fenótipo -foi -estados
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Métodos de Avaliação do Sistema Imune Karina Inacio Carvalho, PhD Pesquisadora Associada do Hospital Albert Einstein Pesquisadora Visitante da FMUSP – LIM 60 System Biology Fisiologia de Múltiplas Células Fenótipo • Analise Integrativa Fisiologia de Célula única • Relação entre fenótipo e Genótipo • Modelo Matemático Network • Novas Hipóteses • Novas descobertas Genoma Gene Genótipo Fluorescência excited electron ENERGY EMITS ENERGY AS LIGHT ATOM Fluorocromos LASER 488 <390 λ 400-450 λ 450-500 λ ultraviolet violet blue FITC 520 PE 575 500-570 λ 570-590 590-620 λ green yellow ECD PI 615 620 orange PC5 665 620-750 λ red FITC = Isotiocianato de fluoresceina PE = Ficoeritrrina (RD1) ECD = energy coupled dye PI = Iodeto de propidium PC5 = Ficoeritrina cianina 5 (PeCy5) >750 λ infrared Anticorpo Monoclonal Linfócitos humanos Injetados no camundongo Hibridona de céls do baço do camundongo Seleção de clones para a produção de anticorpos Específicos para proteínas de superfície dos linfócitos humanos IgG2a Caracterização dos IgG1 anticorpos Purificação dos anticorpos Uso dos anticorpos Marcação com fluorescência + = = + Microscopia de Fluorescência Citometria de Fluxo Marcação radioativa + = Raio-X marcação com enzima + = + Substrato = Espectofotômetro Confocal Microscopia de Fluorescência Microscopia de Fluorescência Lampâda Arc EPI - Iluminação Diafragma de Excitação Filtro de Excitação Ocular Filtro dicróico Objectiva Filtro de Emissão Adaptado de J. Paul Robinson Purdue University www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1414926112 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1414926112 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1414926112 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1414926112 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1414926112 Citometria de Fluxo 4 cores PMT 4 Flow cell PMT Dichroic Filters 3 PMT 2 Bandpass Filters PMT 1 Laser Imunofenotipagem de superfície Linfócitos humanos CD4 CD3 CD8 CD3 CD8 Mouse-anti-CD4 Mouse-anti-CD3 CD3 Mouse-anti-CD8 CD4 CD3 Multitest Citometria de Fluxo Multicolor PLOS Pathogens | www.plospathogens.org July 2014 | Volume 10 | Issue 7 | e1004251 LPS Ionomycin PHA T cell Con A CD3 CD28 Estímulos Secreção stop (Brefeldina A or Monensina) Comercial ou Caseiro Marcação Intracelular Fixação/Permeabilização Superfície Control Co-infected 4000 3000 0.42% 4.25% SSC 2000 1000 0 0 10 2 10 IL-4 3 10 4 10 5 0 10 2 10 3 10 4 10 5 ELISPOT R&D System Luminex PLOS ONE | www.plosone.org February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e90330 February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e90330 Table 4. Correlation table of absolute counts of total monocytes, monocyte subsets and CD38+HLA-DR+CD8 T cells with various plasma cytokines. Shikuma CM, Chow DC, Gangcuangco LMA, Zhang G, Keating SM, et al. (2014) Monocytes Expand with Immune Dysregulation and Is Associated with Insulin Resistance in Older Individuals with Chronic HIV. PLoS ONE 9(2): e90330. doi:10.1371/journal.pone.0090330 http://127.0.0.1:8081/plosone/article?id=info:doi/10.1371/journal.pone.0090330 System Biology System Biology Fisiologia de Múltiplas Células Fenótipo • Analise Integrativa Fisiologia de Célula única • Relação entre fenótipo e Genótipo • Modelo Matemático Network • Novas Hipóteses • Novas descobertas Genoma Gene Genótipo Obrigada!! [email protected]
