Monoclonal Mouse Anti-Human CD3/APC, Clone UCHT1

Monoclonal Mouse
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Utilização prevista
Anti-Human CD3/APC, Clone UCHT1
Anti-Human CD3/FITC, Clone UCHT1
Anti-Human CD3/PerCP, Clone UCHT1
Anti-Human CD3/RPE, Clone UCHT1
Anti-Human CD3/RPE-Cy5, Clone UCHT1
Nº. de código C7225
Nº. de código F0818
Nº. de código PR702
Nº. de código R0810
Nº. de código C7067
Para utilização em diagnósticos in vitro.
C7225, F0818, PR702, R0810 e C7067 foram concebidos para serem utilizados em citometria de fluxo. CD3 é
um antígeno que se limita à estirpe de células pan-T, sendo um importante marcador das células T normais e
neoplásticas. Os anticorpos de CD3 são considerados essenciais para a avaliação inicial das anomalias linfoproliferativas agudas e crónicas (1). A interpretação dos resultados deve ser feita por um patologista
qualificado, dentro do contexto dos antecedentes clínicos do doente e de outros testes diagnósticos.
Resumo e explicação
O TCR/CD3 humano é uma estrutura complexa na superfície do linfócito, a qual consta do heterodímero
TCRαβ ou TCRγδ e do complexo CD3 associado. O complexo CD3 é composto por seis polipéptidos que têm
geralmente quatro diferentes cadeias transmembrana de CD3, γ (gama), δ (delta), ε (épsilon), e ζ (zeta). Três
dímeros diferentes, γε, δε, e ζζ, constituem o complexo CD3. O Mr de CD3ε é 20 000 (2).
O complexo CD3 é crucial para a transdução dos sinais de reconhecimento do antígeno para o citoplasma das
células T e para a regulação da expressão da superfície celular do complexo TCR. Além disso, desempenha
ainda um papel importante na diferenciação dos timócitos (2).
CD3 começa por ser detectável nos timócitos iniciais, e a sua aparência representa provavelmente um dos
primeiros sinais de comprometimento à estirpe das células T. Nos timócitos corticais, durante as fase iniciais de
maturação, o antígeno CD3 encontra-se predominantemente presente no citoplasma celular. Nos timócitos
medulares, o antígeno CD3 é predominantemente detectado na superfície celular (3, 4).
A maior parte dos neoplasmas das células T também expressa CD3, mas encontra-se ausente das
malignidades linfóides das células não T (5). O primeiro local detectável dentro das células neoplásticas é o
citoplasma celular, o que é consistente com o padrão de síntese do antígeno em timócitos normais (3).
Reagente fornecido
Os conjugados Anti-CD3, C7225, F0818, PR702, R0810 e C7067, foram formulados a partir de um anticorpo
monoclonal de rato, purificado. Os conjugados são fornecidos em forma líquida, em tampão contendo
soroalbumina bovina (BSA) a 1% e 15 mmol/L de NaN3 , pH 7,2. Cada frasco contém 100 testes (10 µl de
conjugado para um máximo de 106 de leucócitos de sangue periférico normal).
Isótipo: IgG1, kappa. Concentração do conjugado em mg/L: ver o rótulo do frasco.
Código do
Anticorpo
Fluorocromo
N.º Código
Controlo Negativo
F0818
FITC (Isotiocianato de Fluoresceína Isómero 1)
X0927
R0810
RPE (R-Ficoeritrina)
X0928
PR702
PerCP (Proteína de Clorofila Peridimina)
X7909
C7067
RPE-Cy5 (R-Ficoeritrina-Cianina 5)
X0955
C7225
APC (Aloficocianina)
X0968
Imunogénio
Timócitos e linfócitos humanos infantis extraídos de um doente com doença de Sézary (6).
Especificidade
O Anti-CD3, UCHT1, foi incluído no First and Third International Workshops and Conferences on Human
Leucocyte Differentiation Antigens (Paris 1982, Oxford 1986), e os estudos efectuados por uma série de
laboratórios confirmaram a sua reactividade com o antígeno CD3 (7). O Anti-CD3, UCHT1, reage com a ε-cadeia
de 20 kDa de CD3 (8).
O Anti-CD3 identifica as células T no timo, medula óssea, baço, amígdalas e sangue (3-6). O antígeno identifica
ainda as células Purkinje no cerebelo, o único outro tipo de célula que se sabe ligar anticorpos a CD3 (9).
O anticorpo tem capacidade para induzir a proliferação de timócitos e células T maduras in vitro, na presença
de interleucina-2 (IL-2) (10).
Precauções
1. Para utilizadores profissionais.
2. Este produto contém azida sódica (NaN3), uma substância química altamente tóxica na forma pura. Em
concentrações de produto, mesmo não classificadas como perigosas, a azida sódica poderá reagir com as
canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao
descartar, lavar com grandes quantidades de água a pressão, a fim de evitar a acumulação de azidas
metálicas na canalização.
3. Tal como no caso de qualquer produto derivado de fontes biológicas, devem empregar-se processos de
manuseamento apropriados.
4. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos.
5. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais e nacionais.
Armazenamento
Armazenar em local escuro, entre 2 e 8 ºC. Não utilizar após a data de validade inscrita no frasco. Caso os
reagentes sejam armazenados noutras condições para além das que se encontram especificadas, o utilizador
deve verificar tais condições. Não há sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por
conseguinte, os controlos positivo e negativo devem ser processados em simultâneo com as amostras do
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doente. Caso se observem colorações inesperadas que não possam ser explicadas por variações dos
procedimentos de laboratório e se suspeite de um problema com o anticorpo, contactar com o nosso Centro de
Assistência Técnica.
Processo de coloração
1.
Transferir 100 µL de sangue anticoagulado (EDTA) para um tubo de ensaio de poliestireno de 12 mm x 75 mm.
2.
Adicionar 10 µL de Anti-CD3 conjugado com fluorocromo e misturar suavemente com um agitador tipo vortex.
3.
Incubar o tubo num local escuro entre 2–8 °C d urante 30 minutos ou à temperatura ambiente (20–25 °C)
durante 15–30 minutos.
4.
Adicionar 100 µL de Uti-Lyse™ Reagent A (referência Dako S3325) ao tubo e misturar suavemente com
um agitador tipo vortex. Incubar o tubo durante 10 minutos à temperatura ambiente num local escuro.
5.
Adicionar 1 mL de Uti-Lyse™ Reagent B (referência Dako S3325) ao tubo e misturar suavemente com um
agitador tipo vortex. Incubar o tubo durante 10 minutos à temperatura ambiente num local escuro.
6.
Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 minutos. Aspirar com cuidado o sobrenadante e eliminá-lo,
deixando, aproximadamente, 50 µL de fluido no tubo.
7.
Adicionar 2 mL de PBS ao tubo e ressuspender as células com um agitador tipo vortex.
8.
Repetir a etapa 6.
9.
Ressuspender as células num líquido adequado à citometria de fluxo, por exemplo: 0,3 mL de PBS.
10. Analisar a amostra num citómetro de fluxo ou armazenar a 2–8 °C num local escuro até à data da a nálise.
As amostras devem ser analisadas no prazo de 24 horas após a coloração.
Saliente-se que os conjugados com fluorocromo são fotossensíveis. Os reagentes devem ser protegidos da luz
durante o armazenamento e as amostras devem ser protegidas da luz durante o procedimento de coloração e
até à análise.
Notas do procedimento
Etapa 1: a inclusão de uma amostra de controlo positivo e negativo adequada com cada série, para controlo do
reagente e da preparação, é opcional.
Etapa 2: o volume de conjugado recomendado serve apenas de orientação. As condições ideais de coloração
poderão variar dependendo das amostras e do método de preparação, devendo ser determinadas por cada
laboratório.
A inclusão de um tubo de ensaio com reagente de controlo é opcional. O reagente de controlo deverá
corresponder ao isotipo e fluorocromo do anticorpo conjugado. Os reagentes de controlo recomendados são
indicados na tabela anterior
Etapas 4 e 5: se for utilizado outro reagente de lise celular, é necessário seguir as recomendações para esse
reagente. De salientar que, se o reagente de lise alternativo não contiver agente de fixação como, por exemplo,
o Dako EasyLyse™, referência S2364, o PBS na etapa 9 deve conter 1% de paraformaldeído, a não ser que a
amostra seja analisada no período de tempo recomendado para o reagente de lise.
Etapa 10: em algumas patologias, é possível observarem-se números anormais de células que expressam o
antigénio alvo ou células com níveis aberrantes de expressão de antigénios. Isto pode resultar num padrão de
coloração modificado. É importante compreender o padrão normal de expressão de um antigénio e a sua
relação com a expressão de outros antigénios relevantes para efectuar uma análise adequada.
Recomenda-se a inclusão de uma amostra de controlo positiva e uma negativa adequadas com cada série
para controlo do reagente e da preparação. De salientar que os conjugados de fluorocromo são sensíveis à luz
e as amostras devem ser protegidas da luz durante o procedimento de coloração e até à análise.
Limitações específicas
do produto
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Verificou-se que os conjugados de RPE-Cy5 se podem ligar a monócitos, causando a coloração do fundo (11).
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Referências
1.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
2.
Saito T, Yamazaki T. TC4. CD3 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG,
Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 44-48.
3.
Campana D, Thompson JS, Amlot P, Brown S, Janossy G. The cytoplasmic expression of CD3 antigens
in normal and malignant cells of the T lymphoid lineage. J Immunol 1987;138:648-55.
4.
Swerdlow SH, Angermeier PA, Hartman AL. Intrathymic ontogeny of the T cell receptor associated CD3
(T3) antigen. Lab Invest 1988;58:421-7.
5.
Erber WN, Mynheer LC, Mason DY. APAAP labelling of blood and bone-marrow samples for phenotyping
leukaemia. Lancet 1986;i:761-5
Beverley PC, Callard RE. Distinctive functional characteristics of human "T" lymphocytes defined by E
rosetting or a monoclonal anti-T cell antibody. Eur J Immunol 1981;11:329-34.
6.
7.
McMichael AJ, Gotch FM. T-cell antigens: new and previously defined clusters. In: McMichael AJ,
Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White
cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and Conference; 1986 Sept
21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987. p.31-62.
8.
Tunnacliffe A, Olsson C, Traunecker A, Krissansen GW, Karjalainen K, de la Hera A. T3.2. The majority of
CD3 epitopes are conferred by the epsilon chain. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt
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Oxford University Press; 1989. p. 295-6.
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label Purkinje neurones of many species. Nature 1982;298:375-7.
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11.
van Vugt MJ, van den Herik-Oudijk IE, van de Winkel JGJ. Binding of PE-CY5 conjugates to the human
high-affinity receptor for IgG (CD64). Blood 1996;88:2358-61.
Explicação do s símbolos
Número de c atálogo
Mant er ao abrigo da luz solar
(c ons ultar a s ecç ão de
armazenam ento)
Fabricant e
Consultar as instruções de
utilização
Código de lot e
Dis positivo m édico para
diagnóstic o in v itro
Limites de temperatura
Utilizar até
(104014-002)
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