CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM AMBIENTE E DESENVOLVIMENTO IONTOFORESE ASSOCIADA AO PRINCÍPIO ATIVO ÁCIDO ASCÓRBICO: AVALIAÇÃO ELETROQUÍMICA E DE DIFUSÃO VERTICAL Giovana Sinigaglia Lajeado, fevereiro de 2014 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) Giovana Sinigaglia IONTOFORESE ASSOCIADA AO PRINCÍPIO ATIVO ÁCIDO ASCÓRBICO: AVALIAÇÃO ELETROQUÍMICA E DE DIFUSÃO VERTICAL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ambiente e Desenvolvimento, do Centro Universitário UNIVATES, como parte da exigência para obtenção do grau de Mestre em Ambiente e Desenvolvimento na área de Tecnologia e Ambiente. Orientador: Profa. Dra. Simone Stülp Coorientador: Prof. Dr. Eduardo Périco Lajeado, fevereiro de 2014 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) AGRADECIMENTOS “Em tempos em que quase ninguém se olha nos olhos, em que a maioria das pessoas pouco se interessa pelo que não lhe diz respeito, só mesmo agradecendo àqueles que percebem nossas descrenças, indecisões, suspeitas, tudo o que nos paralisa, e gastam um pouco da sua energia conosco.” (Marta Medeiros). Gostaria de agradecer a Deus, à minha orientadora prof. Dra. Simone Stülp, pessoa e pesquisadora a quem admiro e tenho muito respeito, que tornou possível a realização desta dissertação. Ao prof. Dr. Eduardo Périco, que através do generoso auxílio e atenção a mim disponibilizados foi possível acrescentar qualidade a esta dissertação. Ao professor Eduardo Ethur, pelo auxílio prestado. As bolsistas do NEMP (Verônica Radaelli, Paula Marioti), em especial a Caroline Saling e Laís Bresciani que me acompanharam nos meus experimentos e análises com muita atenção e disposição. Aos meus colegas de trabalho prof Ms. Dênis Duarte Barnes e Débora Urnau Cerutti (in memorian) amigos e apoiadores deste projeto. Prof. Paula Bianchetti e em especial o prof. Ms.João Alberto Tassinary pelo auxílio e apoio nos momentos difíceis e também o incentivo de aprimorar cada vez mais o trabalho. Ás queridas amigas e bolsistas Sara Mallmann, Jéssica Becker e em especial à Maiara Zagonel, por emprestar seus abraços e ouvidos. Aos amigos que fiz durante esta caminhada e que também me apoiaram muito, Diego e Marcelo. E finalmente aos meus familiares e ao meu namorado Alex Bücker pelo apoio em todos os momentos. “Conformar-se é submeter-se e vencer é conformar-se, ser vencido. Por isso toda a vitória é uma grosseria. Os vencedores perdem sempre todas as qualidades de desalento com o presente que os levaram à luta que lhes deu a vitória. Ficam satisfeitos e satisfeito só pode estar aquele que se conforma, que não tem a mentalidade do vencedor. Vence só quem nunca consegue”(Fernando Pessoa). BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) RESUMO A iontoforese é um método de incremento de permeação de substâncias pela pele com a utilização de corrente contínua. Neste estudo, será abordado o princípio ativo ácido ascórbico, que possui efeitos fisiológicos na pele, tais como a sua atividade antioxidante; é também um importante cofator da produção de colágeno pelos fibroblastos e ainda atua como inibidor da melanogênese, proporcionando um clareamento de manchas. Foram realizadas aplicações de iontoforese in vitro em gel com hidroxietilcelulose associada ao princípio ativo ácido ascórbico 5% nos tempos 0, 2, 5 e 10 minutos, para as quais houve um grupo de aplicação da corrente e um grupo controle. O comportamento eletroquímico do ácido ascórbico frente à iontoforese foi analisado através de voltametria cíclica. A liberação, permeação e fluxo do ácido ascórbico foram avaliadas por difusão vertical in vitro utilizando-se a célula do tipo Franz com membrana de acetato de celulose e biomembrana de muda de pele de cobra. Pode-se observar que houve um incremento na liberação e fluxo do ácido ascórbico quando comparada à difusão passiva. O fluxo do ácido ascórbico através da membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese foi de 5.1594 ± 0.2831 µmol L-1 cm-² h-1 e com a aplicação da iontoforese o fluxo de ácido ascórbico aumentou para 16.7132 ± 0.08779 µmol L-1 cm-² h-1. Já em termos de permeação os valores de fluxo de ácido ascórbico obtidos foram de 2.27363 µmol L-1 cm-² h-1 e 2.67576 µmol L-1 cm-² h-1, para sistemas com e sem iontoforese, respectivamente. Por meio da avaliação eletroquímica, verificou-se que nos tempos de 2 e 5 minutos o ácido ascórbico apresentou uma tendência à oxidação com caráter reversível, já em um período de aplicação de iontoforese de 10 minutos a tendência à oxidação ocorreu na forma de ácido deidroascórbico. Palavras-chave: Iontoforese. Ácido ascórbico. Voltametria cíclica. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) ABSTRACT Iontophoresis is a method for increasing the permeation of substances through skin using direct current. In this study, was studied the active ascorbic acid, which has physiological effects on the skin, such as its antioxidant activity principle , it is also an important cofactor in the production of collagen by fibroblasts and also acts as an inhibitor of melanogenesis , providing a bleaching of stains . Applications of iontophoresis in vitro gel hydroxyethylcellulose associated with active ingredient ascorbic acid 5 % at 0, 2 , 5 and 10 minutes were performed for which there will be a group of current application and a control group . The electrochemical behavior of ascorbic acid iontophoresis front was analyzed by cyclic voltammetry. The release and permeation flux were evaluated by ascorbic acid vertical diffusion in vitro using Franz type cell membrane of cellulose acetate and biomembrane snake skin changes. Can be seen that there was an increase in the release and flow of ascorbic acid when compared to the passive diffusion. The flow of ascorbic acid through the pulp without the application of iontophoresis acetate membrane was 5.1594 ± 0.2831 µmol L -1cm -²h -1 and with the application of iontophoresis flow of ascorbic acid increased to 16.7132 ± 0.08779 µmol L -1cm -²h -1 . In terms of the permeation flux values obtained were Ascorbic acid 2.27363 µmol L -1cm -²h -1 and 2.67576 µmol L-1 cm -²h -1 for systems with and without iontophoresis, respectively. Through electrochemical evaluation, ascorbic acid showed a tendency of reversible oxidation in 2 and 5 minutes, but over a period of iontophoresis application of 10 minutes the tendency of oxidation was in molecular form of dehydroascorbic acid. Key Words: Iontophoresis. Ascorbic acid. Cyclic voltammetry. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS AA ou aa - Ácido ascórbico cm- centímetro Hz – Hertz L- litro mA - Miliampères nm - Nanômetros pH - Potencial de hidrogênio RL - Radical livre RNAm - ácido ribonucleico mensageiro UVA - Radiação ultravioleta A UVB - Radiação ultravioleta B V - volt µA - Microampères µmol- Micromol BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1- Estrutura química do ácido ascórbico (C6H8O6) ......................................... 16 Figura 2-Formas reduzidas do ácido ascórbico......................................................... 17 Figura 3 - Aplicação de potencial elétrico e deslocamento da corrente elétrica na presença de eletrodos reversíveis de Ag e AgCl ....................................................... 19 Figura 4- Aparelho utilizado para a aplicação de iontoforese, modelo AF5 da empresa Tone Derm .................................................................................................. 27 Figura 5- Aplicação da iontoforese in vitro. ............................................................... 29 Figura 6- Curva de calibração do ácido ascórbico para potenciais de 0,45 V por voltametria cíclica. ..................................................................................................... 31 Figura 7- Voltametria cíclica de prata em sistema contendo gel com -1 hidroxietilcelulose v= 10mV.s .................................................................................. 32 Figura 8- Voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose com ácido ascórbico 5%. v= 10mV.s-1 ........................................................................................ 33 Figura 9- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose sem a aplicação de iontoforese (linha) e após a aplicação de iontoforese por 2 (linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada +pontilhada), v= 10mV.s-1 .......................................................................................... 33 Figura 10- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose com ácido ascórbico 5% (linha contínua) após a aplicação de iontoforese por 2 ( linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada e pontilhada). No detalhe os picos característicos encontrados na pesquisa, v= 10mV.s-1 .................................................................................................................... 34 Figura 11- Curva de calibração para a concentração de ácido ascórbico. ................ 37 Figura 12- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de acetato de celulose, sem a aplicação de iontoforese in vitro.............. 38 Figura 13- Liberação do ácido ascórbico nos tempos de 0, 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese in vitro............... 38 Figura 14- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de acetato de celulose, com aplicação de iontoforese in vitro ................ 39 Figura 15- Liberação do ácido ascórbico em membrana de acetato de celulose com a aplicação de iontoforese in vitro ............................................................................. 39 Figura 16- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de permeação do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de pele de cobra, sem a aplicação de iontoforese in vitro .................................................................................................................................. 41 Figura 17- Permeação do ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra sem a aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................ 41 Figura 18- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de pele de cobra, com aplicação de iontoforese in vitro.......................... 42 Figura 19- Permeação de ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra com a aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................ 42 Figura 20- Detalhe da aplicação de iontoforese com a célula dividida por placa de vidro isolando os eletrodos de forma que a comunicação ocorra através da solução receptora. .................................................................................................................. 45 Figura 21- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose através da membrana de acetato de celulose, sem e com aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................ 47 Figura 22- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose através da biomembrana de pele de cobra, sem e com aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................................ 47 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) SUMÁRIO INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 10 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................................... 13 2.1 O envelhecimento cutâneo e suas consequências na pele................................... 13 2.2 O ácido ascórbico ..................................................................................................... 16 2.3 A iontoforese ............................................................................................................. 18 2.4 A iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico e seu papel no envelhecimento cutâneo................................................................................................. 22 3 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ....................................................................... 25 3.1 Reagentes .................................................................................................................. 25 3.2 Aplicação da iontoforese in vitro ............................................................................. 25 3.3 Análise eletroquímica ............................................................................................... 27 3.3 Análise da liberação do ácido ascórbico através de uma membrana de acetato de celulose ............................................................................................................................ 28 3.4 Análise da permeação do ácido ascórbico através da biomembrana de pele de cobra .......................................................................................................................................... 29 3.5 Análise estatística ..................................................................................................... 30 3.6 Mensuração de pH .................................................................................................... 30 3.7 Descrição do procedimento ..................................................................................... 30 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 31 4.1 Discussão dos resultados obtidos .......................................................................... 31 4.1.1 Análise do ácido ascórbico ................................................................................... 31 4.1.2 Análise da voltametria cíclica do ácido ascórbico em meio gel com hidroxietilcelulose ........................................................................................................... 32 4.3 Análises espectrofotométricas ................................................................................ 37 4.3.1 Análise de liberação do ácido ascórbico ............................................................. 37 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 4.3.2 Análise da permeação do ácido ascórbico .......................................................... 41 4.3.3. Liberação passiva versus liberação sem a comunicação dos eletrodos na superfície da membrana de acetato de celulose .......................................................... 44 4.3.4. Considerações finais: degradação, fluxo, liberação versus permeação.......... 46 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 50 REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 52 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 10 INTRODUÇÃO A pele é uma barreira mecânica que serve como proteção ao organismo, evitando a perda de líquidos, a entrada de microorganismos e também a permeação de substâncias do exterior. A camada mais superficial da pele, a epiderme, é constituída de cinco camadas, das quais a que oferece maior resistência à permeação é a mais superficial delas, a camada córnea, também chamada estrato córneo (GUIRRO, 2002). Uma forma de incrementar a permeabilidade cutânea é a iontoforese. Este recurso terapêutico é utilizado há muito tempo, existem relatos da sua utilização desde o século XVIII. A iontoforese é um método de administração de substâncias pela pele com a utilização de corrente contínua. Esse método é também chamado de ionização, iontopenetração, dieletrólise e dieletroforese (BORGES, 2006). Há um interesse crescente na obtenção de um aumento de permeação de fármacos através da pele porque, dessa forma, os efeitos colaterais gerados pelas vias clássicas (endovenosa e oral) seriam diminuídos. Neste estudo, será abordado o princípio ativo ácido ascórbico, que possui efeitos fisiológicos na pele, como a sua atividade antioxidante, também é um importante cofator da produção de colágeno pelos fibroblastos e ainda atua como inibidor da melanogênese, proporcionando assim um clareamento de manchas (MAIA et al., 2001). A importância do ácido ascórbico na dermatologia e estética é justificada pela sua ação antioxidante, que atua de forma preventiva no envelhecimento cronológico cutâneo. Este causa modificação do material genético por meio de enzimas, alterações proteicas e decréscimo da proliferação celular. Consequentemente, o 11 tecido perde a elasticidade, a capacidade de regular as trocas aquosas e a replicação do tecido se torna menos eficiente. Oxidações químicas e enzimáticas BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) envolvendo a formação de radicais livres (RL) aceleram esse fenômeno de envelhecimento (HIRATA et al., 2004). O ácido ascórbico é um composto natural, encontrado em frutas cítricas e vegetais, que são amplamente pesquisados tanto farmacologicamente quanto para o desenvolvimento de novas drogas e produtos tópicos. Não somente os seus constituintes são usados diretamente como agentes terapêuticos, mas também como matéria-prima para a síntese ou modelos para compostos farmacologicamente ativos. Assim, as plantas medicinais, as preparações fitofarmacêuticas e os produtos naturais isolados, como a vitamina C, são pesquisados e utilizados em todo o mundo e, dessa forma, representam um mercado que movimenta bilhões de dólares, tanto em países industrializados quanto em desenvolvimento (LIMA et al., 2009). Pode-se enfatizar que a promoção de permeação de fármacos pela pele através da corrente contínua pode levar à maior eficácia da liberação de ativos; ao aumento do fluxo ou retenção do mesmo; ao aumento da liberação localizada, tópica ou dos tecidos alvo através da pele; ou ainda à combinação das hipóteses citadas. No entanto, essa liberação poderá promover efeitos tóxicos tanto intracelulares como extracelulares caso não haja utilização adequada da quantidade do composto associado, ou ainda devido à ocorrência de alteração da estrutura química do composto. O interesse pela temática da iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico surgiu da observação do crescimento da indústria cosmética e do apelo midiático que esta realiza prometendo imensas vantagens advindas da associação da iontoforese aos mais variados princípios ativos para aumentar sua eficácia e permeação. A partir dessa observação, houve questionamentos e inquietações pessoais a respeito do que realmente aconteceria na aplicação transdermal de fármacos e, mais especificamente, do ácido ascórbico e suas propriedades frente à aplicação de corrente contínua. Pode-se observar que é fundamental o conhecimento por parte dos profissionais que atuam mais especificamente na área da estética e dermatologia sobre as 12 questões que envolvem a análise das substâncias após serem expostas a um campo elétrico. Estas podem sofrer modificações na estrutura química de suas BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) moléculas, possibilitando que ofereçam potencial tóxico para a pele e o organismo em que são aplicadas. A maior indicação do uso do ácido ascórbico é para minimizar os sinais de envelhecimento cutâneo, que surgem a partir dos 30 anos de idade e lentamente vão progredindo sem que se perceba até que os sinais fiquem mais evidentes. Só no Brasil, o número de pessoas com 60 anos ou mais cresce em velocidade muito superior à de todas as demais faixas etárias. A população brasileira chegou, em 2008, a 186,6 milhões de habitantes, mas cresce em ritmo cada vez menor devido à queda das taxas de fecundidade (KEDE, 2009). A expectativa de vida média aumentou porque conseguiu-se diminuir algumas causas de morte, mas o processo molecular referente ao envelhecimento mantevese inalterado. Mesmo não sendo sinônimo de adoecer, envelhecer aumenta o peso de cuidados com a saúde (GUIRRO, 2002). Dessa forma, é importante a investigação do comportamento eletroquímico da vitamina C frente à iontoforese para que possa ser avaliada a real eficácia do seu emprego terapêutico. Este trabalho teve como objetivos: Avaliar a estabilidade do ácido ascórbico após a associação à corrente e avaliar e mensurar a liberação e permeação do ácido ascórbico associado à utilização da iontoforese. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 13 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Nesta etapa serão abordados os seguintes temas: o envelhecimento cutâneo e suas consequências na pele; o ácido ascórbico; a iontoforese; e a iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico e o papel exercido no envelhecimento cutâneo. 2.1 O envelhecimento cutâneo e suas consequências na pele O fenômeno biológico do envelhecimento representa a última das três fases do ciclo vital do organismo, sendo as duas primeiras, a infância e a maturidade. Envelhecer é um processo natural, porém a qualidade do envelhecimento está diretamente relacionada com a qualidade de vida à qual o organismo foi submetido (GUIRRO, 2002). O processo de envelhecer pode ser visível aos 30 anos e imperceptível aos 60, isso depende de uma série de causas endógenas e exógenas. As primeiras são decorrentes de um declínio programado nas funções e nas capacidades fisiológicas da pele (ESTEVE, 1994). O envelhecimento extrínseco é também denominado actinossenescência e relaciona-se com as alterações da superfície cutânea provocadas principalmente pelo fotoenvelhecimento, como as modificações do contorno e a elasticidade da 14 pele, que se manifestam por sulcos e rugas associados à flacidez. O envelhecimento intrínseco busca a compreensão da senescência através dos vários fatores causais BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) que atuarão tanto nos órgãos internos quanto na pele (KEDE, 2009). O envelhecimento cutâneo intrínseco, portanto, é o resultado da ação de vários fatores, tais como: fatores individuais (genéticos), hormonais, exposição solar crônica, tabagismo, alcoolismo, estresse emocional e repercussão de doenças cutâneas e sistêmicas. A pele utiliza naturalmente antioxidantes para proteger-se dos efeitos nocivos das radiações solares. Esta utiliza predominantemente o ácido ascórbico (vitamina C) para proteger o meio aquoso das membranas celulares e tocoferol (vitamina E) para proteger as estruturas lipídicas. Em muitos sistemas biológicos as vitaminas C e E trabalham de forma sinérgica, quando a vitamina E torna-se oxidada pelos radicais livres, ele é regenerado na membrana pela vitamina C. (LIN et al., 2003; KEDE, 2009). Clinicamente o envelhecimento intrínseco é atrófico e resulta na perda progressiva da elasticidade, na atrofia da pele e no aumento das linhas de expressão. Especificamente a camada córnea não sofre grandes alterações, mas afina-se com o achatamento da junção dermo-epidérmica, deixando a pele mais frágil. A maior alteração ocorre na derme, com diminuição da vascularização, diminuição da biossíntese dos fibroblastos e espessamento das fibras elásticas e consequente diminuição de sua função (ESTEVE, 1990). A diminuição da elasticidade do epitélio era associada à rigidez protéica da matriz extracelular, resultante da polimerização do colágeno com a elastina. Porém, estudo in vitro realizado com o uso de microscopia atômica-AFM (Atomic Force Microscopy) atribuiu à rigidez excessiva das células epiteliais ao aumento da densidade das fibras do citoesqueleto com o decorrer da idade (SCOTTI et al., 2007). O estudo das causas do envelhecimento é um campo no qual existem várias teorias. Uma das mais aceitas é a teoria justificada pela ação dos radicais livres. Vive-se em um ambiente rico em oxigênio, onde várias espécies de oxigênio reativo são regularmente geradas pela exposição à radiação ultravioleta, à poluição e à inflamação. O oxigênio reativo ameaça constantemente a integridade das estruturas 15 celulares e da matriz extracelular da pele e pode, por exemplo, contribuir para o aparecimento de mutações que resultam em câncer de pele (GUIRRO, 2002). BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) A desorganização do mecanismo de defesa antioxidante provoca doenças na pele, resultado das condições causadas por esse desequilíbrio e que são consequências de danos a estruturas nela presentes, como lipídios, proteínas e DNA. Estima-se que cerca de 80% dos sinais visíveis causados no envelhecimento são provocados pelos raios ultravioletas e pelos radicais livres formados devido à exposição a estes (SCOTTI et al., 2007). Os radicais livres são produzidos, normalmente, em quantidades reduzidas no decorrer da vida celular, sendo rapidamente eliminados a fim de não provocar danos celulares. Desse modo, as células são providas de sistemas enzimáticos e de moléculas de baixo peso molecular, ditas antioxidantes, tais como a vitamina C (MAIA et al., 2001). Oxidações químicas e enzimáticas envolvendo a formação de radicais livres aceleram o fenômeno do envelhecimento por causarem danos ao DNA e atuarem na desidrogenação, hidroxilação e glicação proteica. A última reação envolve a perda das funções biológicas de proteínas, como o colágeno e as proteoglicanas, que resultam em alterações da estrutura da membrana e aumento da flacidez da pele (HIRATA et al., 2004). Os radicais livres se propagam indefinidamente, alterando, em nível molecular, as estruturas das células. Esse ciclo contínuo de propagação e dano celular é interrompido quando dois radicais se encontram ou quando o antioxidante anula o radical (KEDE, 2009). Hirata et al. (2004) ainda afirma que, durante o estresse oxidativo, o ácido ascórbico é esgotado primeiro, seguido do ubiquinol 10, indicando que esses dois antioxidantes são muito sensíveis ao estresse oxidativo. O antioxidante lipossolúvel melhor conhecido, o α-tocoferol, permanece inalterado e, preferentemente, requer o ácido ascórbico e o ubiquinol-10 como coantioxidantes. 16 2.2 O ácido ascórbico O ácido ascórbico, ou vitamina C, é conhecido como promotor de numerosos BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) processos químicos, bioquímicos e fisiológicos, tanto em animais como em plantas. O homem, o macaco, a cobaia, alguns pássaros e alguns peixes, diferentemente da maioria dos animais, não sintetizam a vitamina C por não possuírem a enzima gulonolactona oxidase, envolvida na biossíntese do ácido L-ascórbico a partir de Dglicose, sendo a mesma obtida através da ingestão dos alimentos (LEHNINGER et al.,1993). A deficiência de ácido ascórbico em mulheres grávidas tem sido associada com pré-eclampsia, ruptura prematura de membranas, a degradação do colágeno do líquido amniótico e parto prematuro (OCHOA- BRUST et al., 2007) A vitamina C apresenta-se como cristais incolores ou em forma de pó branco, inodoro e de sabor amargo, sendo sua coloração alterada quando exposta à luz, ao ar ou à umidade. É solúvel em água ou em álcool e praticamente insolúvel em clorofórmio e em éter etílico (REYNOLDS, 1989). Na figura 1 tem-se a fórmula estrutural do ácido ascórbico. Figura 1- Estrutura química do ácido ascórbico (C6H8O6) Fonte: A autora. A importância do ácido ascórbico está na sua relação com várias funções no organismo relacionadas ao sistema imune, agindo como cofator enzimático na formação de colágeno, na absorção de ferro, na inibição da formação de 17 nitrosaminas e na atividade antioxidante. A vitamina C encontra-se na natureza sob forma reduzida ou oxidada (ácido deidroascórbico). Ambas são igualmente ativas, BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) porém a forma oxidada está muito menos difundida nas substâncias naturais (LIMA et al., 2009). A transformação do ácido ascórbico em ácido mono-deidroascórbico ocorre normalmente no interior do organismo e é reversível, permitindo que uma de suas substâncias possa sempre ser transformada na outra. Essa capacidade de transformação funciona como um sistema oxidorredutor capaz de transportar hidrogênio nos processos de respiração, no nível celular (AZULAY, 2003). É encontrado nas plantas em três formas: reduzido a ácido L-ascórbico, ácido mono-dehidroascórbico, que é um intermediário instável, e ácido L-deidroascórbico. Este pode ser perdido irreversivelmente para ácido 2,3 dicetogulônico, que não apresenta atividade vitamínica, como apresenta a Figura 2. Figura 2-Formas oxidadas do ácido ascórbico Fonte: A autora. Uma série de produtos naturais possui ácido ascórbico. Presente no leite e no fígado, ainda assim, as melhores fontes de vitamina C são frutas frescas (particularmente frutas cítricas, tomates e pimentão verde), batata (17 mg por 100 g) e verduras. Algumas frutas, como goiaba (300 mg por 100 g) e a groselha negra (200 mg por 100 g) também são ricas em vitamina C, mas contribuem pouco na dieta alimentar comum no ocidente (FIORUCCI et al., 2002). Em termos práticos, a aplicação tópica de ácido ascórbico mostrou elevar de modo significativo os níveis cutâneos desta substância em porcos e ratos, sendo que 18 a pele de porcos apresenta aspectos similares à da pele humana. O tratamento com ácido ascórbico tópico pode funcionar como fotoprotetor biológico de amplo BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) espectro, retardando de forma significativa os danos causados pela radiação ultravioleta (UVA). A radiação UVA atinge preferencialmente as camadas mais profundas da pele (quando comparada à ultravioleta B - UVB). Como a exposição à radiação UVA resulta em alterações no fotoenvelhecimento, tal proteção é altamente desejável (PINNEL et al., 2001; EBIHARA et al., 2003). A literatura sugere que existe uma ampla aplicação, na área da estética, de terapias que utilizam o ácido ascórbico como antioxidante. A teoria dos radicais livres explica o porquê de os antioxidantes serem considerados agentes para prevenção de rugas (BAUMANN, 2004). Dentre as terapias utilizadas pela estética como alternativa para prevenir o envelhecimento cutâneo, está a iontoforese associada à vitamina C. 2.3 A iontoforese A iontoforese é uma técnica não invasiva que usa potencial ou corrente elétrica para prover uma maneira controlada de aumentar a transferência transdermal de uma variedade de fármacos (OLIVEIRA et al. apud BARRY, 2001). No processo iontoforético, a corrente originária do aparelho é transferida do eletrodo para a pele por meio da solução contendo agentes ativos (BORGES, 2006). Esse processo é particularmente benéfico quando usado com drogas hidrofílicas e também aquelas que possuem alto peso molecular (SILVA et al., 2012). A possibilidade de se realizar iontoforese foi demonstrada ainda no começo do século XX, quando Le Duc efetuou um experimento que se tornou célebre por evidenciar a penetração de íons através da pele. Seu experimento fundamental constituiu na tentativa de aplicação iontoforética de estricnina, um poderoso estimulante do sistema nervoso central, em dois coelhos. Em um dos coelhos a droga foi contida no eletrodo negativo e, no outro, no eletrodo positivo de um sistema elétrico gerador de corrente contínua. Após certo tempo de aplicação, o coelho cuja solução de estricnina estava contida no eletrodo positivo sofreu espasmos convulsionantes que o levaram à morte, enquanto que o outro coelho 19 nada sofreu. As alterações ocorridas em apenas um dos coelhos demonstraram que a droga é transportada através dos tecidos de acordo com suas características de BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) polaridade, responsáveis pela determinação do sentido do fluxo iônico ativado pela corrente contínua. Assim sendo, os íons positivos são introduzidos através do ânodo e os negativos através do cátodo (LEDUC, 1988; OLIVEIRA et al., 2001; GUIRRO, 2002; FIALHO; CUNHA, 2004). Harris (1967) descreveu as primeiras aplicações da iontoforese na medicina, utilizando a técnica para o transporte das seguintes substâncias: sulfato de cobre para o tratamento de tinea pedis (pé de atleta) e cervicite crônica, sulfato de zinco para o tratamento de otite crônica e rinite vasomotora, nitrato de prata para o tratamento de osteoartrite e artrite reumatóide (FIALHO; CUNHA, 2004). Na iontoforese, o sentido de deslocamento dos elétrons é do polo positivo para o polo negativo. Esse sentido é definido pela corrente gerada no equipamento. Para que a corrente elétrica possa promover o fluxo iônico da solução eletrolítica, devem ocorrer transformações químicas. No eletrodo negativo, deve ocorrer um processo de redução no qual algum íon ou molécula aceita elétrons, sendo, portanto, reduzido. Já no eletrodo positivo, os elétrons devem ser liberados para o eletrodo, ocorrendo assim um processo de oxidação. O eletrodo no qual ocorre a redução é chamado de cátodo, e o eletrodo em que ocorre a oxidação é chamado de ânodo. Para que o processo de redução possa continuar acontecendo no cátodo, os íons devem permanecer em movimento na direção dele. Esses íons negativos se deslocam para o ânodo e são chamados de ânions (GUIRRO, 2002). Na figura 3 temos a ilustração do deslocamento da corrente elétrica através da aplicação de potencial elétrico. Figura 3 - Aplicação de potencial elétrico e deslocamento da corrente elétrica na presença de eletrodos reversíveis de Ag e AgCl BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 20 Fonte: Gratieri et al., 2008 A introdução de drogas através da pele em direção ao tecido subcutâneo possui três rotas potenciais: (1) o folículo piloso e suas glândulas sebáceas associadas; (2) os ductos sudoríparos; e (3) através do próprio estrato córneo, entre seus apêndices e falhas (rota intercelular). No entanto, em decorrência das características hidrofóbicas e negativas do estrato córneo e de sua matriz lipoproteica, drogas ionizadas dificilmente penetram através da pele por difusão passiva em quantidades suficientes para atingir níveis terapêuticos (BARRY, 2002; CURDY et al., 2001). A pele constitui uma barreira física que protege o corpo da perda de líquidos, impede a invasão de microrganismos e a entrada de substâncias do meio exterior, incluindo a água. O estrato córneo, correspondente a 10-20 µm (micrômetros) da epiderme, é reconhecido como a principal barreira à transferência transdermal de drogas. Assim, diferentes técnicas para aumento da penetração de várias substâncias através do estrato córneo têm sido testadas (BARRY, 2002). De acordo com Low e Reed (2001), a transferência de íons irá acontecer principalmente nos dutos das glândulas sudoríparas e, em menor extensão, nos folículos pilosos e glândulas sebáceas. Os mecanismos envolvidos na transferência transdermal por iontoforese são: (1) a eletrorrepulsão, criada pela interação droga–campo elétrico, que provê força 21 adicional para direcionar íons de polaridade semelhante à do eletrodo sob o qual são colocados; (2) a eletroosmose, que é o movimento transdermal de parte do solvente BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) juntamente com os componentes neutros e iônicos nele diluídos; e (3) o aumento da permeabilidade intrínseca da pele pela aplicação do fluxo elétrico. Pelo mecanismo da eletrorrepulsão, tanto os fármacos de carga positiva quanto os de carga negativa serão liberados, desde que sejam colocados sob o eletrodo que apresente a mesma carga elétrica (OLIVEIRA et. al., 2005). Kalia et al. (2004) observaram que ocorre uma desorganização do estrato córneo, assim, há uma queda na resistência da pele, seguida de um aumento da hidratação durante a iontoforese. A elevação dos níveis de íons e água poderia facilitar o transporte da corrente através do estrato córneo e promover as mudanças estruturais do mesmo. Então, a fim de que ocorra a transmissão de íons para a membrana, deve-se colocar o fármaco de mesma polaridade sob o eletrodo (BORGES, 2006). Os principais benefícios da iontoforese são: a redução dos riscos e inconvenientes da infusão intravenosa contínua; a prevenção de alterações inter e intrapaciente na absorção e no metabolismo, muitas vezes observadas após administração oral do medicamento; o aumento da eficácia terapêutica pela eliminação do metabolismo de primeira passagem pelo fígado; a redução da possibilidade de superdosagem ou subdosagem, pelo transporte contínuo da droga, programando dentro da faixa terapêutica desejada; o fornecimento de um regime terapêutico simplificado, levando à melhor aceitação do paciente ao tratamento (FIALHO; CUNHA, 2004). É importante ressaltar que o tamanho do eletrodo é calculado de acordo com a área de tecidos excitáveis que se quer atingir. Chama-se de densidade de corrente a quantidade de corrente por unidade de área de condução. Esta é inversamente proporcional à área do eletrodo. À medida que a área do eletrodo diminui, a densidade da corrente aumenta (ROBINSON, 2001). Com relação à intensidade segura, para minimizar a irritação da pele e as queimaduras, esta limita-se a 0,1 mA/cm² da superfície do eletrodo ativo. Outra variável importante refere-se ao tempo de aplicação, sobre o qual foi demonstrado 22 por Low e Reed (2001) que a penetração é maior nos primeiros seis minutos. Segundo esses mesmos autores, a duplicação do tempo de tratamento, ou seja, 12 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) minutos, aumenta em 25% o índice de penetração. Guirro (2002) relata que o emprego da iontoforese na clínica estética apresenta-se atualmente bastante limitado. Isso ocorre talvez devido à escassez de experimentos que fundamentem cientificamente as dosagens ótimas de substâncias específicas, relacionando-as ao tempo de aplicação e intensidade da corrente. As maiores desvantagens do transporte de drogas por iontoforese são os riscos de queimaduras e choques resultantes da utilização de correntes elétricas elevadas e por longos períodos (FIALHO; CUNHA, 2004). Em relação ao ácido ascórbico, especificamente, este, quando no estado sólido, é bastante estável, porém, quando em solução, é facilmente oxidado em reação de equilíbrio ao ácido L- deidroascórbico. Esta oxidação ocorre rapidamente em solução aquosa por processos enzimáticos e não enzimáticos, especialmente quando exposta ao ar, ao calor e à luz (RUMSEY; LEVINE, 1998). 2.4 A iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico e seu papel no envelhecimento cutâneo O ácido L-ascórbico é conhecido como promotor de numerosos processos químicos, bioquímicos e fisiológicos, tanto em animais como em plantas. Desempenha várias funções no organismo relacionadas ao sistema imune, à formação de colágeno, à absorção de ferro, à inibição da formação de nitrosaminas e à atividade antioxidante. O seu conteúdo pode ser influenciado pelo tipo de solo, forma de cultivo, condições climáticas, procedimentos agrícolas para a colheita e armazenamento (O’KEFEE, 2001; SILVA et al., 2004). Com relação ao envelhecimento cutâneo, a importância do ácido L-ascórbico é evidenciada na formação do tecido conjuntivo durante a formação do colágeno. Na pele, colágenos tipos I e III contribuem com 85 a 90% e 8 a 11% do colágeno total sintetizado, respectivamente (AZULAY et al., 2003). 23 A eficiência do sistema de proteção natural do organismo tende a decrescer com a idade, indicando que a geração de radicais livres e o declínio das defesas BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) antioxidantes deve ser considerada contribuidora potencial importante para o processo de envelhecimento. Para reforçar a proteção natural, faz-se uso de compostos exógenos como enzimas, antioxidantes (incluindo vitamina C) e compostos fenólicos, reduzindo assim as reações oxidativas. Dessa forma, pode-se considerar que o uso de sistemas antioxidantes como o ácido ascórbico pode ser favorável à prevenção de envelhecimento cutâneo prematuro. O ácido pode ser fornecido à pele via dietas ricas em frutas e vegetais ou por meio de administração tópica ou oral dos antioxidantes. O ácido ascórbico é cofator para duas enzimas essenciais na biossíntese do colágeno. A lisil e a prolil hidroxilases catalisam a hidroxilação dos resíduos prolil e lisil nos polipeptídeos colágenos, e essas modificações pós-tran slacionais permitem a formação e estabilização do colágeno de tripla hélice e sua subsequente secreção no espaço extracelular como procolágeno. Este é então transformado em tropocolágeno, e, finalmente, fibras colágenas são formadas por um rearranjo espacial espontâneo das moléculas tropocolágenas. Consequentemente, a hidroxilação é uma fase crítica na biossíntese de colágeno, uma vez que regula a formação da tripla hélice, da excreção do procolágeno e do cross-linking do tropocolágeno. A lisil e a prolil hidroxilase são enzimas férricas (AZULAY et al., 2003; DALCIN, 2003; MAIA et al., 2001). A vitamina C, como cofator, previne a oxidação do ferro e, portanto, protege as enzimas contra a autoinativação. Dessa forma, promove a síntese de uma trama colágena madura e normal por meio da perfeita manutenção da atividade das enzimas lisil e prolil hidroxilases (DALCIN et al., 2003). O ácido ascórbico é solúvel em água, porém é rapidamente oxidado quando exposto ao ar e não é suficientemente estável para ser aplicado de forma tópica. Por outro lado, sua utilização tópica deve contemplar sua atuação no tecido conjuntivo, devendo, para tanto, penetrar através do estrato córneo e estar disponível para os fibroblastos dérmicos, daí a importância do incremento de permeação através da iontoforese. 24 Com relação à concentração de produtos de aplicação tópica contendo vitamina C, Pinnel et al. (2001) citam que percentagens de 5 a 30% foram testadas, BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) e os níveis teciduais aumentaram proporcionalmente à concentração da vitamina. A concentração de 20% foi a responsável pelo nível máximo de vitamina no tecido. Por razões desconhecidas, concentrações acima desse valor resultaram em diminuição dos níveis teciduais do ácido ascórbico. Já para Del Rio- Sancho et al. (2012), reportam que a permeação é dependente, ou seja ela tem um aumento de permeação até 5% de concentração e após atinge um platô e não aumenta mais. Os mesmos autores referem que em alguns fármacos, como a memantina, há uma diminuição de permeação em altas concentrações do fármaco, além desta alta concentração em estudos in vivo causar irritação cutânea e toxicidade. Os estudos de Nusgens et al. (2001) e Humbert (2003) foram realizados na pele de voluntários, com vitamina C a 5% comparada com placebo, usada por 6 meses. Demonstraram melhora clínica, histológica e ultraestrutural significativas e, na derme humana, o aumento da expressão do ácido ribonucleico mensageiro (RNAm) para colágenos I e III, das enzimas relacionadas à síntese de colágeno e dos inibidores teciduais da metaloproteinase. O estudo de Fitzpatrick e Rostan (2002) avaliou o efeito da vitamina C a 10% comparada com o veículo na metade da face de 10 voluntários, durante 12 semanas, demonstrando melhora clínica e formação de colágeno no exame histopatológico, estatisticamente significativos. Na pele humana, estão presentes muitos antioxidantes – tocoferol, ubiquinona, glutationa, ascorbato e urato –, e alguns desses são detectáveis em concentrações relevantes mesmo no estrato córneo. Apesar de estarem em altas concentrações, especialmente na epiderme, se o estresse oxidativo perdurar por longos períodos na pele, a concentração pode decair juntamente com um aumento na formação de componentes celulares oxidados. Um tratamento tópico prolongado com ácido ascórbico pode resultar na ativação da síntese de fibroblastos e diminuir as cicatrizes causadas pela idade, principalmente na região periorbital (LUPO, 2001). Como a pele é uma barreira natural à permeação de fármacos, sugere-se intensificar esta permeação através da iontoforese associada ao ácido ascórbico. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 25 3 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS O presente trabalho tem caráter quantitativo experimental e será dividido em duas partes: avaliação eletroquímica a partir de experimentos in vitro, nos quais analisaram-se os parâmetros da voltametria cíclica e avaliação de permeação e liberação in vitro de ácido ascórbico em sistema de difusão vertical. 3.1 Reagentes Nos ensaios de aplicação da corrente elétrica, utilizou-se gel com hidroxietilcelulose manipulado, com composição: Solução conservante de Nipagin® e Nipazol®, propilenoglicol, EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) dissodico, Natrozol, silicone volátil DC 245(ciclometicone volátil) e Germal (Imidazolidinil uréia), associado ao princípio ativo ácido ascórbico a 5%. 3.2 Aplicação da iontoforese in vitro O equipamento de ionização (Figura 3) foi fornecido pelo laboratório do curso de Estética e Cosmética da Univates, e as características técnicas informadas pelo manual do aparelho são as seguintes: - Modelo AF5 da empresa Tone Derm; -Utilização de cabo de alimentação (com 2 pinos) para conexão em rede 26 elétrica com tensão alternada; BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) - Seleção automática de tensão: 127 V/ 220 V ~ 60 Hertz; - Frequência de alimentação: 60 Hz; - Potência de entrada: 23 Volts; - Fusíveis: 200 mA FST; - Modo de operação: contínuo; - Classificação: classe I - tipo BF; - Temporizador: de 01 a 59 minutos; Ionizador: - Tipo de corrente galvânica pulsada; - Forma de onda retangular; - Frequência fixa em 600Hz; - Intensidade da corrente ajustável de 100 a 5000 µA; - Tensão de saída 22 V; - Polaridade selecionável em positiva e negativa; Na figura 4 tem –se a imagem do aparelho utilizado na pesquisa. 27 Figura 4- Aparelho utilizado para a aplicação de iontoforese, modelo AF5 da BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) empresa Tone Derm Fonte: a autora. Foram utilizados os seguintes parâmetros: - Intensidade de 200 µA (calculada pela área do eletrodo que é de 0,4 cm²) e frequência de 600 Hz; - Eletrodos de carbono; - Tempo de 0, 2, 5 e 10 minutos de aplicação. 3.3 Análise eletroquímica A técnica de voltametria cíclica realizou-se com o auxílio de um potenciostato modelo PGSTAT128N, da marca AUTOLAB/Ecochemie®, com velocidade de varredura de 10 mV.s-1. A célula eletroquímica conteve um eletrodo de trabalho de prata com área de 0,385 cm2, assim como um contra eletrodo de platina e um eletrodo de referência, que será um fio de prata revestido com cloreto de prata (Ag/AgCl) e denominado eletrodo de quase-referência (RICHTER, 2003). As amostras analisadas constituíram-se de gel hidroxietilcelulose/ácido ascórbico 5% com e sem aplicação de iontoforese. Para quantificar a quantidade de ácido ascórbico presente, inicialmente construiu-se a curva de calibração, por meio da realização de ensaios de caracterização eletroquímica, com a utilização da técnica de voltametria cíclica, em solução tampão (pH 6,7) de ácido cítrico 0,1M e Na2HPO4 0,1M. Foram preparadas as soluções de ácido ascórbico a partir da solução tampão 28 e de ácido ascórbico SIGMA-ALDRICH em diferentes concentrações. Realizaram- se essas análises igualmente em um potenciostato Autolab/PGSTAT 128N da BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) Autolab/Eco Chemie. A velocidade de varredura utilizada nos experimentos de voltametria cíclica foi de 10mV.s-1 e a janela eletroquímica foi de – 500 mV a + 1600 mV. 3.3 Análise da liberação do ácido ascórbico através de uma membrana de acetato de celulose Para tal, usou-se de membrana de acetato de celulose (0,45 µm de porosidade) da marca Sartorius Biolab Products®, com a finalidade de separar o compartimento doador do receptor, ou seja, formar uma barreira não interferente a um fluido denominado receptor (MOTA et al., 2008). Preparou-se um sistema contendo uma célula de difusão vertical na água aquecida a 37ºC por um banho termostatizado MA-184 MARCONI, simulando a temperatura corporal. Dentro deste, inseriu-se uma célula (150 mL) do tipo Franz com solução receptora de água e álcool etílico 99,5% (Nuclear®) com proporção de 1:1(FDA, 1997). Em contato com esta área da membrana, adicionou-se o agente acoplador, gel com hidroxietilcelulose + ácido ascórbico 5% (pH 3,2), sobre o qual aplicou-se a iontoforese com eletrodos de carbono de área de 0,4 cm². Também foram realizadas triplicatas da aplicação de iontoforese em membrana de acetato de celulose, nos mesmos moldes e parâmetros utilizados anteriormente, porém, separou-se a área da membrana com uma placa de vidro e a solução receptora foi solução tampão de PBS (pH 6,6). Após, realizou-se análises de varreduras espectrofotométricas (190 nm a 990 nm) de alíquotas retiradas da célula de difusão para a verificação da presença do substrato na solução receptora. Os ensaios foram através de um Espectrofotômetro Cary 100 Bio UV/Vis no comprimento de onda de 259 nm. A figura 5 ilustra a aplicação de iontoforese in vitro realizada na pesquisa. 29 Figura 5- Aplicação da iontoforese in vitro. Na figura, 1- Aplicação da iontoforese, eletrodos de carbono sobre o gel com hidroxietilcelulose e ácido BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) ascórbico a 5%- No zoom, detalhe do posicionamento dos eletrodos. 2- banho termostatizado a 37 ͦ C. 3-célula de difusão do tipo Franz. 4- chapa agitadora Fonte: a autora 3.4 Análise da permeação do ácido ascórbico através da biomembrana de pele de cobra Para detectar a permeação in vitro do ácido ascórbico utilizou-se os mesmos parâmetros da espectrofotometria supracitados e o mesmo sistema de difusão vertical, porém substituiu-se o acetato de celulose por muda de pele de cobra Boa constrictor, cedida pelo Museu de Ciências Naturais do Centro Universitário UNIVATES, uma vez que a utilização de tecido humano para pesquisa é dificultada pelas questões éticas envolvidas, formas de armazenagem e obtenção adequadas. Utilizou-se a referida membrana, pois esta vem sendo sugerida como opção na avaliação da permeação in vitro devido à facilidade de obtenção e similaridade com o estrato córneo da pele humana (BARRY et al. 1995; DUTRA et al., 2013). É importante mencionar que se hidratou a pele de cobra por três dias em solução aquosa de azida sódica 0,0002% (NUNES et al., 2005). Todos os experimentos foram repetidos nove vezes (réplicas). 30 3.5 Análise estatística Para comparação das médias das nove replicações com e sem a aplicação de BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) iontoforese, para cada um dos três períodos de tempo testados (2 min, 5 min e 10 min) e para difusão na membrana de acetato de celulose e na biomembrana de pele de cobra foi utilizado o teste t para amostras independentes. Foi considerado significativo p < 0,05. 3.6 Mensuração de pH No acompanhamento deste experimento in vitro foi analisado o pH mensurado a partir de um pHmetro do modelo 827 pH lab, da Metrohm® 3.7 Descrição do procedimento - Preparo das amostras: Preparou-se as amostras de ácido ascórbico a partir de gel com hidroxietilcelulose condutor manipulado com pH 5,5 e ácido ascórbico SIGMA-ALDRICH na concentração de 5%. O pH do gel com hidroxietilcelulose adicionado de ácido ascórbico é 3,2. - Análise instrumental antes da aplicação da iontoforese: Avaliou-se cada uma das amostras de aplicação da iontoforese in vitro através de voltametria cíclica, sendo que as avaliações de liberação e permeação de ácido ascórbico obtiveram-se através de espectrofotometria UV/Vis. - Terapia por iontoforese: Aplicou-se a técnica de iontoforese em cada uma das amostras, na seguinte modulação: frequência de 600 Hz, intensidade 200 µA (calculada pela área do eletrodo de 0,4 cm²) e tempos de 0, 2, 5 e 10 min de aplicação. - Resultados: Analisou-se comparativamente os resultados a partir das análises instrumentais. É importante referir que todas as análises foram realizadas nove vezes (réplicas). BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 31 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Discussão dos resultados obtidos 4.1.1 Análise do ácido ascórbico Inicialmente, foram realizados ensaios de voltametria cíclica das soluções de ácido ascórbico/tampão ácido cítrico-Na2HPO4 em diferentes concentrações, sendo os potenciais analisados em relação ao eletrodo de prata/cloreto de prata, para posterior construção de curva de calibração e determinação das concentrações de ácido ascórbico envolvidas nos sistemas estudados. Na Figura 6 tem-se a curva de calibração do ácido ascórbico em diferentes concentrações y= a + bx, onde a= 9E-5 e b= 0,005, R= 0,9730. Figura 6- Curva de calibração do ácido ascórbico para potenciais de 0,45 V por voltametria cíclica. Fonte: a autora. 32 4.1.2 Análise da voltametria cíclica do ácido ascórbico em meio gel com BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) hidroxietilcelulose Após a construção da curva de calibração, realizou-se ensaios de voltametria cíclica, do sistema gel hidroxietilcelulose/ácido ascórbico 5%, com e sem aplicação da iontoforese. Nas Figuras 7 e 8, tem-se o voltamograma cíclico característico do gel de hidroxietilceluose e deste após adição de ácido ascórbico 5%. Figura 7- Voltametria cíclica de prata em sistema contendo gel com hidroxietilcelulose v= 10mV.s-1 Fonte: a autora. O gel de hidroxietilcelulose é um polímero solúvel não iônico derivado da celulose. Este pode ser usado em muitas aplicações biotecnológicas, biofísicas e industriais devido à sua biocompatibilidade e baixa toxicidade (LIU, 2006). Na Figura 7, pode-se perceber que o gel com hidroxietilcelulose possui um comportamento eletroquímico ativo apresentando pico característico na região de 0,15 V, este comportamento eletroquímico é explicado devido à presença do 33 principal composto do gel de hidroetilcelulose utilizado, o germal (Imidazolidinil uréia), que é um antifúngico (UPADHYAY; YEGNARAMAN, 2000). Quando a este BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) sistema é adicionado ácido ascórbico, este pico não é mais observado, e o comportamento eletroquímico do ácido ascórbico passa a ser observado (Figura 8), com picos de redução em regiões de 0,10 V (SHAKKTHIVEL; CHEN, 2007). Portanto, o gel com hidroxietilcelulose mantém a sua conformação proporcionando um meio que pode beneficiar a transferência de elétrons do ácido ascórbico sem interferir no seu comportamento eletroquímico, não comprometendo a sua análise pela voltametria. Figura 8- Voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose com ácido ascórbico 5%. v= 10mV.s-1 Fonte: a autora Na Figura 9 é apresentada a sobreposição dos voltamogramas da prata nos sistema gel hidroxietilcelulose sem a aplicação de iontoforese e com a aplicação de iontoforese nos tempos 0, 2, 5 e 10 minutos. Figura 9- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose sem a aplicação de iontoforese (linha) e após a aplicação de iontoforese por 2 (linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada +pontilhada), v= 10mV.s-1 BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 34 Fonte: a autora Avaliando a Figura 8, verifica-se que em diferentes tempos de aplicação de iontoforese, o pico característico do gel de hidroxietilcelulose permanece presente, com pequenos deslocamentos no potencial de pico, podendo indicar processos adsortivos no sistema estudado. Na Figura 10 é apresentada a sobreposição dos voltamogramas da prata nos sistema gel hidroxietilcelulose associado ao ácido ascórbico sem a aplicação de iontoforese e com a aplicação de iontoforese nos tempos 0, 2, 5 e 10 minutos. Figura 10- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose com ácido ascórbico 5% (linha contínua) após a aplicação de iontoforese por 2 ( linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada e pontilhada). No detalhe os picos característicos encontrados na pesquisa, v= 10mV.s-1 35 2 min. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 5 min. controle 10 min. Fonte: a autora Observando se os voltamogramas da Figura 10 verifica-se que nos tempos 2 e 5 minutos há o pico de redução em 0,10 V (SHAKKTTHIVEL, 2007) indicando a presença do ativo ácido ascórbico, sendo este dependente das condições experimentais, verifica-se que o ácido ascórbico oxida parcialmente, envolvendo uma etapa de somente um elétron, sendo possível desta forma sua redução, e retorno à molécula de ácido ascórbico (KAMYABI; SHAFIEE, 2012). Já no tempo de 10 minutos de aplicação da iontoforese os picos característicos não são mais observados, demonstrando que o ativo ácido ascórbico não pôde ser detectado através da avaliação eletroquímica, estando provavelmente oxidado na forma de ácido deidroascórbico. Ao observar os voltamogramas pode-se perceber também um aumento de corrente nas regiões de potencial mais alto (acima de 0,3V). Estes picos são observados quando há presença de espécies orgânicas, como o ácido ascórbico (MALPASS; MONTEO, 2008). Este aumento de intensidade de corrente pode ser associado à reação de evolução de oxigênio, e este incremento aparece nos voltamogramas ao aplicar a iontoforese por 2 e 5 minutos, já no tempo de 10 minutos este fenômeno não é mais observado, indicando a degradação do ácido ascórbico. A degradação do ativo provavelmente está relacionada às características físicas da corrente contínua utilizada na técnica de permeação transdérmica. Segundo Borges (2006), a corrente contínua caracteriza-se por um fluxo 36 unidirecional e ininterrupto de partículas carregadas. Esse tráfego da corrente elétrica através de íons contidos nos líquidos produz calor por efeito Joule. Sua BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) intensidade tem relação direta com a resistência específica do meio utilizado. Jadoul et al. (1999) corroboram essa ideia afirmando que o efeito Joule ocorre inicialmente no estrato córneo. O aumento de temperatura que ocorre neste local durante a iontoforese pode de ser estimado. Segundo Prausnitz (1996), uma corrente de baixa voltagem (1 V) por 1 minuto através da pele pode gerar um aumento de temperatura de 0,14º C. É importante ressaltar que esses modelos citados converteram em calor a energia dissipada e podem superestimar o calor obtido através da iontoforese. Os mesmos autores ainda afirmam que o calor gerado pela iontoforese é mínimo. O calor gerado pela iontoforese contribui para a desorganização do estrato córneo, proporcionando um aumento de permeabilidade do mesmo. Guirro (2002) afirma que, em todas as aplicações de correntes polarizadas, produz-se uma vasodilatação sob os eletrodos, a qual é acompanhada pelo aumento da temperatura. Todas as reações químicas liberam energia e aumentam a temperatura local. Na vizinhança de ambos os eletrodos, produz-se uma vasodilatação ativa, sendo mais pronunciada no polo negativo. Esta hiperemia galvânica é um efeito vasomotor que não se restringe somente à pele, mas penetra nos estratos abaixo dela (subcutâneo, fáscia e músculos superficiais). Melhorando a irrigação sanguínea, observa-se uma elevação de temperatura de 2 a 3ºC (GUIRRO, 2002). A citação acima corrobora a temperatura mensurada durante os ensaios de aplicação de iontoforese, sendo que a média de aumento de temperatura foi de 2ºC. Outra explicação para a degradação do ativo pela iontoforese é a eletrólise. Segundo Borges (2006), quando a corrente contínua é aplicada sobre a superfície corporal, íons positivos (cátions) e íons negativos (ânions) que estão dissolvidos nos fluidos corporais são movimentados, de acordo com sua polaridade, em direção à região subcutânea, próxima à colocação dos eletrodos na superfície da pele. Isso é chamado de dissociação eletrolítica ou eletrólise. Os ânions seguem em direção ao polo positivo (ânodo) e os cátions em direção ao polo negativo (cátodo). Esse movimento é chamado eletroforese e é o princípio da iontoforese. Robinson (2001) afirma que, após a concentração de íons, ocorrerá reação química específica sob cada eletrodo em meio aquoso, com formação de ácidos no 37 ânodo (liberação de oxigênio) e bases no cátodo (liberação de hidrogênio). Outro aspecto a ser considerado é que a diminuição de concentração de BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) ácido ascórbico pode também ser justificada pela difusão do mesmo através da membrana de acetato de celulose, já que os experimentos foram realizados sobre a célula de difusão e posteriormente coletou-se o gel para a análise eletroquímica. 4.3 Análises espectrofotométricas 4.3.1 Análise de liberação do ácido ascórbico Primeiramente foram construídas curvas de calibração para posterior aplicação da iontoforese. As curvas de calibração foram construídas no intervalo de concentração de 7,812 x 10-6 a 1,25 x 10-4%. Através da equação da reta gerada no gráfico de absorbância, y= -0,00174 + 1447,09603x R= 0,9983 pode-se calcular a concentração obtida de ácido ascórbico liberada para o meio. Figura 11- Curva de calibração para a concentração de ácido ascórbico. Fonte: a autora Pode-se observar na Figura 11 que a absorbância aumenta à medida que aumenta a concentração do ativo ácido ascórbico. 38 Os gráficos foram obtidos a partir da análise da absorbância das diferentes amostras de gel com hidroxietilcelulose e gel com hidroxietilcelulose associado ao BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) ácido ascórbico 5%, com e sem a aplicação da iontoforese em diferentes tempos, sendo estes 2, 5 e 10 minutos. Nos ensaios de liberação com membrana de acetato de celulose, através de varredura na faixa espectral (190-900 nm) foram considerados os valores próximos a 250 nm como a região de absorbância máxima, conforme se pode ver nas Figuras 12 e 13. Figura 12- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de acetato de celulose, sem a aplicação de iontoforese in vitro Fonte: a autora. Figura 13- Liberação do ácido ascórbico nos tempos de 0, 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese in vitro. Fonte: a autora Através da curva de fluxo de liberação do ácido ascórbico em função do tempo na membrana de acetato de celulose (Figura 12), obteve-se a equação da reta y= a + bx, onde, a= 0,22449, b= 13,70422, R= 0,9615. 39 Na Figura 14 são apresentados os valores de absorbância da aplicação de iontoforese in vitro nos tempos 2, 5 e 10 minutos. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) Figura 14- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de acetato de celulose, com aplicação de iontoforese in vitro Fonte: a autora. Figura 15- Liberação do ácido ascórbico em membrana de acetato de celulose com a aplicação de iontoforese in vitro Fonte: a autora Através da curva de concentração de ácido ascórbico através da membrana de acetato de celulose com a aplicação de iontoforese (Figura 15), obteve-se a equação da reta y = a + bx, onde a= 0,25561, b= 16,20613; R= 0,9434 40 Considerando a difusão na membrana de acetato de celulose, para o tempo de 2 minutos, não foi encontrada diferença significativa entre a utilização e não BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) utilização de iontoforese (t = 0,7388, p = 0,4788). Para o tempo de 5 minutos e 10 minutos, as médias de liberação com aplicação de iontoforese foram significativamente superiores que sem utilização de iontoforese (t = -2,5544, p = 0,0267) e (t = -2,7816, p = 0,0155), respectivamente. Ebihara et al. (2003) analisaram a permeação do ácido ascórbico em ratos, porém sua análise de presença de ácido ascórbico foi realizada por carbono 14, verificando a meia-vida do ácido ascórbico após a aplicação da iontoforese. O resultado obtido pelos autores foi de um incremento significativo da presença de ácido ascórbico na circulação sanguínea e diminuição do mesmo na derme. Na tabela 1, são apresentados os valores de ácido ascórbico liberado nos tempos 2, 5 e 10 minutos in vitro em termos de concentração. Tabela 1- Concentração do ácido ascórbico liberado membrana de acetato de celulose in vitro Tempo (minutos) 2 Concentração sem a aplicação 5 10 7,51 13,14 33,14 10,98 13,90 39,54 -5 de iontoforese (10 %) Concentração com a aplicação -5 de iontoforese (10 %) Fonte: a autora Comparando-se os valores obtidos no tempo de 2 minutos, a liberação foi 46,20 % maior quando da aplicação de iontoforese. Já no tempo de 5 minutos foi 5,78 % maior e no tempo de 10 minutos foi 19,31 % maior em termos de liberação do ativo. Um estudo realizado por Tomoda et al. (2011) afirma que a utilização combinada de fármaco cumarina 6 em forma de nanopartículas e iontoforese pode oferecer muitos benefícios, já que houve um aumento significativo de permeação quando comparado à difusão passiva. A vitamina C, é uma substância hidrossolúvel. Alguns autores concordam que 41 drogas hidrofílicas permeiam mais em regiões hidrofílicas, que contém poros pequenos, favorecendo as substâncias com massa molecular menos que 300 g/mol, BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) como é o caso do ácido ascórbico (massa molecular 176 g/mol). Na presença de baixas correntes são criadas novas vias de permeação, e as moléculas da substância percorrem um novo caminho, com poros maiores (MANABE et al., 2000; FIALHO; CUNHA, 2004; ROZMAN et al., 2009). 4.3.2 Análise da permeação do ácido ascórbico Nas Figuras 16, 17, 18 e 19 tem se a permeação do ácido ascórbico sobre biomembrana de pele de cobra sem e com aplicação de iontoforese in vitro. Na avaliação destes ensaios foram considerados somente duplicata de resultados, em função da variabilidade da biomembrana e pelo fato de estar no limite de quantificação da técnica de detecção utilizada. Figura 16- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de permeação do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de pele de cobra, sem a aplicação de iontoforese in vitro Fonte: a autora Figura 17- Permeação do ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra sem a aplicação de iontoforese in vitro BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 42 Fonte: a autora Através da curva de concentração da quantidade permeada através da biomembrana de pele de cobra, obteve se a equação da reta y= a + bx onde, a= 005779 e b= 1,46718 , R= 0,9836. Figura 18- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre membrana de pele de cobra, com aplicação de iontoforese in vitro Fonte: a autora Figura 19- Permeação de ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra com a aplicação de iontoforese in vitro BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 43 Fonte: a autora Através da curva de fluxo da permeação do ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra, com a aplicação de iontoforese em função do tempo obteve se a equação da reta y= a + bx, onde a= 0,0997 e b= 2,27368 e R= 0,9349. Na tabela 2 são apresentados os valores obtidos em termos de concentração de ácido ascórbico permeado na biomembrana de pele de cobra in vitro nos tempos 2, 5 e 10 minutos. Tabela 2- Concentração do ácido ascórbico permeado membrana de pele de cobra Tempo (minutos) 2 Concentração sem a aplicação 5 10 8,87 23,75 33,94 24,40 33,55 43,85 -6 de iontoforese (10 %) Concentração com a aplicação -6 de iontoforese (10 %) Comparando-se os valores obtidos no tempo de 2 minutos, a liberação foi 175,08 % maior quando da aplicação de iontoforese. Já no tempo de 5 minutos foi 41,26% maior e no tempo de 10 minutos foi 29,19 % maior em termos de liberação do ativo. Del Rio-Sancho et al. (2012) avaliaram o fluxo transdérmico do cloridrato de memantina, bem como sua permeação através de membrana de orelha de suíno, utilizando a célula de difusão vertical de Franz, e afirmam que a quantidade de fármaco retida aumenta logaritmicamente à medida que aumenta o fluxo transdérmico da substância. A importância desse achado é justificada, pois o efeito 44 reservatório poderia levar a uma acumulação do fármaco no estrato córneo quando aplicado topicamente sem a presença da iontoforese. No caso do ácido ascórbico, a BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) aplicação e permanência tópica do ativo é desejado, uma vez que este possui ação clareadora de manchas, atuando na melanina presente na epiderme cutânea. Pinnel et al. (2002) ainda afirmam que a aplicação diária de ácido L-ascórbico tópico a 15% formulado em pH 3,2, após três dias, atingiu nível 20 vezes maior de saturação no tecido aplicado (pele de suíno) do que no controle (pele de suíno sem aplicação). Após a saturação do reservatório da pele, o ácido L-ascórbico mantevese estável e presente no tecido com meia-vida de aproximadamente quatro dias. O pH do ácido ascórbico associado ao gel de hidroxietilcelulose foi mensurado e este ficou em 3,2. Gallarte et al. (1999) realizaram experimentos de solução de ácido ascórbico em diferentes valores de pH e observaram que os valores de pH em torno de 3,0 são mais estáveis e apresentam uma menor degradação quando comparados aos valores de pH 4,0; 5,0 e 7,0. 4.3.3. Liberação passiva versus liberação sem a comunicação dos eletrodos na superfície da membrana de acetato de celulose Também realizou- se triplicatas da aplicação de iontoforese em membrana de acetato de celulose, nos mesmos moldes e parâmetros utilizados anteriormente, porém, separou-se a área da membrana com uma placa de vidro, como demonstrado na Figura 20, impedindo o fluxo de corrente elétrica superficial e incentivando que o fluxo de corrente acontecesse pela solução receptora de PBS (pH 6,6) (SILVA et al., 2012). 45 Figura 20- Detalhe da aplicação de iontoforese com a célula dividida por placa de vidro isolando os eletrodos de forma que a comunicação ocorra através da solução BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) receptora. Fonte: a autora Nas análises realizadas verificou-se menores valores de absorbância em comparação à liberação em experimentos com célula de difusão convencional, não sendo possível a quantificação, porém a partir destes valores pode-se inferir que menores quantidades de ácido ascórbico foram difundidas pelo sistema. Através dos dados obtidos, pode se perceber que na presença de íons competitivos na solução receptora, houve uma diminuição de fluxo. Rim e Rasadi (1986) observaram o mesmo em relação ao fluxo de benzoato. Estes citam que o fluxo de benzoato aumentou com maiores concentrações do ativo e houve uma queda no fluxo com a adição de íons competitivos. Portanto o fluxo da substância utilizada pode ser maximizado evitando a utilização de substâncias iônicas no compartimento doador em um sistema de permeação e liberação por iontoforese. Os autores ainda enfatizam que a utilização de concentrações maiores de ativo pode significar altos custos na produção de produtos ou solubilidade limitada, enquanto que concentrações baixas do ativo não comprometem a liberação da substância, de acordo com os resultados encontrados. A utilização de uma solução receptora água/álcool 1:1(FDA, 1997), possibilita a influência somente da corrente elétrica na resistência da membrana, já que a resistência da pele diminui à medida que a concentração de sais aumenta na solução receptora. Porém, em experimentos in vitro em uma voltagem constante, a diminuição da resistência da membrana promove posteriormente um aumento da 46 densidade da corrente com conseqüente aumento de fluxo do soluto, no entanto, o aumento da densidade da corrente em humanos pode gerar queimaduras cutâneas. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) Outro aspecto que deve ser levado em consideração é que a aplicação de corrente elétrica constante gerará uma menor diferença de potencial através da pele, o que reduz a condução do campo elétrico gerado. Ainda é preciso citar a competição de íons entre o soluto e a solução receptora, à medida que a concentração da solução receptora aumenta, o fluxo total de soluto diminui (LIN et al., 1997). 4.3.4. Considerações finais: degradação, fluxo, liberação versus permeação. A partir das curvas apresentadas foi possível realizar a análise do fluxo de difusão pela área da membrana de acetato de celulose utilizada. O fluxo de ácido ascórbico através da membrana de acetato de celulose aumentou em função do tempo com a aplicação de iontoforese. Estes resultados corroboram a literatura, na qual se percebe o incremento da liberação de ativos à medida que aumenta o tempo de exposição da corrente. Através dos cálculos obtidos com a construção da equação da reta dos gráficos de liberação, fez-se análise estatística a partir do teste t e pode-se afirmar que o fluxo de ácido ascórbico através da membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese foi de J= 5,159 ± 0,2831 µmol L-1. cm-². h-1 e com a aplicação da iontoforese o fluxo de ácido ascórbico aumentou para J= 16,71 ± 0,08779 µmol. L-1. cm-². h-1, estatisticamente significativo para p< 0,05. É possível inferir que a velocidade de liberação do ácido ascórbico foi aumentada com a aplicação de iontoforese através da membrana de acetato de celulose. Pode-se verificar o aumento na Figura 21. Já para sistemas com biomembrana de pele de cobra, que simulam o estrato córneo humano, o fluxo obtido, para sistemas com e sem aplicação de iontoforese foi de J= 2,27363 µmol. L-1. cm-². h-1 e 2,67576 µmol. L-1. cm-². h-1, respectivamente (Figura 22). Avaliando os resultados obtidos verifica-se que, para as condições testadas, não há diferença de fluxo de permeação para sistemas com e sem iontoforese. Ou ainda pode-se dizer que a velocidade de permeação não aumentou frente a aplicação de iontoforese através da biomembrana de muda de pele de 47 cobra. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) Figura 21- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose através da membrana de acetato de celulose, sem e com aplicação de iontoforese in vitro Fonte : a autora Figura 22- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose através da biomembrana de pele de cobra, sem e com aplicação de iontoforese in vitro Fonte: a autora A concentração da droga e seu impacto no fluxo iontoforético é um parâmetro bastante estudado e discutido. Um simples aumento na quantidade de droga na 48 formulação, não necessariamente aumenta o número de moléculas transportadas na membrana; as propriedades físico- químicas da droga podem afetar a capacidade da BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) molécula de interagir com as estruturas dos tecidos durante o transporte iontoforético. As formas de sais das drogas são preferíveis para o transporte de iontoforese devido à alta densidade de carga e solubilidade (FIALHO; CUNHA, 2004). Comparando estes resultados com estudos prévios publicados (KOGAN; GARTI, 2006), verifica-se que em estudos associando iontoforese e ácido ascórbico, em pele de ratos, somente 0,3% do princípio ativo estudado permeou, em associação à iontoforese, sendo que neste estudo os parâmetros estudados foram 10 V por 20 segundos e avaliação da quantidade de ácido ascórbico após 4 horas (EBIHARA, et al.). Ainda cabe mencionar que a pele dos ratos possui pouca similaridade com a pele humana (GALLARTE, 1999), justificando o presente estudo onde a biomembrana de pele de cobra simula com maiores detalhes o estrato córneo humano (DUTRA et al., 2013). Já em outro trabalho publicado, onde o princípio ativo estudado foi o fosfato ascorbil- sódico, que devido as suas alterações estruturais, apresenta maior estabilidade em comparação ao ácido ascórbico (CHORILLI, 2009), para o tempo de aplicação de 30 minutos, aproximadamente 10% do princípio ativo foi difundido, em membranas celulósicas hidrofílicas (SPICLIN, 2003). Li et al. (2005) afirmam que a iontoforese aumenta o transporte de fármacos através das membranas por dois mecanismos, basicamente: eletroforese e eletrosmose. Eletroforese é a facilitação do movimento de espécies iônicas através da aplicação do campo elétrico. Eletrosmose auxilia o transporte de espécies neutras ou carregadas eletricamente através do fluxo gerado pelo campo elétrico e o solvente. Em relação à permeação gerada pela iontoforese, diversos fatores podem influenciar o mecanismo de transporte de substâncias por essa aplicação, entre eles destacam-se a estrutura do fármaco (peso molecular), o comportamento dos íons do soluto em solução, incluindo a condutividade, a resistência do transporte do íon através do tecido, a composição dos veículos utilizados, e a influência de outros íons presentes no processo de transporte (FIALHO; CUNHA, 2004). 49 De acordo com Li et al. (2004), a permeação aumentada através da corrente elétrica dependerá do campo elétrico gerado e da duração da aplicação da BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) iontoforese. Essa afirmação corrobora os achados no estudo, pois, à medida que aumentou o tempo de aplicação da iontoforese, aumentou a liberação de ácido ascórbico para o meio receptor. Pode-se citar, por exemplo, que a aplicação da corrente elétrica ocasionou uma queda na resistência da pele. Na pesquisa realizada por OH et al. (1995), a mudança ocorreu em todas as aplicações realizadas, inclusive, nos 10 primeiros segundos do início do fluxo de corrente, o que seria uma justificativa para o comportamento do ativo ácido ascórbico após a aplicação da iontoforese. Molokhia et al.(2007), relatam em seus estudos que é possível que haja uma maior permeação através da membrana com uma maior densidade de corrente elétrica. Porém, relatam que não houve diferença significativa na profundidade de permeação com a utilização de 2 e 4 mA. Os mesmos autores sugerem que o tempo de exposição à corrente elétrica também aumenta a permeação das substâncias pesquisadas e sugerem um tempo de 20 a 60 minutos de aplicação, contudo, o ácido ascórbico apresentou tendência à degradação em um período de tempo de 10 minutos, no presente estudo, por avaliação eletroquímica. O estrato córneo submetido à iontoforese tem a sua hidratação aumentada. Alguns autores relatam que há uma diminuição na resistência da pele com a hidratação, sua condutância é aumentada e o fluxo de íons aumenta linearmente pela hidratação. Assim, a sua resistência à passagem da corrente diminui. Correntes de baixa frequência geram uma desestabilização do estrato córneo apenas no local onde são aplicadas (JADOUL et al., 1999; EBIHARA et al., 2003). Djabri et al. (2012) confirmam que a utilização de mecanismos de corrente elétrica de baixa intensidade para a transferência transdermal de fármacos é eficaz, uma vez que a liberação ocorre de forma gradual e sem desconforto para o paciente. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 50 CONCLUSÃO Resultados deste estudo corroboram o que a literatura apresenta, uma vez que o fluxo de liberação do ativo ácido ascórbico ocorreu de forma progressiva, conforme o aumento de tempo de exposição à corrente elétrica gerada pela iontoforese. Sugere-se que a aplicação de corrente elétrica de baixa potência tem a capacidade de oxidar o princípio ativo ácido ascórbico em meio com gel hidroxietilcelulose em tempos maiores que 5 minutos, demonstrado nos voltamogramas apresentados. Sabendo-se que houve uma degradação dos sistemas estudados, após a aplicação da técnica de iontoforese por 10 min, torna-se fundamental o conhecimento aprofundado de seus efeitos ao interagir com tecidos, uma vez que a acorrente elétrica sobre o princípio ativo pode causar uma alteração da estrutura molecular e assim, a ação clareadora de manchas e ativadora dos fibroblastos, do ativo estudado, já comprovado, pode não mais existir. Outro fator importante a ser analisado é a permeação e liberação do princípio ativo que pôde ser observado nos valores de absorbância apresentando variação de acordo com a membrana utilizada. Assim, a aplicação da iontoforese é uma facilitadora da permeação e liberação do princípio ativo ácido ascórbico. Quanto ao fluxo de ácido ascórbico pode-se perceber que a corrente elétrica de baixa potência, tem a capacidade de acelerar o fluxo do princípio ativo ácido ascórbico em membrana de acetato de celulose, com tendência a um aumento de 51 permeação, porém sugere-se a continuidade de estudos envolvendo outras membranas, que apresentem uma similaridade ainda maior com a pele humana, BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) aliado a técnicas analíticas mais sensíveis para aprimorar os estudos de permeação deste princípio ativo. Ainda para trabalhos futuros, sugere-se: Avaliar a permanência da atividade antioxidante do ácido ascórbico após exposição à iontoforese; Avaliar a ação nos tecidos da estrutura molecular resultante após à exposição à iontoforese. BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu) 52 REFERÊNCIAS AZULAY, M. M. et al. Vitamina C. An. Bras. Dermatol, v. 78, n. 3, p. 265-272, 2003. 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