, os ventrículos foram separados e seccionados em três cortes transversais e
colocados em cassetes devidamente identificados. O tecido foi desidratado com álcool
em concentrações crescentes, diafanizados com xilol, embebidos e emblocados em
parafina. Secções parafinadas de aproximadamente quatro (4) micrômetros de espessura
foram obtidas em micrótomo, fixadas em lâminas de vidro e coradas pela técnica de
Hematoxilina e Eosina (HE).
3.8 Análise estatística
Os dados foram submetidos a um teste de normalidade Kolmogorov Smirnov.
Para as análises dos parâmetros do ECG, PA e FC a comparação entre os grupos foi
feita utilizando-se Two-way ANOVA seguido do pós-teste Bonferroni. Para as análises
histológicas foi utilizado One-way ANOVA seguido do pós-teste de Tukey. As análises
estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism Project (versão 5.0). Foram
consideradas diferenças significativas para p < 0.05.
45
RESULTADOS
4.
RESULTADOS
4.1 Taxa de mortalidade
Neste estudo foram utilizados 160 animais, sendo que 41 (25,6%) deles vieram a
óbito em menos de 1 h após a oclusão da coronária esquerda. A mortalidade por grupo
está apresentada na tabela 2 e na figura 8. O grupo tratado com espironolactona
20mg/kg apresentou uma taxa de mortalidade menor em relação ao grupo ligadura sem
tratamento.
Tabela 2: Mortalidade por grupo experimental
Grupos experimentais
Valor absoluto
%
(nº animais mortos/ total)
Controle (cirurgia fictícia)
0/6
0%
Ligadura sem tratamento
11/36
30,55%
Espironolactona 20mg/kg
1/12
8,3%
Eplerenona 10mg/kg
3/9
33,33%
Mifepristona 20mg/kg
2/13
15,38%
Mifepristona + Espiroronolactona
1/9
11,11%
Ligadura sem tratamento
9/24
37,5%
Espironolactona 20mg/kg
2/14
14,28%
Eplerenona 10mg/kg
4/10
40%
Mifepristona 20mg/kg
7/19
36,84%
Mifepristona + Espironolactona
1/8
12,5%
ADRENALECTOMIA
47
Taxa de mortalidade%
50
n=10
†=4
n=24
†=9
40
n=9
†=3
n=36
†=11
Ligadura sem tratamento
Espironolactona 20mg/kg
Eplerenona 10mg/kg
Mifepristona 20mg/kg
Mifepristona + Espironolactona
n=19
†=7
30
20
10
n=13
†=2
n=9
†=1
n=12
†=1
n=14
†=2
n=8
†=1
0
Normais
Adrenalectomia
Figura 8: Gráfico representativo da taxa de mortalidade por grupo experimental.
Percentual entre o número total de animais e o número de animais que foram a óbito antes de 1h
após a isquemia.
4.2 Avaliação da pressão arterial e da frequência cardíaca
Os valores absolutos de PAS, PAD e FC estão representados nas figuras 9 e10.
A ligadura da coronária promoveu uma redução da PAS e da PAD, em relação
ao tempo zero (antes da ligadura), de aproximadamente 30 mmHg e 23 mmHg,
respectivamente. Os grupos tratados com os diferentes fármacos também apresentaram
redução da PA após a ligadura. Apenas o grupo ligadura sem tratamento apresentou
diferenças significativas entre os valores de PAS e PAD em relação ao grupo controle
(ligadura fictícia) (Figuras 9 e 11). Nenhum dos tratamentos alterou os valores basais
(antes da ligadura da coronária) de PAS e PAD. Nos animais submetidos à
adrenalectomia bilateral, todos os grupos submetidos à ligadura coronária apresentaram
valores menores de PAS e PAD em relação ao grupo controle (Figuras 9 e 10). A
adrenalectomia não alterou os valores basais destes parâmetros.
A FC também foi reduzida após a ligadura, em todos os grupos. O grupo
controle (ligadura fictícia) também apresentou redução da FC.
48
B
160
160
140
140
120
120
100
80
*
*
60
*
*
PAS (mmHg)
PAS (mmHg)
A
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
C
120
100
100
PAD (mmHg)
120
60
*
*
40
*
* *
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
50
55
60
*
*
*
20
60
80
*
*
*
40
C
PAD (mmHg)
*
80
60
40
80
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
*
*
60
*
*
*
*
40
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
20
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
20
C
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
350
350
300
300
FC (bpm)
FC (bpm)
100
250
200
150
C
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
C
1
5
10
15
20
40
45
50
55
60
250
200
150
100
100
C
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tempo (min)
Controle
Ligadura sem tratamento
25
30
35
Tempo (min)
Espironolactona 20mg/kg
Eplerenona 10mg/kg
Figura 9: Valores absolutos de PA e FC dos animais tratados com Espironolactona 20mg/kg e
Eplerenona 10mg/kg submetidos à ligadura de coronária. A) Animais normais (glândulas
adrenais intactas; B) Animais adrenalectomizados. Valores expressos em média ± e.p.m. Twoway ANOVA seguido do pós-teste Bonferroni. *= P<0,05 em relação ao grupo controle
(cirurgia fictícia). n=6
49
A
B
160
160
140
140
100
*
*
80
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
PAS (mmHg)
PAS (mmHg)
120
120
80
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
5
10
15
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
40
40
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* ** **
* *
*
*
*
40
45
50
*
*
20
C
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
120
C
1
*
*
20 25 30 35
Tempo (min)
55
60
*
*
120
105
75
*
*
*
60
*
*
*
(mmHg)
90
80
PAD
100
60
45
*
*
*
*
*
*
*
*
40
30
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
20
C
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
350
350
300
300
250
FC (bpm)
FC (bpm)
*
*
60
60
PAD (mmHg)
100
200
150
C
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
C
1
5
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
250
200
150
100
C
1
5
Controle
10
15
20 25 30 35
Tempo (min)
40
45
50
55
60
Ligadura sem tratamento
100
Mifepristona 20mg/kg
Mifepristona 20 mg/kg +
Espironolactona 20mg/kg
Figura 10: Valores absolutos de PA e FC dos animais tratados com Mifepristona 20mg/kg
submetidos à ligadura de coronária. A) Animais normais (glândulas adrenais intactas; B)
Animais adrenalectomizados. Valores expressos em média ± e.p.m. Two-way ANOVA seguido
do pós-teste Bonferroni. *= P<0,05 em relação ao grupo controle (cirurgia fictícia). N=6
50
4.3 Avaliação do eletrocardiograma
4.3.1 Alterações no ECG após a ligadura
O ECG foi registrado nas derivações DI, DII e DIII. Após a ligadura da
coronária uma série de alterações eletrocardiográficas foi observada. A alteração com
maior predominância foi o supradesnivelamento de ST e aumento da amplitude de T nas
derivações DI e DII. Foram observadas, ainda, inversão da onda T e do segmento ST,
ondas P anormais, bloqueio atrioventricular, fibrilação e bradicardia. O grupo ligadura
sem tratamento apresentou maior intensidade de alterações que os grupos tratados. A
figura 11 apresenta exemplos dessas alterações na derivação II do ECG.
Onda P
anormal
Figura 11: Exemplos de alterações eletrocardiográficas pós-ligadura. Derivação II.
51
4.3.2 Variação da área sob a curva ST-T
Para análise quantitativa do supradesnivelamento de ST foi utilizada o sinal do ECG
de DII. A figura 13 apresenta a variação percentual da área sob a curva ST-T durante
1 h após a ligadura. A ligadura da coronária promoveu supradesnivelamento de ST dos
animais sem tratamento. A espironolactona 20 mg/kg, administrada via oral 1 h antes da
ligadura, preveniu o supra de ST. A eplerenona 10 mg/kg também foi capaz de reduzir
essa alteração eletrocardiográfica. Um resultado semelhante foi observado nos animais
submetidos à adrenalectomia bilateral. (Figura 13).
Figura 12: Imagem representativa do registro dos ECGs 40 min após a ligadura da coronária.
A) Grupo controle (ligadura fictícia); B) Grupo ligadura sem tratamento; C) Grupo
espironolactona 20mg/kg D) Grupo eplerenona 10 mg/kg.
52
A
Controle
Ligadura sem tratamento
Espironolactona
Eplerenona
300
Variação percentual %
área sob a curva ST-T
200

150










250


100
50
*
0
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* * * *
* * * * * *
*
-50
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tempo (min)
B
Ligadura sem tratamento
Controle
Espironolactona
Eplerenona
300
Variação percentual
área sob a curva ST-T
250
200
150






*
*






100
50
*
*
*
*
*
*
*
0
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
-50
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tempo (min)
Figura 13: Variação da área sob a curva ST-T do ECG dos animais tratados com
Espironolactona e Eplerenona submetidos à ligadura de coronária. A) Animais normais
(glândulas adrenais intactas; B) Animais adrenalectomizados. Valores expressos em média ±
e.p.m. Two-way ANOVA seguido do pós-teste Bonferroni. *= P < 0.05, em relação ao grupo
ligadura sem tratamento; λ=P < 0.05, em relação ao grupo controle. n=6
53
O grupo tratado com o bloqueador de receptor GR (mifepristona 20mg/kg)
apresentarou redução da área sob a curva ST-T nos tempos 40, 45 e 50 minutos após a
ligadura. Nos animais adrenalectomizados não houve diferença significativa em relação
ao grupo ligadura sem tratamento. (Figura 14). No grupo tratado com mifepristona +
espironolactona houve redução da área sob a curva ST-T em relação ao grupo ligadura
sem tratamento. A mifepristona parece, portanto, não influenciar a ação da
espironolactona. (Figura 14).
54
A
Espironolactona
SHAM
Ligadura sem tratamento
Mifepristona
Mifepristona + Espironolactona
300



Variação percentual %
área sob a curva ST-T
250
200






150
*

100



*
*
50
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
-50
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tempo (min)
B
SHAM
Ligadura sem tratamento
Espironolactona
Mifepristona
Mifepristona + Espironolactona
300
Variação percentual %
área sob a curva ST-T
250
200
150












100
50
*
0
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
-50
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tempo (min)
Figura 14: Variação da área sob a curva ST-T do ECG dos animais tratados com Mifepristona
e Espironolactona submetidos à isquemia cardíaca. A) Animais normais (glândulas adrenais
intactas; B) Animais adrenalectomizados.Valores expressos em média ± e.p.m. Two-way
ANOVA seguido do pós-teste Bonferroni. *= P < 0.05, em relação ao grupo ligadura sem
tratamento; λ=P < 0.05, em relação ao grupo controle. n=6
55
4.4 Dosagem da aldosterona sérica
Com o objetivo de verificar se a adrenalectomia bilateral foi realizada corretamente
e se os animais apresentavam níveis insignificantes de aldosterona sérica foi realizada a
dosagem desse hormônio, apresentada na figura 15.
Aldosterona sérica
ng/dL
125
Normal
100
Ligadura sem tratamento
Espironolactona 20mg/kg
Eplerenona 10mg/kg
75
50
25
*
*
*
0
Figura 15: Dosagem sérica da aldosterona. . Valores expressos em média ± e.p.m. OneWay ANOVA seguido do pós-teste Dunn’s *= P < 0.05, em relação ao grupo normal
(adrenais intactas). n=4
56
4.5 Análise histológica
Foi observado nos cortes histológicos a presença de dilatação de vasos
sanguíneos, processo inflamatório intenso e necrose celular no tecido cardíaco dos
animais submetidos à ligadura de coronária (Figura 16 e 17). A necrose celular foi
avaliada qualitativamente de acordo com a sua intensidade em: ausente, leve, moderada
ou extensa. A Tabela 3 e 4 apresenta o grau de intensidade e o percentual de animais
que apresentaram necrose celular em cada grupo.
No grupo ligadura sem tratamento todos os corações analisados apresentaram
áreas de necrose variando entre leve e extensa. O tratamento com espironolactona e
eplerenona atenuou a intensidade da necrose causada pela ligadura e em alguns animais
não foi observada a presença de necrose. Um resultado semelhante foi observado nos
animais submetidos à adrenalectomia bilateral.
Tabela 3: Percentual de animais que apresentaram necrose cardíaca, classificados de
acordo com a intensidade da necrose.
Intensidade da necrose%
Ausente
Leve
Moderada
Extensa
Controle (n=6)
100,00
0,0
0,0
0,0
Ligadura (n=6)
0,0
66,66
16,66
16,66
Espironolactona (n=6)
16,66
66,66
16,66
0,0
Eplerenona (n=6)
16,66
66,66
16,66
0,0
Ligadura (n=5)
0,0
40,0
20,0
40,0
Espironolactona (n=5)
40,0
60,0
0,0
0,0
Eplerenona (n=6)
33,33
66,66
0,0
0,0
Adrenalectomia
57
A
B
C
D
E
F
Figura 16: Histologia do coração de animais submetidos a ligadura da coronária esquerda. (A)
Controle (ligadura fictícia); (B) Ligadura sem tratamento. (C) Espironolactona 20 mg/kg; (D)
Eplerenona 10 mg/kg; (E) Espironolactona 20mg/kg grupo adrenalectomizado; (F) Eplerenona
10mg/kg grupo adrenalectomizado . Coloração Hematoxilina-Eosina. (aumento 40X).
58
Os grupos tratados com mifepristona também apresentaram uma intensidade
menor do grau de necrose, quando esta era presente. O mesmo foi observado nos grupos
tratados com mifepristona + espironolactona (Tabela 4).
Tabela 4: Percentual de animais que apresentaram necrose cardíaca, classificados de
acordo com a intensidade da necrose.
Intensidade da necrose%
Ausente
Leve
Moderada
Extensa
Mifepristona (n=6)
16,66
83,33
0,0
0,0
Mifepristona + Espironolactona (n=6)
40,0
60,0
0,0
0,0
Mifepristona (n=6)
33,33
50,0
16,66
0,0
Mifepristona + Espironolactona (n=5)
50,0
50,0
0,0
0,0
Adrenalectomia
59
A
B
C
D
E
F
Figura 17: Histologia do coração de animais submetidos à ligadura da coronária esquerda. (A)
Controle (ligadura fictícia); (B) Ligadura sem tratamento. (C) Mifepristona 20 mg/kg; (D)
Mifepristona + Espironolactona 20 mg/kg; (E) Mifepristona 20mg/kg grupo adrenalectomizado;
(F) Mifepristona + Espironolactona 20mg/kg grupo adrenalectomizado. Coloração
Hematoxilina-Eosina. (aumento 40X).
60
DISCUSSÃO
5.
DISCUSSÃO
O principal resultado deste trabalho foi a demonstração de que baixas doses de
espironolactona e eplerenona promovem cardioproteção numa fase aguda da isquemia
cardíaca, mesmo na ausência dos esteróides endógenos, aldosterona e corticosterona.
Estudos prévios já haviam demonstrado a capacidade cardioprotetora desses dois
fármacos no infarto do miocárdio tanto clinicamente quanto experimentalmente. (Pitt et
al., 1999; Pitt et al., 2003; Zannad et al, 2010; Sartório et al, 2007; Fraccarollo et al,
2003; Fraccarollo et al, 2008). No entanto, nenhum estudo comparativo tinha sido
realizado até então, e a maioria deles se concentraram na fase crônica do infarto, onde
os níveis de aldosterona encontravam-se elevados.
Foi utilizado o modelo de isquemia em ratos induzida pela ligadura da coronária
esquerda. Este modelo foi descrito inicialmente por Heimburger em 1946 (Heimburger
et al, 1946), e uma das suas principais vantagens é que as alterações morfológicas e
funcionais decorrentes do infarto se assemelham àquelas encontradas em humanos
(Klocke et al, 2007). Por outo lado, esta metodologia apresenta um alto índice de
mortalidade de animais, variando entre 40 e 60% nas primeiras 24 horas (Zornoff et al,
2009). Em nosso estudo a taxa de mortalidade foi aproximadamente 31 %.
O grupo tratado com espironolactona apresentou uma taxa de mortalidade menor
que o grupo ligadura sem tratamento. Song e colaboradores já haviam relatado menores
taxas de mortalidade entre animais submetidos à ligadura da coronária e tratados
espironolactona em uma dose ainda menor que a utilizada em nosso estudo. (Song et al,
2011). O grupo tratado com eplerenona não apresentou redução na taxa de mortalidade.
As principais causas de morte neste modelo relacionam-se a fatores do próprio
procedimento cirúrgico como pneumotórax e depressão respiratória, edema pulmonar e
principalmente a arritmias malignas como taquicardia ventricular e fibrilação
ventricular (Litwin et al, 1995; Pfeffer et al, 1979; Opitz et al, 1995). Os animais
utilizados neste estudo, independentemente do tratamento, apresentaram episódios de
fibrilação ventricular e bloqueio AV nos primeiros minutos posteriores a ligadura. Além
disso, após a isquemia foi observado redução dos valores de PAS e PAD e da FC. A
bradicardia e a redução dos níveis pressóricos também são descritos como causas de
mortalidade em modelos animais de isquemia (Kolettis et al, 2007).
62
O presente estudo teve como objetivo principal avaliar comparativamente o efeito
de antagonistas de MR na isquemia cardíaca independentemente da ação da aldosterona.
Para isso, avaliamos o efeito do pré-tratamento com espironolactona ou eplerenona em
ratos normais e submetidos previamente a adrenalectomia bilateral.
As doses utilizadas de ambos os fármacos foram baseadas em estudos prévios
descritos na literatura. Nestes estudos, a espironolactona 20mg/kg, administrada via
oral, foi capaz de prevenir a proliferação de colágeno em ratos cronicamente infartados
(Silvestre et al, 1999; Mill et al, 2003). E a eplerenona 10mg/kg reduziu a fibrose e
melhorou os parâmetros ecocardiográficos em ratos com IC (Kobayashi et al, 2006). As
doses utilizadas são consideradas baixas para esses antagonistas. A dose de eplerenona
foi menor, pois a dose necessária para bloquear o MR é cerca da metade necessária para
a espironolactona (de Gasparo et al, 1987). Clinicamente, segundo recomendações do
Food and Drug Administration (FDA) doses 50% menores de eplerenona em relação a
espironolactona são utilizadas no tratamento de pacientes com IC (FDA, 2007; 2008).
Os animais submetidos à ligadura da coronária por 1h apresentaram elevação do
segmento ST no ECG, observada pelo aumento da área sob a curva ST-T, e necrose do
tecido cardíaco, caracterizando o modelo agudo de isquemia cardíaca.
Foi observada uma grande variação da intensidade da necrose mesmo dentro de
um mesmo grupo. Essa variação deve-se em parte, ao próprio modelo de isquemia
utilizado. O modelo de ligadura da coronária apresenta uma variação de 5 a 65% do
tamanho da área infartada (Peffer et al, 1979), devido à dificuldade de se ocluir a artéria
no mesmo ponto em todos os animais e devido a diferenças anatômicas entre eles. A
necrose também é influenciada por fatores individuais como fluxo colateral, demanda
individual de oxigênio e nutrientes, e sensibilidade dos miócitos à isquemia. Além
disso, em roedores o tempo para o desenvolvimento completo de necrose varia ente 30 e
90 minutos após a isquemia. (Jugdutt et al, 1993). O nosso protocolo de isquemia
durou1h, nesse período nem todas as células em risco podem ter desenvolvido necrose.
É importante ressaltar que mesmo com todas essas variações e mesmo que a análise
da necrose tenha sido apenas qualitativa, tanto a espironolactona quanto a eplerenona
reduziram a intensidade da necrose em relação ao grupo sem tratamento, nos grupos
normais e submetidos a adrenalectomia bilateral.
63
No início do nosso estudo foi feita dosagem sérica dos níveis de aldosterona nos
animais para caracterizar o modelo experimental. Os níveis circulantes de aldosterona
foram reduzidos a quase zero após a adrenalectomia. Entretanto, a aldosterona também
pode ser sintetizada em tecidos extra-adrenais como o coração, endotélio e musculo liso
vascular. (Takeda et al., 1995; Silvestre et al., 1998). Dessa forma, a adrenalectomia
bilateral não exclui a possibilidade da síntese local de aldosterona.
No entanto, essa questão é controversa. A produção local de aldosterona parece
ser mínima em condições normais, mas pode aumentar em condições patológicas como
na IC. (Fraccarollo et al, 2003; Guder et al, 2007; Mizuno et al, 2001). Em humanos
saudáveis, os níveis plasmáticos de aldosterona não diferem dos níveis locais, mas
indivíduos portadores de IC e hipertensão arterial apresentam níveis maiores de
aldosterona no seio coronário (Mizuno et al, 2001). Enzimas e co-fatores envolvidos na
biossíntese de aldosterona também são expressos no sistema cardiovascular (Taves et
al, 2011), e além disso, a expressão de mediadores do sistema renina-angiotensina
também já foi descrita (MacKenzie et al, 2002) e podem portanto atuar na regulação da
produção local de aldosterona.
Por outro lado, foi demonstrado que os níveis de expressão desses genes são
várias ordens de grandeza menores que a observada no córtex da adrenal (GomesSanches et al, 2004). Além disso, em um estudo realizado em 2005, não foi detectado
níveis de expressão da aldosterona sintase e 11β hidroxilase (enzimas envolvidas na
síntese de aldosterona) em nenhuma das regiões do coração analisadas em condições
normais ou patológicas (Ye et al, 2005).
As questões relacionadas a síntese local de aldosterona permanecem contraditórias
e os estudos recentes sugerem que a adrenal é a maior fonte da aldosterona plasmática e
local. (Chai et al, 2006; Chai et al 2010). Além disso, os níveis locais de aldosterona só
aumentariam em uma fase mais crônica das doenças cardíacas. O nosso estudo foi
realizado numa fase aguda da isquemia cardíaca e o efeito protetor dos antagonistas de
MR foi observado logo nos primeiros minutos após a ligadura da coronária.
Nossos dados demonstram que ambos os antagonistas de receptores MR,
espironolactona e eplerenona, protegem o coração dos danos causados pela isquemia
numa fase inicial do infarto do miocárdio em ratos, prevenindo a elevação do segmento
ST no ECG e atenuando a necrose tecidual. Esses efeitos persistiram nos animais
adrenalectomizados sugerindo que a ação cardioprotetora desses antagonistas vai além
do bloqueio dos efeitos deletérios da aldosterona sobre o coração.
64
Além da aldosterona, o receptor MR possui outro ligante endógeno, o cortisol (ou
corticosterona, em roedores), ambos possuem igual afinidade ao receptor. (Galupo et al,
2012). O cortisol assim com a aldosterona é sintetizado a partir do colesterol nas
No rim a presença da enzima 11βHSD2 cliva o cortisol em
glândulas adrenais.
metabólitos inativos e garantem a ligação preferencial da aldosterona ao MR, uma vez
que as concentrações de cortisol circulantes são 10 à 100 vezes maiores do que a da
aldosterona (Funder et al, 2009). Entretanto, as células do sistema cardiovascular
expressam níveis muito baixos de 11βHSD2 (Yang et al, 2009), o que facilita a
interação do cortisol com os receptores MR. Estudos já comprovaram que o cortisol é
capaz de ativar o MR em situações onde há alteração do estado redox da célula como a
que ocorre na isquemia cardíaca (Mihailidou et al, 2009). Níveis elevados de cortisol e
aldosterona são preditores independentes de risco de morte em pacientes com IC e
disfunção ventricular esquerda (Guder et al, 2007). Antagonistas de MR além de
bloquear os efeitos da aldosterona também protegem o coração por bloquear os efeitos
deletérios do cortisol (Mihailidou et al, 2009).
Em
nosso
estudo,
devido
a
remoção
total
das
glândulas
adrenais,
consequentemente, os níveis de corticosterona provavelmente também eram
insignificantes (dosagem não realizada). Portanto, pela primeira vez foi demonstrado
que a eplerenona, assim como já descrito para a espirononolactona (Mihailidou et al,
2009), apresenta efeitos cardioprotetores independentes do bloqueio da ação de
esteroides endógenos.
Mas se o efeito cardioprotetor desses fármacos é independente de níveis elevados
de aldosterona e cortisol/coricosterona, quais seriam então os mecanismos responsáveis
por essa proteção?
Alguns estudos demonstram que antagonistas de MR podem causar pré e pós
condicionamento isquêmico (Chai et al, 2005; Schimidt et al, 2010).
O pré-
condicionamento isquêmico é definido como um fenômeno pelo qual um ou mais ciclos
de isquemia de pequena duração (5 a 10 minutos) com pequenos ciclos de reperfusão,
promovem proteção do miocárdio contra um subsequente e prolongado período de
isquemia miocárdica e reperfusão (Murry et al, 1986). A aplicação de pequenos ciclos
de isquemia-reperfusão no início do período de reperfusão também causa
cardioproteção de modo similar ao pré-condicionamento, este fenômeno é denominado
pós-condicionamento isquêmico (Zhao et al, 2003).
65
A administração de algumas substâncias antes da isquemia, como adenosina,
bradicinina e opióides também ativa mecanismos celulares capazes de promoverem tal
proteção (Liang et al 1999; Baxter et al, 2002; Zaugg et al, 2002). Esse tratamento foi
denominado pré-condicionamento farmacológico. Chai e colaboradores apresentaram
evidências de que a espironolactona causa pré-condicionamento farmacológico, pois a
administração desse antagonista 15 min antes da isquemia reduziu a área infartada no
coração isolado de ratos (Chai et al, 2005).
A atenuação da elevação do segmento ST é um indicador de pré-condicionamento
isquêmico (Cohen et al, 1997). Em nosso estudo a espironolactona e a eplerenona
preveniram a elevação do ST nos animais submetidos à ligadura da coronária, quando
administradas 30 min antes da isquemia.
As vias intracelulares ativadas durante o pré e pós condicionamento isquêmico
envolvem a participação de canais de potássio mitocondriais sensíveis a ATP (K+ATP). A
abertura desses canais preserva a função mitocondrial por previnir a sobrecarga de
cálcio durante a isquemia (Holmuhamedov et al, 1999). Os mecanismos envolvidos na
ativação de canais K+ATP ainda não são completamente conhecidos. Sato e colaboradores
demonstraram que a ativação de receptores de adenosina podem ativar K+ATP
mitocondriais via PKC dependente em células ventriculares (Sato et al, 2000).
Schimidt e colaboradores demonstraram que a proteção cardíaca da eplerenona
após a isquemia e reperfusão no coração de ratos foi abolida por antagonistas de K +ATP
mitocondrial. (Schimidt et al, 2010). Além de bloqueadores de canais de potássio, esse
estudo também realizou testes com bloqueadores de outras moléculas que sabidamente
estão envolvidas no condicionamento isquêmico, como PKC, receptores de adenosina e
PI3-quinase. Todos os inibidores bloquearam a ação protetora dos antagonistas de MR.
Além disso, um estudo recente em nosso laboratório, ainda não publicado, sugere
que tanto a eplerenona quanto a espironolactona são capazes de aumentar os níveis
celulares de GMPC em cardiomiócitos de rato neonatos (Hermidorff et al, 2013). O
GMPC vem sendo descrito como uma molécula chave nos mecanismos de pré e pós
condicionamento isquêmico. (Garcia-Dorado et al, 2009).
As evidências de que antagonistas de MR promovem condicionamento isquêmico
podem explicar porque o tratamento imediato de pacientes que sofreram infarto do
miocárdio apresenta uma resposta mais satisfatória do que aqueles que só receberam
tratamento mais tarde. O tratamento precoce ativaria vias cardioprotetoras que
tornariam o miocárdio mais resistente aos danos da isquemia e reperfusão, além de
66
antagonizar os efeitos deletérios da aldosterona cujos níveis se encontram aumentados
numa fase mais crônica da doença. Essas ações em conjunto melhorariam o
remodelamento cardíaco e consequentemente, aumentariam a qualidade de vida dos
pacientes e reduziriam a mortalidade.
Alguns pesquisadores também defendem a ideia de que antagonistas de MR
possam atuar como agonistas inversos (Funder et al, 2009). Certos tipos de receptores
podem apresentar uma atividade intrínseca no seu estado inativo, mesmo na ausência de
um ligante endógeno ou de um agonista exógeno administrado. Agonistas inversos
atuam de modo a abolir essa atividade intrínseca do receptor livre (não-ocupado),
resultando em uma redução espontânea da atividade do receptor (Khilnanie Khilnani,
2011).
Mihailidou e colaboradores, em um estudo com coração isolado de ratos,
demonstraram que a espironolactona sozinha era capaz de reduzir a área infartada e
apoptose em ratos adrenalectomizados submetidos à isquemia e reperfusão (Mihailidou
et al, 2009). Os autores atribuíram a resposta cardioprotetora da espironolactona a uma
possível propriedade agonista inversa que pode ser apresentada por esse fármaco, uma
vez que estes efeitos foram observados na ausência dos dois ligantes endógenos do
receptor MR, aldosterona e cortisol. Adicionalmente, um estudo in vitro demonstrou
que a espironolactona sozinha promoveu aumento da expressão da proteína β-integrina
em cardiomiócitos e em células epiteliais do rim (Chun et al, 2002).
Em nosso estudo, demonstramos pela primeira vez que assim como a
espironolactona, a eplerenona promove cardioproteção na isquemia cardíaca de animais
adrenalectomizados. Dentro dessa perspectiva ambos os antagonistas de MR atuariam
não apenas excluindo ação da aldosterona ou do cortisol sobre o MR, mas também
ocupando este receptor e promovendo a ativação de fatores de proteção.
No entanto, não existem dados na literatura que comprovem que os efeitos diretos
de antagonistas de MR sobre o coração são mediados por receptores MR ou por outro
receptor desconhecido.
Os efeitos protetores da espironolactona e eplerenona em nosso estudo foram
observados logo nos primeiros minutos após a isquemia, sugerindo que estes efeitos não
são genômicos, e não envolvem a transcrição de genes. Este dado é importante, pois a
aldosterona também possui efeitos não genômicos e os estudos indicam que os mesmos
podem ser mediados por um receptor distinto do MR. Dessa forma, o mesmo poderia
ocorrer para a eplerenona e espironolactona.
67
Dados recentes do nosso laboratório monstram que tanto a espironolactona quanto
a eplerenona mobilizam Ca+2, ativam GMPc e ERK1/2 em cardiomiócitos de ratos
neonatos. E esses efeitos ocorreram apenas alguns minutos após o tratamento com os
fármacos (Hermidorff, 2013). Evidenciando que há uma ação não genômica desses
antagonistas nas células cardíacas.
Schimidt e colaboradores em um modelo de isquemia e reperfusão em
camundongos demonstrou que os efeitos cardioprotetores da eplerenona foram
bloqueados na presença de um inibidor não seletivo de receptores de adenosina. Além
de ser um potente vasodilatador, a adenosina possui efeitos cardioprotetores diretos
sobre as células cardíacas através de seus receptores de membrana acoplados a proteína
G, sobretudo limitando a área infartada. (Feldman et al, 2011). Esta mesma
pesquisadora, demonstrou que o efeito cardioprotetor do canrenoato de potássio
(metabólito ativo da espironolactona) foi bloqueado em camundongos com deleção
genética para a enzima ecto-5’-nucleotidase, enzima envolvida na síntese de adenosina.
(Schmidt et al, 2010).
Portanto, existem evidências de que a ação de antagonistas de MR sobre o coração
pode estar sendo mediada por uma interação com a adenosina, no entanto os estudos
não são conclusivos quanto a ação ser sobre os receptores de adenosina ou sobre a
síntese e degradação da mesma.
Em nosso estudo também avaliamos a hipótese de que efeitos protetores da
espironolactona possam ser mediados por uma interação com receptores GR. Entretanto,
o antagonista de receptor GR, mifepristona, não foi capaz de bloquear os efeitos da
espironolactona na prevenção da elevação de ST. Apesar de a espironolactona possuir
afinidade por receptores GR e a ativação deste receptor ser descrita como
cardioprotetora, não foi observada nenhuma relação da resposta protetora da
espironolactona com receptores GR. Corroborando com os resultados de Mihailidou e
colaboradores, onde a mifepristona não bloqueou o efeito da espironolactona sobre a
redução da área infartada e apoptose celular na isquemia e reperfusão de corações
isolados de rato.
Entretanto, inesperadamente, quando a mifepristona foi administrada sozinha
houve uma leve atenuação na área sob a curva do segmento ST. A ação
antiglicocorticoide da mifepristona é dose dependente. Doses únicas iguais ou
superiores a 4mg/kg inibem de uma forma competitiva os receptores GR (Cadepond et
al, 1997). Foi utilizada em nosso estudo a dose 20mg/kg. A mifepristona também possui
68
ação antiprogesterogênica e leve ação antiandrogênica e nenhuma ação sobre receptores
MR.
Nossos dados contrastam com o estudo de Bobryshev e colaboradores (2007),
onde a mifepristona na dose 20mg/kg inibiu os efeitos do pré condicionamento
isquêmico em um modelo de isquemia e reperfusão em ratos. Uma possível explicação
para o resultado seria devido ao fato da mifepristona poder atuar como um agonista
parcial de receptores GR em determinadas circunstâncias. Em pacientes com
insuficiência adrenal, a mifepristona apresentou efeitos agonistas, reduzindo os níveis
plasmáticos de ACTH (Laue et al, 1988). Adicionalmente, Zang e colaboradores
demonstraram que a atividade agonista da mifepristona é dependente da concentração
de receptores GR na célula, esta atividade aumenta quando há superexpressão destes
receptores (Zhang et al, 2007). Vazqués e colaboradores, demonstraram que a
adrenalectomia promove aumento da expressão de receptores GR em áreas específicas
do hipocampo (Vazqués et al, 1993), entretanto, nenhum estudo até o momento avaliou
se o mesmo acontece no coração.
69
CONCLUSÃO
6.
CONCLUSÃO
Comparativamente, não foram observadas diferenças entre os efeitos da
espironolactona e eplerenona. Ambas foram capazes de prevenir, em baixas doses, os
danos causados pela ligadura da coronária em ratos anestesiados, reduzindo a elevação
do segmento ST no ECG e a necrose dos miócitos cardíacos.
Adicionalmente foi demonstrado que tanto a espironolactona quanto a eplerenona
são capazes de promover cardioproteção numa fase aguda da isquemia cardíaca e esses
efeitos são independentes do bloqueio da ação da aldosterona e da corticosterona.
Com base em nossos dados e aos encontrados na literatura, podemos sugerir que
esses fármacos não atuam somente como antagonistas de MR e poderiam assim, serem
classificados em uma nova classe farmacológica. Existem evidências claras de que seus
efeitos também ocorram por vias diretas, e estes podem estar sendo mediados por um
agonismo inverso sobre o receptor MR ou por um receptor distinto, ainda não
conhecido. No entanto, mais estudos precisam ser realizados com o objetivo de
investigar melhor as vias ativadas por estes dois fármacos no coração.
Do ponto de vista clínico, nossos resultados também são relevantes. Antagonistas
de MR são utilizados na fase crônica da IC pós-infarto do miocárdio. Nossos resultados
sugerem que a cardioproteção também ocorre na fase inicial após a isquemia. Assim,
esses fármacos podem ser uma alternativa terapêutica no tratamento de pacientes numa
fase precoce do IAM, mesmo na ausência de IC.
71
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7.
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82
ANEXOS
A. Protocolo de aprovação do comitê de ética
84
B. Valores Basais de PA e FC
TABELA 1: Pressão arterial e Frequência cardíaca dos animais antes da ligadura da coronária.
Controle
Ligadura
116,8 ± 7,4
108,5 ± 9,7
106,6
±
5,1
105
± 6,0
104
PAD 85,07 ± 5,7
75,64 ± 7,5
76,97
±
4,9
73,9
± 4,8
82,32 ± 10,76 79,66 ± 4,6
258,5 ± 25,5 317,5 ± 22,5 296,9
±
26,4
271,2 ± 21,5 302,4 ± 12,8
PAS
FC
Espironolactona
Eplerenona
Valores absolutos e erro padrão da média de PA (mmHg) e FC (bpm).
Mifepristona
± 5,2
Mife + Espiro
112,9 ± 7,2
266,3 ± 25,2
TABELA 2: Pressão arterial e Frequência cardíaca dos animais adrenalectomizados antes da ligadura da coronária.
Controle
Ligadura
Espironolactona
Eplerenona
Mifepristona
Mife + Espiro
116,8 ±
7,4
93,96 ±
8,1
85,96
±
7,8
83,68 ±
3,6
82,61 ±
3,2 76,77 ±
4,5
PAD 85,07 ±
5,7
69,96 ±
6,0
65,74
±
6,6
63,48 ±
3,2
59,87 ±
3,1
3,4
258,5 ± 25,5 317,5 ± 22,5
321,1
±
29,7
252,6 ± 16,9 298,5 ± 21,9 224,2 ± 40,4
PAS
FC
55,33 ±
Valores absolutos e erro padrão da média de PA (mmHg) e FC (bpm).
86