ALTERAÇÃO DOS PERFIS PROTÉICOS PROVOCADA POR METIL

ALTERAÇÃO DOS PERFIS PROTÉICOS PROVOCADA POR METIL JASMONATO (MEJA) EM
FOLHAS DE Ricinus communis L.
Jucélia da Silva Araújo Giuli1, Cristiane M. C. Salles2, Olga Lima Tavares Machado3
UENF - Campos dos Goytacazes RJ
[email protected], [email protected], [email protected]
RESUMO - As plantas percebem as agressões, e sua alta capacidade de adaptação torna possível sua
sobrevivência. As plantas desenvolveram mecanismos de resposta para se defenderem e protegerem
das várias formas de estresse ambiental. Os mecanismos de defesa de plantas em muitos casos
baseiam-se na expressão de genes e alterações no conjunto de proteínas da célula. Análise do perfil
de proteínas através de técnicas eletroforéticas é usada para estudar e entender mecanismos
fisiológicos da planta em condições normais e sob estresse. Plantas tratadas com MeJa ou exposta a
tipos de estresse que induzem a acumulação de jasmonatos, sintetizam polipeptídeos (JIPs).
Concomitantemente estes tecidos reduzem ou interrompem a síntese de muitas proteínas constitutivas.
A mamona foi escolhida como modelo para estudo por ser muito resistente e de fácil adaptação. Neste
trabalho, verficaram-se alterações no perfil protéico das folhas de mamona após tratamentos com
MeJa. Como já reportado para outras plantas, MeJa altera a expressão de genes em plantas de
mamona, visto pelas alterações no perfil protéico, e promove eventos de senescência como a redução
das subunidades da Rubisco. Os resultados encontrados mostram que metil jasmonato faz parte
atuante na rota de sinalização do mecanismo de defesa da mamona.
INTRODUÇÃO
Os vegetais sofrem constantes agressões por agentes bióticos e abióticos. Em geral, agentes
não-biológicos são radiação ultravioleta, salinidade, temperatura, umidade e outros produtos tóxicos
presentes em rejeitos industriais e domésticos que alteram o ambiente (MARGIS-PINHEIRO et al.,
1999). Agentes naturais como insetos, vírus, bactérias e fungos tentam criar nas plantas diferentes
habitats como fonte de nutrientes (BARON e ZAMBRYSKI, 1995). Apesar da aparente passividade, as
plantas percebem as agressões, e sua alta capacidade de adaptação torna possível que sobrevivam
com freqüência, mesmo tendo muitas vezes seu desenvolvimento prejudicado. As plantas
desenvolveram sofisticados mecanismos de resposta para se defenderem e protegerem das várias
formas de estresse ambiental (HOLLEY et al., 2003). Os mecanismos de defesa de plantas em muitos
casos baseiam-se na expressão de genes de defesa e alterações no conjunto de proteínas da célula.
Análise do perfil de proteínas através de técnicas eletroforéticas tem sido muito usada para estudar e
entender mecanismos fisiológicos e biológicos da planta em condições normais e sob os mais diversos
tipos de estresse (SCHILTZ et al., 2004). Plantas tratadas com metil jasmonato ou exposta a tipos de
estresse que induzem a acumulação de jasmonatos, sintetizam altos níveis de polipeptídeos chamados
JIPs. Concomitantemente estes tecidos reduzem ou interrompem a síntese de muitas proteínas
presentes antes do tratamento por metil jasmonato (REINBOTHE et al., 1994). A mamona (Ricinus
communis) foi escolhida como modelo para estudo por ser muito resistente, se adaptando com
facilidade a diversos tipos de solos e climas, por isso espera-se que ela seja adequada para a
compreensão do mecanismo de defesa de plantas. Este trabalho teve por finalidade avaliar as
alterações no perfil protéico das folhas de mamona após tratamentos com metil jasmonato e assim
verificar o papel deste hormônio na rota de sinalização no mecanismo de defesa da mamona.
MATERIAIS E MÉTODOS
As sementes de R communis, cultivar IAC 80 foram adquiridas no Instituto Agronômico de
Campinas. As mesmas foram semeadas em potes plásticos contendo o substrato orgânico Plantmax®
em casa de vegetação. No estágio trifoliar, as plantas foram levadas para o laboratório e expostas a
MeJa. Após os tratamentos, as folhas cortadas foram pesadas e maceradas com auxilio de grau e
pistilo na presença de nitrogênio líquido. O pó obtido foi ressuspenso em 5 volumes de tris-HCl 100 mM
pH 8,0, EDTA 10 mM, PMSF 10 mM , benzamidina 4 mM, PVPP 5%, mantido por 1 hora e centrifugado
a 15.000 x g por 30 min. a 4C. O sedimento foi descartado e o sobrenadante foi reservado para
análises posteriores. Para 2D SDS-PAGE as proteínas foram extraídas segundo Tsugita et al. (1996).
As eletroforeses unidimensionais foram feitas segundo Laemmli (1970) e as bidimensionais segundo O'
Farrel (1975), Bjellqvist et al. (1982) e Görg et al. (1985 e 1988) empregando os aparelhos IPGphor e
MULTIphor II (GE Healthcare) de acordo com instruções do fabricante. A análise de imunodetecção foi
realizada segundo Towbin et al. (1979). A caracterização por espectrometria de massas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após 24 horas não observamos indução aparente (Fig. 1A), somente são vistas as reduções
das bandas de 50 e 15 kDa. Para o tempo de 48 horas (Fig. 1B), além dessas mesmas reduções,
observamos o aparecimento das bandas de 21, 24 e 32 kDa. Comportamento similar é observado após
72 h (Fig. 2A), mostrando-se mais acentuados após 144 h (Fig. 2B). As bandas protéicas com
características similares e que apresentaram reduções ou induções foram retiradas do gel e
hidrolisadas. As proteínas extraídas e os fragmentos triptícos foram levados ao espectrômetro de
massas para serem seqüenciados, e as seqüências encontradas foram comparadas com outras
seqüências encontradas em bancos de dados. Obteve-se a identificação de duas proteínas com massa
de 50 e 15 kDa como sendo Rubisco , cadeias pesada e leve (LSU e SSU). Os ensaios por “Western
Blotting”, confirmaram as reduções e, fragmentos da LSU 25 e 30 kDa foram identificados (Figura 2C).
Estas reduções da Rubisco, são sintomas típicos de plantas estressadas e demonstram eventos de
senescência. Este fenômeno já foi reportado em outras plantas, como Oryza sativa, Hordeum vulgare
Brassica napus e Arabidopsis thaliana, quando submetidas ao mesmo tratamento (SEMBDNER e
PARTHIER, 1993). A eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2 DE) foi utilizada como uma
ferramenta analítica para estudar as mudanças no proteoma das plantas. 2-DE revelou alterações
consideráveis no perfil protéico das folhas tratadas com MeJa em relação as plantas não tratadas.
Alguns “spots” protéicos mostram reduções, outros aumento e alguns aparecem nas plantas tratadas e
não são vistos nos controles. Nas Figuras 3 e 4 destaca-se um “spot” com massa em torno de 50 kDa e
ponto isoelétrico 6,1 que tem seus níveis reduzidos em 16% em 1 hora de tratamento e chega a 94%
em 48 horas, o qual foi identificada com LSU e confirmada por ensaio de “Western Blotting” (Figuras
4G e 4H). Outra importante redução é de um “spot” com massa em torno de 15 kDa e pI 7,8 visto a
partir de 14 horas e que apresenta características semelhantes com SSU. As proteínas
superexpressadas podem fazer parte de algumas proteínas de defesa constitutiva, e as novas podem
ser constituintes de grupos de proteínas induzidas por jasmonatos (JPIs) que podem ser, inibidores de
proteinases, tioninas, proteínas ricas em prolina, enzimas envolvidas no metabolismo de
fenilpropanóide e proteínas inativadoras de ribossomos -RIPs (Reinbothe et al., 1994), ou proteínas de
reserva vegetativa (VSPs), proteínas induzidas que parecem ser de estresse, com a função de proteger
e defender as plantas sob condições de estresse (ROSSATO et al., 2002).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MARGIS-PINHEIRO, M.; MARTIN, C.; DIDIERJAN, L.; BURKARD, G. (1999) -Differential expression of
bean chitinase genes by virus infection, chemical treatment and UV irradiation. Plant Molecular
Biology. 22: 659-668.
BARON, C.; ZAMBRYSKI, P. C. (1995) The Plant Response in Pathogenesis, Symbiosis, and
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HOLLEY, S. R.; YALAMANCHILI, R. D.; MOURA, D. S.; RYAN, C. A.; STRATMANN, J. W. (2003) Convergence of Signaling Pathways Induced by Systemin, Oligosaccharide Elicitors, and Ultraviolet-B
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A
250
160
105
75
M
controle
tratada
M
A
B B
controle
M
controle
tratada
tratada
250
160
105
75
50
50
35
35
30
30
25
25
15
15
10
10
Figura 1: SDS-PAGE 15%, de proteínas extraídas de folhas de plantas controles e
tratadas com metil jasmonato após 24 horas (A), 48 horas(B).
B
M
controle
Figura 2. SDS-PAGE 15% de proteínas extraídas de folhas de plantas controles e tratadas com
metil jasmonato após 72 horas (C) e 144 horas (D). (E) Imunodetecção após eletroforese em gel
15 %. C1 (controle); T1, T2, T3 e T4 (24, 48, 72 e 144 horas após tratamento
-
3
10
A
160
105
75
50
3
10
B
35
30
25
15
250
160
105
75
50
35
30
25
C
D
E
F
15
10
250
160
105
75
50
35
30
25
15
10
4
G
7
4
7
H
Figura 4: Eletroforese bidimensional dos extratos protéicos de folhas de mamona controle (A)
e tratadas com MeJa (B) após14 horas, controle (C) e tratada (D) e após 24 horas, controle
(E) e tratada (F) e após 48 horas. Imunodetecção após focalização isoelétrica na fixa de pH 4
a 7 e SDS-PAGE 12% das proteínas extraídas das plantas controles (G) e tratadas com
MeJa (H), no tempo de 24 horas.