docx - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Agosto de 2014 a Agosto de 2015
( ) PARCIAL
(X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Conservação de recursos zoogenéticos: produção
in vitro de embriões de Pecari tajacu
Nome do Orientador: Hilma Lúcia Tavares Dias
Titulação do Orientador: doutorado
Unidade: Núcleo de Ciências Agrárias e Desenvolvimento Rural - NCADR
Laboratório: Laboratório de Tecnologia Biomolecular
Título do Plano de Trabalho: Avaliação da qualidade microbiológica de sushi
comercializado na região metropolitana de Belém, Pará.
Nome do Bolsista: Blenda Manueli Simões
Tipo de Bolsa:
( ) PIBIC/CNPq
( ) PIBIC/CNPq-AF
( x ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/UFPA-AF
( ) PIBIC/INTERIOR
( ) PIBIC/FAPESPA
( ) PARD
( ) PARD – renovação
( ) PADRC
( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007
Resumo do Projeto de Pesquisa: Atualmente, a Amazônia está no centro das
discussões sobre a conservação ambiental, assim como dos conflitos agrários,
uma vez que o índice de desenvolvimento humano (renda, educação e saúde)
desta região é considerado um dos mais baixos do Brasil (PUDN-ONU, 2012).
Em parte, esses problemas sócio-ambientais são reflexos da política de
desenvolvimento econômico adotado no passado para a região, a qual foi
baseada fundamentalmente em grandes latifúndios para a pecuária e no
comércio da madeira, e mais recentemente na exploração mineral. Entretanto, é
possível diminuir ou mesmo excluir alguns problemas enfrentados atualmente
nesta região, quer seja do ponto de vista ambiental, social ou econômico, por
meio
do
desenvolvimento
e
da
difusão
do
conhecimento
sobre
processos/atividades alternativos e rentáveis. Neste contexto, a exploração
racional da rica biodiversidade em benefício das comunidades é de fundamental
importância. As espécies autóctones, adaptadas as condições locais, são
geneticamente importantes e ideais para o manejo ou a criação. Em estudo
sobre os produtos florestais não madeireiros, a FAO (1999) afirma que o Brasil,
em especial a região Amazônica, possui uma grande quantidade destes recursos
genéticos. Entre esses há uma lista de animais da fauna nativa de interesse em
bioprospecção. Algumas espécies da fauna silvestre como o caititu (Pecari
tajacu), a capivara (Hydrochoerus hydrochaeris), a cutia (Dasyprocta sp.), a paca
(Cuniculus paca) e alguns quelônios são amplamente utilizados para o consumo
de carne e/ou ovos (Bonaudo et al., 2005; Pezzuti et al., 2004, 2010). Em
relação à biodiversidade de pouco adiantará possuí-la se não for possível
conhecê-la e utilizá-la em melhorias para a sociedade (Rumpf et al., 2000). O
uso da biotecnologia da reprodução possibilita a conservação da diversidade
biológica, sendo mais um recurso para evitar a perda das espécies (Barbosa,
2001). O caititu (Pecari tajacu) é um dos animais mais caçados na Amazônia
para alimentação humana e a sua criação em cativeiro é um instrumento legal
para a comercialização. Apesar do interesse na criação, há poucos dados sobre
a sua biologia, o que dificulta o aumento da produção desta espécie. Diante do
exposto, torna-se importante e necessário a aplicação de pesquisa na área da
reprodução animal que contribuam para o aumento na oferta produtiva, e
auxiliem o desenvolvimento sustentado da Amazônia.
INTRODUCAO
Nos últimos anos houve um grande aumento no consumo de sushi, e
diante da presença de um estimável número de agentes zoonóticos, os
pesquisadores e as autoridades sanitárias passaram a refletir sobre tal consumo
(SILVA & SOUZA, 2003). Entretanto, juntamente com o crescimento desses
serviços observa-se que os alimentos ficaram mais expostos a diversos perigos
ou oportunidades de contaminações microbianas associadas a práticas
incorretas de manipulação e processamento. Pois nos últimos anos tem se
mostrado cada vez mais comum, em diversos países casos de doenças
veiculadas por alimentos de etiologia variados muitas vezes por contaminação
da matéria prima ou do produto para o consumo.
O sushi por ser um prato preparado com pescado cru e é considerado um
produto altamente perecível não só porque é consumido in natura apenas
ligeiramente resfriado, mas também pelos aspectos higiênicos – sanitários
envolvidos na sua preparação e conservação os quais exigem cuidados e
conhecimento (VIEIRA et al., 2006). E ainda, o pescado é um excelente alimento
equilibrado e rico em vários nutrientes essenciais, pelo que os microrganismos
não têm qualquer dificuldade de crescimento neste meio (VAZ- PIRES,2006). Os
microrganismos representam uma ameaça à segurança dos alimentos, pois
podem ser causadores de doenças de origem alimentar.
A captura de pescado contaminado com microrganismos potencialmente
patogênicos (Salmonella, Shigella, E.coli e vírus entéricos) podem oferecer
riscos, porque baixas doses infectantes são capazes de provocar doenças de
origem alimentar. Os alimentos que possuem este tipo de contaminação
poderiam eliminar os riscos destes microrganismos através da temperatura,
entretanto, a principal preocupação com segurança alimentar relaciona-se com o
consumo destes alimentos crus, como no caso do sushi e sashimi (HUSS et al.,
2000). Segundo Vaz Pires (2006), o pescado sofre diversas alterações após a
sua
morte,
destacando-se
alterações
sensoriais,
químicas,
físicas,
microbiológicas. Todas estas formas de degradação estão interligadas e não são
facilmente distinguíveis entre si (GUZMÁN, 1998).
Dentre as patogenias que podem ser transmitidas por esses pratos estão
as salmoneloses, causadas pelas bactérias do gênero Salmonella, o qual é
considerado o principal agente etiológico de doenças transmitidas por alimentos
no mundo (CDC,1999). A ocorrência de Salmonella em pescados de origem
marinha tem vindo a ser comunicada e representa perigo para a saúde publica, e
predomina nas aguas poluídas por esgotos. Como consequência direta da
manipulação inadequada é apontada Staphylococcus aureus, de origem
humana, encontrado nas mucosas e superfície da pele, e que encontra no
pescado um ambiente favorável para sua multiplicação (COSTA et al., 2007). A
presença de S. aureus em pescados e seus subprodutos ocorrem durante o
processamento pelo contato com as mãos do manipulador sem que sofram
modificações em sua aparência e sabor.
As analises microbiológicas permitem detectar a presença de bactérias
patogênicas, de microrganismos indicadores de contaminação fecal ou até de
eventuais práticas de manuseio deficiente (HUSS, 2000).
JUSTIFICATIVA
Reconhecendo os riscos que envolvem a venda de sushi por serem
pratos preparados com pescado cru e também pelos aspectos higiênicos –
sanitários envolvidos em sua preparação e conservação (MENEZES, 2006), a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária estabeleceu valores de referencia para
estabelecer os padrões microbiológicos sanitários para alimentos. E diante de
diversas ocorrências, de que estes pratos causaram à saúde publica em
diversas regiões brasileiras como em Cariri no Ceará, pelo menos 30 pessoas
foram hospitalizadas após consumirem sushi e apresentarem sintomas de
intoxicação alimentar. Recentemente em Belém foi encontrado em sushi
adquirido em restaurante de culinária japonesa, larvas e que possivelmente
podem ser sinais de má manipulação podendo até mesmo, conter outros microorganismos não visíveis a olho nu.
Um alimento produzido ou manipulado com condições precárias de
higiene pode oferecer riscos à saúde de quem o ingere. Alguns microrganismos
que podem contaminar os alimentos são patogênicos, causando doenças em
seu hospedeiro. Outros não causam enfermidades nos seres humanos, mas são
indícios de condições higiênicas inadequadas, e sua presença sugere a
existência de outros microrganismos (BASTI et al., 2006). Dentre os
microrganismos destaca-se a bactéria Staphylococcus aureus, em que alguns
casos produzem uma enterotoxina termoestável, responsável no homem pelo
quadro de intoxicação alimentar.
A contaminação de alimentos por bactérias Gram-negativas patogênicas
ao homem é de grande interesse do ponto de vista da saúde publica. Nos
alimentos o estudo desta bactéria é de extrema importância, não apenas como
deteriorante, mas também sendo considerado o melhor indicador de sua
contaminação fecal. O reservatório natural da Salmonella é o trato intestinal de
mamíferos, aves e repteis e podem alcançar o ambiente aquático através da
contaminação fecal, desta forma serem detectadas em peixes e produtos
pesqueiros.
Neste contexto é ressaltado que, a avaliação microbiológica dos
alimentos constitui-se em um dos parâmetros mais importantes para se
determinar a qualidade e sanidade dos alimentos, e é igualmente relevante para
verificar se padrões e especificações microbiológicas nacionais e internacionais
estão sendo atendidas (ROÇA, 1994).
A conservação e higiene dos equipamentos, a origem e a qualidade das
matérias-primas, o grau de conhecimento e o preparo dos manipuladores, os
responsáveis técnicos, são imprescindíveis para garantir a segurança dos
alimentos.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar a qualidade microbiológica de sushi comercializado em diferentes
pontos da cidade de Belém, Pará, observando se os resultados obtidos
encontram-se dentro dos valores permitidos pela legislação vigente.
Objetivos Específicos
o
identificar e quantificar Staphylococcus aureus, microrganismos aeróbios
mesófilos, coliformes totais, termotolerantes e Salmonella sp. em sushi
comercializado na cidade de Belém-Pa;
o
estabelecer a relação entre os resultados e a forma como esses pratos
são apresentados aos consumidores.
MATERIAIS E MÉTODOS
As
amostras
de
especializados e não
sushi
foram
especializados
adquiridas
em
em
estabelecimentos
culinária nipônica
da
região
metropolitana de Belém, expostas em sistemas de buffet e a qualquer horário,
realizando-se três coletas alternadas em cada estabelecimento. As amostras
foram embaladas em sacos estéreis e acondicionadas em caixa isotérmica com
gelo reciclável e conduzidas ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular para
início das análises.
Coleta e preparo das amostras
Cerca de 200 gramas de preparações de 18 amostras de pescado cru
foram retiradas do balcão onde estavam expostas e acondicionadas em sacos
estéreis em caixa isotérmica para conservar a temperatura de exposição até a
chegada ao laboratório.
Isolamento dos microrganismos
Os procedimentos para a análise microbiológica foram realizados de
acordo com a metodologia preconizada por Métodos Analíticos Oficiais para
Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água
(BRASIL, 2003).
Para cada coleta, os alimentos foram homogeneizados assepticamente,
em liquidificador, a fim de formar uma mistura em proporções idênticas ao da
amostra original.
As amostras de sushi foram avaliadas, em duplicata, as seguintes
análises: determinação do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes a 35 ºC,
Coliformes termotolerantes a 45 °C e E. coli, contagem de Staphylococcus spp.
e pesquisa de Salmonella sp.
Pesquisa de Coliformes e E. coli
A pesquisa de coliformes foi realizada através da técnica de tubos
múltiplos com série de três tubos de cada diluição seriada, até 10 -3 para
determinação do número mais provável de organismos por grama (NMP/g).
Após a homogeneização da amostra, 25 gramas da mistura inicial foram
adicionados a 225 mL de água peptonada estéril com 0,1% de NaCl e foram
realizadas as diluições sucessivas, a partir da diluição inicial (10-1), inoculandose volumes de 1 mL em serie de 3 tubos contendo Lauril triptose. De cada
diluição foi transferido 1mL para três tubos contendo 9mL de Caldo Lauril triptose
estéril, com tubo de Durham invertido e incubados a 35 ºC até 48 horas. Foram
considerados positivos para coliformes totais os tubos que apresentaram
turvação e formação de gás. Com auxílio de alça microbiológica, três alçadas
foram transferidas dos tubos positivos para os tubos com 9 mL de caldo
Escherichia coli (EC) estéril e para o caldo Verde Brilhante. Após foram
incubados a 45 ºC e 35 °C, respectivamente, por até 48 horas. Foram
considerados para contagem do número mais provável (NMP) de coliformes
termotolerantes os tubos que apresentasse turvação e formação de gás.
Pesquisa de Staphylococcus sp.
Para contagem presuntiva de Staphylococcus sp. foi utilizado o método
de contagem direta em placas. A partir das diluições seriadas preparadas, foram
transferidas alíquotas de 100 µL de cada uma das diluições 10-1 a 10-3 em placas
contendo meio Baird Parker (BP) adicionados de 5% de solução de gema de ovo
com telurito e espalhadas com alça de Drigaslski estéril. As amostras foram
incubadas por 48 horas a 37ºC. As colônias negras com bordas regulares,
apresentando halo de hidrólise foram contadas e transferidas para microtubos
com ágar Lúria semi-sólido. As cepas foram reisoladas em placas de ágar com
ágar Cystine Lactose Electrolyte Deficient (CLED) e identificadas pelos testes de
catalase e coagulase. A quantidade de unidades formadoras de colônias por
grama de amostra (UFC/g) foi determinada em função do número de colônias
típicas contadas, diluição inoculada e porcentagem de colônias confirmadas.
Pesquisa de Salmonella sp.
Uma porção de 25 gramas de cada amostra inicial foi adicionada em 225
mL de solução salina peptonada 1% e incubada a 36 °C por 16 a 20 horas. Após
esse período, 0,1 mL foram inoculados em caldo seletivo Rappaport e 1 mL para
tubos contendo Selenito cisteina que foram incubados a 41 °C por 24 a 30
horas.
O isolamento foi realizado a partir de caldos seletivos de enriquecimento e
repicado sobre a superfície previamente seca de placas com cada meio sólido
seletiva, estriando de forma a se obter colônias isoladas. Dessa forma foram
obtidas 2 placas de BPLS, uma originária do caldo Rappaport Vassiliadis e outra
originária do caldo selenito cistina e 2 placas de Agar XLD, obtidas do mesmo
modo. Incubaram-se todas as placas, invertidas, a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
As colônias com suspeita de Salmonella sp., em ambas as metodologias
foram submetidas as seguintes provas bioquímicas: TSI, teste de indol, teste de
uréase, teste de fermentação do ducitol, teste de fermentação da glicose,
lactose,sacarose, maltose e manitol, teste descarboxilação de lisina, teste
de citrato.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Do total de 18 amostras analisadas foi possível observar a presença de
Staphylococcus sp., Escherichia coli e coliformes termotolerantes e ausência de
Salmonella sp.
Na
tabela
1
encontram
se
as
variações
das
contagens
para
Staphylococcus sp. em UFC/g das 18 amostras de sushis. Diante dos resultados
obtidos foi possível observar que grande parte das amostras encontram se
dentro do valor permitido e preconizado pela RDC n°12 que admite valores até a
diluição 10-3, entretanto, também foram encontrados valores acima do limite
permitido como nas amostras 09 e 14.
A presença deste microrganismo em todas as amostras deve-se ao
contato direto dos manipuladores com alimento uma vez que os mesmos não
utilizam
luvas
no
momento
do
preparo
facilitando
a
veiculação
do
Staphylococcus sp., pois são encontrados na pele e mucosas de seres humanos
mas também pode ocorrer devido a uma possível inadequada limpeza e
sanificação dos materiais e equipamentos.
A presença de Staphylococcus sp. e da espécie S. aureus, foi confirmada
pelos
testes
bioquímicos
que
revelaram
4
amostras
positivas
para
Staphylococcus aureus. Entretanto vale ressaltar que os estafilococos
coagulase-negativos também são de grande relevância visto que nos últimos
anos foram reconhecidos como agentes de doenças humanas (KONEMAN,
2001).
Tabela-1. Resultados das contagens para Staphylococcus em UFC/g-1 das 18
amostras de sushis comercializadas na cidade de Belém, 2015.
Contagem de Staphylococcus (UFC.g-1)
Amostras
01
2,5 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
02
2,5 x 10-2 UFC/g
S. aureus
03
4,7 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
04
3,4 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
05
2,5 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
06
2,1 x 10-4 UFC/g
Staphylococcus sp.
07
2,8 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
08
2,0 x 10-3 UFC/g
S.aureus
09
2,7 x 10-5 UFC/g
Staphylococcus sp.
10
2,5 x 10-2 UFC/g
S.aureus
11
9,5 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
12
6,5 x 10-2 UFC/g
S.aureus
13
2,6 x 10-3 UFC/g
Staphylococcus sp.
14
2,6 x 10-4 UFC/g
Staphylococcus sp.
15
3,9 x 10-2 UFC/g
Staphylococcus sp.
16
2,7 x 10-3 UFC/g
Staphylococcus sp.
17
2,8 x 10-3 UFC/g
Staphylococcus sp.
18
1,3 x 10-3 UFC/g
Staphylococcus sp.
A tabela 2 exibe os achados referentes à Escherichia coli, sendo possível
observar que houve similaridade na prevalência deste microrganismo. Pois
foram encontrados resultados relevantes e considerando a RDC nº 12/ANVISA e
a RDC nº 216/ANVISA, pode-se concluir que os estabelecimentos avaliados não
cumprem as regras de boas práticas desta legislação, visto que o contágio por
E. coli se dá através da ingestão de água ou alimentos que não foram
processados e tiveram algum tipo de contaminação fecal durante a sua
produção e, essa bactéria é prejudicial para os alimentos, onde sua presença
determina inutilidade dos mesmos pois oferece
grande risco de intoxicação
alimentar (FRAZIER, 1976).
Aspectos também vêm sendo apontados na literatura como contribuidores
ao risco a saúde do consumidor, como a qualidade da água e do gelo utilizados
em conservação e preparo, e a falta de um fluxograma que promova o melhor
controle dos pontos críticos de contaminação (VIEIRA, 2007; FURLAN, 2009).
Na legislação atual, a ANVISA tem uma maior atenção sobre a presença de E.
coli dentre as termotolerantes, com vistas a indicar o produto como impróprio
para consumo.
Tabela 02. Resultados das contagens para Coliformes totais e termotolerantes
(NMP.g-1) das 18 amostras de sushis comercializadas na cidade de Belém, 2015.
Amostras
Contagem de coliformes
Contagem de coliformes total
-1
termotolerantes (NMP.g )
(NMP.g-1)
01
>1.110 NMP/g
>1.110 NMP/g
02
>1.110 NMP/g
>1.100 NMP/g
03
1.100 NMP/g
1.500 NMP/g
04
93 NMP/g
330 NMP/g
05
1.100 NMP/g
9,2 NMP/g
06
1.100 NMP/g
9,2 NMP/g
07
>1.110 NMP/g
1.100 NMP/g
08
>1.110 NMP/g
>1.110 NMP/g
09
>1.110 NMP/g
>1.110 NMP/g
10
20.000 NMP/g
920NMP/g
11
>1.110 NMP/g
>1.110 NMP/g
12
>1.110 NMP/g
11.000 NMP/g
13
>1.110 NMP/g
>1.110 NMP/g
14
430 NMP/g
430 NMP/g
15
<3,0 NMP/g
<3,0 NMP/g
16
920 NMP/g
43 NMP/g
17
<3,0 NMP/g
210 NMP/g
18
>1.110 NMP/g
>1.110 NMP/g
Para pesquisa de Salmonella sp. foram obtidos resultados negativos, o
que é esperado pela RDC nº12/2001 que preconiza a ausência deste
microrganismo.
CONCLUSÃO
As análises microbiológicas dos sushis demonstraram que nos dois tipos de
estabelecimentos, especializados e não especializados, na culinária japonesa,
pode ter ocorrido erros graves em uma ou mais etapas na elaboração do
alimento, armazenamento ou comercialização apresentando como consequência
a presença de coliformes totais e termotolerantes acima dos limites
estabelecidos na legislação brasileira, bem como, para Staphylococcus sp, o que
indica
condições
higiênico-sanitárias
inadequadas
dos
estabelecimentos
pesquisados.
Foi de grande relevância o conhecimento da presença destes
microrganismos neste alimento, pois é um alerta para os estabelecimentos se
adequarem no preparo de seu produto, que será destinado ao consumo e, que
estão impróprios para este fim. Torna-se necessária a adoção de medidas
higiênico-sanitárias mais rigorosas e a aplicação das Boas Práticas de
Fabricação (BPF), a fim de controlar os possíveis riscos potenciais à saúde do
consumidor.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BASTI A. A., MISAGUI A, SALAHI TZ, KAMKAR A. Bacterial pathogens in fresh,
smoked and salted Iranian fish. Food Control , 2006.
BRASIL, Ministério da saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), Resolução RDC nº 12 de 02 de janeiro de 2001. Regulamento
Técnico Sobre Os Padrões Microbiológicos para Alimentos. Diário Oficial.
Brasília, DF. 10 de janeiro de 2011.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) do Ministério da
Saúde. Resolução RDC nº175, de 08 de julho de 2003. Regulamento Técnico de
Avaliação de Matérias Macroscópicas e Microscópicas Prejudiciais à Saúde
Humana em Alimentos Embalados. Diário Oficial da República Federativa do
Brasil, Brasília, DF, 09 jul 2003.
CDC - Centers for Disease Control and Prevention. Salmonella URL:
http.//www.cdc.gov/oc/media/fact/samonella.htm.acessed in:16/07/1999.
COSTA, R.A.; VIEIRA, G.H.F.; SILVA, G.C.; PEIXOTO, J.R.O.; BRITO, M.V.
Bactérias de interesse sanitário em sushi comercializado em Sobral-Ceará.
Boletim Técnico-Científico do Cepene, v.15, n.1, p.15-19, 2007.
EVANGELISTA-BARRETO, N.S. Staphyloccocus aureus. In Vieira, R.H.S.F.
Microbiologia, Higiene e qualidade do pescado-teoria e prática. Varela editora.
São Paulo, p.380,2004
FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurança alimentar. Trad. Maria Carolina
Minardi Guimarães e Cristina Leonhardt – Porto Alegre: Artmed, 2002
FURLAN, E.F. Segurança alimentar na cadeia produtiva do pescado. III
SIMCOPE – SIMPÓSIO DE CONTROLE DO PESCADO, 3., 4 a 6 jun. 2008, [S.
l.].
Minicurso
apresentado[S.l.],2008.
Disponível
em:
<ftp://ftp.sp.gov.br/ftppesca/3simcope/3simcope_mini-curso7.pdf>. Acesso em:
23 mar. 2015.F
FRANCO, B. D. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia Dos Alimentos. São Paulo,
1996, p. 43 – 46.
FRAZIER, N.C. Microbiologia de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1976. 512p
HUSS, H.H.; REILLY; EMBAREK, P.K.B. Prevention and control of hazards in
seafood. Food Control, v.11, p.149-156, 2000.
JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. 6º ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.
SILVA & SOUZA, A, T. Certificação da qualidade de pescados. Biológico, São
Paulo, v.65, n.1/2, p.11-13, jan./dez., 2003.
VIEIRA, R.H.S.F.; SILVA, C.; CARVALHO, F.C.T.; MENEZES, F.G.R.; REIS, E.M.
F.; RODRIGUES, D.P. Salmonella e Staphylococcus coagulase positiva em sushi
e sashimi preparados em dois restaurantes da cidade de Fortaleza, Ceará.
Boletim Técnico Científico do CEPENE, v.14, p.1-10, 2007.