iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico

CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM AMBIENTE E DESENVOLVIMENTO
IONTOFORESE ASSOCIADA AO PRINCÍPIO ATIVO ÁCIDO
ASCÓRBICO: AVALIAÇÃO ELETROQUÍMICA E DE DIFUSÃO
VERTICAL
Giovana Sinigaglia
Lajeado, fevereiro de 2014
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Giovana Sinigaglia
IONTOFORESE ASSOCIADA AO PRINCÍPIO ATIVO ÁCIDO
ASCÓRBICO: AVALIAÇÃO ELETROQUÍMICA E DE DIFUSÃO
VERTICAL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Ambiente
e
Desenvolvimento, do Centro Universitário
UNIVATES, como parte da exigência para
obtenção do grau de Mestre em Ambiente
e Desenvolvimento na área de Tecnologia
e Ambiente.
Orientador: Profa. Dra. Simone Stülp
Coorientador: Prof. Dr. Eduardo Périco
Lajeado, fevereiro de 2014
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AGRADECIMENTOS
“Em tempos em que quase ninguém se olha nos olhos, em que a maioria das pessoas pouco se
interessa pelo que não lhe diz respeito, só mesmo agradecendo àqueles que percebem nossas
descrenças, indecisões, suspeitas, tudo o que nos paralisa, e gastam um pouco da sua energia
conosco.” (Marta Medeiros).
Gostaria de agradecer a Deus, à minha orientadora prof. Dra. Simone Stülp,
pessoa e pesquisadora a quem admiro e tenho muito respeito, que tornou possível a
realização desta dissertação. Ao prof. Dr. Eduardo Périco, que através do generoso
auxílio e atenção a mim disponibilizados foi possível acrescentar qualidade a esta
dissertação. Ao professor Eduardo Ethur, pelo auxílio prestado. As bolsistas do
NEMP (Verônica Radaelli, Paula Marioti), em especial a Caroline Saling e Laís
Bresciani que me acompanharam nos meus experimentos e análises com muita
atenção e disposição. Aos meus colegas de trabalho prof Ms. Dênis Duarte Barnes e
Débora Urnau Cerutti (in memorian) amigos e apoiadores deste projeto. Prof. Paula
Bianchetti e em especial o prof. Ms.João Alberto Tassinary pelo auxílio e apoio nos
momentos difíceis e também o incentivo de aprimorar cada vez mais o trabalho. Ás
queridas amigas e bolsistas Sara Mallmann, Jéssica Becker e em especial à Maiara
Zagonel, por emprestar seus abraços e ouvidos. Aos amigos que fiz durante esta
caminhada e que também me apoiaram muito, Diego e Marcelo. E finalmente aos
meus familiares e ao meu namorado Alex Bücker pelo apoio em todos os momentos.
“Conformar-se é submeter-se e vencer é conformar-se, ser vencido. Por isso toda a vitória é uma
grosseria. Os vencedores perdem sempre todas as qualidades de desalento com o presente que os
levaram à luta que lhes deu a vitória. Ficam satisfeitos e satisfeito só pode estar aquele que se conforma,
que não tem a mentalidade do vencedor. Vence só quem nunca consegue”(Fernando Pessoa).
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RESUMO
A iontoforese é um método de incremento de permeação de substâncias pela pele
com a utilização de corrente contínua. Neste estudo, será abordado o princípio ativo
ácido ascórbico, que possui efeitos fisiológicos na pele, tais como a sua atividade
antioxidante; é também um importante cofator da produção de colágeno pelos
fibroblastos e ainda atua como inibidor da melanogênese, proporcionando um
clareamento de manchas. Foram realizadas aplicações de iontoforese in vitro em
gel com hidroxietilcelulose associada ao princípio ativo ácido ascórbico 5% nos
tempos 0, 2, 5 e 10 minutos, para as quais houve um grupo de aplicação da corrente
e um grupo controle. O comportamento eletroquímico do ácido ascórbico frente à
iontoforese foi analisado através de voltametria cíclica. A liberação, permeação e
fluxo do ácido ascórbico foram avaliadas por difusão vertical in vitro utilizando-se a
célula do tipo Franz com membrana de acetato de celulose e biomembrana de muda
de pele de cobra. Pode-se observar que houve um incremento na liberação e fluxo
do ácido ascórbico quando comparada à difusão passiva. O fluxo do ácido ascórbico
através da membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese foi de
5.1594 ± 0.2831 µmol L-1 cm-² h-1 e com a aplicação da iontoforese o fluxo de ácido
ascórbico aumentou para 16.7132 ± 0.08779 µmol L-1 cm-² h-1. Já em termos de
permeação os valores de fluxo de ácido ascórbico obtidos foram de 2.27363 µmol L-1
cm-² h-1 e 2.67576 µmol L-1 cm-² h-1, para sistemas com e sem iontoforese,
respectivamente. Por meio da avaliação eletroquímica, verificou-se que nos tempos
de 2 e 5 minutos o ácido ascórbico apresentou uma tendência à oxidação com
caráter reversível, já em um período de aplicação de iontoforese de 10 minutos a
tendência à oxidação ocorreu na forma de ácido deidroascórbico.
Palavras-chave: Iontoforese. Ácido ascórbico. Voltametria cíclica.
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ABSTRACT
Iontophoresis is a method for increasing the permeation of substances through skin
using direct current. In this study, was studied the active ascorbic acid, which has
physiological effects on the skin, such as its antioxidant activity principle , it is also an
important cofactor in the production of collagen by fibroblasts and also acts as an
inhibitor of melanogenesis , providing a bleaching of stains . Applications of
iontophoresis in vitro gel hydroxyethylcellulose associated with active ingredient
ascorbic acid 5 % at 0, 2 , 5 and 10 minutes were performed for which there will be a
group of current application and a control group . The electrochemical behavior of
ascorbic acid iontophoresis front was analyzed by cyclic voltammetry. The release
and permeation flux were evaluated by ascorbic acid vertical diffusion in vitro using
Franz type cell membrane of cellulose acetate and biomembrane snake skin
changes. Can be seen that there was an increase in the release and flow of ascorbic
acid when compared to the passive diffusion. The flow of ascorbic acid through the
pulp without the application of iontophoresis acetate membrane was 5.1594 ± 0.2831
µmol L -1cm -²h -1 and with the application of iontophoresis flow of ascorbic acid
increased to 16.7132 ± 0.08779 µmol L -1cm -²h -1 . In terms of the permeation flux
values obtained were Ascorbic acid 2.27363 µmol L -1cm -²h -1 and 2.67576 µmol L-1
cm -²h -1 for systems with and without iontophoresis, respectively. Through
electrochemical evaluation, ascorbic acid showed a tendency of reversible oxidation
in 2 and 5 minutes, but over a period of iontophoresis application of 10 minutes the
tendency of oxidation was in molecular form of dehydroascorbic acid.
Key Words: Iontophoresis. Ascorbic acid. Cyclic voltammetry.
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AA ou aa - Ácido ascórbico
cm- centímetro
Hz – Hertz
L- litro
mA - Miliampères
nm - Nanômetros
pH - Potencial de hidrogênio
RL - Radical livre
RNAm - ácido ribonucleico mensageiro
UVA - Radiação ultravioleta A
UVB - Radiação ultravioleta B
V - volt
µA - Microampères
µmol- Micromol
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Estrutura química do ácido ascórbico (C6H8O6) ......................................... 16
Figura 2-Formas reduzidas do ácido ascórbico......................................................... 17
Figura 3 - Aplicação de potencial elétrico e deslocamento da corrente elétrica na
presença de eletrodos reversíveis de Ag e AgCl ....................................................... 19
Figura 4- Aparelho utilizado para a aplicação de iontoforese, modelo AF5 da
empresa Tone Derm .................................................................................................. 27
Figura 5- Aplicação da iontoforese in vitro. ............................................................... 29
Figura 6- Curva de calibração do ácido ascórbico para potenciais de 0,45 V por
voltametria cíclica. ..................................................................................................... 31
Figura
7-
Voltametria
cíclica
de
prata
em
sistema
contendo
gel
com
-1
hidroxietilcelulose v= 10mV.s .................................................................................. 32
Figura 8- Voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose com ácido
ascórbico 5%. v= 10mV.s-1 ........................................................................................ 33
Figura 9- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel
hidroxietilcelulose sem a aplicação de iontoforese (linha) e após a aplicação de
iontoforese por 2 (linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada
+pontilhada), v= 10mV.s-1 .......................................................................................... 33
Figura 10- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel
hidroxietilcelulose com ácido ascórbico 5% (linha contínua) após a aplicação de
iontoforese por 2 ( linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada
e pontilhada). No detalhe os picos característicos encontrados na pesquisa, v=
10mV.s-1 .................................................................................................................... 34
Figura 11- Curva de calibração para a concentração de ácido ascórbico. ................ 37
Figura 12- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico
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5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de acetato de celulose, sem a aplicação de iontoforese in vitro.............. 38
Figura 13- Liberação do ácido ascórbico nos tempos de 0, 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese in vitro............... 38
Figura 14- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico
5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de acetato de celulose, com aplicação de iontoforese in vitro ................ 39
Figura 15- Liberação do ácido ascórbico em membrana de acetato de celulose com
a aplicação de iontoforese in vitro ............................................................................. 39
Figura 16- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de permeação do ácido
ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10
minutos sobre membrana de pele de cobra, sem a aplicação de iontoforese in vitro
.................................................................................................................................. 41
Figura 17- Permeação do ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra sem a
aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................ 41
Figura 18- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico
5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de pele de cobra, com aplicação de iontoforese in vitro.......................... 42
Figura 19- Permeação de ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra com a
aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................ 42
Figura 20- Detalhe da aplicação de iontoforese com a célula dividida por placa de
vidro isolando os eletrodos de forma que a comunicação ocorra através da solução
receptora. .................................................................................................................. 45
Figura 21- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com
hidroxietilcelulose através da membrana de acetato de celulose, sem e com
aplicação de iontoforese in vitro ................................................................................ 47
Figura 22- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com
hidroxietilcelulose através da biomembrana de pele de cobra, sem e com aplicação
de iontoforese in vitro ................................................................................................ 47
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 10
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................................... 13
2.1 O envelhecimento cutâneo e suas consequências na pele................................... 13
2.2 O ácido ascórbico ..................................................................................................... 16
2.3 A iontoforese ............................................................................................................. 18
2.4 A iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico e seu papel no
envelhecimento cutâneo................................................................................................. 22
3 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ....................................................................... 25
3.1 Reagentes .................................................................................................................. 25
3.2 Aplicação da iontoforese in vitro ............................................................................. 25
3.3 Análise eletroquímica ............................................................................................... 27
3.3 Análise da liberação do ácido ascórbico através de uma membrana de acetato de
celulose ............................................................................................................................ 28
3.4 Análise da permeação do ácido ascórbico através da biomembrana de pele de cobra
.......................................................................................................................................... 29
3.5 Análise estatística ..................................................................................................... 30
3.6 Mensuração de pH .................................................................................................... 30
3.7 Descrição do procedimento ..................................................................................... 30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 31
4.1 Discussão dos resultados obtidos .......................................................................... 31
4.1.1 Análise do ácido ascórbico ................................................................................... 31
4.1.2 Análise da voltametria cíclica do ácido ascórbico em meio gel com
hidroxietilcelulose ........................................................................................................... 32
4.3 Análises espectrofotométricas ................................................................................ 37
4.3.1 Análise de liberação do ácido ascórbico ............................................................. 37
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4.3.2 Análise da permeação do ácido ascórbico .......................................................... 41
4.3.3. Liberação passiva versus liberação sem a comunicação dos eletrodos na
superfície da membrana de acetato de celulose .......................................................... 44
4.3.4. Considerações finais: degradação, fluxo, liberação versus permeação.......... 46
CONCLUSÃO ................................................................................................................... 50
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 52
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10
INTRODUÇÃO
A pele é uma barreira mecânica que serve como proteção ao organismo,
evitando a perda de líquidos, a entrada de microorganismos e também a permeação
de substâncias do exterior. A camada mais superficial da pele, a epiderme, é
constituída de cinco camadas, das quais a que oferece maior resistência à
permeação é a mais superficial delas, a camada córnea, também chamada estrato
córneo (GUIRRO, 2002).
Uma forma de incrementar a permeabilidade cutânea é a iontoforese. Este
recurso terapêutico é utilizado há muito tempo, existem relatos da sua utilização
desde o século XVIII. A iontoforese é um método de administração de substâncias
pela pele com a utilização de corrente contínua. Esse método é também chamado
de ionização, iontopenetração, dieletrólise e dieletroforese (BORGES, 2006).
Há um interesse crescente na obtenção de um aumento de permeação de
fármacos através da pele porque, dessa forma, os efeitos colaterais gerados pelas
vias clássicas (endovenosa e oral) seriam diminuídos. Neste estudo, será abordado
o princípio ativo ácido ascórbico, que possui efeitos fisiológicos na pele, como a sua
atividade antioxidante, também é um importante cofator da produção de colágeno
pelos fibroblastos e ainda atua como inibidor da melanogênese, proporcionando
assim um clareamento de manchas (MAIA et al., 2001).
A importância do ácido ascórbico na dermatologia e estética é justificada pela
sua ação antioxidante, que atua de forma preventiva no envelhecimento cronológico
cutâneo. Este causa modificação do material genético por meio de enzimas,
alterações proteicas e decréscimo da proliferação celular. Consequentemente, o
11
tecido perde a elasticidade, a capacidade de regular as trocas aquosas e a
replicação do tecido se torna menos eficiente. Oxidações químicas e enzimáticas
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envolvendo a formação de radicais livres (RL) aceleram esse fenômeno de
envelhecimento (HIRATA et al., 2004).
O ácido ascórbico é um composto natural, encontrado em frutas cítricas e
vegetais, que são amplamente pesquisados tanto farmacologicamente quanto para o
desenvolvimento de novas drogas e produtos tópicos. Não somente os seus
constituintes são usados diretamente como agentes terapêuticos, mas também
como matéria-prima para a síntese ou modelos para compostos farmacologicamente
ativos. Assim, as plantas medicinais, as preparações fitofarmacêuticas e os produtos
naturais isolados, como a vitamina C, são pesquisados e utilizados em todo o mundo
e, dessa forma, representam um mercado que movimenta bilhões de dólares, tanto
em países industrializados quanto em desenvolvimento (LIMA et al., 2009).
Pode-se enfatizar que a promoção de permeação de fármacos pela pele através
da corrente contínua pode levar à maior eficácia da liberação de ativos; ao aumento
do fluxo ou retenção do mesmo; ao aumento da liberação localizada, tópica ou dos
tecidos alvo através da pele; ou ainda à combinação das hipóteses citadas. No
entanto, essa liberação poderá promover efeitos tóxicos tanto intracelulares como
extracelulares caso não haja utilização adequada da quantidade do composto
associado, ou ainda devido à ocorrência de alteração da estrutura química do
composto.
O interesse pela temática da iontoforese associada ao princípio ativo ácido
ascórbico surgiu da observação do crescimento da indústria cosmética e do apelo
midiático que esta realiza prometendo imensas vantagens advindas da associação
da iontoforese aos mais variados princípios ativos para aumentar sua eficácia e
permeação. A partir dessa observação, houve questionamentos e inquietações
pessoais a respeito do que realmente aconteceria na aplicação transdermal de
fármacos e, mais especificamente, do ácido ascórbico e suas propriedades frente à
aplicação de corrente contínua.
Pode-se observar que é fundamental o conhecimento por parte dos profissionais
que atuam mais especificamente na área da estética e dermatologia sobre as
12
questões que envolvem a análise das substâncias após serem expostas a um
campo elétrico. Estas podem sofrer modificações na estrutura química de suas
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moléculas, possibilitando que ofereçam potencial tóxico para a pele e o organismo
em que são aplicadas.
A maior indicação do uso do ácido ascórbico é para minimizar os sinais de
envelhecimento cutâneo, que surgem a partir dos 30 anos de idade e lentamente
vão progredindo sem que se perceba até que os sinais fiquem mais evidentes. Só no
Brasil, o número de pessoas com 60 anos ou mais cresce em velocidade muito
superior à de todas as demais faixas etárias. A população brasileira chegou, em
2008, a 186,6 milhões de habitantes, mas cresce em ritmo cada vez menor devido à
queda das taxas de fecundidade (KEDE, 2009).
A expectativa de vida média aumentou porque conseguiu-se diminuir algumas
causas de morte, mas o processo molecular referente ao envelhecimento mantevese inalterado. Mesmo não sendo sinônimo de adoecer, envelhecer aumenta o peso
de cuidados com a saúde (GUIRRO, 2002).
Dessa forma, é importante a investigação do comportamento eletroquímico da
vitamina C frente à iontoforese para que possa ser avaliada a real eficácia do seu
emprego terapêutico. Este trabalho teve como objetivos: Avaliar a estabilidade do
ácido ascórbico após a associação à corrente e avaliar e mensurar a liberação e
permeação do ácido ascórbico associado à utilização da iontoforese.
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13
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Nesta etapa serão abordados os seguintes temas: o envelhecimento cutâneo e
suas consequências na pele; o ácido ascórbico; a iontoforese; e a iontoforese
associada ao princípio ativo ácido ascórbico e o papel exercido no envelhecimento
cutâneo.
2.1 O envelhecimento cutâneo e suas consequências na pele
O fenômeno biológico do envelhecimento representa a última das três fases do
ciclo vital do organismo, sendo as duas primeiras, a infância e a maturidade.
Envelhecer é um processo natural, porém a qualidade do envelhecimento está
diretamente relacionada com a qualidade de vida à qual o organismo foi submetido
(GUIRRO, 2002).
O processo de envelhecer pode ser visível aos 30 anos e imperceptível aos 60,
isso depende de uma série de causas endógenas e exógenas. As primeiras são
decorrentes de um declínio programado nas funções e nas capacidades fisiológicas
da pele (ESTEVE, 1994).
O envelhecimento extrínseco é também denominado actinossenescência e
relaciona-se com as alterações da superfície cutânea provocadas principalmente
pelo fotoenvelhecimento, como as modificações do contorno e a elasticidade da
14
pele, que se manifestam por sulcos e rugas associados à flacidez. O envelhecimento
intrínseco busca a compreensão da senescência através dos vários fatores causais
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que atuarão tanto nos órgãos internos quanto na pele (KEDE, 2009).
O envelhecimento cutâneo intrínseco, portanto, é o resultado da ação de vários
fatores, tais como: fatores individuais (genéticos), hormonais, exposição solar
crônica, tabagismo, alcoolismo, estresse emocional e repercussão de doenças
cutâneas e sistêmicas. A pele utiliza naturalmente antioxidantes para proteger-se dos
efeitos nocivos das radiações solares. Esta utiliza predominantemente o ácido
ascórbico (vitamina C) para proteger o meio aquoso das membranas celulares e
tocoferol (vitamina E) para proteger as estruturas lipídicas. Em muitos sistemas
biológicos as vitaminas C e E trabalham de forma sinérgica, quando a vitamina E
torna-se oxidada pelos radicais livres, ele é regenerado na membrana pela vitamina
C. (LIN et al., 2003; KEDE, 2009).
Clinicamente o envelhecimento intrínseco é atrófico e resulta na perda
progressiva da elasticidade, na atrofia da pele e no aumento das linhas de
expressão. Especificamente a camada córnea não sofre grandes alterações, mas
afina-se com o achatamento da junção dermo-epidérmica, deixando a pele mais
frágil. A maior alteração ocorre na derme, com diminuição da vascularização,
diminuição da biossíntese dos fibroblastos e espessamento das fibras elásticas e
consequente diminuição de sua função (ESTEVE, 1990).
A diminuição da elasticidade do epitélio era associada à rigidez protéica da
matriz extracelular, resultante da polimerização do colágeno com a elastina. Porém,
estudo in vitro realizado com o uso de microscopia atômica-AFM (Atomic Force
Microscopy) atribuiu à rigidez excessiva das células epiteliais ao aumento da
densidade das fibras do citoesqueleto com o decorrer da idade (SCOTTI et al.,
2007).
O estudo das causas do envelhecimento é um campo no qual existem várias
teorias. Uma das mais aceitas é a teoria justificada pela ação dos radicais livres.
Vive-se em um ambiente rico em oxigênio, onde várias espécies de oxigênio reativo
são regularmente geradas pela exposição à radiação ultravioleta, à poluição e à
inflamação. O oxigênio reativo ameaça constantemente a integridade das estruturas
15
celulares e da matriz extracelular da pele e pode, por exemplo, contribuir para o
aparecimento de mutações que resultam em câncer de pele (GUIRRO, 2002).
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A desorganização do mecanismo de defesa antioxidante provoca doenças na
pele, resultado das condições causadas por esse desequilíbrio e que são
consequências de danos a estruturas nela presentes, como lipídios, proteínas e
DNA. Estima-se que cerca de 80% dos sinais visíveis causados no envelhecimento
são provocados pelos raios ultravioletas e pelos radicais livres formados devido à
exposição a estes (SCOTTI et al., 2007).
Os radicais livres são produzidos, normalmente, em quantidades reduzidas no
decorrer da vida celular, sendo rapidamente eliminados a fim de não provocar danos
celulares. Desse modo, as células são providas de sistemas enzimáticos e de
moléculas de baixo peso molecular, ditas antioxidantes, tais como a vitamina C
(MAIA et al., 2001).
Oxidações químicas e enzimáticas envolvendo a formação de radicais livres
aceleram o fenômeno do envelhecimento por causarem danos ao DNA e atuarem na
desidrogenação, hidroxilação e glicação proteica. A última reação envolve a perda
das funções biológicas de proteínas, como o colágeno e as proteoglicanas, que
resultam em alterações da estrutura da membrana e aumento da flacidez da pele
(HIRATA et al., 2004). Os radicais livres se propagam indefinidamente, alterando, em
nível molecular, as estruturas das células. Esse ciclo contínuo de propagação e dano
celular é interrompido quando dois radicais se encontram ou quando o antioxidante
anula o radical (KEDE, 2009).
Hirata et al. (2004) ainda afirma que, durante o estresse oxidativo, o ácido
ascórbico é esgotado primeiro, seguido do ubiquinol 10, indicando que esses dois
antioxidantes são muito sensíveis ao estresse oxidativo. O antioxidante lipossolúvel
melhor conhecido, o α-tocoferol, permanece inalterado e, preferentemente, requer o
ácido ascórbico e o ubiquinol-10 como coantioxidantes.
16
2.2 O ácido ascórbico
O ácido ascórbico, ou vitamina C, é conhecido como promotor de numerosos
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processos químicos, bioquímicos e fisiológicos, tanto em animais como em plantas.
O homem, o macaco, a cobaia, alguns pássaros e alguns peixes, diferentemente da
maioria dos animais, não sintetizam a vitamina C por não possuírem a enzima
gulonolactona oxidase, envolvida na biossíntese do ácido L-ascórbico a partir de Dglicose, sendo a mesma obtida através da ingestão dos alimentos (LEHNINGER et
al.,1993).
A deficiência de ácido ascórbico em mulheres grávidas tem sido associada
com pré-eclampsia, ruptura prematura de membranas, a degradação do colágeno do
líquido amniótico e parto prematuro (OCHOA- BRUST et al., 2007)
A vitamina C apresenta-se como cristais incolores ou em forma de pó branco,
inodoro e de sabor amargo, sendo sua coloração alterada quando exposta à luz, ao
ar ou à umidade. É solúvel em água ou em álcool e praticamente insolúvel em
clorofórmio e em éter etílico (REYNOLDS, 1989).
Na figura 1 tem-se a fórmula estrutural do ácido ascórbico.
Figura 1- Estrutura química do ácido ascórbico (C6H8O6)
Fonte: A autora.
A importância do ácido ascórbico está na sua relação com várias funções no
organismo relacionadas ao sistema imune, agindo como cofator enzimático na
formação de colágeno, na absorção de ferro, na inibição da formação de
17
nitrosaminas e na atividade antioxidante. A vitamina C encontra-se na natureza sob
forma reduzida ou oxidada (ácido deidroascórbico). Ambas são igualmente ativas,
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porém a forma oxidada está muito menos difundida nas substâncias naturais (LIMA
et al., 2009).
A transformação do ácido ascórbico em ácido mono-deidroascórbico ocorre
normalmente no interior do organismo e é reversível, permitindo que uma de suas
substâncias possa sempre ser transformada na outra. Essa capacidade de
transformação funciona como um sistema oxidorredutor capaz de transportar
hidrogênio nos processos de respiração, no nível celular (AZULAY, 2003).
É encontrado nas plantas em três formas: reduzido a ácido L-ascórbico, ácido
mono-dehidroascórbico, que é um intermediário instável, e ácido L-deidroascórbico.
Este pode ser perdido irreversivelmente para ácido 2,3 dicetogulônico, que não
apresenta atividade vitamínica, como apresenta a Figura 2.
Figura 2-Formas oxidadas do ácido ascórbico
Fonte: A autora.
Uma série de produtos naturais possui ácido ascórbico. Presente no leite e no
fígado, ainda assim, as melhores fontes de vitamina C são frutas frescas
(particularmente frutas cítricas, tomates e pimentão verde), batata (17 mg por 100 g)
e verduras. Algumas frutas, como goiaba (300 mg por 100 g) e a groselha negra
(200 mg por 100 g) também são ricas em vitamina C, mas contribuem pouco na
dieta alimentar comum no ocidente (FIORUCCI et al., 2002).
Em termos práticos, a aplicação tópica de ácido ascórbico mostrou elevar de
modo significativo os níveis cutâneos desta substância em porcos e ratos, sendo que
18
a pele de porcos apresenta aspectos similares à da pele humana. O tratamento com
ácido ascórbico tópico pode funcionar como fotoprotetor biológico de amplo
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espectro, retardando de forma significativa os danos causados pela radiação
ultravioleta (UVA). A radiação UVA atinge preferencialmente as camadas mais
profundas da pele (quando comparada à ultravioleta B - UVB). Como a exposição à
radiação UVA resulta em alterações no fotoenvelhecimento, tal proteção é altamente
desejável (PINNEL et al., 2001; EBIHARA et al., 2003).
A literatura sugere que existe uma ampla aplicação, na área da estética, de
terapias que utilizam o ácido ascórbico como antioxidante. A teoria dos radicais livres
explica o porquê de os antioxidantes serem considerados agentes para prevenção
de rugas (BAUMANN, 2004). Dentre as terapias utilizadas pela estética como
alternativa para prevenir o envelhecimento cutâneo, está a iontoforese associada à
vitamina C.
2.3 A iontoforese
A iontoforese é uma técnica não invasiva que usa potencial ou corrente
elétrica para prover uma maneira controlada de aumentar a transferência
transdermal de uma variedade de fármacos (OLIVEIRA et al. apud BARRY, 2001).
No processo iontoforético, a corrente originária do aparelho é transferida do eletrodo
para a pele por meio da solução contendo agentes ativos (BORGES, 2006). Esse
processo é particularmente benéfico quando usado com drogas hidrofílicas e
também aquelas que possuem alto peso molecular (SILVA et al., 2012).
A possibilidade de se realizar iontoforese foi demonstrada ainda no começo
do século XX, quando Le Duc efetuou um experimento que se tornou célebre por
evidenciar a penetração de íons através da pele. Seu experimento fundamental
constituiu na tentativa de aplicação iontoforética de estricnina, um poderoso
estimulante do sistema nervoso central, em dois coelhos. Em um dos coelhos a
droga foi contida no eletrodo negativo e, no outro, no eletrodo positivo de um
sistema elétrico gerador de corrente contínua. Após certo tempo de aplicação, o
coelho cuja solução de estricnina estava contida no eletrodo positivo sofreu
espasmos convulsionantes que o levaram à morte, enquanto que o outro coelho
19
nada sofreu. As alterações ocorridas em apenas um dos coelhos demonstraram que
a droga é transportada através dos tecidos de acordo com suas características de
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polaridade, responsáveis pela determinação do sentido do fluxo iônico ativado pela
corrente contínua. Assim sendo, os íons positivos são introduzidos através do ânodo
e os negativos através do cátodo (LEDUC, 1988; OLIVEIRA et al., 2001; GUIRRO,
2002; FIALHO; CUNHA, 2004).
Harris (1967) descreveu as primeiras aplicações da iontoforese na medicina,
utilizando a técnica para o transporte das seguintes substâncias: sulfato de cobre
para o tratamento de tinea pedis (pé de atleta) e cervicite crônica, sulfato de zinco
para o tratamento de otite crônica e rinite vasomotora, nitrato de prata para o
tratamento de osteoartrite e artrite reumatóide (FIALHO; CUNHA, 2004).
Na iontoforese, o sentido de deslocamento dos elétrons é do polo positivo
para o polo negativo. Esse sentido é definido pela corrente gerada no equipamento.
Para que a corrente elétrica possa promover o fluxo iônico da solução eletrolítica,
devem ocorrer transformações químicas. No eletrodo negativo, deve ocorrer um
processo de redução no qual algum íon ou molécula aceita elétrons, sendo, portanto,
reduzido. Já no eletrodo positivo, os elétrons devem ser liberados para o eletrodo,
ocorrendo assim um processo de oxidação. O eletrodo no qual ocorre a redução é
chamado de cátodo, e o eletrodo em que ocorre a oxidação é chamado de ânodo.
Para que o processo de redução possa continuar acontecendo no cátodo, os íons
devem permanecer em movimento na direção dele. Esses íons negativos se
deslocam para o ânodo e são chamados de ânions (GUIRRO, 2002). Na figura 3
temos a ilustração do deslocamento da corrente elétrica através da aplicação de
potencial elétrico.
Figura 3 - Aplicação de potencial elétrico e deslocamento da corrente elétrica na
presença de eletrodos reversíveis de Ag e AgCl
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20
Fonte: Gratieri et al., 2008
A introdução de drogas através da pele em direção ao tecido subcutâneo
possui três rotas potenciais: (1) o folículo piloso e suas glândulas sebáceas
associadas; (2) os ductos sudoríparos; e (3) através do próprio estrato córneo, entre
seus apêndices e falhas (rota intercelular). No entanto, em decorrência das
características hidrofóbicas e negativas do estrato córneo e de sua matriz
lipoproteica, drogas ionizadas dificilmente penetram através da pele por difusão
passiva em quantidades suficientes para atingir níveis terapêuticos (BARRY, 2002;
CURDY et al., 2001).
A pele constitui uma barreira física que protege o corpo da perda de líquidos,
impede a invasão de microrganismos e a entrada de substâncias do meio exterior,
incluindo a água. O estrato córneo, correspondente a 10-20 µm (micrômetros) da
epiderme, é reconhecido como a principal barreira à transferência transdermal de
drogas. Assim, diferentes técnicas para aumento da penetração de várias
substâncias através do estrato córneo têm sido testadas (BARRY, 2002).
De acordo com Low e Reed (2001), a transferência de íons irá acontecer
principalmente nos dutos das glândulas sudoríparas e, em menor extensão, nos
folículos pilosos e glândulas sebáceas.
Os mecanismos envolvidos na transferência transdermal por iontoforese são:
(1) a eletrorrepulsão, criada pela interação droga–campo elétrico, que provê força
21
adicional para direcionar íons de polaridade semelhante à do eletrodo sob o qual são
colocados; (2) a eletroosmose, que é o movimento transdermal de parte do solvente
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juntamente com os componentes neutros e iônicos nele diluídos; e (3) o aumento da
permeabilidade intrínseca da pele pela aplicação do fluxo elétrico. Pelo mecanismo
da eletrorrepulsão, tanto os fármacos de carga positiva quanto os de carga negativa
serão liberados, desde que sejam colocados sob o eletrodo que apresente a mesma
carga elétrica (OLIVEIRA et. al., 2005).
Kalia et al. (2004) observaram que ocorre uma desorganização do estrato
córneo, assim, há uma queda na resistência da pele, seguida de um aumento da
hidratação durante a iontoforese. A elevação dos níveis de íons e água poderia
facilitar o transporte da corrente através do estrato córneo e promover as mudanças
estruturais do mesmo. Então, a fim de que ocorra a transmissão de íons para a
membrana, deve-se colocar o fármaco de mesma polaridade sob o eletrodo
(BORGES, 2006).
Os principais benefícios da iontoforese são: a redução dos riscos e
inconvenientes da infusão intravenosa contínua; a prevenção de alterações inter e
intrapaciente na absorção e no metabolismo, muitas vezes observadas após
administração oral do medicamento; o aumento da eficácia terapêutica pela
eliminação do metabolismo de primeira passagem pelo fígado; a redução da
possibilidade de superdosagem ou subdosagem, pelo transporte contínuo da droga,
programando dentro da faixa terapêutica desejada; o fornecimento de um regime
terapêutico simplificado, levando à melhor aceitação do paciente ao tratamento
(FIALHO; CUNHA, 2004).
É importante ressaltar que o tamanho do eletrodo é calculado de acordo com
a área de tecidos excitáveis que se quer atingir. Chama-se de densidade de corrente
a quantidade de corrente por unidade de área de condução. Esta é inversamente
proporcional à área do eletrodo. À medida que a área do eletrodo diminui, a
densidade da corrente aumenta (ROBINSON, 2001).
Com relação à intensidade segura, para minimizar a irritação da pele e as
queimaduras, esta limita-se a 0,1 mA/cm² da superfície do eletrodo ativo. Outra
variável importante refere-se ao tempo de aplicação, sobre o qual foi demonstrado
22
por Low e Reed (2001) que a penetração é maior nos primeiros seis minutos.
Segundo esses mesmos autores, a duplicação do tempo de tratamento, ou seja, 12
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minutos, aumenta em 25% o índice de penetração.
Guirro (2002) relata que o emprego da iontoforese na clínica estética
apresenta-se atualmente bastante limitado. Isso ocorre talvez devido à escassez de
experimentos que fundamentem cientificamente as dosagens ótimas de substâncias
específicas, relacionando-as ao tempo de aplicação e intensidade da corrente.
As maiores desvantagens do transporte de drogas por iontoforese são os
riscos de queimaduras e choques resultantes da utilização de correntes elétricas
elevadas e por longos períodos (FIALHO; CUNHA, 2004). Em relação ao ácido
ascórbico, especificamente, este, quando no estado sólido, é bastante estável,
porém, quando em solução, é facilmente oxidado em reação de equilíbrio ao ácido
L- deidroascórbico. Esta oxidação ocorre rapidamente em solução aquosa por
processos enzimáticos e não enzimáticos, especialmente quando exposta ao ar, ao
calor e à luz (RUMSEY; LEVINE, 1998).
2.4 A iontoforese associada ao princípio ativo ácido ascórbico e seu papel no
envelhecimento cutâneo
O ácido L-ascórbico é conhecido como promotor de numerosos processos
químicos, bioquímicos e fisiológicos, tanto em animais como em plantas.
Desempenha várias funções no organismo relacionadas ao sistema imune, à
formação de colágeno, à absorção de ferro, à inibição da formação de nitrosaminas
e à atividade antioxidante. O seu conteúdo pode ser influenciado pelo tipo de solo,
forma de cultivo, condições climáticas, procedimentos agrícolas para a colheita e
armazenamento (O’KEFEE, 2001; SILVA et al., 2004).
Com relação ao envelhecimento cutâneo, a importância do ácido L-ascórbico
é evidenciada na formação do tecido conjuntivo durante a formação do colágeno. Na
pele, colágenos tipos I e III contribuem com 85 a 90% e 8 a 11% do colágeno total
sintetizado, respectivamente (AZULAY et al., 2003).
23
A eficiência do sistema de proteção natural do organismo tende a decrescer
com a idade, indicando que a geração de radicais livres e o declínio das defesas
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antioxidantes deve ser considerada contribuidora potencial importante para o
processo de envelhecimento. Para reforçar a proteção natural, faz-se uso de
compostos exógenos como enzimas, antioxidantes (incluindo vitamina C) e
compostos fenólicos, reduzindo assim as reações oxidativas. Dessa forma, pode-se
considerar que o uso de sistemas antioxidantes como o ácido ascórbico pode ser
favorável à prevenção de envelhecimento cutâneo prematuro. O ácido pode ser
fornecido à pele via dietas ricas em frutas e vegetais ou por meio de administração
tópica ou oral dos antioxidantes.
O ácido ascórbico é cofator para duas enzimas essenciais na biossíntese do
colágeno. A lisil e a prolil hidroxilases catalisam a hidroxilação dos resíduos prolil e
lisil nos polipeptídeos colágenos, e essas modificações pós-tran slacionais permitem
a formação e estabilização do colágeno de tripla hélice e sua subsequente secreção
no espaço extracelular como procolágeno. Este é então transformado em
tropocolágeno, e, finalmente, fibras colágenas são formadas por um rearranjo
espacial
espontâneo
das
moléculas
tropocolágenas.
Consequentemente,
a
hidroxilação é uma fase crítica na biossíntese de colágeno, uma vez que regula a
formação da tripla hélice, da excreção do procolágeno e do cross-linking do
tropocolágeno. A lisil e a prolil hidroxilase são enzimas férricas (AZULAY et al., 2003;
DALCIN, 2003; MAIA et al., 2001).
A vitamina C, como cofator, previne a oxidação do ferro e, portanto, protege
as enzimas contra a autoinativação. Dessa forma, promove a síntese de uma trama
colágena madura e normal por meio da perfeita manutenção da atividade das
enzimas lisil e prolil hidroxilases (DALCIN et al., 2003).
O ácido ascórbico é solúvel em água, porém é rapidamente oxidado quando
exposto ao ar e não é suficientemente estável para ser aplicado de forma tópica. Por
outro lado, sua utilização tópica deve contemplar sua atuação no tecido conjuntivo,
devendo, para tanto, penetrar através do estrato córneo e estar disponível para os
fibroblastos dérmicos, daí a importância do incremento de permeação através da
iontoforese.
24
Com relação à concentração de produtos de aplicação tópica contendo
vitamina C, Pinnel et al. (2001) citam que percentagens de 5 a 30% foram testadas,
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e os níveis teciduais aumentaram proporcionalmente à concentração da vitamina. A
concentração de 20% foi a responsável pelo nível máximo de vitamina no tecido. Por
razões desconhecidas, concentrações acima desse valor resultaram em diminuição
dos níveis teciduais do ácido ascórbico. Já para Del Rio- Sancho et al. (2012),
reportam que a permeação é dependente, ou seja ela tem um aumento de
permeação até 5% de concentração e após atinge um platô e não aumenta mais. Os
mesmos autores referem que em alguns fármacos, como a memantina, há uma
diminuição de permeação em altas concentrações do fármaco, além desta alta
concentração em estudos in vivo causar irritação cutânea e toxicidade.
Os estudos de Nusgens et al. (2001) e Humbert (2003) foram realizados na
pele de voluntários, com vitamina C a 5% comparada com placebo, usada por 6
meses. Demonstraram melhora clínica, histológica e ultraestrutural significativas e,
na derme humana, o aumento da expressão do ácido ribonucleico mensageiro
(RNAm) para colágenos I e III, das enzimas relacionadas à síntese de colágeno e
dos inibidores teciduais da metaloproteinase. O estudo de Fitzpatrick e Rostan
(2002) avaliou o efeito da vitamina C a 10% comparada com o veículo na metade da
face de 10 voluntários, durante 12 semanas, demonstrando melhora clínica e
formação de colágeno no exame histopatológico, estatisticamente significativos.
Na pele humana, estão presentes muitos antioxidantes – tocoferol,
ubiquinona, glutationa, ascorbato e urato –, e alguns desses são detectáveis em
concentrações relevantes mesmo no estrato córneo. Apesar de estarem em altas
concentrações, especialmente na epiderme, se o estresse oxidativo perdurar por
longos períodos na pele, a concentração pode decair juntamente com um aumento
na formação de componentes celulares oxidados.
Um tratamento tópico prolongado com ácido ascórbico pode resultar na
ativação da síntese de fibroblastos e diminuir as cicatrizes causadas pela idade,
principalmente na região periorbital (LUPO, 2001). Como a pele é uma barreira
natural à permeação de fármacos, sugere-se intensificar esta permeação através da
iontoforese associada ao ácido ascórbico.
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
25
3 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
O presente trabalho tem caráter quantitativo experimental e será dividido em
duas partes: avaliação eletroquímica a partir de experimentos in vitro, nos quais
analisaram-se os parâmetros da voltametria cíclica e avaliação de permeação e
liberação in vitro de ácido ascórbico em sistema de difusão vertical.
3.1 Reagentes
Nos ensaios de aplicação da corrente elétrica, utilizou-se gel com
hidroxietilcelulose manipulado, com composição: Solução conservante de Nipagin®
e Nipazol®, propilenoglicol, EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) dissodico,
Natrozol, silicone volátil DC 245(ciclometicone volátil) e Germal (Imidazolidinil uréia),
associado ao princípio ativo ácido ascórbico a 5%.
3.2 Aplicação da iontoforese in vitro
O equipamento de ionização (Figura 3) foi fornecido pelo laboratório do curso
de Estética e Cosmética da Univates, e as características técnicas informadas pelo
manual do aparelho são as seguintes:
- Modelo AF5 da empresa Tone Derm;
-Utilização de cabo de alimentação (com 2 pinos) para conexão em rede
26
elétrica com tensão alternada;
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
- Seleção automática de tensão: 127 V/ 220 V ~ 60 Hertz;
- Frequência de alimentação: 60 Hz;
- Potência de entrada: 23 Volts;
- Fusíveis: 200 mA FST;
- Modo de operação: contínuo;
- Classificação: classe I - tipo BF;
- Temporizador: de 01 a 59 minutos;
Ionizador:
- Tipo de corrente galvânica pulsada;
- Forma de onda retangular;
- Frequência fixa em 600Hz;
- Intensidade da corrente ajustável de 100 a 5000 µA;
- Tensão de saída 22 V;
- Polaridade selecionável em positiva e negativa;
Na figura 4 tem –se a imagem do aparelho utilizado na pesquisa.
27
Figura 4- Aparelho utilizado para a aplicação de iontoforese, modelo AF5 da
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
empresa Tone Derm
Fonte: a autora.
Foram utilizados os seguintes parâmetros:
- Intensidade de 200 µA (calculada pela área do eletrodo que é de 0,4 cm²) e
frequência de 600 Hz;
- Eletrodos de carbono;
- Tempo de 0, 2, 5 e 10 minutos de aplicação.
3.3 Análise eletroquímica
A técnica de voltametria cíclica realizou-se com o auxílio de um potenciostato
modelo PGSTAT128N, da marca AUTOLAB/Ecochemie®, com velocidade de
varredura de 10 mV.s-1. A célula eletroquímica conteve um eletrodo de trabalho de
prata com área de 0,385 cm2, assim como um contra eletrodo de platina e um
eletrodo de referência, que será um fio de prata revestido com cloreto de prata
(Ag/AgCl) e denominado eletrodo de quase-referência (RICHTER, 2003). As
amostras analisadas constituíram-se de gel hidroxietilcelulose/ácido ascórbico 5%
com e sem aplicação de iontoforese. Para quantificar a quantidade de ácido
ascórbico presente, inicialmente construiu-se a curva de calibração, por meio da
realização de ensaios de caracterização eletroquímica, com a utilização da técnica
de voltametria cíclica, em solução tampão (pH 6,7) de ácido cítrico 0,1M e Na2HPO4
0,1M. Foram preparadas as soluções de ácido ascórbico a partir da solução tampão
28
e de ácido ascórbico SIGMA-ALDRICH em diferentes concentrações. Realizaram- se
essas análises igualmente em um potenciostato Autolab/PGSTAT 128N da
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Autolab/Eco Chemie. A velocidade de varredura utilizada nos experimentos de
voltametria cíclica foi de 10mV.s-1 e a janela eletroquímica foi de – 500 mV a + 1600
mV.
3.3 Análise da liberação do ácido ascórbico através de uma membrana de
acetato de celulose
Para tal, usou-se de membrana de acetato de celulose (0,45 µm de
porosidade) da marca Sartorius Biolab Products®, com a finalidade de separar o
compartimento doador do receptor, ou seja, formar uma barreira não interferente a
um fluido denominado receptor (MOTA et al., 2008).
Preparou-se um sistema contendo uma célula de difusão vertical na água
aquecida a 37ºC por um banho termostatizado MA-184 MARCONI, simulando a
temperatura corporal. Dentro deste, inseriu-se uma célula (150 mL) do tipo Franz
com solução receptora de água e álcool etílico 99,5% (Nuclear®) com proporção de
1:1(FDA, 1997). Em contato com esta área da membrana, adicionou-se o agente
acoplador, gel com hidroxietilcelulose + ácido ascórbico 5% (pH 3,2), sobre o qual
aplicou-se a iontoforese com eletrodos de carbono de área de 0,4 cm². Também
foram realizadas triplicatas da aplicação de iontoforese em membrana de acetato de
celulose, nos mesmos moldes e parâmetros utilizados anteriormente, porém,
separou-se a área da membrana com uma placa de vidro e a solução receptora foi
solução tampão de PBS (pH 6,6). Após, realizou-se análises de varreduras
espectrofotométricas (190 nm a 990 nm) de alíquotas retiradas da célula de difusão
para a verificação da presença do substrato na solução receptora. Os ensaios foram
através de um Espectrofotômetro Cary 100 Bio UV/Vis no comprimento de onda de
259 nm.
A figura 5 ilustra a aplicação de iontoforese in vitro realizada na pesquisa.
29
Figura 5- Aplicação da iontoforese in vitro. Na figura, 1- Aplicação da
iontoforese, eletrodos de carbono sobre o gel com hidroxietilcelulose e ácido
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ascórbico a 5%- No zoom, detalhe do posicionamento dos eletrodos. 2- banho
termostatizado a 37 ͦ C. 3-célula de difusão do tipo Franz. 4- chapa agitadora
Fonte: a autora
3.4 Análise da permeação do ácido ascórbico através da biomembrana de pele
de cobra
Para detectar a permeação in vitro do ácido ascórbico utilizou-se os mesmos
parâmetros da espectrofotometria supracitados e o mesmo sistema de difusão
vertical, porém substituiu-se o acetato de celulose por muda de pele de cobra Boa
constrictor, cedida pelo Museu de Ciências Naturais do Centro Universitário
UNIVATES, uma vez que a utilização de tecido humano para pesquisa é dificultada
pelas questões éticas envolvidas, formas de armazenagem e obtenção adequadas.
Utilizou-se a referida membrana, pois esta vem sendo sugerida como opção na
avaliação da permeação in vitro devido à facilidade de obtenção e similaridade com
o estrato córneo da pele humana (BARRY et al. 1995; DUTRA et al., 2013). É
importante mencionar que se hidratou a pele de cobra por três dias em solução
aquosa de azida sódica 0,0002% (NUNES et al., 2005).
Todos os experimentos foram repetidos nove vezes (réplicas).
30
3.5 Análise estatística
Para comparação das médias das nove replicações com e sem a aplicação de
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iontoforese, para cada um dos três períodos de tempo testados (2 min, 5 min e 10
min) e para difusão na membrana de acetato de celulose e na biomembrana de pele
de cobra foi utilizado o teste t para amostras independentes. Foi considerado
significativo p < 0,05.
3.6 Mensuração de pH
No acompanhamento deste experimento in vitro foi analisado o pH mensurado
a partir de um pHmetro do modelo 827 pH lab, da Metrohm®
3.7 Descrição do procedimento
- Preparo das amostras: Preparou-se as amostras de ácido ascórbico a
partir de gel com hidroxietilcelulose condutor manipulado com pH 5,5 e ácido
ascórbico SIGMA-ALDRICH na concentração de 5%. O pH do gel com
hidroxietilcelulose adicionado de ácido ascórbico é 3,2.
- Análise instrumental antes da aplicação da iontoforese: Avaliou-se cada
uma das amostras de aplicação da iontoforese in vitro através de voltametria cíclica,
sendo que as avaliações de liberação e permeação de ácido ascórbico obtiveram-se
através de espectrofotometria UV/Vis.
- Terapia por iontoforese: Aplicou-se a técnica de iontoforese em cada uma
das amostras, na seguinte modulação: frequência de 600 Hz, intensidade 200 µA
(calculada pela área do eletrodo de 0,4 cm²) e tempos de 0, 2, 5 e 10 min de
aplicação.
- Resultados: Analisou-se comparativamente os resultados a partir das
análises instrumentais. É importante referir que todas as análises foram realizadas
nove vezes (réplicas).
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31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Discussão dos resultados obtidos
4.1.1 Análise do ácido ascórbico
Inicialmente, foram realizados ensaios de voltametria cíclica das soluções de
ácido ascórbico/tampão ácido cítrico-Na2HPO4 em diferentes concentrações, sendo
os potenciais analisados em relação ao eletrodo de prata/cloreto de prata, para
posterior construção de curva de calibração e determinação das concentrações de
ácido ascórbico envolvidas nos sistemas estudados. Na Figura 6 tem-se a curva de
calibração do ácido ascórbico em diferentes concentrações y= a + bx, onde a= 9E-5
e b= 0,005, R= 0,9730.
Figura 6- Curva de calibração do ácido ascórbico para potenciais de 0,45 V por
voltametria cíclica.
Fonte: a autora.
32
4.1.2 Análise da voltametria cíclica do ácido ascórbico em meio gel com
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hidroxietilcelulose
Após a construção da curva de calibração, realizou-se ensaios de voltametria
cíclica, do sistema gel hidroxietilcelulose/ácido ascórbico 5%, com e sem aplicação
da iontoforese.
Nas Figuras 7 e 8, tem-se o voltamograma cíclico característico do gel de
hidroxietilceluose e deste após adição de ácido ascórbico 5%.
Figura
7-
Voltametria
cíclica
de
prata
em
sistema
contendo
gel
com
hidroxietilcelulose v= 10mV.s-1
Fonte: a autora.
O gel de hidroxietilcelulose é um polímero solúvel não iônico derivado da
celulose. Este pode ser usado em muitas aplicações biotecnológicas, biofísicas e
industriais devido à sua biocompatibilidade e baixa toxicidade (LIU, 2006).
Na Figura 7, pode-se perceber que o gel com hidroxietilcelulose possui um
comportamento eletroquímico ativo apresentando pico característico na região de 0,15 V, este comportamento eletroquímico é explicado devido à presença do
33
principal composto do gel de hidroetilcelulose utilizado, o germal (Imidazolidinil
uréia), que é um antifúngico (UPADHYAY; YEGNARAMAN, 2000). Quando a este
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sistema é adicionado ácido ascórbico, este pico não é mais observado, e o
comportamento eletroquímico do ácido ascórbico passa a ser observado (Figura 8),
com picos de redução em regiões de 0,10 V (SHAKKTHIVEL; CHEN, 2007).
Portanto, o gel com hidroxietilcelulose mantém a sua conformação proporcionando
um meio que pode beneficiar a transferência de elétrons do ácido ascórbico sem
interferir no seu comportamento eletroquímico, não comprometendo a sua análise
pela voltametria.
Figura 8- Voltametria cíclica da prata no sistema gel hidroxietilcelulose com ácido
ascórbico 5%. v= 10mV.s-1
Fonte: a autora
Na Figura 9 é apresentada a sobreposição dos voltamogramas da prata nos
sistema gel hidroxietilcelulose sem a aplicação de iontoforese e com a aplicação de
iontoforese nos tempos 0, 2, 5 e 10 minutos.
Figura 9- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel
hidroxietilcelulose sem a aplicação de iontoforese (linha) e após a aplicação de
iontoforese por 2 (linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada
+pontilhada), v= 10mV.s-1
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
34
Fonte: a autora
Avaliando a Figura 8, verifica-se que em diferentes tempos de aplicação de
iontoforese, o pico característico do gel de hidroxietilcelulose permanece presente,
com pequenos deslocamentos no potencial de pico, podendo indicar processos
adsortivos no sistema estudado.
Na Figura 10 é apresentada a sobreposição dos voltamogramas da prata nos
sistema gel hidroxietilcelulose associado ao ácido ascórbico sem a aplicação de
iontoforese e com a aplicação de iontoforese nos tempos 0, 2, 5 e 10 minutos.
Figura 10- Sobreposição da voltametria cíclica da prata no sistema gel
hidroxietilcelulose com ácido ascórbico 5% (linha contínua) após a aplicação de
iontoforese por 2 ( linha tracejada), 5 (linha pontilhada) e 10 minutos (linha tracejada
e pontilhada). No detalhe os picos característicos encontrados na pesquisa, v=
10mV.s-1
35
2 min.
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
5 min.
controle
10 min.
Fonte: a autora
Observando se os voltamogramas da Figura 10 verifica-se que nos tempos 2
e 5 minutos há o pico de redução em 0,10 V (SHAKKTTHIVEL, 2007) indicando a
presença do ativo ácido ascórbico, sendo este dependente das condições
experimentais, verifica-se que o ácido ascórbico oxida parcialmente, envolvendo
uma etapa de somente um elétron, sendo possível desta forma sua redução, e
retorno à molécula de ácido ascórbico (KAMYABI; SHAFIEE, 2012). Já no tempo de
10 minutos de aplicação da iontoforese os picos característicos não são mais
observados, demonstrando que o ativo ácido ascórbico não pôde ser detectado
através da avaliação eletroquímica, estando provavelmente oxidado na forma de
ácido deidroascórbico.
Ao observar os voltamogramas pode-se perceber também um aumento de
corrente nas regiões de potencial mais alto (acima de 0,3V). Estes picos são
observados quando há presença de espécies orgânicas, como o ácido ascórbico
(MALPASS; MONTEO, 2008). Este aumento de intensidade de corrente pode ser
associado à reação de evolução de oxigênio, e este incremento aparece nos
voltamogramas ao aplicar a iontoforese por 2 e 5 minutos, já no tempo de 10
minutos este fenômeno não é mais observado, indicando a degradação do ácido
ascórbico.
A degradação do ativo provavelmente está relacionada às características
físicas da corrente contínua utilizada na técnica de permeação transdérmica.
Segundo Borges (2006), a corrente contínua caracteriza-se por um fluxo
36
unidirecional e ininterrupto de partículas carregadas. Esse tráfego da corrente
elétrica através de íons contidos nos líquidos produz calor por efeito Joule. Sua
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intensidade tem relação direta com a resistência específica do meio utilizado. Jadoul
et al. (1999) corroboram essa ideia afirmando que o efeito Joule ocorre inicialmente
no estrato córneo. O aumento de temperatura que ocorre neste local durante a
iontoforese pode de ser estimado. Segundo Prausnitz (1996), uma corrente de baixa
voltagem (1 V) por 1 minuto através da pele pode gerar um aumento de temperatura
de 0,14º C. É importante ressaltar que esses modelos citados converteram em calor
a energia dissipada e podem superestimar o calor obtido através da iontoforese. Os
mesmos autores ainda afirmam que o calor gerado pela iontoforese é mínimo.
O calor gerado pela iontoforese contribui para a desorganização do estrato
córneo, proporcionando um aumento de permeabilidade do mesmo. Guirro (2002)
afirma que, em todas as aplicações de correntes polarizadas, produz-se uma
vasodilatação sob os eletrodos, a qual é acompanhada pelo aumento da
temperatura. Todas as reações químicas liberam energia e aumentam a temperatura
local. Na vizinhança de ambos os eletrodos, produz-se uma vasodilatação ativa,
sendo mais pronunciada no polo negativo. Esta hiperemia galvânica é um efeito
vasomotor que não se restringe somente à pele, mas penetra nos estratos abaixo
dela (subcutâneo, fáscia e músculos superficiais). Melhorando a irrigação
sanguínea, observa-se uma elevação de temperatura de 2 a 3ºC (GUIRRO, 2002). A
citação acima corrobora a temperatura mensurada durante os ensaios de aplicação
de iontoforese, sendo que a média de aumento de temperatura foi de 2ºC.
Outra explicação para a degradação do ativo pela iontoforese é a eletrólise.
Segundo Borges (2006), quando a corrente contínua é aplicada sobre a superfície
corporal, íons positivos (cátions) e íons negativos (ânions) que estão dissolvidos nos
fluidos corporais são movimentados, de acordo com sua polaridade, em direção à
região subcutânea, próxima à colocação dos eletrodos na superfície da pele. Isso é
chamado de dissociação eletrolítica ou eletrólise. Os ânions seguem em direção ao
polo positivo (ânodo) e os cátions em direção ao polo negativo (cátodo). Esse
movimento é chamado eletroforese e é o princípio da iontoforese.
Robinson (2001) afirma que, após a concentração de íons, ocorrerá reação
química específica sob cada eletrodo em meio aquoso, com formação de ácidos no
37
ânodo (liberação de oxigênio) e bases no cátodo (liberação de hidrogênio).
Outro aspecto a ser considerado é que a diminuição de concentração de
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ácido ascórbico pode também ser justificada pela difusão do mesmo através da
membrana de acetato de celulose, já que os experimentos foram realizados sobre a
célula de difusão e posteriormente coletou-se o gel para a análise eletroquímica.
4.3 Análises espectrofotométricas
4.3.1 Análise de liberação do ácido ascórbico
Primeiramente foram construídas curvas de calibração para posterior aplicação
da iontoforese. As curvas de calibração foram construídas no intervalo de
concentração de 7,812 x 10-6 a 1,25 x 10-4%.
Através da equação da reta gerada no gráfico de absorbância, y= -0,00174 +
1447,09603x R= 0,9983 pode-se calcular a concentração obtida de ácido ascórbico
liberada para o meio.
Figura 11- Curva de calibração para a concentração de ácido ascórbico.
Fonte: a autora
Pode-se observar na Figura 11 que a absorbância aumenta à medida que
aumenta a concentração do ativo ácido ascórbico.
38
Os gráficos foram obtidos a partir da análise da absorbância das diferentes
amostras de gel com hidroxietilcelulose e gel com hidroxietilcelulose associado ao
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ácido ascórbico 5%, com e sem a aplicação da iontoforese em diferentes tempos,
sendo estes 2, 5 e 10 minutos. Nos ensaios de liberação com membrana de acetato
de celulose, através de varredura na faixa espectral (190-900 nm) foram
considerados os valores próximos a 250 nm como a região de absorbância máxima,
conforme se pode ver nas Figuras 12 e 13.
Figura 12- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico
5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de acetato de celulose, sem a aplicação de iontoforese in vitro
Fonte: a autora.
Figura 13- Liberação do ácido ascórbico nos tempos de 0, 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de acetato de celulose sem a aplicação de iontoforese in vitro.
Fonte: a autora
Através da curva de fluxo de liberação do ácido ascórbico em função do
tempo na membrana de acetato de celulose (Figura 12), obteve-se a equação da
reta y= a + bx, onde, a= 0,22449, b= 13,70422, R= 0,9615.
39
Na Figura 14 são apresentados os valores de absorbância da aplicação de
iontoforese in vitro nos tempos 2, 5 e 10 minutos.
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Figura 14- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico
5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de acetato de celulose, com aplicação de iontoforese in vitro
Fonte: a autora.
Figura 15- Liberação do ácido ascórbico em membrana de acetato de celulose com
a aplicação de iontoforese in vitro
Fonte: a autora
Através da curva de concentração de ácido ascórbico através da membrana
de acetato de celulose com a aplicação de iontoforese (Figura 15), obteve-se a
equação da reta y = a + bx, onde a= 0,25561, b= 16,20613; R= 0,9434
40
Considerando a difusão na membrana de acetato de celulose, para o tempo
de 2 minutos, não foi encontrada diferença significativa entre a utilização e não
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utilização de iontoforese (t = 0,7388, p = 0,4788). Para o tempo de 5 minutos e 10
minutos,
as
médias
de
liberação
com
aplicação
de
iontoforese
foram
significativamente superiores que sem utilização de iontoforese (t = -2,5544, p =
0,0267) e (t = -2,7816, p = 0,0155), respectivamente.
Ebihara et al. (2003) analisaram a permeação do ácido ascórbico em ratos,
porém sua análise de presença de ácido ascórbico foi realizada por carbono 14,
verificando a meia-vida do ácido ascórbico após a aplicação da iontoforese. O
resultado obtido pelos autores foi de um incremento significativo da presença de
ácido ascórbico na circulação sanguínea e diminuição do mesmo na derme.
Na tabela 1, são apresentados os valores de ácido ascórbico liberado nos
tempos 2, 5 e 10 minutos in vitro em termos de concentração.
Tabela 1- Concentração do ácido ascórbico liberado membrana de acetato de
celulose in vitro
Tempo (minutos)
2
Concentração sem a aplicação
5
10
7,51
13,14
33,14
10,98
13,90
39,54
-5
de iontoforese (10 %)
Concentração com a aplicação
-5
de iontoforese (10 %)
Fonte: a autora
Comparando-se os valores obtidos no tempo de 2 minutos, a liberação foi
46,20 % maior quando da aplicação de iontoforese. Já no tempo de 5 minutos foi
5,78 % maior e no tempo de 10 minutos foi 19,31 % maior em termos de liberação
do ativo.
Um estudo realizado por Tomoda et al. (2011) afirma que a utilização
combinada de fármaco cumarina 6 em forma de nanopartículas e iontoforese pode
oferecer muitos benefícios, já que houve um aumento significativo de permeação
quando comparado à difusão passiva.
A vitamina C, é uma substância hidrossolúvel. Alguns autores concordam que
41
drogas hidrofílicas permeiam mais em regiões hidrofílicas, que contém poros
pequenos, favorecendo as substâncias com massa molecular menos que 300 g/mol,
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como é o caso do ácido ascórbico (massa molecular 176 g/mol). Na presença de
baixas correntes são criadas novas vias de permeação, e as moléculas da
substância percorrem um novo caminho, com poros maiores (MANABE et al., 2000;
FIALHO; CUNHA, 2004; ROZMAN et al., 2009).
4.3.2 Análise da permeação do ácido ascórbico
Nas Figuras 16, 17, 18 e 19 tem se a permeação do ácido ascórbico sobre
biomembrana de pele de cobra sem e com aplicação de iontoforese in vitro.
Na avaliação destes ensaios foram considerados somente duplicata de
resultados, em função da variabilidade da biomembrana e pelo fato de estar no limite
de quantificação da técnica de detecção utilizada.
Figura 16- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de permeação do ácido
ascórbico 5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10
minutos sobre membrana de pele de cobra, sem a aplicação de iontoforese in vitro
Fonte: a autora
Figura 17- Permeação do ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra sem a
aplicação de iontoforese in vitro
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
42
Fonte: a autora
Através da curva de concentração da quantidade permeada através da
biomembrana de pele de cobra, obteve se a equação da reta y= a + bx onde, a=
005779 e b= 1,46718 , R= 0,9836.
Figura 18- Varredura espectrofotométrica dos ensaios de difusão do ácido ascórbico
5% associado a gel com hidroxietilcelulose nos tempos de 2, 5 e 10 minutos sobre
membrana de pele de cobra, com aplicação de iontoforese in vitro
Fonte: a autora
Figura 19- Permeação de ácido ascórbico em biomembrana de pele de cobra com a
aplicação de iontoforese in vitro
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
43
Fonte: a autora
Através da curva de fluxo da permeação do ácido ascórbico em biomembrana
de pele de cobra, com a aplicação de iontoforese em função do tempo obteve se a
equação da reta y= a + bx, onde a= 0,0997 e b= 2,27368 e R= 0,9349.
Na tabela 2 são apresentados os valores obtidos em termos de concentração
de ácido ascórbico permeado na biomembrana de pele de cobra in vitro nos tempos
2, 5 e 10 minutos.
Tabela 2- Concentração do ácido ascórbico permeado membrana de pele de cobra
Tempo (minutos)
2
Concentração sem a aplicação
5
10
8,87
23,75
33,94
24,40
33,55
43,85
-6
de iontoforese (10 %)
Concentração com a aplicação
-6
de iontoforese (10 %)
Comparando-se os valores obtidos no tempo de 2 minutos, a liberação foi
175,08 % maior quando da aplicação de iontoforese. Já no tempo de 5 minutos foi
41,26% maior e no tempo de 10 minutos foi 29,19 % maior em termos de liberação
do ativo.
Del Rio-Sancho et al. (2012) avaliaram o fluxo transdérmico do cloridrato de
memantina, bem como sua permeação através de membrana de orelha de suíno,
utilizando a célula de difusão vertical de Franz, e afirmam que a quantidade de
fármaco retida aumenta logaritmicamente à medida que aumenta o fluxo
transdérmico da substância. A importância desse achado é justificada, pois o efeito
44
reservatório poderia levar a uma acumulação do fármaco no estrato córneo quando
aplicado topicamente sem a presença da iontoforese. No caso do ácido ascórbico, a
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aplicação e permanência tópica do ativo é desejado, uma vez que este possui ação
clareadora de manchas, atuando na melanina presente na epiderme cutânea.
Pinnel et al. (2002) ainda afirmam que a aplicação diária de ácido L-ascórbico
tópico a 15% formulado em pH 3,2, após três dias, atingiu nível 20 vezes maior de
saturação no tecido aplicado (pele de suíno) do que no controle (pele de suíno sem
aplicação). Após a saturação do reservatório da pele, o ácido L-ascórbico mantevese estável e presente no tecido com meia-vida de aproximadamente quatro dias. O
pH do ácido ascórbico associado ao gel de hidroxietilcelulose foi mensurado e este
ficou em 3,2. Gallarte et al. (1999) realizaram experimentos de solução de ácido
ascórbico em diferentes valores de pH e observaram que os valores de pH em torno
de 3,0 são mais estáveis e apresentam uma menor degradação quando comparados
aos valores de pH 4,0; 5,0 e 7,0.
4.3.3. Liberação passiva versus liberação sem a comunicação dos eletrodos na
superfície da membrana de acetato de celulose
Também realizou- se triplicatas da aplicação de iontoforese em membrana de
acetato de celulose, nos mesmos moldes e parâmetros utilizados anteriormente,
porém, separou-se a área da membrana com uma placa de vidro, como
demonstrado na Figura 20, impedindo o fluxo de corrente elétrica superficial e
incentivando que o fluxo de corrente acontecesse pela solução receptora de PBS
(pH 6,6) (SILVA et al., 2012).
45
Figura 20- Detalhe da aplicação de iontoforese com a célula dividida por placa de
vidro isolando os eletrodos de forma que a comunicação ocorra através da solução
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receptora.
Fonte: a autora
Nas análises realizadas verificou-se menores valores de absorbância em
comparação à liberação em experimentos com célula de difusão convencional, não
sendo possível a quantificação, porém a partir destes valores pode-se inferir que
menores quantidades de ácido ascórbico foram difundidas pelo sistema.
Através dos dados obtidos, pode se perceber que na presença de íons
competitivos na solução receptora, houve uma diminuição de fluxo. Rim e Rasadi
(1986) observaram o mesmo em relação ao fluxo de benzoato. Estes citam que o
fluxo de benzoato aumentou com maiores concentrações do ativo e houve uma
queda no fluxo com a adição de íons competitivos. Portanto o fluxo da substância
utilizada pode ser maximizado evitando a utilização de substâncias iônicas no
compartimento doador em um sistema de permeação e liberação por iontoforese. Os
autores ainda enfatizam que a utilização de concentrações maiores de ativo pode
significar altos custos na produção de produtos ou solubilidade limitada, enquanto
que concentrações baixas do ativo não comprometem a liberação da substância, de
acordo com os resultados encontrados.
A utilização de uma solução receptora água/álcool 1:1(FDA, 1997), possibilita
a influência somente da corrente elétrica na resistência da membrana, já que a
resistência da pele diminui à medida que a concentração de sais aumenta na
solução receptora. Porém, em experimentos in vitro em uma voltagem constante, a
diminuição da resistência da membrana promove posteriormente um aumento da
46
densidade da corrente com conseqüente aumento de fluxo do soluto, no entanto, o
aumento da densidade da corrente em humanos pode gerar queimaduras cutâneas.
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Outro aspecto que deve ser levado em consideração é que a aplicação de corrente
elétrica constante gerará uma menor diferença de potencial através da pele, o que
reduz a condução do campo elétrico gerado. Ainda é preciso citar a competição de
íons entre o soluto e a solução receptora, à medida que a concentração da solução
receptora aumenta, o fluxo total de soluto diminui (LIN et al., 1997).
4.3.4. Considerações finais: degradação, fluxo, liberação versus permeação.
A partir das curvas apresentadas foi possível realizar a análise do fluxo de
difusão pela área da membrana de acetato de celulose utilizada. O fluxo de ácido
ascórbico através da membrana de acetato de celulose aumentou em função do
tempo com a aplicação de iontoforese. Estes resultados corroboram a literatura, na
qual se percebe o incremento da liberação de ativos à medida que aumenta o tempo
de exposição da corrente.
Através dos cálculos obtidos com a construção da equação da reta dos gráficos
de liberação, fez-se análise estatística a partir do teste t e pode-se afirmar que o
fluxo de ácido ascórbico através da membrana de acetato de celulose sem a
aplicação de iontoforese foi de J= 5,159 ± 0,2831 µmol L-1. cm-². h-1 e com a
aplicação da iontoforese o fluxo de ácido ascórbico aumentou para J= 16,71 ±
0,08779 µmol. L-1. cm-². h-1, estatisticamente significativo para p< 0,05. É possível
inferir que a velocidade de liberação do ácido ascórbico foi aumentada com a
aplicação de iontoforese através da membrana de acetato de celulose. Pode-se
verificar o aumento na Figura 21.
Já para sistemas com biomembrana de pele de cobra, que simulam o estrato
córneo humano, o fluxo obtido, para sistemas com e sem aplicação de iontoforese
foi de J= 2,27363 µmol. L-1. cm-². h-1 e 2,67576 µmol. L-1. cm-². h-1, respectivamente
(Figura 22). Avaliando os resultados obtidos verifica-se que, para as condições
testadas, não há diferença de fluxo de permeação para sistemas com e sem
iontoforese. Ou ainda pode-se dizer que a velocidade de permeação não aumentou
frente a aplicação de iontoforese através da biomembrana de muda de pele de
47
cobra.
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Figura 21- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com
hidroxietilcelulose através da membrana de acetato de celulose, sem e com
aplicação de iontoforese in vitro
Fonte : a autora
Figura 22- Gráfico comparativo do fluxo de ácido ascórbico 5% associado a gel com
hidroxietilcelulose através da biomembrana de pele de cobra, sem e com aplicação
de iontoforese in vitro
Fonte: a autora
A concentração da droga e seu impacto no fluxo iontoforético é um parâmetro
bastante estudado e discutido. Um simples aumento na quantidade de droga na
48
formulação, não necessariamente aumenta o número de moléculas transportadas na
membrana; as propriedades físico- químicas da droga podem afetar a capacidade da
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molécula de interagir com as estruturas dos tecidos durante o transporte
iontoforético. As formas de sais das drogas são preferíveis para o transporte de
iontoforese devido à alta densidade de carga e solubilidade (FIALHO; CUNHA,
2004).
Comparando estes resultados com estudos prévios publicados (KOGAN;
GARTI, 2006), verifica-se que em estudos associando iontoforese e ácido ascórbico,
em pele de ratos, somente 0,3% do princípio ativo estudado permeou, em
associação à iontoforese, sendo que neste estudo os parâmetros estudados foram
10 V por 20 segundos e avaliação da quantidade de ácido ascórbico após 4 horas
(EBIHARA, et al.). Ainda cabe mencionar que a pele dos ratos possui pouca
similaridade com a pele humana (GALLARTE, 1999), justificando o presente estudo
onde a biomembrana de pele de cobra simula com maiores detalhes o estrato
córneo humano (DUTRA et al., 2013). Já em outro trabalho publicado, onde o
princípio ativo estudado foi o fosfato ascorbil- sódico, que devido as suas alterações
estruturais, apresenta maior estabilidade em comparação ao ácido ascórbico
(CHORILLI, 2009), para o tempo de aplicação de 30 minutos, aproximadamente 10%
do princípio ativo foi difundido, em membranas celulósicas hidrofílicas (SPICLIN,
2003).
Li et al. (2005) afirmam que a iontoforese aumenta o transporte de fármacos
através das membranas por dois mecanismos, basicamente: eletroforese e
eletrosmose. Eletroforese é a facilitação do movimento de espécies iônicas através
da aplicação do campo elétrico. Eletrosmose auxilia o transporte de espécies
neutras ou carregadas eletricamente através do fluxo gerado pelo campo elétrico e o
solvente.
Em relação à permeação gerada pela iontoforese, diversos fatores podem
influenciar o mecanismo de transporte de substâncias por essa aplicação, entre eles
destacam-se a estrutura do fármaco (peso molecular), o comportamento dos íons do
soluto em solução, incluindo a condutividade, a resistência do transporte do íon
através do tecido, a composição dos veículos utilizados, e a influência de outros íons
presentes no processo de transporte (FIALHO; CUNHA, 2004).
49
De acordo com Li et al. (2004), a permeação aumentada através da corrente
elétrica dependerá do campo elétrico gerado e da duração da aplicação da
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iontoforese. Essa afirmação corrobora os achados no estudo, pois, à medida que
aumentou o tempo de aplicação da iontoforese, aumentou a liberação de ácido
ascórbico para o meio receptor.
Pode-se citar, por exemplo, que a aplicação da corrente elétrica ocasionou
uma queda na resistência da pele. Na pesquisa realizada por OH et al. (1995), a
mudança ocorreu em todas as aplicações realizadas, inclusive, nos 10 primeiros
segundos do início do fluxo de corrente, o que seria uma justificativa para o
comportamento do ativo ácido ascórbico após a aplicação da iontoforese.
Molokhia et al.(2007), relatam em seus estudos que é possível que haja uma
maior permeação através da membrana com uma maior densidade de corrente
elétrica. Porém, relatam que não houve diferença significativa na profundidade de
permeação com a utilização de 2 e 4 mA. Os mesmos autores sugerem que o tempo
de exposição à corrente elétrica também aumenta a permeação das substâncias
pesquisadas e sugerem um tempo de 20 a 60 minutos de aplicação, contudo, o
ácido ascórbico apresentou tendência à degradação em um período de tempo de 10
minutos, no presente estudo, por avaliação eletroquímica.
O estrato córneo submetido à iontoforese tem a sua hidratação aumentada.
Alguns autores relatam que há uma diminuição na resistência da pele com a
hidratação, sua condutância é aumentada e o fluxo de íons aumenta linearmente
pela hidratação. Assim, a sua resistência à passagem da corrente diminui. Correntes
de baixa frequência geram uma desestabilização do estrato córneo apenas no local
onde são aplicadas (JADOUL et al., 1999; EBIHARA et al., 2003). Djabri et al. (2012)
confirmam que a utilização de mecanismos de corrente elétrica de baixa intensidade
para a transferência transdermal de fármacos é eficaz, uma vez que a liberação
ocorre de forma gradual e sem desconforto para o paciente.
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50
CONCLUSÃO
Resultados deste estudo corroboram o que a literatura apresenta, uma vez
que o fluxo de liberação do ativo ácido ascórbico ocorreu de forma progressiva,
conforme o aumento de tempo de exposição à corrente elétrica gerada pela
iontoforese.
Sugere-se que a aplicação de corrente elétrica de baixa potência tem a
capacidade de oxidar o princípio ativo ácido ascórbico em meio com gel
hidroxietilcelulose
em
tempos
maiores
que
5
minutos,
demonstrado
nos
voltamogramas apresentados.
Sabendo-se que houve uma degradação dos sistemas estudados, após a
aplicação da técnica de iontoforese por 10 min, torna-se fundamental o
conhecimento aprofundado de seus efeitos ao interagir com tecidos, uma vez que a
acorrente elétrica sobre o princípio ativo pode causar uma alteração da estrutura
molecular e assim, a ação clareadora de manchas e ativadora dos fibroblastos, do
ativo estudado, já comprovado, pode não mais existir.
Outro fator importante a ser analisado é a permeação e liberação do princípio
ativo que pôde ser observado nos valores de absorbância apresentando variação de
acordo com a membrana utilizada. Assim, a aplicação da iontoforese é uma
facilitadora da permeação e liberação do princípio ativo ácido ascórbico.
Quanto ao fluxo de ácido ascórbico pode-se perceber que a corrente elétrica
de baixa potência, tem a capacidade de acelerar o fluxo do princípio ativo ácido
ascórbico em membrana de acetato de celulose, com tendência a um aumento de
51
permeação, porém sugere-se a continuidade de estudos envolvendo outras
membranas, que apresentem uma similaridade ainda maior com a pele humana,
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aliado a técnicas analíticas mais sensíveis para aprimorar os estudos de permeação
deste princípio ativo.
Ainda para trabalhos futuros, sugere-se:
Avaliar a permanência da atividade antioxidante do ácido ascórbico após
exposição à iontoforese;
Avaliar a ação nos tecidos da estrutura molecular resultante após à exposição
à iontoforese.
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52
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