Diapositivo 1

UBA III – Biologia Molecular
Aula prática 2
2012/2013
Maria José Correia
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Sumário P2:
• Aplicações biotecnológicas das enzimas
de restrição
• Eletroforese em gel de agarose
• Avaliação do padrão de restrição obtido pela
digestão de DNA λ com as enzimas PstI,
EcoRI e HindIII.
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Enzimas de restrição – ferramentas
básicas em biologia molecular
• Tecnologia do DNA recombinante/
clonagem de genes
• Farmacologia
• Biotecnologia em processos industriais
• Fingerprinting de DNA
• Testes de paternidade
• Investigações criminais e outras aplicações forenses
• Manipulação de produtos transgénicos
• Incremento valor comercial de espécies
• Terapia génica
• transferência direta de genes em humanos
com fim terapêutico
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Eletroforese em gel de agarose
• Separação de diferentes fragmentos de DNA em função
da sua mobilidade num campo elétrico
• Fatores que influenciam a migração de DNA em gel
• Peso molecular
• Conformação do DNA
• Concentração de agarose
• Voltagem aplicada
• Composição do tampão de eletroforese
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php
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Eletroforese: preparação do gel de agarose
1. Preparar uma solução de agarose em tampão TAE (1x) com
concentração final de 1% (m/v).
2. Aquecer a mistura em microondas até toda a agarose se ter
dissolvido.
3. Montar o suporte do gel na respetiva base de preparação do gel.
4. Colocar o pente formador de poços na posição correta.
5. Verter a agarose no suporte eliminando bolhas de ar que se tenham
formado e deixar solidificar à temperatura ambiente.
6. Retirar o pente cuidadosamente para não danificar os poços.
7. Colocar o suporte na tina de eletroforese, de modo a que os poços
estejam do lado do elétrodo negativo, e adicionar tampão TAE(1x)
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Electroforese: preparação das amostras
1. Adicionar tampão de carga às reações de digestão (L, P, E e N)
• este vai conferir densidade à amostra, facilitando a sua
aplicação nos poços
2. Aplicar as amostras nos respetivos poços com uma micropipeta,
evitando a contaminação dos poços adjacentes.
3. Reservar um dos poços para aplicar marcador de pesos
moleculares (para referência)
4. Colocar a tampa na tina e verificar se a migração das amostras se
dá no sentido cátodo-ânodo (preto-vermelho).
5. Estabelecer a corrida a 100V durante 30 minutos.
6. Depois da corrida, desligar a tina e retirar o gel e colocá-lo numa
tina com corante.
7. Lavar o gel com água (40-55ºC)
8. Examinar os resultados.
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Registo e análise dos resultados
• Medir a distância “poço – banda”
• registar valores na tabela
x
y
x
y
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