DE RESPOSTA IMUNE POR Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES DO TIPO TOLL NA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE POR Lactobacillus
delbrueckii UFV H2b20
Autor: Leonardo Santos de Freitas
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Ouro Preto, como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Biológicas,
área
de
concentração:
Imunobiologia de Protozoários.
Ouro Preto, Novembro de 2007
1
F866a
Freitas, Leonardo Santos de.
Avaliação da participação de receptores do tipo toll na indução de resposta
imune por Lactobacillus delbrueckii UFV H2b 20 [manuscrito] / Leonardo
Santos de Freitas. – 2007.
91 f.: il., graf., tab.
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunoparasitologia.
1. Leishmania - Teses. 2. Lactobacilo -Teses. 3. Citocinas - Teses.
Catalogação:
[email protected]
4. Quimiocinas
- Teses.
I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
2
3
O presente trabalho foi desenvolvido no
Laboratório de Imunoparasitologia do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto (UFOP), sob orientação do
Professor Doutor Luís Carlos Crocco Afonso e com
auxílio financeiro da UFOP, da Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior
(CAPES) e da FAPEMIG (EDT – 2409/03).
4
DEDICATÓRIA
Dedicatória
Este trabalho é dedicado à minha família,
Alair, Denize, Vinícius, Carolina e Juninho,
e à Thalyta, por terem acreditado que este
sonho seria possível.
5
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Agradeço de forma especial ao professor Dr. Luís Carlos Crocco Afonso, pela
imensa paciência e incomparável compreensão, durante todos os momentos deste trabalho,
e por ter dedicado seu esforço para a realização deste projeto. Agradeço também pelos
grandes ensinamentos, apoio e amizade.
Aos professores Drs. Vanessa Carla Mosqueira, Helio Ideo Babá, Milton, Rogelio
Brandão e Ieso Castro por terem aberto as portas dos seus laboratórios sempre com muita
disposição.
Ao professor Roney por disponibilizar seu trabalho para a execução de testes
importantes para finalização deste estudo.
Ao professor Jorge Humberto pela importante colaboração durante grande parte
deste trabalho e por possibilitar a realização dos estudos de caracterização molecular. E,
ainda, por compartilhar seus conhecimentos e experiência.
Às professoras Drs. Cláudia e Simone pelo apoio no momento mais difícil deste
trabalho.
Aos professores do NUPEB, por terem contribuído para a concretização deste
sonho, cada um de sua maneira.
Ao Leandro por se mostrar sempre disposto a ajudar e contribuir com os materiais.
À Cida, por estar sempre disposta a nos ajudar.
Ao Eduardo por ter dedicado grande parte de seu tempo auxiliando na execução e
padronização de diversas técnicas e, também, por compartilhar seus conhecimentos. Além
disto, por ter descoberto uma importante alteração na seqüência do primer de CCL5/Rantes.
A todos os colegas do LIP pela amizade e ajuda indispensáveis para a concretização
deste projeto.
A todos os colegas de turma do mestrado pela convivência e apoio.
Aos demais laboratórios associados ao NUPEB pela grande disponibilidade em
ajudar em todos os momentos.
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradecimentos Especiais
Agradeço a Deus por ter me guiado durante esta caminhada.
Aos meus pais, por me apoiarem sempre e por compreenderem todas as minhas
dificuldades.
Aos meus irmãos Di, Carol e Juninho pelo carinho e pela força que sempre me
deram.
À Thalyta, por estar ao meu lado durante toda esta etapa de minha vida.
À Lúcia, Edinho, Ítalo, César e familiares, pela torcida.
Aos meus parentes e familiares, em especial à minha vó, por torcerem por mim,
apesar da distância.
Aos amigos, Marcelo, Fernando, Matheus, Zé Arnaldo e Rodrigo pela amizade
incondicional.
Aos amigos Thiago, Lucas, Tuir e Didi pela convivência, sempre alegre e
harmoniosa.
Ao Laos, pela amizade, pelos conselhos e pela constante demonstração de alegria.
Aos meus novos colegas de trabalho, pela convivência e pela força.
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LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Lista de figuras e tabelas
Tabela 1 – Quimiocinas.....................................................................................................................................27
Tabela 2 – Primers de citocinas e quimiocinas..................................................................................................42
Figura 1 - Produção de IFN-γ por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em
diferentes dosagens, por camundongos de diferentes linhagens .......................................................................46
Figura 2 - Produção de TNF-α por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em
diferentes dosagens, por camundongos de diferentes linhagens........................................................................47
Figura 3 - Produção Relativa de RNA de IL-10................................................................................................49
Figura 4 - Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao
estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens.....................................................................51
Figura 5 - Produção de TNF-α por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao
estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens.....................................................................51
Figura 6 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/-...53
Figura 7 - Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ em resposta ao
estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens.....................................................................55
Figura 8 - Produção de TNF-α por esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ em resposta ao
estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens.....................................................................55
Figura 9 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ....57
Figura 10 - Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta aos
estímulos (-) extrato e extrato de parede, em diferentes dosagens.....................................................................60
8
Figura 11 - Produção de TNF-α por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta aos
estímulos (-) extrato e extrato de parede, em diferentes dosagens.....................................................................61
Figura 12 - Detecção de carboidratos em extrato de parede de L. delbrueckii por Dot-Blot...........................62
Figura 13 - Cromatografia em camada delgada do extrato de parede de L.delbrueckii revelada em câmara de
iodo ....................................................................................................................................................................63
Tabela 3 - Dosagem de Glicose e Triglicérides da fração Extrato de Parede....................................................63
Figura 14 - Espectrometria de Infra-vermelho de extrato de parede de L.delbrueckii......................................65
9
RESUMO
Resumo
O uso de bactérias probióticas como adjuvantes de vacinas tem sido considerado
uma importante estratégia para o aumento de eficácia desta ferramenta de combate às mais
diversas patologias.
Trabalhos recentes realizados com o candidato a adjuvante, Lactobacillus
delbrueckii UFV H2b20, demonstraram sua capacidade de induzir, in vitro, a produção das
citocinas pró-inflamatórias IFN-γ, TNF-α e IL-12 por esplenócitos de camundongos
BALB/c e células mononucleares do sangue periférico humano. Apesar da indução destas
citocinas características de uma resposta imune TH1, esta estirpe bacteriana foi incapaz de
proteger camundongos BALB/c da infecção por L. braziliensis, sugerindo uma possível
regulação do processo inflamatório. A partir destes dados, decidiu-se caracterizar o perfil
de resposta induzido por L. delbrueckii em esplenócitos de diferentes linhagens de
camundongos, no intuito de compreender os mecanismos envolvidos no controle da
resposta. Neste sentido, verificamos que o estímulo L. delbrueckii morto pelo calor
determinou a produção de citocinas pró e antiinflamatórias, e também das quimiocinas
CCL2 e CXCL10, sugerindo que esta preparação é capaz de induzir o recrutamento de
macrófagos e células NK.
Avaliou-se também a participação dos receptores do tipo Toll, mais precisamente
TLR-2 e TLR-4, no reconhecimento do lactobacilo, e a importância deste processo na
indução da resposta imune subseqüente. Os resultados obtidos nos experimentos com
linhagens deficientes para estes receptores demonstraram a participação efetiva apenas do
receptor TLR-2. Este dado foi comprovado pelos experimentos realizados com o extrato de
parede do probiótico, em que a ausência do receptor levou à diminuição da indução de IFNγ. A caracterização molecular desta fração da bactéria, por sua vez, demonstrou que esta
possui naturezas glicídicas e lipídicas.
Em síntese, nossos dados demonstraram que o lactobacilo estudado é capaz de
induzir diferentes perfis de resposta imunológica e que esta capacidade é determinada de
forma importante pela ativação de TLR-2.
10
ABSTRACT
Abstract
The use of probiotic bacteria as an adjuvant has been considered an important
strategy to increase the effectiveness of vaccines against several pathogens.
Recent work with the adjuvant candidate, Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20,
described its capacity to induce, in vitro, pro-inflammatory cytokines such as IFN-γ, TNF-α
and IL-12 by mouse splenocites and mononuclear peripheral human blood cells. The
production of cytokines characteristic of a TH1 immune response was, however, unable to
protect BALB/c mice against a Leishmania braziliensis infection, suggesting a possible
regulation of the inflammatory process. Based on these observations, we decided to
characterize the L. delbrueckii induced response profile, aiming to understand the
mechanism involved in the response control. To this aim, we have verified the dead L.
delbrueckii stimulation induced pro and anti-inflammatory cytokines production and also
CCL2 and CXCL10 chemokines, suggesting that this preparation is probably able to recruit
macrophages and NK cells.
Toll-like receptors, specifically TLR-2 and TLR-4, were also evaluated as
participants in lactobacilli recognition and involvement in the subsequent immune response
induction. The results of experiments with mouse lineages deficient for these receptors
showed an effective participation of TLR-2 receptor only. These results were confirmed by
experiments performed with the probiotic wall extract, which the absence of this receptor
leaded to a decrease IFN-γ induction. The molecular characterization of this bacterial
fraction demonstrated the presence of sugar and lipids in its composition.
In summary, our data showed that the studied lactobacilli is able to induce different
immunological responses depending on the dose used and that ability is mediated by TLR-2
activation.
11
ÍNDICE
Índice
DEDICATÓRIA...........................................................................................................5
AGRADECIMENTOS..................................................................................................6
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS..............................................................................7
LISTA DE FIGURAS E TABELAS...............................................................................8
RESUMO.....................................................................................................................10
ABSTRACT..................................................................................................................11
ÍNDICE............................................................................................................12
ABREVIATURAS.......................................................................................................13
INTRODUÇÃO...........................................................................................................15
JUSTIFICATIVA........................................................................................................30
OJETIVOS..................................................................................................................33
MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................35
RESULTADOS...........................................................................................................45
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS............................................................................67
SUMÁRIO DOS RESULTADOS................................................................................79
CONCLUSÃO............................................................................................................81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................83
12
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABTS
Ácido 2,2`-bio-azino-3-etilbenzil-tiazol-6-sulfônico
BAL
Bactérias do ácido lático
CMSP
Células mononuclears do sangue periférico
DC
Células dendríticas
DMEM
Dulbecco`s modified eagle medium
ELISA
Enzime linked immunosorbent assay
HEPES
N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-ácido-etanosulfônico
IFN
Interferon
Ig
Imunoglobulina
IL
Interleucina
IRF
Fator regulador dos interferons
Ldmc
Lactobacillus delbrueckii morto pelo calor
LPS
Lipopolissacarídeo
MHC
Complexo principal de histocompatibilidade
MTT
Brometo de 3-[4.5-dimetiltiazol-2]-2.5-difeniltetrazólio
NF-kB
Fator nuclear kappa B
NK
Célula natural killer
PAMPS
Padrões moleculares associados a patógenos
PBS
Salina tamponada com fosfato
PCR
Reação em cadeia da polimerase
RNAm
RNA mensageiro
RT-PCR
Transcriptase Reversa – Reação em cadeia da polimerase
SDS
Duodecil sulfato de sódio
TLR
Receptor do tipo Toll
TNF
Fator de necrose tumoral
TRIS
Tris (Hidroximetil) aminometano
Tween 20
Polioxietilenosorbitano monolaurato
13
Introdução
14
INTRODUÇÃO
Introdução
Probióticos e modulação do sistema imune
A microbiota do trato gastrointestinal de um indivíduo é um ecossistema de alta
complexidade, contendo cerca de 100 trilhões de bactérias pertencentes a mais de 400
espécies diferentes. Esses microorganismos convivem em relações simbióticas ou
antagônicas, crescendo nos componentes que são ingeridos ou nas secreções do trato
intestinal do hospedeiro.
Além desta microbiota, um adulto abriga, ainda, uma massa bacteriana distribuída pela
pele, cavidades rino-faríngeas e trato genital. Sua composição, embora seja estável em
indivíduos saudáveis, pode se alterar por diversos fatores como dietas, stress, estado
imunológico, entre outras situações, ocasionando problemas gastrointestinais, resultando
em doença ou até mesmo morte.
A colonização microbiana, que é constituída por diversas espécies em sua maioria
anaeróbias e microaerófilas, Gram-positivas e Gram-negativas (Bocci, 1992; Conway,
1995), tem importantes efeitos benéficos para a saúde como imunoestimulação e
contribuição nutricional.
Diversas são as formas pelas quais a presença destes seres pode favorecer a
sobrevivência do hospedeiro. A simples colonização simbiótica do trato intestinal, por
exemplo, previne o estabelecimento de patógenos exógenos por efeito conhecido como
“exclusão competitiva” ou “efeito barreira”. Além disto, estas mesmas bactérias sintetizam
substâncias como vitaminas e proteínas que, muitas vezes, são absorvidas e utilizadas pelo
hospedeiro. Bactérias benéficas podem ainda estimular o sistema imunológico através de
compostos produzidos, sejam eles excretados ou presentes em sua parede celular.
Entre os microorganismos que constituem a microbiota do intestino humano estão os
lactobacilos e as bifidobacterias. Estas bactérias fazem parte de um grupo designado
bactérias do ácido lático (BAL), que além do habitat intestinal humano e de outros animais,
podem estar presentes em outros ambientes nutricionalmente ricos como vegetais, leite e
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subprodutos, e carne. No entanto, alguns membros pertencem a habitats específicos como
vagina, boca e intestinos de mamíferos.
O grupo lático possui a característica comum de produzir ácido lático em seu
metabolismo, além de serem gram-positivos, não apresentarem catalase ou apenas uma
pseudocatalase, não formarem esporos, não apresentarem motilidade e serem tolerantes ao
ar (Adamberg e cols., 2003).
A partir do ácido lático, essas bactérias podem produzir uma variedade de outras
substâncias, incluindo bacteriocinas, peróxido de oxigênio e ácidos orgânicos, que podem
causar inibição do crescimento de outros microorganismos (van de Guchte e cols., 2001).
As BAL são importantes na indústria alimentícia devido a seu papel na fermentação de
alimentos, especialmente produtos lácteos. Vários estudos mostram que as BAL exibem
uma variedade de efeitos fisiológicos e terapêuticos, incluindo estimulação da resposta
imune e supressão do crescimento de patógenos (Fuglsang e cols., 2002; Klaenhammer,
1998; Rhee & Park, 2001). Dentre as BAL, incluem-se espécies dos gêneros Lactobacillus,
Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc e Pediococcus (Mombelli &
Gismondo, 2000), mas apenas os dois primeiros apresentam estudos e dados consistentes.
A observação dos efeitos benéficos da colonização microbiana no organismo, através
de vários estudos realizados ao longo dos anos, deu origem ao termo probiótico. Diversas
definições têm sido utilizadas na tentativa de contemplar as características comuns às
preparações microbianas capazes de beneficiar, de alguma forma, o corpo humano.
Segundo Schrezenmeir e colaboradores (2001), probióticos são preparações contendo
determinados microorganismos viáveis e em número suficiente, que alteram a microbiota
em um compartimento do hospedeiro, exercendo, para este, efeitos benéficos. A definição
sugerida, entretanto, não corresponde de forma completa aos dados científicos recentes que
comprovam a não necessidade da viabilidade dos microorganismos para a concretização
destes efeitos (Lee e cols., 2004; Matsuguchi e cols., 2003; Miake e cols., 1985; Sun e
cols., 2005). Com o objetivo de incluir e contemplar estes dados, Salminen e colaboradores
(1999) definiram probióticos como “preparações ou componentes de células microbianas
que possuem um efeito benéfico na saúde e bem estar do hospedeiro”.
Algumas propriedades são fundamentais para a caracterização de um probiótico tais
como: ser de origem humana; ser resistente à destruição por processamento térmico, pela
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bile e pelo suco gástrico; aderir ao epitélio intestinal; ser capaz de colonizar o trato
gastrointestinal, mesmo que temporariamente; produzir substâncias antimicrobianas;
influenciar atividades metabólicas humanas (metabolismo do colesterol, produção de
vitamina, digestão da lactose, etc.) e modular o sistema imune (Gibson & Fuller, 2000).
Além disso, uma característica fundamental é que o microorganismo não acarrete efeitos
nocivos à saúde e ao bem estar do hospedeiro (Ishibashi & Yamazaki, 2001; Guarner &
Schaafsma, 1998; Salminen e cols., 1999).
Diversos efeitos têm sido associados aos probióticos, tais como a diminuição do
colesterol sérico e da reabsorção de compostos aminados indesejáveis, o aumento da
absorção de minerais como cálcio, ferro e magnésio, a liberação de enzimas que favorecem
o metabolismo de algumas substâncias como a lactose, o aumento da resistência natural a
doenças infecciosas do trato intestinal, a supressão do câncer e a estimulação do sistema
imune (Fuller, 1989; Gonzalez e cols., 1995; Saavedra, 1995; Gibson & Roberfroid, 1995).
Para isso, são propostos mecanismos de ação que incluem: atividade antimicrobiana;
capacidade de resistência e colonização; efeitos antimutagênicos; influência na atividade
enzimática; liberação de enzimas e modulação da resposta imune (Sanders, 2000).
A modulação da resposta imune por microorganismos probióticos, bem como os efeitos
de sua utilização no desenvolvimento de diversas doenças, tem sido amplamente estudada.
Diversos trabalhos têm avaliado a utilização destes microorganismos em diferentes
patologias tanto em humanos quanto em modelos animais.
Estudo realizado por Miake e colaboradores (1985) demonstrou o efeito protetor do
pré-tratamento com Lactobacillus casei morto pelo calor frente à infecção por
Pseudomonas aeruginosa em camundongos. O tratamento da diarréia por Cryptosporidium
parvum, em pacientes imunocomprometidos, utilizando bactérias probióticas, também tem
demonstrado excelentes resultados (Pickerd & Tuthill, 2004). Além destes, estudo recente
demonstrou que o tratamento de pacientes com colite ulcerativa utilizando o probiótico
Escherichia coli apresenta eficácia equivalente ao tratamento convencional com
antibacterianos (Kruis e cols., 2004).
Sato (1984) demonstrou, ainda, o aumento da resistência de camundongos à infecção
por Listeria monocytogenes após tratamento com Lactobacillus casei. Este efeito, segundo
o trabalho, está ligado à ativação e à migração de macrófagos pela ação do probiótico.
17
Outro estudo, desta vez realizado com crianças, demonstrou a eficiência da ingestão de
leite contendo Lactobacillus rhamnosus na prevenção de doenças respiratórias (Hatakka e
cols., 2001).
Os mecanismos que direcionam as respostas imunológicas determinadas pelo uso de
probióticos também têm sido avaliados pela caracterização dos perfis de citocinas,
quimiocinas e células do sistema imune que participam deste processo. Com este objetivo,
Perdigon e colaboradores (2002) estudaram o efeito da interação de bactérias do ácido
lático com o sistema imune do aparelho digestivo de camundongos. Foi observado, então, o
aumento da produção das citocinas IFN-γ e TNF-α para todas as cepas utilizadas e, para
algumas bactérias, a produção das citocinas IL-10 e IL-4. Kawahara e Otani (2006)
avaliaram a expressão de citocinas por esplenócitos de camundongos induzidos por
diferentes cepas de Lactobacillus. Todas apresentaram uma indução do aumento da
produção de IFN-γ e IL-12. Mohamadzadeh e colaboradores (2005) demonstraram que
diferentes cepas de Lactobacillus induziram, in vitro, um aumento da expressão de
moléculas co-estimulatórias, além da secreção de IL-12 e IL-18 por células dendríticas
mielóides de camundongos. Estudo realizado por Haller e colaboradores (2000) evidenciou
a produção das citocinas IL-8, TNF-α e IL-1, e da quimiocina CCL2 por culturas de células
de leucócitos do sangue periférico de humanos, co-cultivadas com células do epitélio
intestinal, quando estimulados com Lactobacillus sakei e Escherichia coli. Por outro lado,
neste mesmo estudo, foi verificada a produção da citocina IL-10 pelos leucócitos cocultivados. A expressão desta citocina, após indução por probióticos, foi também
demonstrada por Miettinen (1996). Neste trabalho, observou-se a indução da produção de
TNF-α, IL-6 e IL-10 por células mononucleares do sangue periférico após estímulo com
diferentes cepas de bactérias do ácido lático.
Além do aumento da expressão da molécula imunoreguladora IL-10, outro efeito
inibitório na indução de citocina foi verificado com o uso de microorganismo probiótico.
Neste caso, Lactobacillus reuteri levou a uma diminuição dos níveis de IL-8, induzida por
TNF-α, em culturas de células epiteliais intestinais (Ma e cols., 2004).
O estímulo para produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IFN-γ, IL-18 e
IL-12, bem como o estímulo da expressão de moléculas co-estimuladoras e marcadores de
maturação, podem favorecer a eliminação de patógenos, seja através da ativação de
18
macrófagos ou aumento da eficiência da apresentação de antígenos por células
competentes. Além disto, a indução da expressão de quimiocinas também pode influenciar
a resposta inflamatória. Estes fatores podem ser responsáveis pela contribuição do uso de
probióticos no auxílio do controle de vários agentes patogênicos. Por outro lado, a
estimulação de citocinas reguladoras como IL-10, ou mesmo citocinas de perfil TH2 como
a IL-4, podem atuar de forma favorável no controle geral da resposta imune, determinando
um balanço entre TH1 e TH2, diminuindo os efeitos maléficos de respostas imunes
exacerbadas, ou mesmo beneficiando diretamente o hospedeiro em alguns casos
específicos. A tolerância a diversas substâncias ingeridas pode, por exemplo, ser favorecida
pela ação da regulação do sistema imune do aparelho digestivo. Da mesma forma, esta ação
pode ser importante para o controle de processos alérgicos. Neste contexto, um estudo
recente realizado por Helwig e colaboradores (2006) demonstrou a indução de citocinas pró
e antiinflamatórias, como IL-10, IL-1β e TNF-α, por células mononucleares do sangue
periférico de humanos, quando induzidas por diferentes cepas de Lactobacillus e
Bifidobacteria, e por Escherichia coli.
A ativação da resposta celular decorrente do estímulo por bactérias probióticas está
intimamente relacionada com as moléculas presentes em suas estruturas, estando elas,
principalmente,
em
sua
parede
celular.
Sabe-se
que,
dentre
as
moléculas
imunomoduladoras destes microorganismos estão os lipopolissacarídeos, constituintes de
bactérias gram-negativas como a Escherichia coli, e os peptideoglicanos e ácido
lipoteicóico, de bactérias gram-positivas como os lactobacilos e as bifidobacterias. O
reconhecimento destas moléculas, por sua vez, ocorre através de receptores específicos
denominados receptores do tipo toll (TLR), que reconhecem variados padrões moleculares.
A ativação destes receptores, por estas moléculas, determina respostas celulares
características, como a indução da expressão de citocinas, quimiocinas, outros receptores
celulares e moléculas co-estimuladoras.
Estudo realizado por Vinderola e colaboradores (2005) demonstrou a participação do
TLR-2 na indução de IL-6 em camundongos alimentados com Lactobacillus casei e
Lactobacillus helveticus. O tratamento intraperitonial de camundongos BALB/c com
peptideoglicano, por outro lado, levou ao aumento da expressão de IL-12 e IFN-γ (Sun e
cols., 2005). Foi observado, ainda, em estudo desenvolvido por Matsugushi (2003) que
19
diversas cepas de lactobacilos foram capazes de induzir a expressão de TNF-α, in vitro, por
esplenócitos de camundongos BALB/c. Neste mesmo trabalho, foi verificado que ácido
lipoteicóico de L. casei e, também de L. fermentum, não foi capaz de induzir a produção
desta mesma citocina em camundongos deficientes em TLR-2.
A capacidade de estimular diferentes padrões de citocinas, por diferentes bactérias
comensais, foi avaliada por Lan e cols. (2005). Este trabalho revelou que os ligantes de
TLR-2 e TLR-4, peptideoglicano e lipopolissacarídeo respectivamente, levaram à secreção
de IL-6, CCL2 e CXCL10 por células do epitélio intestinal murino. Além disso, a
exposição a E. coli foi capaz de estimular a produção de CCL3, CCL4 e IFN-γ, enquanto
Lactobacillus ovatus induziu a expressão da quimiocina CCL2.
Todos os estudos mencionados comprovam a capacidade dos probióticos em estimular o
sistema imunológico, ativando-o e direcionando-o. Esta propriedade tem sido considerada
para o uso destes microorganismos como adjuvantes em vacinas para diversas patologias.
No entanto, o amplo perfil de resposta, determinado por situações específicas, revela a
importância da realização de novos trabalhos que visem a compreensão dos mecanismos
característicos de cada processo.
Receptores tipo Toll e sistema imune inato
A imunidade inata é a primeira linha de defesa do sistema imunológico que permite aos
organismos multicelulares uma resposta imediata contra diversos patógenos, sem exposição
prévia aos mesmos.
Entre as características do sistema imune inato está a capacidade de reconhecer, pela
interação com receptores celulares, estruturas presentes em vários grupos de
microorganismos e distingui-los de moléculas próprias do hospedeiro, de ativar
mecanismos para destruir os invasores e, ainda, de ativar e orientar uma resposta imune
adaptativa que, através da expansão clonal de linfócitos, é capaz de combater
especificamente microorganismos persistentes.
Este sistema reconhece padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) que são
estruturas conservadas comuns a diferentes grupos de microorganismos, e rapidamente
inicia uma resposta imunológica, não apenas através de células profissionais apresentadoras
20
de antígenos, como as células dendríticas (DCs), mas também através de células ditas não
profissionais, que têm o primeiro contato com os mesmos.
Embora a existência de receptores específicos para as PAMPs tivesse sido considerada
por muitos anos, suas características ainda permaneciam obscuras.
Durante a elucidação do sistema imunológico de insetos, uma linhagem mutante de
moscas apresentou-se susceptível à infecção por fungos.
Investigações subseqüentes
demonstraram que o produto gênico tratava-se de um receptor transmembrana tipo I que foi
denominado toll e moléculas homólogas foram encontrados posteriormente em mamíferos,
sendo então designados como receptores do tipo toll (TLR) (Vogel e cols., 2003).
Entre os mamíferos são conhecidos 10 TLRs (Akira, 2003). Esta família de receptores
possui uma porção extracelular rica em leucina, que é essencial para o reconhecimento
molecular, e, ainda, uma porção citoplasmática altamente conservada (Baratin e cols.,
2005), através da qual um grupo de proteínas, denominadas adaptadoras, os conectam às
vias de sinalização intracelular (Vogel e cols., 2003). Assim, a ligação de componentes dos
microorganismos aos TLRs induz a ativação das proteínas adaptadoras que desencadeia à
rápida ativação dos fatores de transcrição gênica, como o NF-κB e os IRFs que, uma vez
ativados, translocam-se para o núcleo e induzem a expressão de vários genes envolvidos na
resposta imunológica, incluindo genes que codificam citocinas, quimiocinas, moléculas de
MHC e co-estimuladoras (Miettinen e cols., 2000; Medzhitov, 2001). Por fim, a expressão
destas moléculas direcionará a resposta inflamatória.
Vários são os ligantes para TLR. Entre as PAMPs, os lipopolissacarídeos (LPS) são
grandes indutores de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-6, e IL-12, além de
substâncias inflamatórias como leucotrienos, prostanóides e óxido nítrico em monócitos.
Estudos mostraram que TLR-4 associado a uma glicoproteína de superfície, CD14, e
também a uma outra proteína, MD-2, é responsável pelo reconhecimento do LPS (da Silva
e cols., 2001).
Por outro lado, alguns autores mostraram, através de estudos in vitro e in vivo com uso
de células e camundongos deficientes em TLR-2, que este receptor é essencial para o
reconhecimento de peptideoglicano, lipoproteína e ácido lipoteicóico, presentes em paredes
celulares de bactérias gram-positivas (Takeuchi e cols., 1999; Yoshimura e cols., 1999);
(Han e cols., 2003).
21
Um grande número de observações sugere ainda que TLR-1 e TLR-6 interagem com
TLR-2, influenciando diretamente nas respostas primariamente mediadas por TLR-2. A
expressão de TLR-1, por exemplo, aumenta a ativação de NF-κB dependente de TLR-2 em
resposta a Neisseria meningitidis (Wyllie e cols., 2000). Além disto, células deficientes em
TLR-6, bem como deficientes em TLR-2, são incapazes de produzir citocinas em resposta
ao zimosam (Takeuchi e cols., 2001).
Outros estudos utilizando DNA bacteriano com seqüências não metiladas CpG, e mais
recentemente AT, revelaram o papel de TLR-9 no reconhecimento destes e indução de uma
resposta protetora (Shimosato e cols., 2005). Além disto, um componente do flagelo da
bactéria Listeria monocytogenes foi identificado como ligante para receptor TLR-5,
induzindo ativação de células epiteliais e macrófagos murinos (Hayashi e cols., 2001).
Além destes ligantes, fitas duplas de RNA e análogos sintéticos de imidazoquinolina
também foram caracterizadas como importantes substâncias reconhecidas por TLR-3 e
TLR-7 respectivamente (Alexopoulou e cols., 2001; Hemmi e cols., 2002).
A capacidade de ativar diferentes formas de resposta a partir do reconhecimento de
diversas moléculas conservadas provém das variadas vias de sinalização a que está ligado
cada receptor. Como forma de simplificar a visualização dos mecanismos de sinalização
intracelular, estas vias podem ser dividas em dois grupos: dependentes e independentes de
MyD88 (Akira & Hoshino, 2003). A interação entre os diversos receptores TLR e a
molécula adaptadora MyD88 desencadeia uma série de novas interações intermoleculares
no interior celular que, por fim, determina a translocação de fatores de transcrição gênica,
direcionando a expressão de diversas citocinas, assim como a ativação de outras atividades
celulares. Do mesmo modo, receptores TLR que não estão conectados a esta molécula
desempenham suas funções utilizando, no entanto, outras moléculas adaptadoras (Vogel e
cols., 2003) .
Entre os receptores do tipo toll, TLR-1, TLR-2, TLR-6, TLR-5, TLR-7, TLR-8 e TLR-9
estão conectados à via de sinalização por meio do conector MyD88. Os receptores TLR-3 e
TLR-4, por outro lado, permanecem atuando mesmo após completa exclusão deste
adaptador (Akira & Hoshino, 2003). É interessante dizer que TLR-4, na verdade, possui
uma menor atividade nesta situação, mostrando que este receptor atua de forma dependente
e independente de MyD88 (Kawai e cols., 1999; Kawai e cols., 2001). Apesar dos
22
mecanismos de sinalização estarem diretamente relacionados à participação de MyD88,
muitas outras proteínas conectoras contribuem para o processo até à mensagem final,
tornando, assim, a resposta à ativação destes receptores extremamente complexa (Vogel e
cols., 2003).
Alguns trabalhos têm demonstrado a participação dos TLRs nas mais diversas
patologias, caracterizando a importância da ativação dos mesmos para a indução de
citocinas e quimiocinas relevantes à eliminação dos agentes patogênicos. TLR-4, por
exemplo, demonstrou grande contribuição no controle da infecção por Leishmania major
em camundongos, uma vez que sua ausência determinou a diminuição na produção de
óxido nítrico induzida pelo patógeno (Kropf e cols., 2004). A expressão gênica de
quimicionas em camundongos deficientes em TLR-4, infectados por este mesmo
protozoário, foi avaliada por Antoniazi e colaboradores (2004). Neste trabalho, não foram
evidenciadas diferenças para as quimicionas CCL2, CCL5, CXCL10 e CCL3/MIP-1α, entre
camundongos deficientes ou não em TLR-4. Em outro estudo, utilizando camundongos
deficientes, este receptor mostrou-se importante na indução da imunidade mediada por
célula e resistência à infecção por Brucella abortus. Sua participação, neste caso, foi
essencial para a indução da expressão de TNF-α e IL-12 por este patógeno (Campos e cols.,
2004). Por outro lado, camundongos deficientes em TLR-2 demonstraram-se susceptíveis à
infecção ao Staphilococcus aureus, evidenciando sua importância para o direcionamento de
uma resposta imune eficaz (Takeuchi e cols., 2000).
A interação entre as moléculas ligantes e os TLRs correspondentes pode, além de
determinar a expressão de citocinas e quimiocinas específicas, induzir ativação, modulação
e proliferação de alguns tipos celulares, contribuindo de forma significativa para a
estimulação e controle do processo inflamatório.
Estudo realizado por Liu (2006) demonstrou que a ativação de TLR-2 é capaz de
modular a função de células T reguladoras CD4+ CD25+, diminuindo, de forma transitória,
sua atividade. Por outro lado, foi observado que sua ativação induziu a proliferação destas
mesmas células e, também, a ativação e expansão de células efetoras. Assim, este trabalho
propôs um perfil de resposta desencadeado por TLR-2, onde a eliminação do patógeno é
favorecida após a inibição das células T reguladoras e ativação das células T efetoras.
Entretanto, segundo a mesma proposta, a eliminação do patógeno leva à diminuição dos
23
ligantes de TLR-2, o que promove o restabelecimento das funções das células T
reguladoras, anteriormente expandidas pela ativação deste receptor, promovendo um
controle mais eficaz da resposta imune desencadeada pelo agente patológico.
Outro estudo recente, sobre a participação dos TLRs nos mecanismos de ativação de
células T CD4, demonstrou que a geração de células T de memória não é suficientemente
induzida apenas por uma resposta primária por células T. Foi verificado, então, que a
ativação de vias de sinalização por TLR é essencial para o desenvolvimento de células T
de memória (Pasare & Medzhitov, 2004). Além disto, foi observado que a ativação de
mecanismos dependentes de TLR confere, às células dendríticas, capacidade de estimular
células NK (Zanoni e cols., 2005). Estes trabalhos comprovam a participação destes
receptores no controle da resposta inflamatória.
É interessante observar que os perfis de resposta, originados a partir da ativação de
diferentes receptores, podem se sobrepor, desencadeando aumento ou diminuição na
resposta final. Dentro deste contexto, um estudo realizado por Strominger e Re (2004)
buscou avaliar a resposta imune após o estímulo concomitante de vários receptores TLR,
através da dosagem de citocinas. Este estudo demonstrou, através do uso de ligantes
purificados, que a indução da expressão de IL-10 por TLR-2, em células dendríticas
humanas, bloqueou a expressão de citocinas de perfil TH1, especificamente induzidas por
TLR -3 e -4, como IL-12 e IFN-γ. Por outro lado, a indução da citocina reguladora IL-10
não impediu o estímulo das citocinas IL-15 e IFN-β.
Considerando os diversos trabalhos já realizados para a compreensão da ação dos
receptores TLR, pode-se verificar a grande importância destes dentro do sistema
imunológico como um todo. Apesar disto, a imensa variedade de respostas induzidas por
estes receptores torna o estudo de suas atividades extremamente necessário para a
compreensão dos mecanismos específicos decorrentes de diferentes processos patológicos.
Participação das citocinas e quimiocinas na resposta imunológica
As citocinas compreendem um amplo grupo de moléculas protéicas, secretadas por
células do sistema imunológico, capazes de regular as reações imunes, atuando como
agentes mensageiros deste sistema.
24
A expressão das citocinas é estritamente regulada. Em geral, não se observa uma
produção constitutiva destas moléculas, sendo necessária uma ativação celular para se tenha
quantidade suficiente para execução de suas atividades biológicas. Outras características
desta família são extremamente importantes para o controle rigoroso da resposta
imunológica. Além de expressadas de forma transitória, elas são capazes de atuar em
diferentes tipos celulares, e em sinergismo ou antagonismo a outras citocinas. Mais de uma
citocina pode, ainda, atuar ao mesmo tempo em uma mesma célula. A ligação específica e
de alta afinidade com os receptores celulares é também outra propriedade deste complexo.
As ações das citocinas podem ser locais ou sistêmicas. Em grande parte, estas
proteínas agem próximo ao seu local de excreção, tanto em células adjacentes quanto na
célula de origem. Entretanto, em grandes quantidades podem atingir a circulação e atuar de
forma sistêmica, o que é raramente desejável.
Ao se ligarem em seus receptores celulares, a maior parte das citocinas desencadeia
alterações na expressão gênica destas células, resultando na ativação de outras funções,
proliferação celular ou mesmo produção de outras citocinas. Assim, este grupo de
moléculas tem importante participação na mediação e regulação das respostas imunes
inatas e adaptativas e, ainda na hematopoiese.
Entre as que participam da resposta imune inata estão o TNF-α, a IL-1, a IL-12, a
IL-10, o IFN-γ, as quimiocinas e outras como IL-6, IL-15 e IL-18. Dentre estas, destacamse o TNF-α, o IFN-γ, a IL-10, a IL-4 e algumas quimiocinas, que serão objetos deste
estudo.
O TNF foi assim designado por sua capacidade de induzir apoptose em diferentes
tipos celulares (Laster e cols., 1988). No entanto, sabe-se, hoje, que esta citocina
desempenha, além desta atividade, papel fundamental na indução de uma resposta
inflamatória. Entre suas funções estão a estimulação de neutrófilos e monócitos o
recrutamento para os sítios de inflamação, através da indução de expressão de moléculas de
adesão por células do endotélio vascular e também de quimiocinas, e a estimulação da
secreção de IL-1 por fagócitos mononucleares (Barna e cols., 1994; Livingston e cols.,
1989; Sasaki e cols., 2003; Xia e cols., 1998). O TNF é produzido, principalmente, por
macrófagos ativados, mas também por células T e NK estimuladas por antígeno (Urban e
cols., 1986). É fortemente expresso após estímulo por lipopolissacarídeo, LPS, bacteriano
25
gram-negativo, e suas funções são influenciadas pelos tipos de receptores aos quais irá se
ligar na célula-alvo (Yoshimura e cols., 1997).
Embora não apresentem função estimuladora celular, as quimiocinas desempenham
importante função na resposta imune. Elas são responsáveis pelo recrutamento e migração
dos tipos celulares envolvidos no processo inflamatório e, conseqüentemente, na
eliminação do patógeno ou antígeno associado. Podem também ser produzidas
constitutivamente por várias células de diversos tecidos e, assim, regulam o tráfego celular
normal do sistema imune. Entretanto, em resposta a estímulos externos, os leucócitos são
induzidos a produzir quimiocinas que determinarão o fluxo de células inflamatórias para os
locais específicos (Le e cols., 2004).
As quimiocinas compreendem um grupo de moléculas que pode ser dividido em
dois outros grupos principais: as famílias CXC e CC. Duas outras classes de quimiocinas
foram também descritas: C e CX3C. Esta nomenclatura foi estabelecida com base no
arranjo dos resíduos N-terminais de cisteína comuns às moléculas de quimiocinas, no
intuito de facilitar a identificação das mesmas. Desta forma, a família CXC, por exemplo,
possui um aminoácido entre os dois resíduos de cisteína e a família CC possui os dois
resíduos adjacentes. A classe C, por sua vez, possui apenas um resíduo de cisteína,
enquanto a classe CX3C possui 3 aminoácidos entre os resíduos de cisteína (Zlotnik &
Yoshie, 2000).
Em uma reação inflamatória, as quimiocinas CXC atuam principalmente sobre os
neutrófilos e as CC, sobre monócitos, linfócitos e eosinófilos. As quimiocinas de ambos os
grupos são produzidas por leucócitos e outros tipos celulares como células endoteliais,
epiteliais e fibroblastos. A expressão pode ser induzida por microorganismos e/ou mesmo
por citocinas como TNF e IL-1. Algumas quimiocinas da família CC podem, ainda, ser
produzidas por células T ativadas por antígenos (Ono e cols., 2003).
A expressão de diversos receptores para quimiocinas, nos diferentes tipos de células
do sistema imune, determinará o perfil celular deslocado para o sítio de resposta. É
importante salientar que alguns receptores podem se ligar a mais de um tipo de quimiocina
e, ao mesmo tempo, uma quimiocina pode se ligar a mais de um receptor específico. Dentro
da família das quimiocinas vale ressaltar a importância da CCL2, responsável pelo
recrutamento de monócitos (Hardy e cols., 2004), da CCL5, pelo recrutamento misto de
26
leucócitos (Marfaing-Koka e cols., 1995), e CXCL10, pelo deslocamento células NK para
os sítios de resposta (Wald e cols., 2006).
Alguns trabalhos têm evidenciado a importância das quimiocinas para o controle de
algumas patologias, bem como demonstrado o aumento de suas concentrações em situações
específicas. CCL2, por exemplo, encontra-se em concentrações elevadas na pancreatite. A
quimiocina CCL5, por sua vez, contribui fortemente para o desenvolvimento e manutenção
da asma crônica, por fungos, em camundongos, através do recrutamento seletivo de
leucócitos e eosinófilos (Schuh e cols., 2002). Por outro lado, estudo realizado por
Antonelli e colaboradores, em 2004, demonstrou a prevalência de altas concentrações de
CXCL10 circulante em pacientes com hipotiroidismo (Antonelli e cols., 2004). Vasquez e
Soong (2006) verificaram que a injeção local de CXCL10 em lesões de infecção por
Leishmania amazonensis reduz significativamente o número de parasitas, mostrando o
papel protetor desta quimiocina para esta doença.
Quimiocinas
Nomenclatura
Nomenclatura
Atual
antiga
CCL2
MCP-1
CCL3
MIP-1α
CCL4
MIP-1β
CCL5
Rantes
CCL7
CCL8
CCL13
CXCL8
CXCL10
MCP-3
MCP-2
MCP-4
IL-8
IP-10
Receptor
CCR2
CCR1, CCR5
CCR5
CCR1, CCR3 ,
CCR5 e CCR9
CCR1, CCR2, CCR3
CCR3, CCR5
CCR2, CCR3
CXCR1,CXCR2
CXCR3
Células Recrutadas
Monócitos, células NK
Misto de leucócitos
Células T, DCs,
Monócitos e NK
Misto de leucócitos
Misto de leucócitos
Misto de leucócitos
Misto de leucócitos
Neutrófilo
Células NK
Tabela 1. Quimiocinas – Revisto por Haringman e cols. (2004) ; Rollins (1997); Rottman (1999).
Entre as citocinas, o IFN-γ tem papel destacado e é considerada a principal citocina
ativadora de macrófagos, exercendo funções fundamentais e críticas na imunidade inata e
adaptativa mediada por células. Sua participação é imprescindível para uma função
microbicida eficaz exercida pelo macrófago (Nathan e cols., 1983). Sua ação ocorre
mediante estimulação da síntese de reativos de oxigênio e óxido nítrico, através da ativação
da transcrição de genes que codificam as enzimas necessárias para a formação destes
27
compostos. Além disso, o IFN-γ estimula a produção de diversas proteínas como moléculas
de MHC de classe 2 (Collins e cols., 1984). Esta citocina promove, ainda, a diferenciação
de células T CD4+ TH0, para o subtipo TH1 e inibe, desta forma, a proliferação de células
TH2 (Gajewski & Fitch, 1988). Por este motivo e por ser produzida também por células
TH1, sua presença tem sido utilizada como marcador do tipo de resposta imunológica
celular.
Outra citocina tem se apresentado como fundamental para o controle da resposta
inflamatória: a IL-10. Esta interleucina é uma citocina reguladora, capaz de inibir a ação de
macrófagos e células dendríticas ativados, regulando e controlando as reações da imunidade
inata e adaptativa (Cassatella e cols., 1993). Sua função pode ocorrer através da inibição da
produção de IL-12 e outras citocinas como IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α (de Waal e cols.,
1991). Sua participação no controle de diversas patologias tem sido amplamente estudada.
A indução da expressão desta citocina por probióticos, por exemplo, tem se mostrado
importante no controle de patologias como a colite em murinos (Di e cols., 2005)
Entre as citocinas participantes de uma resposta TH2, a IL-4 é considerada como
característica deste processo. Esta citocina é capaz de inibir a ativação de macrófagos
mediada por IFN-γ e também promover a diferenciação de células T TH0 para o subtipo
TH2. Este efeito foi verificado por Chatelain e Coffman, em 1992, em camundongos
infectados por Leishmania major (Chatelain e cols., 1992). Além disto, pode estimular a
troca de classe de imunoglobulinas de células B para o isotipo IgE (Lebman & Coffman,
1988).
É importante perceber que o conhecimento das funções das citocinas e quimiocinas
possibilita uma avaliação mais apurada do desenvolvimento dos eventos inflamatórios,
sejam eles decorrentes de infecções, respostas auto-imunes ou qualquer outro processo.
Deste modo, a variação na concentração local ou sistêmica destas substâncias, ou mesmo a
detecção da expressão gênica das mesmas, permite, também, visualizar diferentes etapas de
uma resposta inflamatória, ou ainda avaliar e acompanhar a eficácia de um possível
tratamento.
28
.
Justificativa
29
JUSTIFICATIVA
Justificativa
A busca por vacinas eficazes contra as mais diversas patologias que afligem os seres
humanos tem sido um dos maiores desafios para a ciência. As tentativas de
desenvolvimento de formulações eficientes contribuíram para o crescimento do
conhecimento sobre os probióticos, um dos mais promissores adjuvantes para vacinas
profiláticas. Diversos estudos demonstram o papel destes probióticos no direcionamento de
uma resposta imunológica efetiva, seja ativando o sistema fagocitário mononuclear, seja
induzindo a produção de citocinas específicas.
Para se avaliar a capacidade de um probiótico em modular a resposta imune, é
interessante saber previamente o tipo de resposta esperada para a indução de um perfil de
resistência a um determinado patógeno.
Para o caso da leishmaniose, principal alvo de estudo de nosso laboratório, uma
estratégia utilizada é a indução de uma resposta TH1 através do uso de adjuvantes nas
vacinas.
Dados obtidos em nosso laboratório mostraram que o Lactobacillus delbrueckii
UFV H2b20 induziu a produção de citocinas características de uma resposta TH1 como IL12, IFN-γ, TNF-α por células do sistema mononuclear do sangue periférico de voluntários
normais. Além disto, neste mesmo trabalho, realizado por Castanheira e colaboradores
(2007), o Lactobacillus delbrueckii foi capaz de ativar macrófagos infectados com L.
amazonensis e primar células T virgens, induzindo a diferenciação em linfócitos TH1
específicos.
Estes resultados direcionaram a realização de novos estudos que, por fim,
evidenciaram que esta bactéria ácido lática foi incapaz de proteger camundongos BALB/c
da infecção por Leishmania braziliensis. Estes dados, entretanto, divergiram de outros,
obtidos neste mesmo trabalho, onde se observou uma forte indução, in vitro, de uma
resposta TH1. Esta resposta foi caracterizada pela detecção da produção de IFN-γ, TNF-α e
IL-12 por esplenócitos de camundongos BALB/c, induzidos por L. delbrueckii morto pelo
calor.
30
Os estudos supracitados demonstraram a importância de se caracterizar, de forma
mais aprofundada, os mecanismos envolvidos na indução diferencial da resposta
imunológica pelas bactérias probióticas, incluindo o L. delbrueckii.
Uma avaliação correta de tais mecanismos deve considerar a participação dos
receptores envolvidos no reconhecimento do adjuvante e suas vias de sinalização, assim
como as estruturas moleculares responsáveis pela ativação destes receptores.
Entre os receptores celulares responsáveis pelo reconhecimento dos patógenos têm
se destacado, em estudos recentes, os TLRs.
A estimulação destes receptores por determinadas moléculas associadas a patógenos
é capaz de levar à produção específica de citocinas, que, por sua vez, determinarão o
sentido da resposta e os tipos celulares envolvidos.
Alguns trabalhos têm revelado, por exemplo, a indução de IL-10, IL-6, TNF-α,
IFN-γ, CXCL10 e IL-12 por TLRs, além de demonstrar a participação destes no controle de
patógenos como Leishmania sp e Brucella sp. (Antoniazi e cols., 2004; Campos e cols.,
2004; Heinzel e cols., 1991).
Diante do exposto, optou-se por avaliar a capacidade do Lactobacillus delbrueckii
UFV H2b20 em induzir, in vitro, uma resposta TH1 efetiva em esplenócitos de
camundongos, e avaliar o envolvimento de TLRs, especificamente TLR-2 e TLR-4, nesta
indução.
31
Objetivos
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OBJETIVOS
Objetivos
Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo geral analisar a capacidade do Lactobacillus
delbrueckii UFV H2b20 em induzir, in vitro, uma resposta TH1 efetiva em esplenócitos de
camundongo, bem como avaliar a possibilidade do envolvimento de TLRs, TLR-2 e TLR4, nesta indução.
Objetivos Específicos
Verificar, in vitro, a indução, por Lactobacillus delbrueckii autoclavado, extrato
de Parede de L.delbrueckii e fração sem parede, da produção de uma resposta TH1 por
esplenócitos de camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeJ, C3H/HeN, TLR-2 -/-, através
da dosagem das citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-4.
Verificar a transcrição de RNA mensageiros para quimiocinas e citocinas (IFN-γ,
IL-10, CCL2, CCL5 e CXCL10), em esplenócitos dos camundongos BALB/c, C57BL/6,
C3H/HeJ, C3H/HeN, TLR-2 -/- induzidos, in vitro,
por Lactobacillus delbrueckii
autoclavado, em diferentes dosagens.
Avaliar o efeito da variação da dose dos estímulos utilizados na indução da
produção e transcrição de RNAm de citocinas e quimiocinas por esplenócitos dos
camundongos citados.
Identificar e caracterizar as moléculas presentes no Extrato de parede de L.
delbrueckii.
33
Material e Métodos
34
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
Animais Experimentais
Foram utilizados camundongos fêmeas e machos, com idade média entre cinco e
oito semanas, das seguintes linhagens: BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN, C3H/HeJ, TLR-2 -/-.
Os animais BALB/c e C57BL/6 eram provenientes do Biotério Central da Universidade
Federal de Ouro Preto. Os demais foram adquiridos na Fundação Oswaldo Cruz (MG). Os
animais eram mantidos em estante com sistema de filtração de ar, recebendo água e ração
ad libidum.
Microorganismos
Foi utilizado o microorganismo Lactobacillus delbrueckii estirpe UFV H2b20
fornecido pelo Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, Minas
Gerais. As culturas deste foram trazidas em meio Ágar + MRS (De Man, Rogosa e Sharp,
Merck, São Paulo, Brasil) e repicadas duas vezes em caldo MRS (De Man, Rogosa e Sharp,
Difco Becton, Dickinson and Company, USA) sendo incubadas por dezoito horas a 37 °C.
Posteriormente as culturas foram congeladas em leite desnatado reconstituído (LDR) a 12%
(Molico, Nestlé, São Paulo, Brasil) a uma temperatura de -70 °C.
Para a realização de cada experimento, as culturas em LDR 12% eram
descongeladas à temperatura ambiente e repicadas duas vezes em caldo MRS para ativação
(Neumann e cols., 1998).
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Obtenção do Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 Íntegro
As culturas ativadas eram adicionadas em tubos estéreis de polipropileno de fundo
cônico com capacidade para 15ml (Falcon-Becton Dickinson Labware and Company
Franklin Lakes NJ, USA) e centrifugadas a 2740 x g por 23 minutos, a 4°C. Desprezava-se
o sobrenadante e lavava-se o sedimento por duas vezes em solução salina tamponada com
fosfato (PBS) estéril. Após este procedimento os microorganismos eram ressuspendidos
para o volume original de PBS (10mL). Retirava-se uma alíquota da suspensão de bactérias
e a diluía-se 1:10 em PBS, para leitura em espectrofotômetro a 550nm. Utilizando-se o
valor de transmitância, calculava-se a quantidade total de bactérias existentes e ajustava-se
a concentração de bactérias de modo a se obter 1x1010 UFC/ml. A cultura era, então,
autoclavada a 121°C, por 15 minutos. A preparação era resfriada à temperatura ambiente e
aliquotada. Em seguida, as preparações eram armazenadas a uma temperatura de -70°C, até
sua utilização para realização dos experimentos.
Obtenção do Extrato de Parede do Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20
As culturas, depois de descongeladas e repicadas duas vezes em caldo MRS, eram
lavadas por duas vezes em PBS estéril, como descrito acima. A seguir, ressuspendiam-se os
microorganismos em 10mL de PBS e retirava-se uma alíquota da cultura, para
quantificação das bactérias por leitura espectrofotométrica, conforme já descrito. Após
ajuste da concentração, procedia-se autoclavação a 121°C, por 15 minutos, seguida do
resfriamento da preparação à temperatura ambiente.
O material obtido era centrifugado três vezes a 2740 x g, por 20 minutos, a 4° C, em
tampão HEPES 50mM, pH 7,0 (Sigma – Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA),
contendo 20mM de CaCl2 (Reagen, RJ, BR). Após este procedimento, realizava-se novo
processo de lavagem utilizando tampão fosfato 50mM, pH 7,0 (Synth-Labsynth, SP, BR;
VETEC-Vetec Química Fina Ltda, RJ, BR). A seguir, o sedimento era ressuspendido nesta
mesma solução e a suspensão incubada a 30 °C por duas horas. Utilizou-se a razão de 10
µL de tampão fosfato para 1 mg de sedimento obtido. Após a incubação, a preparação era
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centrifugada a 12.000 x g durante cinco minutos, a 4°C . O sobrenadante era rotulado como
“extrato de parede”. O sedimento, era rotulado como “Lactobacilo sem parede” e
ressuspendido em PBS de modo a atingir uma concentração igual a 1x1010 UFC/mL.
Ambos eram armazenados em uma temperatura igual a -70 °C, até o momento de utilização
nos experimentos (Tsakalidou e cols., 1999).
Para possibilitar as análises moleculares por espectrometria de infravermelho,
amostras de Extrato de Parede foram concentradas por centrifugação a vácuo (Speed-Vac),
por 4 (quatro) horas
Identificação da Molécula Imunoestimuladora Presente no Extrato de Parede do L.
delbrueckii
Detecção da Presença de Carboidratos por Dot-Blot
A análise da presença de carboidratos foi realizada através da aplicação das
amostras do extrato de parede do Ldmc em membrana de PVDF (Gelman Sciense) e
posterior incubação em 1mM de MnCl2 em presença de 50mg/mL de ConA (concanavalina
A) (Bouvier e cols., 1985).
Detecção da Presença de Carboidrato e Lipídeos por Ensaio Enzimático
O extrato de parede foi submetido à dosagem de carboidratos e Lipídeos pelo
método de ensaio bioquímico enzimático colorimétrico, utilizando-se kits de diagnósticos
laboratoriais Bioclin, kit Glicose Crystal e kit Triglicérides Crystal (QUIBASA, Belo
Horizonte, BR). Estes testes foram realizados no Laboratório Piloto de Análises Clínicas da
Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto (LAPAC-UFOP).
37
Cromatografia de Camada Delgada
Para identificação das características da molécula imunoestimuladora presente no
Extrato de Parede, foi realizada cromatografia em camada delgada utilizando-se placas de
sílica e mistura dos eluentes etanol, acetato de etila e água em diferentes proporções. Para
revelação, as placas eram incubadas em câmara de iodo por 18 horas.
Espectrometria de Infravermelho
Para
identificação
dos
grupos
moleculares
presentes
na
molécula
imunoestimuladora, o Extrato de Parede, concentrado por centrifugação a vácuo, foi
analisado por espectrometria de infravermelho, após incorporação da amostra em nujol e
pastilhas de KBr.
Experimentos de Imunoestimulação in vitro e Isolamento de células mononucleares
Os experimentos foram realizados utilizando-se esplenócitos dos camundongos das
linhagens anteriormente citadas. Para obtenção das células, os animais foram sacrificados
por deslocamento cervical e tiveram seus baços coletados. Os órgãos foram processados em
homogeneizador de vidro, e concentração celular ajustada para 5x106 células/mL de meio
de cultura, em meio DMEM (HYCLONE – Logan, Utah, EUA) acrescido de 10% de soro
fetal bovino, 2mM de L-glutamina, 25mM de HEPES, 50µM de 2-mercaptoetanol
(Pharmacia Biotech – Uppsala, Suíça) e 100µg/mL de sulfato de estreptomicina (Sigma –
Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA) e 100unidades/mL de penicilina G. Para a
cultura das células foram utilizadas placas de 48 poços de poliestireno, e cada poço recebeu
0,5mL da suspensão de células. As células foram estimuladas com diferentes concentrações
do Ldmc, do extrato de parede ou Lactobacilo sem parede, a fim de avaliar a produção de
citocinas. Para dosagem de TNF-α, o sobrenadante foi coletado após 24 horas de cultura, e
para IL-4, IFN-γ o sobrenadante foi coletado após 48 horas de cultura. Estes tempos foram
determinados com base em experimentos realizados anteriormente em nosso laboratório,
38
em que se verificou o aumento da produção destas citocinas após estes intervalos de
incubação.
Dosagem de Citocinas
Foram dosadas as citocinas IL-4, e IFN-γ pelo método imunoenzimático ELISA
(enzyme linked immunosorbent assay), tipo captura.
Para dosagem dessas citocinas foram utilizadas placas de 96 poços (Nunclon
Maxisorp-Nalge, Nunc. International), que eram sensibilizadas com o anticorpo
monoclonal contra a citocina de interesse e deixadas a 5°C por dezoito horas. Logo após,
procedia-se o bloqueio das placas com PBS suplementado com 5% de soro fetal bovino
(SFB) por 30 minutos a 25°C. Decorrido esse tempo, os sobrenadantes das culturas, bem
como o padrão da citocina de interesse, eram adicionados às placas, seguindo-se incubação
por duas horas, a 25°C. Após a adição do segundo anticorpo, seguia-se nova incubação por
uma hora a 25°C. Na etapa seguinte, o anticorpo ligado à enzima peroxidase era
adicionado, com incubação também a 25°C durante uma hora. Adicionava-se, então, o
substrato para a peroxidase, juntamente com o cromóforo, para a formação de um produto
colorido, facilmente detectável através da leitura da absorbância. Entre cada etapa, as
placas eram submetidas à lavagem em solução salina com 0,5% de Tween 20
(Polioxietileno sorbitano monolaurato-Labsynth Ltda., Diadema-SP, Brasil).
Para dosagem de IL-4, foram utilizados os anticorpos monoclonais 11B11 (anti IL4), e para captura o BVD-6 biotinilado para reação enzimática. Como conjugado foi
utilizada estreptoavidina-peroxidase (Zymed Laboratories, Inc. - So. São Francisco, CA,
EUA). A dosagem da citocina IFN-γ foi feita utilizando-se o anticorpo monoclonal de
captura R46-A2, e como segundo anticorpo, IgG de coelho anti IFN-γ de camundongo. O
conjugado utilizado foi o anti-IgG de coelho peroxidase (Zymed Laboratories, Inc. - So.
São Francisco, CA, EUA). A revelação dos ensaios foi feita com o cromóforo ABTS
(Sigma Chemical Co. - St. Louis, MO, EUA), tendo como substrato H2O2 30 volumes. A
leitura foi feita em leitor de ELISA (Emax - Molecular Devices - Sunnyvale, CA, EUA) em
filtro de 405nm. Como padrões para cálculo das quantidades de citocinas, foram utilizados
padrões de IL-4 e IFN-γ murino recombinantes (R&D Systems, Inc. - Minneapolis, MN,
39
EUA). O limite de detecção foi de 15,6 pg/mL para IL-4 e IFN-γ. Os anticorpos, R46-A2,
IgG de coelho anti- IFN-γ, 11B11 e BVD-6 biotina são de produção própria do laboratório.
Bioensaio de TNF
Para dosagem de TNF, foi realizado o bioensaio com linhagem de células WEHI
previamente descrito por Lattime e cols. (1988). As amostras e o padrão foram diluídos em
meio para WEHI, contendo RPMI pH 7,2 (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA)
acrescido de 10% de SFB, 2 mM de L-glutamina, 100 µg/mL de sulfato de streptomicina,
100 unidades/mL de penicilina G e 1,0 mL de solução de aminoácidos não essenciais 100 X
concentrado (890 mg/mL de L-alanina, 1320 mg/mL de L-asparagina, 1330 mg/mL de Lácido aspártico, 1470 mg/mL de L-ácido glutâmico, 750 mg/mL de L-glicina, 1150 mg/mL
de L-prolina e 1050 mg/mL de L-serina). O padrão utilizado foi TNF recombinante (rTNF)
murino (R&D Systems Inc. – Mineapolis, MN, USA) na concentração de 9,5 ng/mL. Após
as diluições descritas pela técnica, foram adicionados 1x106 células WEHI-164, tratadas
com actinomicina D (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA), à placa onde se
realizava o bioensaio, seguindo-se incubação a 37°C / 5% de CO2, por 24h. Após esse
período, foi adicionado MTT (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA) a 2,5 mg/mL
como metabólito para as células WEHI para determinação indireta de TNF-α, e as placas
foram novamente incubadas, sob as mesmas condições, durante 4 h. A seguir, adicionou-se
SDS 10% (VETEC, Rio de Janeiro, RJ, BR) em HCl 0,01M, e a placa foi incubada por 16h.
Procedeu-se, então, à leitura no leitor de ELISA (Emax - Molecular Devices - Sunnyvale,
CA, EUA), em filtro de 570 nm. A curva padrão foi submetida à regressão log-logit, e o
limite de detecção foi de 0,1 pg/mL.
Coleta de células e extração de RNA de células induzidas in vitro
Primeiramente, as placas com as amostras de interesse, eram centrifugadas por 10
minutos a 210 x g a 4 °C , utilizando rotor apropriado. Posteriormente, o sobrenadante era
coletado, e sobre os poços eram adicionados 0,5 mL de solução salina tamponada (PBS)
estéril. As placas eram deixadas em gelo por 15 minutos para que as células presentes no
40
fundo de cada poço se soltassem da placa. Utilizando-se pipetador automático, o PBS era
homogeneizado nos poços para retirada completa das células aderidas.
As amostras eram transferidas (PBS + Células) para tubos estéreis de polipropileno
de fundo cônico com capacidade para 15ml (Falcon-Becton Dickinson Labware and
Company Franklin Lakes NJ, USA) e uma alíquota era retirada para contagem de células.
A seguir, as amostras eram novamente centrifugadas por 10 minutos, 4 °C e 210 x g. O
sobrenadante era, então, descartado. Para cada 1 x 106 células, por amostra, era adicionado
120 µL de solução desnaturante. A partir disto, procedia-se a extração de RNA das
amostras, utilizando o kit de extração de RNA (RNAgents® total RNA Isolation System Promega), segundo protocolo do próprio fabricante.
Para quantificar o RNA, realizou-se uma diluição de 2 µL do mesmo em 500 µL de
água DEPC. As amostras foram lidas em espectrofotômetro a 260 nm. Para avaliar a
pureza das amostras em relação à concentração de proteínas, fazia-se também uma leitura
em 280 nm. Uma relação de leitura 260nm /280 nm superior a 1,8 indicava um bom grau
de pureza. A concentração de RNA era, então, determinada pelo cálculo [RNA] (µg/ µL) =
Abs 260 nm x 40 x 250
1000
O RNA total obtido de cada amostra era armazenado em tubos apropriados a -70
°C.
Síntese de cDNA por RT-PCR
Após a quantificação, os RNAs das amostras eram, então, submetidos à transcrição
reversa para obtenção do cDNA, utilizando reagentes do kit Superscript® (Invitrogen) e
seguindo instruções do fabricante.
Amplificação por PCR
Para amplificação dos genes de interesse por PCR (Polymerase Chain Reaction), foi
utilizado termociclador automático (MasterCyclerTM / Eppendorf). Seguiram-se, assim,
41
programas de amplificação com número de ciclos e temperatura de anelamento específicos
para cada primer utilizado, como descrito na tabela abaixo.
Citocina
Primers
5’- ACCAGCTGGACAACATACTGCT-3’
IL-10
5’- CTTGTAGACACCTTGGTCTTGG -3’
Rantes/CCL5
5’-CCACGTCAAGGAGTATTTCTACACC-3’
5’ –CTGGTTTCTTGGGTTTGCTGTG’-3’
5’- GTTGGATACAGGCCAAGACTTTGTTG -3’
HPRT
5’- GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC -3’
MCP-1/CCL2
5’- GGATTCACAGAGAGGGAAAAATGG -3’
5’- CACTCACCTGCTGCTACTCATTCA -3’
5’- ACACTGCATCTTGGCTTTGC -3’
IFN-γ
5’- CTTGCTGTTGCTGAAGAAGG -3’
IP-10/CXCL10
5’- TGAGCAGAGATGTCTGAATC -3’
5’- TCGCACCTCCACATAGCTTACAG -3’
Temperatura de
Número de
Anelamento
Ciclos
54 °C
30
54 °C
26
58 °C
30
62 °C
30
47 °C
30
62 °C
32
Tabela 2. Primers de citocinas e quimiocinas
Visualização dos Produtos da PCR e Quantificação Relativa do RNA
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 6% e visualizados após coloração por nitrato de prata (Wray e cols., 1981).
Os géis foram fotografados em transiluminador e as bandas de cada gel foram analisadas
através do software Quantity One (Bio-Rad). Para análise, foram utilizados os valores de
volume ajustado de cada banda, considerando áreas idênticas para todas e o background
local de cada uma. Os valores para cada citocina eram corrigidos através da divisão pela
banda correspondente do gene da enzima constitutiva hipoxantina fosforribosiltransferase
(HPRT). Posteriormente, os valores obtidos para as amostras estimuladas foram divididos
pelos valores dos respectivos controles de cada linhagem de camundongo. Assim, os
valores finais obtidos referem-se à produção relativa de RNA da citocina frente ao controle.
42
Análise Estatística
Para avaliar a diferença estatística entre as variáveis, utilizaram-se os testes t de Student
para amostras pareadas e não pareadas, de acordo com as propriedades de cada avaliação.
Foi utilizado, também, teste de Mann-Whitney para a comparação entre dados não
paramétricos. Os resultados foram aceitos como significativos a um nível de significância
de 95% (p<0,05)
43
Resultados
44
RESULTADOS
Resultados
A capacidade de induzir a produção, in vitro, de citocinas características de uma
resposta imune do tipo 1, em camundongos BALB/c, foi verificada em nosso laboratório
por Castro (2005) . Com o intuito de verificar se espécies distintas de camundongos
apresentariam variação nos perfis de respostas imunológicas induzidas por Lactobacillus
delbrueckii UFV H2B20, optou-se por estudar a produção de citocinas pró e antiinflamatórias pelas espécies BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN.
Esplenócitos murinos destas linhagens foram, então, estimulados com L. delbrueckii
morto pelo calor (Ldmc), para posterior dosagem das citocinas IFN-γ, IL-4, TNF-α e IL-10.
A avaliação da produção destas, utilizando as metodologias de ELISA, Bioensaio e RTPCR, procurou demonstrar, também, a influência do uso de doses crescentes do estímulo.
Inicialmente, pôde-se constatar que o estímulo Ldmc foi capaz de induzir a
produção de IFN-γ e TNF-α tanto em camundongos BALB/c, como verificado
anteriormente por Castro (2005) quanto nas linhagens C57BL/6 e C3H/HeN (Fig. 1 e Fig.
2).
Os resultados encontrados permitiram observar que para todas as linhagens, a
produção de IFN-γ (Fig.1) foi mais elevada nas doses de 0,1, 0,5, 1, 5 e 10
microorganismos por esplenócito, com picos na dose 0,1 e 1, havendo um decaimento
significativo com o aumento das doses. Por outro lado, para TNF-α, embora o padrão de
resposta tenha seguido a mesma tendência que IFN-γ, é possível verificarmos que ocorre
uma maior variabilidade em sua produção (Fig.2).
Para uma melhor investigação quanto à regulação da resposta TH1, avaliou-se a
produção de IL-4, já que esta citocina pode modular negativamente o desenvolvimento
deste tipo de resposta e deslocar para TH2 (Chatelain e cols., 1992). A indução de IL-4 não
foi, no entanto, observada em qualquer uma das linhagens de camundongos (dados não
mostrados), o que sugere a ausência do estímulo de resposta TH2.
45
Fig. 1 - Produção de IFN-γγ por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes
dosagens, por camundongos de diferentes linhagens
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN, foram estimulados, com
Ldmc, nas doses indicadas. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de IFN-γ por ELISA de
captura. Os dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença
estatística (p<0,05) em relação ao controle. (**) indica diferença estatística entre as doses.
46
Fig. 2 - Produção de TNF-α
α por esplenócitos em resposta ao estímulo L. delbrueckii morto pelo calor, em diferentes
dosagens, por camundongos de diferentes linhagens
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN, foram estimulados, com
Ldmc, nas doses indicadas. Após 24 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de TNF-α por
Bioensaio. Os dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica
diferença estatística (p<0,05) em relação ao controle. (**) indica diferença estatística entre as doses.
47
Para avaliar a importância da dose na indução da resposta imune frente ao
lactobacilo, decidiu-se por selecionar duas doses que pudessem demonstrar o efeito dose
dependente para a indução das citocinas e, assim, dar continuidade ao estudo. Para tanto,
foram escolhidas as doses 1:1 e 150:1, visto as diferenças observadas nas figuras 1 e 2.
Uma comparação estatística entre estas doses mostrou uma diminuição significativa da
produção de IFN-γ após o aumento de 1:1 para 150:1. Este fato comprovou o decaimento
da indução desta citocina de forma dose dependente, mostrando a importância desta relação
para o estímulo por L. delbrueckii (Fig.1). Para a citocina TNF-α, as diferenças entre as
concentrações obtidas para estas doses demonstraram que, nas linhagens BALB/c e
C3H/HeN, a produção é maior na dose 1:1. Por outro lado, em camundongos C57BL/6 não
foi possível esta observação, embora o perfil de resposta tenha se mantido (Fig.2).
Ao avaliar a presença de RNAm para a citocina reguladora IL-10, buscou-se
averiguar se a indução de resposta TH1, caracterizada pela presença de IFN-γ e TNF-α,
poderia estar sendo controlada ou modulada. Através da técnica de RT-PCR, pôde-se
verificar sua transcrição em todas as linhagens avaliadas. No entanto, foi observado que,
apenas para BALB/c, os valores obtidos mostraram-se consideravelmente superiores ao
controle para a dose 1:1 de Ldmc. Já para C57BL/6 e C3H/HeN foram encontradas
produções relativas de RNAm com valores próximos a 1, demonstrando que esta dose foi
ineficiente para a indução desta citocina nestas linhagens. O aumento da dose para 150:1,
por sua vez, levou a uma maior transcrição desta citocina em todos os grupos de
camundongos, exceto para BALB/c, onde ocorreu uma manutenção dos valores. Apesar de
esta tendência ter sido observada, os dados não demonstraram diferenças estatisticamente
significativas (Fig.3).
48
Fig. 3 - Produção Relativa de RNAm de IL-10
Esplenócitos de camundongos BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN foram estimulados com Ldmc nas doses
indicadas. Após 48 horas, as células foram coletadas das placas e o RNA total das células foi extraído para
posterior transcrição reversa e amplificação do cDNA por PCR. As amostras obtidas foram separadas em gel
de poliacrilamida e as bandas foram analisadas, depois de fotografadas, por meio de software específico. Os
valores das bandas foram corrigidos através da divisão pela banda correspondente de HPRT (RNA de proteína
constitutiva). Posteriormente, os valores obtidos para as amostras estimuladas foram divididos pelos valores
dos respectivos controles de cada linhagem. Os dados correspondem às médias e aos desvios padrão de 3
experimentos.
49
Os resultados obtidos para as linhagens BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN, mostraram
que a estimulação por L. delbrueckii induziu de forma distinta a transcrição de IL-10. Esta
diferença pode ser determinada ou influenciada pela prevalência de receptores celulares
responsáveis pelo reconhecimento de moléculas presentes em patógenos, entre os quais se
destacam os receptores tipo Toll.
Para avaliar a importância dos receptores TLR-2 na indução da resposta imune pelo
estímulo estudado, foram realizados experimentos com camundongos deficientes para estes
receptores, TLR-2 -/-, e seus respectivos controles, C57BL/6. Foram, assim, dosadas as
citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-4 de sobrenadante de cultura de esplenócitos induzidos por
Ldmc nas doses 1:1 e 150:1. Com o objetivo de caracterizar esta participação de forma mais
completa, foi avaliada, também, a transcrição gênica de algumas citocinas e quimiocinas
por RT-PCR. Para isto, foram selecionadas as citocinas IFN-γ e IL-10, e as quimiocinas
CCL5, CCL2 e CXCL10. Ao selecionar estas quimiocinas tentou-se, mais uma vez,
minimizar os custos e, ao mesmo tempo, verificar a importância do receptor para o
recrutamento seletivo de leucócitos induzidos por Ldmc.
Entre estas duas linhagens pôde-se verificar diferença significativa na produção da
citocina IFN-γ, particularmente para a dose 1:1, onde se observou maior produção entre os
camundongos C57BL/6. Por outro lado, foram verificadas diferenças estatísticas entre as
doses 1:1 e 150:1 para as duas linhagens, assim como entre a menor dose, 1:1, e o controle
(Fig.4).
Para TNF-α, por sua vez, não foi verificado diferença significativa entre as doses,
bem como entre as linhagens (Fig.5). No entanto, os dados apresentaram a mesma
tendência de diminuição da citocina com o aumento da dose. Além disto, a presença de IL4 também não foi detectada para os camundongos TLR-2 -/- (dados não mostrados).
50
Fig. 4 - Produção de IFN-γγ por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao estímulo L.
delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens.
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados, com Ldmc, nas
doses indicadas. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de IFN-γ por ELISA de captura.
Os dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística
(p<0,05) em relação ao controle. (**) e (+) indicam diferenças estatísticas entre as doses. (^) indica a
diferença estatística entre as linhagens.
Fig. 5 - Produção de TNF-α
α por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta ao estímulo L.
delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens
51
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados, com Ldmc, nas
doses indicadas. Após 24 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de TNF-α por Bioensaio. Os dados
representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística (p<0,05)
em relação ao controle.
Já a análise da indução de mensagem para IFN-γ (Fig.6) demonstrou resultados
diferentes dos encontrados para a expressão da proteína (Fig.4). Neste caso, pôde-se
perceber que a ausência do receptor TLR-2 levou a um aumento na transcrição de RNAm
para IFN-γ, para ambas as doses consideradas. Por outro lado, os dados obtidos para as
duas linhagens não permitiram verificar diferença entre as doses, apesar de mostrarem o
mesmo perfil de decaimento observado na figura 4.
Para a citocina IL-10, foi verificado que os camundongos TLR-2 -/- apresentaram
RNAm em níveis superiores ao controle na dose 1:1, diferentemente dos camundongos
C57BL6.
O aumento da dose de Ldmc, por outro lado, desencadeou o aumento da
mensagem para esta citocina em ambas as linhagens. É interessante ressaltar que, embora
não tenha sido encontrada diferença estatística entre os dados, a ausência deste receptor
levou, aparentemente, ao aumento da citocina IL-10 (Fig.6).
Considerando-se a quimiocina CCL2, pôde-se constatar que apenas em
camundongos C57BL/6 ocorreu uma produção significativa de RNAm. Esta alta produção
só foi observada na dose 1:1, havendo grande decréscimo na dose 150:1 (Fig.6). Entretanto,
não se observou diferença significativa entre as doses, possivelmente devido ao número de
experimentos realizados terem sido relativamente pequeno. Assim, estes dados indicam que
a ausência de TLR-2 pode levar à diminuição na transcrição de RNAm para CCL2, uma
vez que camundongos C57BL/6 apresentam produção significativamente maior que a
linhagem TLR-2 -/-.
A produção relativa de RNAm para a quimiocina CCL5, também foi averiguada.
Para esta quimiocina não se observou diferença entre as doses 1:1 e 150:1, assim como não
foi verificada diferença significativa entre as linhagens (Fig.6).
A avaliação da mensagem para a quimiocina CXCL-10 mostrou maior transcrição
gênica em camundongos C57BL/6, não havendo diferença para as doses 1:1 e 150:1 de
Ldmc para as duas linhagens (Fig.6). Este fato, assim como ocorrido para CCL2, indica a
importância da presença do receptor TLR-2 nesta indução.
52
Fig. 6 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/-
Esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados com Ldmc nas doses indicadas. Após
48 horas, as células foram coletadas das placas e o RNA total das células foi extraído para posterior
53
transcrição reversa e amplificação do cDNA por PCR. As amostras obtidas foram separadas em gel de
poliacrilamida e as bandas foram analisadas, depois de fotografadas, por meio de software específico. Os
valores das bandas foram corrigidos através da divisão pela banda correspondente de HPRT (RNA de proteína
constitutiva). Posteriormente, os valores obtidos para as amostras estimuladas foram divididos pelos valores
dos respectivos controles de cada linhagem. Os dados correspondem às médias e aos desvios padrão de 3
experimentos. Os dados correspondem às médias e desvio padrão de 3 experimentos. (*) e (**) indicam
diferença estatística (p<0,05) entre os dados representados pelas colunas.
A participação do receptor TLR-4 também foi avaliada utilizando-se os mesmos
parâmetros considerados para TLR-2. No entanto, para este caso foram utilizados, nos
experimentos, animais C3H/HeJ como camundongos mutantes para o receptor, e
camundongos C3H/HeN como controle desta linhagem.
A produção da citocina pró-inflamatória IFN-γ foi observada nas duas linhagens
consideradas, assim como nas demais linhagens já analisadas. Neste caso, apesar de ter sido
observada diferença entre as doses 1:1 e 150:1, dentro de cada linhagem, não ficou
evidenciada, de forma estatisticamente significativa, a importância do receptor TLR-4 nesta
indução (Fig.7).
A presença de Ldmc também induziu a produção de TNF-α nas duas linhagens. O
aumento da dose do estímulo levou a uma diminuição da produção desta citocina, tanto
para camundongos mutantes para TLR-4, quanto para C3H/HeN. Entretanto, somente para
este último, pôde-se observar diferença significativa. Além disto, não se verificou, através
dos dados encontrados, diferença entre as linhagens para ambas as doses (Fig.8).
54
Fig . 7 - Produção de IFN-γγ por esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ em resposta ao estímulo L.
delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ foram estimulados, com Ldmc,
nas doses indicadas. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de IFN-γ por ELISA de
captura.. Os dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença
estatística (p<0,05) em relação ao controle. (**) e (***) indicam diferenças estatísticas entre as doses.
Fig. 8 - Produção de TNF-α
α por esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ em resposta ao estímulo L.
delbrueckii morto pelo calor, em diferentes dosagens
55
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ foram estimulados, com Ldmc,
nas doses indicadas. Após 24 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de TNF-α por Bioensaio. Os
dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística
(p<0,05) em relação ao controle. (**) indica diferença estatística entre as doses.
A dosagem de RNAm para IFN-γ corroborou os dados encontrados para expressão
da proteína (Fig.7), demonstrando que TLR-4 não está envolvido na indução desta citocina
por Ldmc. Além disto, evidenciou a diminuição da transcrição de forma dose dependente,
sendo esta significativa apenas para a linhagem C3H/HeN (Fig.9).
A indução da produção de RNAm para IL-10 não foi observada para estas duas
linhagens de camundongos na dose 1:1. Neste caso, a produção relativa deste RNA só se
elevou na dose de 150:1 quando comparado ao controle (Fig.9). Além disto, não se
observou diferenças significativas entre os dados obtidos para as duas linhagens,
evidenciando que a deficiência em TLR-4 não influenciou a indução de IL-10.
O gráfico para a quimiocina CCL2, por sua vez, mostrou que não há indução de sua
transcrição gênica para as duas linhagens, considerando as doses de Ldmc analisadas
(Fig.9).
Para CCL5, a análise do gráfico não permite visualizar uma queda estatisticamente
significativa em sua produção relativa para camundongos deficientes para o receptor TLR4, em relação ao seu controle. O aumento da dose de Ldmc, por sua vez, não alterou os
valores encontrados para as duas linhagens, sugerindo que, para esta quimiocina, a dose de
estímulo não interfere em sua indução (Fig.9).
Através da análise dos índices de RNAm para CXCL/10, pôde-se observar sua
produção apenas na dose 1:1 da linhagem C3H/HeN. Além disto, não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre as diferentes doses, assim como entre as
linhagens (Fig.9).
56
Fig. 9 - Produção Relativa de RNA de citocinas e quimiocinas de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ
Esplenócitos de camundongos C3H/HeN e C3H/HeJ foram estimulados com Ldmc nas doses indicadas. Após
48 horas, as células foram coletadas das placas e o RNA total das células foi extraído para posterior
transcrição reversa e amplificação do cDNA por PCR. As amostras obtidas foram separadas em gel de
poliacrilamida e as bandas foram analisadas, depois de fotografadas, por meio de software específico. Os
57
valores das bandas foram corrigidos através da divisão pela banda correspondente de HPRT (RNA de proteína
constitutiva). Posteriormente, os valores obtidos para as amostras estimuladas foram divididos pelos valores
dos respectivos controles de cada linhagem. Os dados correspondem às médias e aos desvios padrão de 3
experimentos. Os dados correspondem às médias e desvio padrão dos experimentos. (*) indica diferença
estatística (p<0,05) entre os dados representados pelas colunas.
Após avaliação da participação dos receptores TLR-2 e TLR-4 na indução de
resposta imune por L. delbrueckii, e a observação, por meio dos dados comparativos, dos
interessantes resultados obtidos para TLR-2, optou-se por tentar identificar a molécula
responsável pela indução da produção de IFN-γ.
A participação de TLR-2 no reconhecimento de bactérias gram-positivas, e
moléculas associadas a estas, foi descrita em diferentes estudos (Vinderola e cols, 2005;
Yoshimura e cols, 1999). As bactérias gram-positivas possuem moléculas características
em sua parede celular, como pepitideoglicano e ácido lipoteicóico, capazes de estimular
uma resposta imunológica através da interação com este receptor. Estudos anteriores
realizados em nosso laboratório, utilizando extrato de parede de L. delbrueckii já
demonstravam a indução da produção de IFN-γ de forma dose dependente, por esplenócitos
de camundongos BALB/c . Nesse estudo, foi observado que baixas doses de extrato não
induziam a produção desta citocina, quando, por outro lado, o aumento da dose
determinava um aumento da mesma. Além disto, foi verificado que a fração (-) extrato, ou
seja, lactobacilos obtidos, após o tratamento para extração de parede, apresentavam um
perfil de indução de IFN-γ semelhante ao obtido para a bactéria íntegra morta pelo calor.
Assim, a fim de avaliar a importância do receptor TLR-2 na indução de uma
resposta pelo extrato de parede de L. delbrueckii foram realizados experimentos para
dosagem de IFN-γ, TNF-α e IL-4. Esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/foram, então, estimulados in vitro com extrato de parede e (-) extrato.
A figura 10 apresenta os perfis de resposta de produção de IFN-γ entre as linhagens
avaliadas, frente aos estímulos citados. Pôde-se verificar que, para o estímulo
(-)
extrato, o aumento da dose provocou uma diminuição da produção de IFN-γ, tanto para
C57BL/6 quanto para TLR-2 -/-. Uma comparação entre os dados das linhagens mostra
que, apesar de não haver diferenças significativas entre elas, há uma tendência de maior
produção desta citocina para os camundongos C57BL/6.
58
A produção de IFN-γ para extrato de parede de L. delbrueckii, por sua vez,
apresenta um perfil inverso ao identificado para o estímulo anterior, bem como para o
estímulo Ldmc, sendo que o aumento da dose induz o aumento da citocina IFN-γ. Para este
estímulo, a dose 1:1 de extrato não induziu a produção de IFN-γ, tanto para C57BL/6,
quanto para TLR-2 -/-. Já para a dose de 150:1, foi observado que, apesar do aumento da
produção da citocina para as duas linhagens, a deficiência para o receptor TLR-2 levou a
uma produção estatisticamente menor de IFN-γ. Estes dados permitem concluir que a
ausência de TLR-2 interfere na indução de uma resposta TH1, caracterizada pela presença
de IFN-γ, pela preparação extrato de parede de L. delbrueckii.
A citocina IL-4, por sua vez, não foi verificada em nenhuma das dosagens
realizadas nos sobrenadantes das culturas celulares estimuladas, demonstrando que os
estímulos utilizados não determinam uma resposta TH2, nas linhagens de camundongos
estudadas (dados não mostrados).
A produção de TNF-α foi também avaliada e demonstrou, em resposta à variação
das doses dos estímulos utilizados, um perfil semelhante ao observado para IFN-γ. A
ausência do receptor, entretanto, não determinou um aumento estatisticamente significativo
da produção para os estímulos utilizados (Fig.11).
59
Fig. 10 - Produção de IFN-γγ por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta aos estímulos (-)
extrato e extrato de parede, em diferentes dosagens
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados, com Ldmc, nas
doses indicadas. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de IFN-γ por ELISA de captura.Os
dados representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística
(p<0,05) em relação ao controle. (**) indica diferença estatística (p<0,05) entre os dados das linhagens.
60
Fig. 11 - Avaliação da produção de TNF-α
α por esplenócitos de camundongos C57BL/6 e TLR-2 -/- em resposta aos
estímulos (-) extrato e extrato de parede, em diferentes dosagens
Os esplenócitos (5x106 células/mL) de camundongos C57BL/6 e TLR-2-/- foram estimulados, com Ldmc, nas
doses indicadas. Após 24 horas, o sobrenadante foi coletado para dosagem de TNF-α por Bioensaio. Os dados
representam a média e o erro padrão das dosagens de 3 experimentos. (*) indica diferença estatística (p<0,05)
em relação ao controle.
61
Caracterização do extrato de parede de L. delbrueckii UFV H2b20
Avaliação da presença de carboidratos por Dot-Blot
Extratos de parede de L. delbrueckii, preparados em dias diferentes e com capacidade de
estimular a produção de IFN-γ por esplenócitos in vitro, foram analisados por Dot-Blot para
avaliação da presença de carboidratos. Após o procedimento, pôde-se observar coloração
característica da ligação da concanavalina A a moléculas de carboidratos. (Fig. 12).
Extrato 16/03/05
Extrato 01/06/05
Extrato 07/07/05
Fig. 12 – Detecção de carboidratos em extrato de parede de L. delbrueckii por Dot-Blot.
Ensaio Enzimático para detecção da presença de Lipídeos e Carboidratos
Ensaios enzimáticos foram realizados no intuito de verificar a presença de
moléculas lipídicas no extrato de parede de L. delbrueckii e, também, confirmar os dados
obtidos por Dot-Blot, onde se observou a presença de carboidratos.
Os dados obtidos (Tabela 1) demonstraram a presença de, não só, carboidratos,
como descrito anteriormente, como também a presença de moléculas lipídicas na amostra.
62
Amostra
Data de
Glicose (mg/dL)
Triglicérides (mg/dL)
extração
Média
Desvio Padrão
Média
Desvio Padrão
15/12/2004
0,75
0,05
2,40
0,10
Extrato de Parede de L.
22/02/2005
1,92
0,12
4,49
0,16
delbrueckii
06/07/2005
1,53
0,10
5,05
0,17
14/09/2005
0,96
0,07
2,80
0,08
Tabela 3. Dosagem de Glicose e Triglicérides da fração Extrato de Parede
As amostras foram extraídas em dias diferentes e dosadas em triplicata por métodos de ensaios bioquímicos
enzimáticos colorimétricos, utilizando-se kits de diagnósticos laboratoriais Bioclin, kit Glicose Crystal e kit
Triglicérides Crystal (QUIBASA, Belo Horizonte, BR).
Avaliação das Características do Extrato de Parede por Cromatografia em Camada
Delgada
Para perceber melhor as características peculiares ao extrato de parede,
principalmente em relação à sua polaridade, e ao mesmo tempo, analisarmos as possíveis
influências dos grupos moleculares de sua composição, resolveu-se realizar análises por
cromatografia de camada delgada em placas de sílica.
Pôde-se observar, de acordo com os resultados obtidos, que o extrato de parede
possui características anfifílicas que determinaram sua capacidade de percorrer a placa de
sílica, quando utilizado o eluente Metanol e Acetato de Etila na proporção 1:1.
A
B
Fig. 13 - Cromatografia em camada delgada do extrato de parede de L.delbrueckii revelada em câmara de iodo
A) Eluente: Metanol
B) Eluente: Metanol e Acetato de Etila na proporção 1:1
63
É possível observar na figura 13A que o extrato de parede permanece ao redor do
ponto de aplicação, o que demonstra sua dificuldade em ser carreado por um eluente
altamente polar como o metanol.
A figura 13B, por sua vez, vem corroborar com o fato observado anteriormente e
mostrar que, utilizando-se de um eluente mais apolar (Metanol e Acetato de Etila 1:1), o
extrato saiu do ponto de sua aplicação.
Os resultados encontrados vão ao encontro dos dados da dosagem de carboidratos e
lípides, uma vez que estas moléculas possuem, respectivamente, características polares e
apolares.
Avaliação dos grupos moleculares e ligações químicas do extrato através da
espectrometria de infra-vermelho
Com o objetivo de se caracterizar os grupos moleculares e tipos de ligação da
molécula presente no extrato de parede, capaz de induzir a resposta imunológica, foram
realizadas análises de amostras de extratos produzidos em datas diferentes por
espectrometria de infra-vermelho. As análises foram feitas incorporando o extrato,
previamente concentrado por centrifugação a vácuo, em nujol e brometo de potássio. Os
gráficos obtidos demonstraram, tanto quando foi utilizado nujol ou KBr, a presença de
picos nas regiões de 1640, 2400 e 3000 a 3600. Os picos em 1640 são característicos de
ligações duplas entre átomos de carbono. Os picos entre 3000 e 3600, por sua vez,
caracterizam estiramento de ligações entre carbono e hidrogênio. Estes dados indicam a
presença de uma molécula, aparentemente, apolar, caracterizada principalmente por uma
cadeia carbônica.
Para desconsiderarmos a interferência do nujol, foi realizada uma leitura utilizando
apenas nujol. A sobreposição dos gráficos do nujol e nujol + amostra demonstra claramente
os picos provenientes da molécula do extrato. Por outro lado, é importante salientar que o
extrato de parede não era purificado, o que pode ter prejudicado uma leitura mais precisa.
64
A análise do extrato incorporado em KBr, apesar de ter apresentado resultados
semelhantes aos outros com nujol, não ficou tão satisfatória, já que não se conseguiu
preparar uma pastilha homogêneamente translúcida.
Nujol
Nujol + Extrato
Fig. 14 - Espectrometria de Infra-vermelho de extrato de parede de L.delbrueckii
Sobreposição dos Espectros do Nujol e Nujol + extrato.
65
Discussão dos Resultados
66
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Discussão dos Resultados
A verificação dos perfis de citocinas e quimiocinas produzidas por células do
sistema imune, induzidas por um determinado estímulo, auxilia a compreensão dos
mecanismos envolvidos neste processo de resposta, e possibilita avaliar a capacidade do
estímulo estudado em modular processos inflamatórios. Diversos estudos têm sido
realizados no intuito de se compreender as respostas de células do sistema imune, através
da avaliação das citocinas e quimiocinas produzidas, às bactérias probióticas, e mais
particularmente aos Lactobacillus sp. Neste trabalho, a observação dos resultados nos
permitiu caracterizar, de forma mais detalhada, a resposta imunológica de esplenócitos
murinos frente ao Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20.
Os dados anteriormente obtidos em nosso laboratório por Castro (2005) e
Castanheira e colaboradores (2007), e que justificaram a elaboração deste estudo, já
demonstravam a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-12, TNF-α e IFN-γ por
esplenócitos murinos e células mononucleares do sangue periférico humano, induzida por
L. delbureckii UFV H2b20 morto pelo calor. Diversos outros estudos, utilizando bactérias
probióticas, também documentaram a indução da produção destas citocinas próinflamatórias por diferentes tipos celulares (Mohamadzadeh e cols., 2005; Haller e cols.,
2000; Hessle e cols., 2000; Miettinen e cols., 1996). Recentemente, Sashihara e cols.(2006)
verificaram que algumas cepas de lactobacilos apresentam a capacidade de induzir, in vitro,
a produção de IL-12 por espenócitos murinos e que estas mesmas conferiram redução nos
níveis de IgE induzidos por ovoalbumina em camundongos BALB/c. Outro estudo,
realizado por Ishida-Fujii e colaboradores (2007), observou que macrófagos de
camundongos tratados com Lactobacillus casei mostraram maior ativação de NF-κB e
produção de TNF-α e IL-12 após indução por LPS.
Os experimentos iniciais, utilizando camundongos BALB/c, C57BL/6 e C3H/HeN,
corroboram os dados acima descritos quando avaliamos a produção das citocinas TNF-α e
IFN-γ induzidas pela estirpe bacteriana estudada (Fig. 1 e 2). Além desta observação,
pudemos perceber que a dose de Ldmc utilizada mostrou-se importante para a produção
67
significativa destas citocinas, assim como fora detectado pelos trabalhos citados
anteriormente. Pudemos, deste modo, verificar que, para todas as linhagens citadas, o
aumento da dose de Ldmc determinou a diminuição dos índices de IFN-γ e ΤNF-α, com
aumento da transcrição de IL-10 (Fig.3).
A presença de RNAm para IL-10, detectada nas linhagens BALB/c, C57BL/6 e
C3H/HeN, altera, por sua vez, a percepção da resposta imunológica anteriormente
constatada, já que esta citocina pode determinar a modulação do processo inflamatório (de
Waal e cols., 1991). Embora não tenha sido avaliada no trabalho desenvolvido por Castro
(2005), a produção de IL-10 induzida por lactobacilos e outras bactérias probióticas foi
verificada por diversos outros autores (Chatelain e cols., 1992; Di e cols., 2005; Helwig e
cols., 2006; Miettinen e cols., 1996; Niers e cols., 2005).
O aumento da transcrição gênica desta citocina, de forma dose dependente, poderia
explicar a diminuição da expressão de TNF-α e IFN-γ (Oswald e cols., 1992). Por outro
lado, a necessidade do aumento da dose de Ldmc para transcrição de IL-10 sugere que a
molécula indutora desta citocina encontra-se em baixas concentrações no estímulo. Neste
contexto, Christensen e colaboradores (2002) mostraram que baixas doses de Lacobacillus
casei induziram altos níveis de IL-6, IL-12 e TNF-α e não foram capazes de induzir IL-10.
Entretanto, em altas concentrações, a produção de IL-10 aumentou expressivamente.
Alternativamente, pode-se supor que o excesso de citocinas inflamatórias, induzidas pelo
aumento da concentração do estímulo, pode determinar o aumento de IL-10 na tentativa de
modulação da resposta.
Particularmente, os resultados apresentados em nosso trabalho são contrários aos
descritos por Castanheira e colaboradores (2007), onde não foi verificada a produção desta
citocina reguladora por células mononucleares do sangue periférico (CMSP) humano. Esta
diferença de indução pode ser decorrente da baixa dose de estímulo utilizada, 50:1, em
relação a dose 150:1 de Ldmc que apresentou maior indução desta citocina, ou pela
diferença entre os tipos celulares e condições experimentais envolvidos nos estudos. Por
outro lado, Foligne e colaboradores (2007) observaram que algumas cepas de lactobacilos
foram capazes de induzir in vitro a produção de IL-10 em CMSPs humano. Este estudo
mostrou ainda que as bactérias que determinaram maiores concentrações de IL-10 em
relação à produção de IL-12 atenuaram de forma mais significativa os sintomas de colite
68
em camundongos BALB/c e C57BL/6. Estes dados também diferem dos encontrados por
Castanheira e cols. (2007), onde não se verificou a presença de IL-10 induzida por L.
delbrueckii. Neste caso esta divergência pode ser devido ao uso de cepas distintas de
lactobacilos.
Drakes e colaboradores (2004) demonstraram que DC derivadas de monócitos
murinos podem apresentar marcadores de maturação em sua superfície e, ainda produzir
citocinas como IL-10, após a indução por probióticos contendo Lactobacillus sp. Outro
trabalho utilizando este mesmo tipo celular revelou uma indução de resposta tipo TH2 após
tratamento com L. reuteri (Christensen e cols., 2002). Por outro lado, Mohamadzadeh e
colaboradores (2005), mostrou que DCs mielóides humanas tratadas com este mesmo
lactobacilo levou à ativação de células TH1. Considerando estes estudos, podemos perceber
que diferentes tipos celulares podem reagir de forma distinta a um mesmo estímulo, o que
também poderia explicar a discrepância entre os resultados obtidos por Castanheira e
colaboradores (2007) e os aqui apresentados. Este fato pode ser determinado pela diferença
na expressão de receptores entre os tipos celulares, como observado por Kadowaki e cols.
(2001) em estudo utilizando subtipos precursores de células dendríticas.
Ainda dentro deste contexto, é interessante observarmos a diferença dos resultados
obtidos para a dosagem de RNAm de IL-10 para as linhagens BALB/c, quando comparadas
aos animais C57BL/6 e C3H/HeN. Para esses animais, o aumento da dose de Ldmc não
interferiu na produção de RNAm desta citocina reguladora, que se manteve elevada tanto
para 1:1 quanto para 150:1 (Fig.3). Os altos índices de RNAm IL-10 para os camundongos
BALB/c ajudam a entender os dados obtidos por Castro (2005)
que mostraram a
ineficiência do lactobacilo em proteger esta linhagem contra a infecção por Leishmania
braziliensis.
Todas estas variações de perfis podem ser melhor compreendidas se considerarmos
as diferenças na expressão de TLRs entre diferentes linhagens de camundongos. Segundo
Liu e colaboradores (2002), por exemplo, células dendríticas de camundongos BALB/ c
apresentam mais receptores TLR-2, -4, -5 e -6 em relação a animais C57BL/6, que por sua
vez expressam mais TLR-9. Além disto, foi verificada neste estudo uma maior expressão
de STAT4 para esta última linhagem, o que poderia explicar a tendência desta linhagem em
69
produzir maiores níveis de IFN-γ, já que este fator de transcrição contribui para a produção
desta citocina mesmo na ausência de IL-12 (Pasare & Medzhitov, 2004).
A indução da produção de citocinas pró e anti-inflamatórias, por L. delbrueckii,
pode indicar o envolvimento de diferentes moléculas estimuladoras, bem como a
participação de receptores celulares distintos que, ao reconhecerem seus ligantes, podem
determinar respostas finais sinérgicas ou antagônicas. Desta forma, a citocina IFN-γ pode
estar regulada, tanto em sua produção quanto em sua ação, pela citocina reguladora IL-10
(Silva e cols., 1992). Este fato poderia explicar a ausência de reação inflamatória, in vivo,
dos camundongos BALB/c tratados com Ldmc e desafiados com Leishmania braziliensis,
durante
os
experimentos
realizados
por
Castro
(2005).
Heinzel
e
colaboradores (1991) verificaram que células T CD4+ de camundongos BALB/c infectados
com Leishmania major, apresentavam altos índices de RNAm para IL-10 e, ao mesmo
tempo, suscetibilidade à infecção. O uso de anticorpos anti-CD4, porém, determinou uma
diminuição dos índices desta citocina e aumento de RNAm de citocinas inflamatórias como
IFN-γ. Este trabalho fortalece a hipótese apresentada e, assim como diversos outros,
demonstra a participação fundamental da citocina IL-10 para a modulação do sistema
imune.
Sabe-se, atualmente, que receptores TLR-2 estão envolvidos no reconhecimento de
bactérias gram-positivas, e por conseqüência auxiliam na determinação da resposta celular
para estes agentes (Vinderola e cols., 2005; Yoshimura e cols., 1999).
A realização dos experimentos comparativos entre camundongos C57BL/6 e TLR-2
-/- nos permitiu observar a importância deste receptor para os eventos imunológicos
decorridos da indução por Ldmc. Os dados obtidos nos revelam que a ausência do receptor,
aparentemente, levou a uma demora na produção de IFN-γ, uma vez que, após 48 horas de
indução, a produção desta citocina mostrou-se superior para C57BL6 (figura 4), enquanto
os animais TLR-2 -/- apresentaram maiores índices de RNAm da mesma (figura 6).
Trabalhos recentes têm demonstrado a participação de TLR-2 na modulação de
células T reguladoras, importantes para o controle da resposta inflamatória. Sutmuller e
colaboradores (2006) observaram que a ativação de TLR-2 diretamente em células T
reguladoras, por ligante específico, induz a proliferação das mesmas, in vitro e in vivo, e
ainda promove uma perda temporária de sua capacidade supressora. Da mesma forma, Liu
70
e colaboradores (2006) verificaram que a interação entre este receptor e seu agente agonista
levou à proliferação de células T efetoras e reguladoras e, ao mesmo tempo, à inibição
transiente da atividade supressiva destas últimas, permitindo a produção de IFN-γ por
células T efetoras. Além de regular de forma direta a função da célula T reguladora, foi
observado que a ativação de TLR-2, em células T efetoras, promove a produção de citocina
IL-2, que, por sua vez, é capaz de conferir, a estas mesmas células, efeitos refratários à ação
das células T reguladoras.
Em conjunto, estes trabalhos nos dão subsídios para a formulação de uma hipótese
para explicar as discrepâncias encontradas nos perfis de IFN-γ, citocina e RNAm, entre os
animais selvagens e deficientes para TLR-2. Em um primeiro momento, células T
reguladoras presentes entre os esplenócitos poderiam ser inibidas de exercer sua atividade
supressora, através da ativação dos receptores TLR-2 por Ldmc. Esta ativação poderia
ocorrer diretamente nas células T reguladoras, inibindo sua atividade, ou em células T
efetoras tornando-as menos susceptíveis à ação supressora das células T reguladoras pela
indução de IL-2. Esta modulação permitiria inicialmente uma produção significativa de
IFN-γ por linfócitos T auxiliares e, conseqüentemente, a eliminação do estímulo Ldmc por
macrófagos ativados por esta citocina. A redução dos níveis do agonista de TLR-2, a partir
da eliminação do lactobacilo, possibilitaria o restabelecimento da atividade supressora das
células T reguladoras e, conseqüentemente, o controle da resposta inflamatória. Por outro
lado, esta inibição da atividade supressora das células T reguladoras não ocorre na cultura
de esplenócitos de camundongos deficientes para TLR-2, podendo haver uma modulação
da resposta inflamatória inicial. Desta forma, podemos observar que, para este caso, após
48 horas, os níveis da citocina IFN-γ se encontram inferiores aos da linhagem C57BL/6. Já
a presença de RNAm é significativamente superior, demonstrando o retardo na resposta.
As dosagens de TNF-α nos experimentos comparativos não demonstraram a
influência de TLR-2 em sua indução. Este resultado difere dos encontrados em outros
trabalhos, em que se observou que a ausência deste receptor determinou a diminuição da
produção desta citocina por esplenócitos e macrófagos murinos (Matsuguchi e cols., 2003;
Murciano e cols., 2007) e por células mononucleares de sangue periférico humano (Lien e
cols., 1999). A expressão desta citocina, entretanto, pode estar vinculada também ao
estímulo de outros receptores que poderiam ser ativados por Ldmc, como TLR-4 (Zughaier
71
e cols., 2005). A avaliação da produção de TNF-α por camundongos C3H/HeJ mostram
que ausência de TLR-4 funcional determinou a diminuição dos níveis desta citocina, porém
não de forma estatisticamente significativa (Fig.8).
Outro fato interessante foi observado através da análise da citocina IL-10. Quando
avaliamos sua transcrição gênica em camundongos deficientes para receptores TLR-2 e
comparamos com as linhagens selvagens, pudemos perceber sua relação no controle da
resposta imune por esplenócitos murinos frente ao estímulo Ldmc. A ausência do receptor
TLR-2 nestas células aparentemente levou a um aumento da indução de IL-10, o que pode
indicar sua participação no balanço da resposta imune, provavelmente através da indução
vias de sinalização que direcionam a produção de citocinas características de um perfil
TH1. Esta observação corrobora outros estudos que revelam a importância de TLR-2 para a
maturação de células dendríticas humanas, indução da síntese de IFN-γ, IL-12 e outras
citocinas pró-inflamatórias (Hertz e cols., 2001; Liew e cols., 2005; Sobek e cols., 2004).
Este dado, no entanto, difere de alguns trabalhos que demonstram a participação deste
receptor na modulação do sistema imune através da indução de IL-10. Neste sentido,
utilizando Mycobacterium tuberculosis, Jang e colaboradores (2004) observaram que a
ausência de TLR-2 em células dendríticas murinas impediu a síntese das citocinas IL-6 e
IL-10. Re e Strominger (2004), por outro lado, observaram que a produção de IL-10,
induzida por TLR-2, bloqueou a produção de citocinas TH1 induzidas por TLR-4 e TLR-3
em células dendríticas humanas.
Além da participação das citocinas no processo inflamatório, o recrutamento
seletivo de monócitos, neutrófilos e demais células do sistema de defesa para os sítios de
inflamação é considerado outro ponto crítico para o estabelecimento de uma resposta imune
eficaz do hospedeiro aos agentes infecciosos. Alguns estudos têm sido realizados a fim de
se compreender a possível relação entre o reconhecimento de moléculas associadas a
patógenos por TLR e a expressão de quimiocinas e seus respectivos receptores.
No intuito de se avaliar a participação específica de TLR-2 e -4 na expressão de
receptores CCR1 e CCR2, importantes receptores de quimiocinas, Parker e colaboradores
(2004) realizaram experimentos in vitro que demonstraram uma regulação negativa destes,
após o tratamento de monócitos humanos com ligantes de TLRs. Durante este estudo, os
autores observaram que a ativação de TLR-2 e -4 levaram à produção de CCL5 e CXCL8, e
72
não induziram CCL2 e CXCL10. Estes resultados divergem dos encontrados em nossos
experimentos, onde se pôde constatar que camundongos deficientes em TLR-2
apresentaram quantidade relativa de RNAm para as quimiocinas CCL2 e CXCL10
inferiores aos camundongos C57BL/6 (Fig.6). Por outro lado, estudo realizado por Lan e
cols. (2005), assim como nosso trabalho, demonstrou a importância do estímulo de TLR-2
para a indução destas mesmas quimiocinas. Neste mesmo estudo verificou-se, por meio de
ligantes específicos e bactérias íntegras, como Escherichia coli, que a ligação a TLR-4
também induzia estas quimiocinas. A comparação dos dados citados permite observar que
condições diferenciadas, como células e ligantes, podem determinar resultados distintos
para o estímulo de quimiocinas.
A relação entre as quimiocinas CCL2, CCL5 e CXCL10, objetos deste trabalho, e
diferentes perfis de resposta imune, TH1 e TH2, estão diretamente vinculados aos tipos
celulares que estas moléculas recrutam. CCL2 e CXCL10, por exemplo, são responsáveis
pelo deslocamento de monócitos e células NK, enquanto CCL5 destaca-se pelo
recrutamento misto de leucócitos, incluindo células T (Haringman e cols., 2004; Rollins,
1997; Rottman, 1999). A importância deste tipo celular para o estabelecimento de uma
resposta TH1 sugere a participação de CCL5 neste perfil resposta.
Nossos resultados demonstraram a importância da ativação de TLR-2 por L.
delbrueckii para a indução de CCL2 e CXCL10. Sua ausência, no entanto, não alterou a
indução de CCL5. Neste caso, mesmo a estimulação de células dos camundongos C57BL/6
não levaram à produção desta citocina. Este fato auxilia a compreensão dos resultados
encontrados por Castro (2005) que mostram a incapacidade de Ldmc em funcionar como
um adjuvante in vivo em camundongos imunizados contra L. braziliensis.
Receptores TLR-4 estão intimamente relacionados ao reconhecimento de bactérias
gram-negativas, por um importante componente da parede celular, o LPS. Sua ativação
pelo agente ligante, segundo alguns trabalhos, podem direcionar a resposta imunológica
através da indução de diversas citocinas (Campos e cols., 2004; Hoshino e cols., 1999).
Apesar de sua participação no reconhecimento de LPS, sua importância na participação da
resposta imune frente a bactérias gram-positivas, como L. delbrueckii, não pode ser
descartada.
73
O estudo da síntese de IFN-γ e TNF-α em camundongos C3H/HeJ (Fig.7 e 8), nos
mostrou uma tendência de menor produção das mesmas pelos esplenócitos, o que sugere a
participação do receptor TLR-4 no reconhecimento de moléculas do estímulo Ldmc e,
conseqüentemente na intensidade da resposta, apesar de se tratar de uma bactéria gram
positiva. Em acordo com esta observação, Kawahara e Otani (2006) observaram uma
diminuição da produção de IFN-γ por esplenócitos murinos induzidos por diferentes cepas
de lactobacilos, após o uso de anticorpos anti-TLR-4. Esta complexa relação entre ligante e
receptor, relacionada ao reconhecimento de moléculas associadas a bactérias gram positivas
e negativas, foi evidenciada por Hirshfeld e colaboradores (2001), através da observação de
que LPS derivado de Porphyromonas gingivalis é reconhecido por TLR-2, enquanto LPS
de bactérias como Escherichia coli são reconhecidos por TLR-4. Outro dado relevante
nesse aspecto, foi a observação de que moléculas semelhantes de ácido lipoteicóico de
diferentes espécies bacterianas induziram de forma distinta a produção de TNF-α, via TLR2 (Han e cols., 2003). Em conjunto, estes trabalhos sugerem que o reconhecimento do
agente ligante, por um determinado receptor, depende, basicamente, de suas características
moleculares.
Já a participação de TLR-4 para a indução da citocina reguladora IL-10 não ficou
bem estabelecida, visto que, apesar de observarmos a diminuição de sua produção em
camundongos mutantes, os dados não são estatisticamente significativos. Esta participação
foi evidenciada em um trabalho recente, realizado por Higgins (2003), onde se mostrou a
indução de IL-10 via TLR-4, por células dendríticas murinas, estimuladas in vitro com
Bordetella pertussis.
Ao avaliarmos as quimiocinas CCL2, CCL5 e CXCL10, percebemos que a
deficiência neste receptor não determinou diferenças na transcrição gênica para estas
moléculas. Esta observação foi também evidenciada por Antoniazi (2004) utilizando-se
infecção por Leishmania major em camundongos TLR-4 deficientes. De forma
interessante, tanto para C3H/HeJ, quanto para C3H/HeN, não foram observadas mensagens
significativas para estas moléculas, indicando que para estas duas linhagens o estímulo
Ldmc aparentemente não leva à sinalização para o recrutamento de leucócitos. Entretanto, é
necessário salientar que a quantificação do RNAm foi avaliada após um tempo fixo
determinado. Assim, a transcrição gênica para estas moléculas poderia se fazer em
74
momentos diferentes, anterior ou posterior ao verificado. A variação da transcrição de
quimiocinas em relação ao tempo foi observada no estudo realizado por Parker e
colaboradores (2004). Neste, foi observado que o estímulo de TLR-4 por LPS não induziu a
produção de CCL2 e CXCL10, assim como verificado em nossos experimentos. Entretanto,
pôde-se observar a indução transitória de CCL5, com pico no tempo de 4 horas e posterior
decaimento. Este dado sugere que a não detecção de CCL5 em nossos experimentos pode
ter ocorrido devido ao tempo utilizado para avaliação da indução desta citocina.
Coletivamente, nossos dados nos revelam que TLR-2 se apresenta mais importante
para uma resposta imune à estirpe bacteriana L. delbrueckii UFV H2b20. A ativação deste
receptor contribuiu para o balanço dos eventos imunológicos favorecendo a indução TH1 e
diminuindo a modulação da resposta.
Uma vez observado a participação de TLR-2 no reconhecimento de L. delbrueckii
íntegro, optou-se por verificar sua influência para a resposta induzida pela fração extrato de
parede da bactéria.
A realização de experimentos utilizando extrato de parede de L. delbrueckii UFV
H2b20 foi proposta inicialmente por Castro (2005), na tentativa de se obter, de forma
isolada, a molécula da bactéria responsável pela indução in vitro das citocinas IFN-γ, IL-12
e TNF-α em esplenócitos de BALB/c.
A ativação de receptores TLR-2 por moléculas provenientes de bactérias gram
positivas, como ácido lipoteicóico e peptideoglicano, tem sido documentada e relacionada
com a indução da produção de variadas citocinas (Liu e cols., 2002; Yoshimura e cols.,
1999; Sun e cols., 2005) .
Os dados obtidos em nosso trabalho nos mostraram que este receptor foi essencial
para a indução de IFN-γ, mas não de TNF-α, frente ao estímulo extrato de parede.
Entretanto, através da avaliação do perfil de resposta, tanto em camundongos C57BL/6
quanto em TLR-2 -/-, pudemos verificar a necessidade de maiores doses deste estímulo
para a produção de IFN-γ, o que indica a presença de menor concentração da molécula
imunomoduladora no extrato, e que esta é responsável pela indução desta citocina. Por
outro lado, a produção de IFN-γ mostrou-se superior em relação ao Ldmc, anteriormente
utilizado. Este fato indica que provavelmente outras moléculas presentes na bactéria são
responsáveis pelo controle da produção da resposta TH1 induzida pela molécula retirada
75
pelo processo de extração. Este procedimento, no entanto, não alterou o perfil de resposta
apresentado pela bactéria, como verificado através dos experimentos utilizando a fração (-)
extrato, o que pode indicar a pouca eficiência do processo para obtenção da fração extrato
de parede.
Os resultados apresentados corroboram os de Castro (2005) que evidenciaram a
produção da citocina pró-inflamatória IFN-γ, de forma dose dependente, a partir da
ativação deste receptor pela fração extrato e (-) extrato de parede. Nossos dados, além disto,
complementam esta verificação, indicando a que TLR-2 é o principal responsável pelo
reconhecimento da molécula imunomoduladora presente no extrato de parede.
Outro fato interessante de se verificar é que, apesar da importância de TLR-2 para a
indução de IFN-γ por extrato de parede, sua ausência não determinou uma completa
isenção da citocina, o que indica que outros mecanismos e receptores podem estar
envolvidos no reconhecimento da molécula do extrato. Entre estes podemos citar TLR-4, já
que sua ausência, como verificado anteriormente, levou a um decréscimo desta citocina, e
também STAT4, já que fator de transcrição gênica é capaz de induzir este tipo de resposta,
mesmo na ausência de TLR-2 e IL-12 (Pasare & Medzhitov, 2004) .
É importante ressaltar que todos os estímulos utilizados nos experimentos que
compõe este trabalho não induziram a produção significativa de IL-4 em nenhuma das
linhagens avaliadas (dados não mostrados). Esse resultado sugere que essa bactéria não
induz, in vitro, ativação direta de células TH2 produtoras desta citocina.
A constatação da capacidade da fração extrato de parede em estimular esplenócitos
murinos, via TLR-2, para a expressão de citocinas pró-inflamatórias, nos direcionou para a
análise da substância presente neste estímulo.
A parede celular de bactérias gram-positivas, e mais especificamente bactérias ácido
láticas, possui moléculas e estruturas bem caracterizadas (Delcour e cols., 1999; Navarre &
Schneewind, 1999; Schar-Zammaretti & Ubbink, 2003). Apesar de sua complexidade,
algumas das moléculas da parede destas bactérias possuem atividade imunomoduladora
bem documentada, destacando-se ácido lipoteicóico e pepitideoglicano (Kao e cols., 2005;
Matsuguchi e cols., 2003; Sun e cols., 2005; Yoshimura e cols., 1999)..
Dados anteriores obtidos em nosso laboratório demonstraram a ausência de
proteínas na fração extrato de parede. Em razão destes resultados, das características
76
moleculares dos principais constituintes da parede bacteriana e do conhecimento do
potencial imunomodulador dos carboidratos, direcionamos os testes para a verificação de
grupos moleculares específicos.
Os resultados encontrados por dosagens enzimáticas colorimétricas indicaram a
presença de moléculas de características glicídicas e lipídicas. A detecção de carboidrato no
extrato foi confirmada por dot-blot e está de acordo com os resultados obtidos por Castro
(2005). É interessante salientar que estes dados foram obtidos através da análise de
diferentes
preparações
de
extrato,
e
que
todas
elas
demonstraram
atividade
imunomoduladora.
Diferentes aspectos correspondentes a estes grupos moleculares foram verificados
através de cromatografia por camada delgada e espectrometria de infra-vermelho.
Constatou-se, nestes testes, que a fração extrato de parede apresenta características polares
e apolares, e que o grupo, ou grupos moleculares, possui ligações duplas entre átomos de
carbono e ligações C-H. Estas observações condizem com os resultados obtidos nos outros
experimentos realizados para caracterização do estímulo como as dosagens enzimáticas e
Dot-Blot, uma vez que estas características são comuns a moléculas de carboidratos e
lipídeos.
Apesar dos resultados da caracterização molecular contribuírem para a compreensão
dos mecanismos envolvidos na modulação do sistema imune pela estirpe L. delbrueckii
UFV H2b20, não foi possível a identificação precisa da molécula presente no extrato de
parede, responsável pela ativação do receptor TLR-2.
77
Sumário dos Resultados
78
SUMÁRIO DOS RESULTADOS
Sumário dos resultados
Os resultados observados neste trabalho demonstraram que a estirpe bacteriana L.
delbrueckii UFV H2b20 é capaz de induzir, de forma diferenciada, a produção de citocinas
pró e antiinflamatórias, e quimiocinas, por esplenócitos de diferentes linhagens de
camundongos. Nossos resultados mostraram, ainda, a participação efetiva do receptor TLR2, mas não de TLR-4, nesta indução. Observou-se, pelos perfis de produção de citocinas,
que a ausência de TLR-2 levou a um retardo na produção de IFN-γ, após a indução por
Ldmc. Baseado em trabalhos recentes, que revelam a participação deste receptor na
regulação das atividades supressoras de células T reguladoras, e nos resultados aqui
apresentados, podemos sugerir que sua ausência nestas células permitiu a ação das mesmas,
determinando a diminuição da produção de IFN-γ.
Além disto, a detecção do RNAm para IL-10 e a observação do aumento da
transcrição gênica desta citocina, de forma dose dependente, explicam, de certa forma, a
diminuição da expressão de TNF-α e IFN-γ.
Este estudo mostrou, também, que a fração extrato de parede do lactobacilo induz
uma notável produção de IFN-γ através do receptor TLR-2. Este dado corrobora os
resultados anteriores e comprovam a importância deste receptor para o reconhecimento de
um composto molecular presente na parede celular do Lactobacillus delbrueckii UFV
H2b20.
Finalmente, os experimentos de caracterização molecular desta preparação
mostraram as características glicídicas e lipídicas da molécula imunoestimuladora.
Nossos dados comprovaram a importância de se caracterizar os mecanismos
envolvidos na indução da resposta imunológica pelas bactérias probióticas, incluindo o L.
delbrueckii, para que se consiga compreender os diversos dados da literatura e, ao mesmo
tempo, visualizar novas possibilidades para a busca de novas vacinas.
79
Conclusão
80
CONCLUSÃO
Conclusão
Nossos resultados permitiram concluir que o probiótico Lactobacillus delbrueckii
UFV H2b20 é capaz de induzir, in vitro, a produção de citocinas e quimiocinas
inflamatórias, características de perfil TH1, por esplenócitos de camundongos pela
estimulação de receptores TLR-2, quando em baixas doses.
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Referências Bibliográficas
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