O PCR consiste em amplificar cópias de DNA “in vitro”, usando os

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EXPRESSÃO GÊNICA E DIAGNÓSTICOS. APLICAÇÕES DO PCR EM
TEMPO REAL
O PCR consiste em amplificar cópias de DNA “in vitro”, usando os
elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. É o método para
rápida amplificação de seqüências específicas de DNA. A localização da
seqüência alvo é feita pelos iniciadores, que são oligonucleotídeos com 20-24
bases usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um
genoma de alta complexidade. Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a
partir dos iniciadores serve como molde para a síntese de uma nova fita, isso
garante o aumento exponencial do número de novas fitas.
O PCR convencional não apresenta valores quantitativos, por isso foi
desenvolvido o PCR em tempo real, que é uma técnica descrita como
quantitativa porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas
produzidas a cada ciclo. As características relevantes do PCR em tempo real
são rapidez, especificidade, sensibilidade e quantificação. A amplificação é
dividida em 3 fases: a linha basal na qual não há produtos de PCR suficientes
para detectar fluorescência, a fase log em que a quantidade de produtos de
PCR dobra a cada ciclo e a fase platô onde não há mais aumento no número
de produtos.
No PCR em tempo real existem dois métodos de quantificação: a
detecção não-específica e a específica. O Syber Green é o exemplo mais
utilizado de detecção não-específica, no qual fluoróforos fluorescentes se ligam
à fita-dupla de DNA, emitindo fluorescência. O TaqMan e o Molecular Beacon
são sondas altamente específicas a seqüência alvo, liberando fluorescência
apenas na presença do produto de PCR de interesse. Eles são capazes de
realizar reações múltiplas, detectando diferentes patógenos de plantas em uma
mesma reação, por exemplo.
O PCR em tempo real pode ser utilizado para diversas aplicações, tais
como: quantificação do número de cópias de transgênicos, resistência à
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fungicida,
contaminação
de
alimentos,
identificação
de
organismos
geneticamente modificados, detecção e quantificação de patógenos, entre
outros.
Diagnósticos baseados no DNA estão em enorme crescimento no
estudo de plantas, e as características de especificidade e sensibilidade do
PCR em tempo real abrirão novas oportunidades para pesquisa sobre
interações patógeno-hospedeiro, OGM, diagnósticos pré-sintomáticos, etc.
Limitações do PCR em tempo real devido ao seu alto custo podem ser
compensadas pela utilização rotineira e para diferentes práticas.
Referências
•
Gachon C, Mingam A, Charrier B, 2004. Real – time PCR: what
relevance to plant studies? J Exp Bot 55: 1445-1454.
•
Korimbocus J, Coates D, Barker I, Boonham N, 2002. Improved
detection of Sugarcane yellow leaf virus using a real – time fluorescent
(TaqMan) RT – PCR assay. J Virol Methods 103: 109-120.
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Lee SH, Kim JK, Yi BY, 2007. Detection methods for biotech cotton
MON 15985 e MON 88913 by PCR. J Agric Food Chem 55: 3351-3357.
•
Luo Y, Ma Z, Michailides TJ, 2007. Quantification of allele E198A in
beta-tubulin conferring benzimidazole resistance in Monilinia fructicola
using real - time PCR. Pest Manag Sci 63: 1178-1184.
•
McCartney HA, Foster SJ, Fraaije BA, Ward E, 2003. Molecular
diagnostics for fungal plant pathogens. Pest Manag Sci 59: 129-142.
•
Schaad NW, Frederick RD, 2002. Real-time PCR and its application for
rapid plant disease diagnostics. J Plant Pathol 24: 250-258.
•
Yang L, Ding J, Zhang C, Jia J, Weng H, Liu W, Zhang D, 2005.
Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by real time quantitative PCR. Plant Cell Rep 23: 759-763.
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