Replicacao do DNA - Tecnologia do PCR
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PCR – Polymerase Chain Reaction Reação em cadeia da polimerase – 1983 – Kary Mullis – Premio Nobel em 1993. Polymerase chain reaction (PCR) É a técnica utilizada para amplificar o número de cópias de uma região específica do DNA – para produzir DNA suficiente para estudos. PCR Milhões de cópias de DNA podem ser produzidas em poucas horas incubando-se o DNA em condicoes especificas O que você precisa para realizar um experimento de PCR? Molécula de DNA molde 1 par de primers. Enzima DNA polimerase: Nucleotídeos livres (bases): dCTP, dGTP, dATP, dTTP Tampão: com MgCl2 (co-fator para a DNA polimerase) Equipamentos: Micro-tubos e fonte de calor: termocicladores O processo O processo do PCR é composto de ciclos contendo os seguintes passos: 1- desnaturação 2- anelamento 3- extensão desnaturação O DNA é aquecido para quebrar as pontes de hidrogênio entre as fitas complementares, permitindo a separação das fitas. anelamento Uma vez separadas as fitas, o DNA é resfriado para permitir que os primers (forward e reverse – sense e antisense), se liguem nas seqüências complementares do molde. Extensão Uma vez que os primers estejam ligados, a DNA polimerase começa a estender os primers pela adição de nucleotídeos usando as fitas do DNA molde como modelo. Para realizar um experimento de PCR deve-se conhecer exatamente as seqüências de DNA que flanqueiam as duas extremidades da região de interesse – que pode ser um gene ou qualquer outra seqüência. Primeiro passo para o experimento de PCR: Construção dos oligonucleotídeos primers (1 par) ATATCGGGTTAACCCCGGTATGTACGCTA – representa parte de um gene; 3’TTAACGGGGCCCTTTAAA........TTTAAACCCGGGTTT5’ Fita complementar: 5’AATTGCCCCGGGAAATTT........AAATTTGGGCCCAAA3’ TTAACGGGGCCCTTTAAA........TTTAAACCCGGGTTT AATTGCCCCGGGAAATTT.......................> <.....................................................TTTAAACCCGGGTTT AATTGCCCCGGGAAATTT........AAATTTGGGCCCAAA Taq polimerase Enzima termo estável, isolada da bactéria Thermus aquaticus Onde o PCR é usado: Qualquer material genético: sangue, bulbo capilar, tecidos, microorganismos, animal, plantas, fósseis, etc. Como o PCR é usado? Saúde humana –diagnóstico doenças Projetos genoma DNA forense DNA antigo – relações evolutivas Sistemática moderna Estudos ecológicos Comportamento animal Etc. etc. etc. etc. etc. Visualização do produto de PCR Eletroforese em gel de agarose Definição de eletroforese: é o processo no qual moléculas (proteínas, DNA ou RNA) são separadas de acordo com o tamanho e carga elétrica pela aplicação de uma corrente elétrica nas mesmas. A corrente elétrica força as moléculas pelos poros de uma camada fina de gel. A matriz do gel pode ser feita em concentrações e materiais específicos para separar moléculas dentre uma variação especifica de tamanhos e formas. Fragmentos menores, geralmente movem-se mais rápidos que os maiores. Eletroforese: termo referente a migração de uma molécula através de uma matriz ou gel, sob a influencia de uma forca eletrica. A forca eletrica puxa a molécula atraves do gel que encontra resistencia, resultando na separacao das mesmas. Moleculas maiores migram mais devagar do que moleculas menores atraves do gel; A distancia da migracao dentro do gel pode ser usado para determinar o tamanho da molecula. Gel de DNA O grupo fosfato encontrado no DNA tem carga negativa; Quando a corrente elétrica é aplicada no gel, os fragmentos de DNA migram em direção ao pólo positivo da cuba. Para avaliar o tamanho dos Fragmentos: uso do padrão
