UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DULCE HELENA REBOUÇAS DE SOUZA ESTUDO SOROEPIDEMIOLÓGICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS - 1 EM MULHERES PROFISSIONAIS DO SEXO EM GOIÂNIA - GOIÁS Orientadora Profa. Dra. Megmar Aparecida dos Santos Carneiro Co-Orientadora Profa. Dra. Sheila Araújo Teles Dissertação de Mestrado Goiânia-GO 2012 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DULCE HELENA REBOUÇAS DE SOUZA ESTUDO SOROEPIDEMIOLÓGICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS - 1 EM MULHERES PROFISSIONAIS DO SEXO EM GOIÂNIA - GOIÁS Orientadora Profa. Dra. Megmar Aparecida dos Santos Carneiro Co-Orientadora Profa. Dra. Sheila Araújo Teles Dissertação submetida ao PPGMTSP/UFG, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre em Medicina Tropical, na área de concentração em Microbiologia. Goiânia-GO 2012 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) GPT/BC/UFG S729e Souza, Dulce Helena Rebouças de. Estudo soroepidemiológico da infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas – 1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia - Goiás [manuscrito] / Dulce Helena Rebouças de Souza. - 2012. xv, 82 f. : il., figs., tabs. Orientadora: Profª. Drª. Megmar Aparecida dos Santos Carneiro; Coorientadora: Profª. Drª. Sheila Araújo Teles. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2012. Bibliografia. Inclui lista de figuras, tabelas e quadros. 1. Vírus linfotrópico (HTLV-1) – Epidemiologia. 2. Vírus linfotrópico (HTLV-1) – Mulheres - Profissionais do sexo – Goiânia (GO). I. Título. CDU: 616.155:578.828 III DEDICATÓRIA A Deus, que sustentou meus sonhos e minha energia emocional para a concretização desta etapa; À minha querida mãe, ao meu padrasto e ao meu irmão, Santana, Bartolomeu e Waldemar, que sempre acreditaram em mim. Alicerces da minha formação que já me consideravam mestre na vida; Ao meu namorado, Cleuber, pelo incentivo, pelo apoio e pela paciência que teve comigo nestes anos de estudo. IV AGRADECIMENTOS Agradecer é sensação de dever cumprido, melhor ainda é perceber que tenho muito e muitos a agradecer. Em especial, agradeço: A Deus, por ter me dado a oportunidade de desenvolver esse trabalho. Nele busquei força e coragem para continuar lutando apesar das dificuldades. À minha orientadora Professora Doutora Megmar Aparecida dos Santos Carneiro, não só pelos ensinamentos, críticas e sugestões, mas também pela amizade, dedicação, incentivo e confiança que me fez crescer não só cientificamente, mas também contribuindo com minha formação pessoal. À minha co-orientadora Professora Doutora Sheila Araújo Teles, a quem aprendi a admirar pelo exemplo de vida acadêmica, dedicação, competência e humanismo. À Professora Doutora Márcia Alves Dias de Matos, pela disponibilidade em ajudar a todos do laboratório, compartilhando seus conhecimentos. À Professora Doutora Regina Maria Bringel Martins, que gentilmente abriu às portas de seu laboratório dando-me a oportunidade de fazer parte de sua equipe e possibilitanto a execução deste trabalho. À Professora Doutora Carmen Luci Rodrigues Lopes, pelo apoio e pelas palavras de incentivo. Ao Professor Mestre Marcos André de Matos, pelos longos meses de coleta, conversas e orientações profissionais. Aos amigos do Laboratório Profª Margarida DoblerKomma (IPTSP/UFG), pelos ensinamentos e conselhos que foram transmitidos com tanto carinho. Obrigada a todos! V Às companheiras de projeto Divânia, Karlla e Luciene, obrigada por tornar tão divertida e gratificante as manhãs, tardes e noites de coletas. Ao NUCLAIDS e ao NECAIH, pelas reuniões e pela colaboração em tudo que era necessário para a realização do projeto. À minha amiga, irmã, mãe Sueli Meira, pelas palavras certas, nos momentos certos, que não fizeram com que desistisse de um grande sonho. Amo você!!! Às minhas eternas amigas e companheiras Ana Carolina e Pollyanne, pela amizade, pelos momentos de desabafo, pelas horas no telefone, pelo companherismo desde a época de faculdade. À minha irmã de coração que ganhei no mestrado, Mestre Nativa Helena Alves DelRios, pelas horas no sábado que disponibilizou para me ajudar, pelo apoio e também pelos momentos de desabafos. À minha irmã caçula, Lyriane, pelas horas de feriado disponibilizadas para conferir referências. Obrigada amore! Aos companheiros do Laboratório de Virologia do IPTSP/UFG, Ágabo, Aline, Andréia, Kamilla, Lyriane, Ludimila, Marina, Nádia, Nativa, Matheus, Pollyanne, Tamíris, Thaís e Tássia, por ter me acolhido e me dado suporte quando precisei. Pelo importante auxílio na realização dos testes sorológicos e moleculares. Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, pelo auxílio prestado ao longo desses dois anos. Aos professores da Microbiologia e funcionários do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, pela convivência e auxílios. VI À minha família (tios, tias e primos), pelas palavras de incentivo. À minha queria mãe, por ser minha melhor amiga e me aguentar durante todos os momentos de desespero, tendo sempre uma palavra amiga para me confortar. Mãe te amo e obrigada por tudo! Ao meu padrasto, ao meu irmão e minha cunhada, Bartolomeu, Waldemar e Gleycyara, pelas palavras de incentivo e pelos momentos de descontração. Ao meu namorado Cleuber, por ter suportado com muita paciência todos os momentos de stress. Às minhas amigas Glaucya e Kelvea, pelos momentos de descontração, pela paciência e companherismo. Obrigada por ter me apoiado e terem feito parte desse momento. Aos amigos da Agência Municipal do Meio Ambiente (AMMA), pelo apoio, por não importarem com tantas saídas antes do final do expediente, por ajudarem com os processos atrasados e por sempre estarem ao meu lado. À Doutora Ana Carolina Paula Vicente e à Mestre Koko Otsuki, do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ - RJ), pelo apoio com os testes moleculares. À banca do exame de qualificação, composta pelas professoras, Dra. Fabíola Souza Fiaccadori, Dra. Márcia Alves Dias de Matos e Dra. Regina Maria Bringel Martins, pelas críticas construtivas e valiosas sugestões. Às mulheres profissionais do sexo de Goiânia-GO, pelas contribuições nos estudos. Obrigada pelas experiências e expectativas compartilhadas. Enfim, a todos que contribuíram de forma direta ou indireta na realização deste trabalho. VII “Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já têm a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos que nos levam sempre aos mesmos lugares. É tempo da travessia e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós mesmos.” (Fernando Pessoa) VIII SUMÁRIO ÍNDICE DE FIGURAS....................................................................................................... X ÍNDICE DE TABELAS...................................................................................................... XI ÍNDICE DE QUADROS..................................................................................................... XII RESUMO............................................................................................................................. XIII SUMMARY.......................................................................................................................... XIV 1. INTRODUÇÃO................................................................................................................ 1 1.1. Breve Histórico ........................................................................................ 1 1.2. Características Biológicas do Vírus Linfotrópico de Células T Humanas ............ 2 1.2.1. Classificação ................................................................................... 2 1.2.2. Estrutura do HTLV-1 ........................................................................ 2 1.2.3. Organização Genômica e Proteínas do HTLV-1 ..................................... 4 1.2.4. Replicação do HTLV-1...................................................................... 6 1.2.5. Variabilidade Genética e Origem do HTLV-1........................................ 7 1.3. Epidemiologia da Infecção pelo HTLV-1 ...................................................... 9 1.3.1. Transmissão .................................................................................... 9 1.3.2. Prevalência da Infecção pelo HTLV-1 .................................................. 11 1.3.3. Distribuição dos Subtipos .................................................................. 13 1.4. Aspectos Clínicos da Infecção pelo HTLV-1 ................................................. 14 1.5. Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo HTLV-1 ........................................ 16 1.6. Prevenção e Controle da Infecção pelo HTLV-1 ............................................ 18 1.7. Profissionais do Sexo e a Infecção pelo HTLV-1 ........................................... 20 1.8. Justificativa ............................................................................................. 23 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 24 2.1. Objetivo Geral .............................................................................................. 24 2.2. Objetivos Específicos ................................................................................... 24 3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 25 3.1. Natureza, Local de Estudo, População-Alvo e Amostra ................................ 25 3.2. Coletas de dados ........................................................................................... 25 3.2.1. Respondent-Driven Sampling e Profissionais do Sexo ............................ 25 3.3. Testes Sorológicos ......................................................................................... 29 IX 3.3.1. Ensaio de Triagem .............................................................................................. 29 3.3.2. Ensaio Confirmatório ......................................................................................... 30 3.4. Testes Moleculares ................................................................................................... 31 3.4.1. Extração do DNA ............................................................................................... 31 3.4.2. Nested-PCR ........................................................................................................ 32 3.4.3. Eletroforese em Gel de Agarose ......................................................................... 34 3.4.4. Purificação do DNA ........................................................................................... 34 3.4.5. Sequenciamento e Análise Filogenética ............................................................. 35 3.5. Processamento e Análise de Dados .......................................................................... 36 4. RESULTADOS ............................................................................................................... 37 4.1. Distribuição Espacial dos Pontos de Prostituição das Mulheres Profissionais do Sexo em Goiânia-GO ................................................................................ 37 4.2. Características Sociodemográficas das Mulheres Profissionais do Sexo ........ 38 4.3. Características Laborais das Mulheres Profissionais do Sexo ................................. 40 4.4. Características de Risco para a Infecção pelo HTLV-1 Relatadas pelas Mulheres Profissionais do Sexo em Goiânia-GO ................................................................................ 41 4.5. Detecção de Anticorpos Anti-HTLV e do DNA Viral ............................................. 44 4.6. Características da Mulher Profissional do Sexo Infectada pelo HTLV-1 ......... 45 4.7. Análise Filogenética ................................................................................................. 45 5. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 48 6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 52 7. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 53 X ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 – Representação esquemática do vírus linfotrópico de células T em primatas mostrando sua estrutura e composição ................................................................................ 3 Figura 2 – Organização genômica do HTLV-1 ................................................................... 4 Figura 3 – Ciclo de replicação do HTLV ............................................................................ 6 Figura 4 – Distribuição geográfica da prevalência da infecção pelo HTLV-1 em áreas endêmicas ............................................................................................................................ 11 Figura 5 – Distribuição geográfica dos subtipos do HTLV-1 ............................................. 13 Figura 6 – Distribuição espacial dos pontos de prostituição das profissionais do sexo estudadas em Goiânia-GO, 2009-2010 ............................................................................... 37 Figura 7 – Rede social das mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO ..................... 44 Figura 8 – Análise filogenética da região LTR do HTLV-1, incluindo isolados e sequências do GenBank dos subtipos a-e............................................................................. 46 XI ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 – Características sociodemográficas de 395 mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO, 2009-2010 ........................................................................................................ 39 Tabela 2 – Análise das características laborais das mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO, 2009-2010 ........................................................................................................ 41 Tabela 3 – Análise descritiva das características de risco para infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo de Goiânia-GO, 2009-2010 ................................................. 43 Tabela 4 – Detecção de anticorpos anti-HTLV por Western Blot e do HTLV-DNA pela PCR nas três amostras reagentes pelo ELISA ....................................................................... 45 XII ÍNDICE DE QUADROS Quadro 1 – Prevalências da infecção pelo HTLV-1 em MPS em outros Países, no período de 1990 a 2009 ....................................................................................................................... 22 Quadro 2 - Prevalências da infecção pelo HTLV-1 em MPS, no Brasil, no período de 1989 a 2007 ............................................................................................................................ 22 Quadro 3 – Características das profissionais do sexo selecionadas não aleatoriamente (sementes) para o estudo ........................................................................................................ 27 Quadro 4 – Interpretação dos resultados no teste Western blot ............................................. 31 Quadro 5 – Iniciadores genéricos para a região tax do HTLV............................................. 32 Quadro 6 - Iniciadores específicos para a região tax do HTLV-1 ...................................... 33 Quadro 7 - Iniciadores específicos para a região LTR do HTLV-1 .................................... 33 Quadro 8 - Iniciadores específicos para a região env do HTLV-1 ....................................... 33 XIII RESUMO O vírus linfotrópico de células T humanas 1 (HTLV-1) é um retrovírus associado ao desenvolvimento de doenças como leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) e mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). A transmissão ocorre por vias sexual, parenteral e vertical. As mulheres profissionais do sexo (MPS) constituem uma população vulnerável as infecções de transmissão parenteral e sexual, uma vez que apresentam comportamentos de risco, incluindo o uso de drogas e o sexo sem proteção. Este estudo teve como objetivo investigar o perfil soroepidemiologico da infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia, GO, usando a metodologia Respondent-Driven Sampling (RDS). Um total de 402 MPS foi entrevistada sobre dados sociodemográficos e características de risco para a infecção pelo HTLV, entre maio de 2009 e junho de 2010. As amostras de sangue foram coletadas de todas as mulheres e triadas pelo ELISA para a detecção de anticorpos para HTLV-1/2. As amostras positivas foram retestadas para a confirmação por western blot e PCR, sendo caracterizadas por sequenciamento e análise filogenética. A idade média das mulheres foi 27,5 anos (Dp: 9,1 anos). A maioria (67,1%) era solteira, 47,3% tinham entre 10 e 12 anos de educação formal. Um terço das profissionais (34,1%) relatou uso de drogas ilícitas, embora apenas 2,7% usaram drogas injetáveis, 51,9% tiveram mais de sete parceiros sexuais na ultima semana e 36,3% não usaram preservativos com parceiros não pagantes. Algumas mulheres relataram recrutar seus clientes em mais de um tipo de local, boates (41%), bares (27,7%) e ruas (25%). Das 402 amostras triadas pelo ELISA, três foram positivas e submetidas à detecção do HTLV-DNA para as regiões tax, LTR e env. Apenas uma foi positiva para HTLV-1, por PCR, resultando numa prevalência de 0,2% (IC 95%: 0,0-1,6). O isolado viral foi classificado como subtipo Cosmopolita (HTLV-1a), subgrupo Transcontinental (A). Os resultados mostram uma baixa endemicidade para a infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO, entretanto estudos epidemiológicos sobre essa infecção são importantes para reforçar a necessidade de estratégias de prevenção baseadas na divulgação dos modos de transmissão e acompanhamento do status sorológico dos infectados. XIV SUMMARY Lymphotropic virus human T cells 1 (HTLV-1) is a retrovirus associated with the development of diseases such as T cell leukemia in adults (ATL) and tropical spastic paraparesis (TSP) or HTLV-associated myelopathy (HAM/TSP). Transmission occurs by sexual routes, parenteral and vertical. Female sex workers (FSW) are a population vulnerable to parenteral and sexually transmitted infections since they have often risky behaviors including drug use and unprotected sex. The study aimed to investigate the seroepidemiological profile of HTLV-1 infection among a population of female sex workers in Goiânia city, using the Respondent driven Sampling methodology. A total of 402 FSWs were interviewed about demographic and risk characteristics for HTLV infection, between May 2009 and June 2010. Blood samples were collected from all females and screened by ELISA for detection of antibodies to HTLV-1/2. Positive samples were retested for confirmation by western blot and PCR, and characterized by sequencing and phylogenetic analyses. The mean age was 27.5 years (SD: 9.1 years). Most of FSWs (67.1%) were single, 47.3% had 10 a 12 years of formal education. One third of female sex workers reported illicit drug (34.1%), thought only (2.7%) used injection illicit drugs, 51.9% had more than seven sexual partners in the last week and 36.3% did not use condom with their steady sexual partners. Some women reported to recruit their clients in more than one type of venue, being nightclubs (41%), bars (27.7%) and streets (25%) predominant. Of the 402 samples screened by ELISA, three were positive and submitted to detection of DNA-HTLV for the tax, LTR and env regions. Only one was positive for HTLV-1, resulting in a prevalence of 0.2%. (CI 95%: 0.0-1.6). The virus isolate was classified as Transcontinental subgroup of the HTLV-1 Cosmopolitan subtype. These findings show a low endemicity for HTLV-1 infection in female sex workers in Goiânia-GO, however epidemiological studies of this infection are important to reinforce the need for prevention strategies based on the disclosure of the modes of transmission and status tracking serological the infected. 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. Breve Histórico O vírus linfotrópico de células-T humano 1 (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus humano identificado. Em 1979, nos Estados Unidos da América (EUA), esse vírus foi isolado de um paciente com linfoma cutâneo de células-T (Poiesz et al. 1980). O HTLV-1 foi, inicialmente, associado com leucemia de célula T do adulto (ATL) e, posteriormente anticorpos contra esse vírus foram observados em um indivíduo portador da paraparesia espástica tropical (TSP) em Martinica, no Caribe (Gessain et al. 1985). Estudos sobre essa infecção demonstraram o caráter neurotrópico do HTLV-1, associando-o a mielopatia crônica (HAM) (Osame & Igata 1989, Gessain & Gout 1992). Com a detecção de anticorpos anti-HTLV-1 no soro e no liquor de pacientes que apresentavam HAM/TSP nas regiões do Caribe, Colômbia e Japão, foi possível verificar que HAM e TSP são enfermidades relacionadas entre si e associadas ao HTLV-1, sendo também observadas em outras regiões do mundo (Ijichi & Osame 1995). O HTLV-2 foi descrito em 1982, em uma linhagem de células T estabelecida a partir de pacientes com leucemia de células pilosas (Kalyanaraman et al. 1982). O papel desse vírus em doenças humanas é limitado, sendo associado ao desenvolvimento de desordens neurológicas similares a HAM/TSP (Roucoux & Murphy 2004). Em 2005, foram identificados mais dois tipos do HTLV (HTLV-3 e HTLV-4) em indivíduos assintomáticos em Camarões, na África Central. Ainda são necessárias pesquisas para determinar a distribuição, a prevalência e a patogenicidade desses dois tipos virais (Calattini et al. 2005, Mahieux & Gessain 2009, 2011). 2 1.2. Características Biológicas do Vírus Linfotrópico de Células T Humanas 1.2.1. Classificação O grupo de vírus linfotrópico de células T em primatas (PTLVs) é composto pelos vírus linfotrópico de células T humanas (HTLVs) e não humanos (STLVs). Esse grupo é dividido em PTLV-1, PTLV-2 e PTLV-3, que corresponde aos HTLV-1, HTLV-2 e HTLV-3, respectivamente, e seus análogos não humanos. O PTLV-4 é composto apenas pelo HTLV-4 (Wolfe et al. 2005, Sintasath et al. 2009, Switzer et al. 2009). O HTLV é classificado na família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero Deltaretrovirus (ICTV 2009). 1.2.2. Estrutura do HTLV-1 O HTLV-1 é um vírus de forma circular com aproximadamente 100 nm (nanômetros) de diâmetro. O vírion é envolvido por um envelope, formado por uma bicamada lipoprotéica que é originada da membrana da célula hospedeira, possui uma proteína de superfície, uma proteína transmembrana e, junto com a membrana do envelope, a matriz protéica. O capsídeo do vírus é de simetria icosaédrica, as enzimas protease (PR), transcriptase reversa (TR) e integrase (IN) são organizadas juntamente com o nucleocapsídeo em um complexo ribonucleoprotéico (Figura 1) (Franchini 1995, Van Dooren 2005, Kannian & Green 2010). 3 Figura 1 - Representação esquemática da partícula viral do HTLV em primatas Fonte: Van Dooren 2005 (modificada) 1.2.3. Organização Genômica e Proteínas do HTLV-1 O genoma do HTLV-1 é relativamente pequeno, com 9 Kb (quilobases), formado por duas fitas RNA diméricas, com polaridade positiva (Goff 2001, Johnson et al. 2001). Durante a replicação viral, a fita simples de RNA é convertida em DNA de fita dupla e inserida junto ao DNA da célula hospedeira. Assim como outros retrovírus, o genoma do HTLV-1 nas extremidades 3’ e 5’ consiste em duas sequências repetidas não codificantes, conhecidas como terminações longas de sequências repetidas (LTRs – Long Terminal Repeats) e são constituídas pelas regiões U3, R e U5, que são essenciais na interação do DNA proviral com o DNA da célula hospedeira, além de regular a transcrição do genoma proviral (Seiki et al. 1983, Kannian & Green 2010, Lairmore et al. 2011). O HTLV-1 apresenta três genes codificantes, gag, pol e env, que originam as proteínas estruturais e enzimas que participam do processo de infecção da célula hospedeira. O gene gag codifica proteínas do capsídeo, o pol a transcriptase reversa, ribonuclease H e integrase, e o env codifica as glicoproteínas de superfície e transmembrana do envelope. Além dos genes estruturais, o HTLV-1 contém genes que 4 codificam proteínas regulatórias (Tax e Rex) da expressão viral (Figura 2) (Ciminale et al. 1992, Azran et al. 2004, Kannian & Green 2010). pro 5’- LTR env 3’- LTR DNA Viral U3 R U5 U3 gag pol U5 pX ORF-I ORF-II ORF-III ORF-IV Figura 2 - Organização genômica do HTLV-1 Fonte: Azran et al. 2004 (modificada) O gene gag está envolvido na montagem e infecção do vírion. As proteínas resultantes desse gene compõem a matriz (p19), o capsídeo (p24) e o nucleocapsídeo (p15). Essas proteínas são formadas a partir da clivagem de uma poliproteína precursora, gag-pol, clivada pela protease viral, codificada pela região pro, que é expressa por uma região de leitura aberta que sobrepõe aos genes gag-pol (Nam et al. 1988, Mazurov et al. 2006, Grigsby et al. 2010). As enzimas virais necessárias para a replicação são codificadas pelo gene pol pela clivagem da proteína precursora, gag-pol, pela protease. Esse gene possui quatro diferentes funções enzimáticas. (1ª) codifica a transcriptase reversa, uma DNA polimerase RNA dependente, que é necessária para a transcrição do RNA viral em DNA, (2ª) codifica uma atividade de RNAse H que remove a fita de RNA da fita dupla híbrida RNA-DNA, (3ª) codifica a integrase, necessária para integrar o vírus no genoma da célula hospedeira e (4ª) codifica uma protease necessária para a clivagem proteolítica dos produtos primários da tradução (Seiki et al. 1983, Trentin et al. 1998). Duas glicoproteínas do envelope viral (gp46 e gp21), importantes no processo infeccioso do vírus, são codificadas pelo gene env a partir da clivagem de uma proteína precursora, gp62. A gp46 ou glicoproteína de superfície é a mais externa e se liga ao receptor da célula hospedeira, enquanto a gp21, ou glicoproteína transmembrana, é 5 responsável pela fusão da membrana celular com o envelope viral, facilitando a entrada do vírus na célula (Hattori et al. 1984, Delamarre et al. 1996, Grange et al. 1998). Na porção 3’ do genoma viral, em uma região conhecida como pX, ocorre a síntese de proteínas acessórias e regulatórias (Smith & Greene 1991, Taylor 2007). Essa região apresenta quatro fases de leitura aberta (ORFs: Open Reading Frames): ORFs I e II sintetizam proteínas acessórias (p12/p27, p13/p30) em combinação com quadros alternativos de processamento (splicing), enquanto as ORFs III e IV sintetizam as proteínas regulatórias, Rex e Tax, respectivamente (Azran et al. 2004, Edwards et al. 2011). Além disso, ocorre a síntese do fator HBZ, “basic zipper factor”. A transcrição desse fator pode ser feita a partir de dois sítios de iniciação, e por isso resulta em dois transcrito de mRNA (RNA mensageiro) diferentes (Murata et al. 2006). Esse fator gera produtos por processamentos alternativos e está relacionada à oncogenicidade viral e proliferação das células infectadas (Gaudray et al. 2002, Usui et al. 2008). As proteínas acessórias têm um papel significativo na fase inicial da infecção dos linfócitos, podendo manter a alta carga viral, a ativação da célula hospedeira e regular a transcrição do gene, controlando, assim, as interações vírus-célula durante a infecção (Bartoe et al. 2000, Albrecht & Lairmore 2002). Tax e Rex são proteínas responsáveis pelo controle da expressão dos genes virais e latência do vírus. Essas proteínas são traduzidas para multiplicar os RNAs mensageiros (mRNAs) na fase precoce da infecção e regular a produção de proteínas e enzimas durante a fase final (Hamaia et al. 1997). A fosfoproteína tax (p40), localizada na região U3 da LTR proviral, encontrada principalmente no núcleo, é identificada como transativadora da transcrição viral. Ela também, transcricionalmente, ativa a expressão de alguns genes celulares que participam da ativação normal e indução do crescimento de células T. A ativação da tax no processo de transcrição viral pode representar um importante mecanismo pelo qual o HTLV-1 inicia a transformação da célula T, aumentando a expressão de oncogenes celulares, fatores de crescimento e de alguns receptores. Essas funções da tax não apenas induzem a proliferação celular, que pode levar a transformação maligna, mas também aumentam a taxa de mutação e a resistência a apoptose (Smith & Greene 1991, Azran et al. 2004, Feuer & Green 2005, Boxus et al. 2008). 6 A fosfoproteína rex (p27) atua como regulador pós-transcricional do genoma ao controlar o splicing do mRNA viral, exportando seletivamente o mRNA gag/pol e env do núcleo para o citoplasma, os quais codificam as proteínas estruturais e enzimáticas que são essenciais para a produção de progênie viral, podendo ter implicações importantes na latência do vírus (Smith & Greene 1991, Feuer & Green 2005, SinhaDatta et al. 2007, Kesic et al. 2009). 1.2.4. Replicação do HTLV-1 Embora, in vitro, vários tipos de células possam ser infectados pelo HTLV-1, o tropismo preferencial do vírus, in vivo, inclui as células linfóides T periféricos, envolvendo linfócitos T CD4+ e CD8+. A replicação viral depende da interação de glicoproteínas do envelope viral, a gp46, ao receptor celular, e a gp21 que funde o envelope viral à membrana da célula-alvo. Além disso, são necessários para a entrada eficiente do vírus na célula, o transportador de glicose 1 (GLUT-1), neuropilina 1 (NRP-1) e proteoglicanos de superfície heparan-sulfato (HSPGs), que são receptores celulares de superfície para HTLV-1 e facilitam a fusão viral (Figura 3) (Gessain 2004, Manel et al. 2005, Boxus & Willems 2009). Figura 3 - Ciclo de replicação do HTLV Fonte: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd08_08.pdf (Brasil 1998) 7 Após a fusão das membranas celular e viral, ocorre à penetração do nucleocapsídeo no citoplasma da célula e a liberação do RNA viral. Sequencialmente, a fita simples de RNA, utilizando a transcriptase reversa, codifica uma fita de DNA. Em seguida o RNA usado como molde é degradado pela ação da ribonuclease (RNase H), no termino do processo da retrotranscrição é formada uma molécula de DNA fita dupla. Esta migra para o núcleo da célula hospedeira para a inserção do material genético viral no cromossomo do hospedeiro, pela proteína integrase, formando o provírus (Goff 2001, Gessain 2004, Manel et al. 2004). Posteriormente, inicia-se a fase tardia da replicação que é mediada por enzima do hospedeiro. Ocorre a sintese do RNA viral utilizando o DNA proviral como molde, este RNA é transcrito e processado para formar os RNAmensageiros (mRNAs) e genômico. Os mRNA subgenômicos, através do processo de tradução, irão codificar as proteínas estruturais e não estruturais, originando novas partículas virais. A última etapa para formação de uma partícula viral completa e infecciosa é a maturação. Nessa fase, ocorre à proteólise das proteínas do capsídeo, obtendo a partícula viral madura. Finalmente essas partículas virais emergem da superfície celular por brotamento, carregando consigo parte da membrana celular bilipídica como constituinte do seu envelope (Goff 2001, Manel et al. 2004). 1.2.5. Variabilidade Genética e Origem do HTLV-1 A variabilidade genética do HTLV-1 é de apenas 4%, possuindo uma grande estabilidade quando comparada a outros retrovírus. Essa estabilidade tem sido indicada por várias estimativas da taxa de evolução do vírus, que é medida pelo número de substituições de nucleotídeos por sítio por ano para env e LTR (Van Dooren et al. 2004, Lemey et al. 2005). A baixa diversidade de sequências do HTLV-1 também pode ocorrer devido à dinâmica de replicação do vírus, que sofre um número limitado de replicações durante a infecção, assim uma alta carga proviral é mantida pela expansão clonal das células infectadas (Wattel et al. 1995). Estudos confirmam a estabilidade genética do vírus e demonstram relação entre a filogenia do vírus e a localização geográfica de seus hospedeiros (Komurian et al. 1991, Ratner et al. 1991, Van Dooren et al. 2004, Lemey et al. 2005). 8 No genoma proviral, as regiões LTR e env apresentam maior variabilidade genética quando comparadas às regiões gag e pol, que possuem uma alta similaridade entre diferentes isolados provirais (Pique et al. 1990, Miura et al. 1994). Com base nas análises filogenéticas da região LTR o HTLV-1 foi classificado em sete subtipos: o HTLV-1a (Cosmopolita), HTLV-1b, d, e, f, g (África Central) e HTLV-1c (Melanésia) (Gessain et al. 1993, Vandamme et al. 1994, Van Dooren et al. 2001, Cassar et al. 2005, Wolfe et al. 2005). Desses, o subtipo mais divergente é o HTLV-1c (Melanésia), apresentando heterogeneidade superior a 11% nas sequências de nucleotídeos (Cassar et al. 2005). De acordo com a localização geográfica, o HTLV-1a pode ser dividido em cinco subgrupos: A (Transcontinental), B (Japão), C (Oeste da África), D (Norte da África) e E (Peru) (Miura et al. 1994, Yamashita et al. 1996, Carneiro-Proietti et al. 2006, Rego et al. 2008). Com a descoberta de tais variantes, estudos moleculares foram realizados a fim de obter mais conhecimento sobre a origem e evolução do HTLV-1, comparando assim a variação da sequência da partícula proviral em várias áreas do mundo (Gessain et al. 1992, Cassar et al. 2005). Acredita-se que o ancestral comum de todos os PTLVs originou na África, pois é o único continente onde os diferentes PTLVs foram encontrados: HTLV tipos 1 a 4 e os seus homólogos símios, STLV tipos 1 a 3 (Vandamme et al. 1998, Verdonck et al. 2007). Essa origem africana deve-se a transmissão interespécies, a partir de primatas não humanos, sendo introduzido no Japão e Novo Mundo (Caribe, Estados Unidos e América do Sul) pelos negros africanos, durante o período de tráfico de escravos, no século XVI (Miura et al. 1994, Ibrahim et al. 1995, Slattery et al. 1999, Wolfe et al. 2005). A hipótese da origem do vírus é baseada na existência de infecções causadas pelo HTLV-1 na África Equatorial e em descendentes de africanos no Caribe e na América Latina. Porém, outros estudos demonstram o aparecimento de leucemia de célula T do adulto na região sudoeste do Japão, tornando assim polêmica a origem deste vírus (Broder & Gallo 1985, Galvão-Castro et al. 2009). De acordo com os estudos filogenéticos, a diversidade de subtipos do HTLV-1 é consequência das inferências evolutivas e transmissões interespécies. Os subtipos 9 HTLV-1a, b, d, e, f, g originaram na África, enquanto o subtipo HTLV-1c, autralomelanésico, é o subtipo mais divergente, o que indica longo período de evolução. A descoberta de tais divergências deve-se à migração das populações infectadas pelo Pacífico, há 40.000-60.000 anos atrás (Liu et al. 1996, Van Dooren et al. 2001, Cassar et al. 2005). Pesquisas têm defendido a hipótese da entrada do vírus nas Américas, a partir da migração de paleomongolóides através do Estreito de Bering há cerca de 12.000 anos. De acordo com esta hipótese, essa população partiu inicialmente do norte da Ásia, passando pela América do Norte, até se espalharem pela América do Sul e se estabelecerem nos Andes e nas regiões Amazônicas, sugerindo, assim, que o HTLV-1 tenha sido introduzido por meio de sucessivas migrações humanas em épocas remotas (Miura et al. 1994, Sonoda et al. 2000, Galvão-Castro et al. 2009). 1.3. Epidemiologia da Infecção pelo HTLV-1 1.3.1. Transmissão A transmissão do HTLV-1 pode ocorrer pelas vias vertical, sexual e parenteral (Sullivan et al. 1991, Hirata et al. 1992, Okochi et al. 1984, Murphy et al. 1989a, Fujino & Nagata 2000, Roucoux et al. 2005). A transmissão vertical ocorre em 20% dos filhos de mães infectadas, e tem sido relacionada à carga proviral da mãe, elevados títulos de anticorpos e tempo prolongado de amamentação (Hino et al. 1995, Ureta-Vidal et al. 1999). Uma das principais formas de transmissão do HTLV-1 da mãe para o filho é por meio do aleitamento, mas não é descartada a possibilidade de transmissão via transplacentária ou parto. A transmissão pós-natal por meio da amamentação possui taxas que variam de 18-39%, porém o risco de transmissão aumenta com o tempo de amamentação (> 6 meses) (Furnia et al. 1999). Anticorpos maternos parecem ser protetores no início do período pós-nascimento, porém não são suficientes para proteger a criança contra a infecção durante um período prolongado de amamentação. Assim, para reduzir o risco de transmissão vertical do HTLV-1, recomenda-se o não 10 aleitamento materno ou sua limitação (Furnia et al. 1999, Fujino & Nagata 2000, Bittencourt et al. 2002, Figueiró-Filho et al. 2005). Outros mecanismos de transmissão vertical dessa infecção são: transplacentária ou hematogênica, por microrganismos ascendentes da vagina ou contaminação fetal no canal do parto, o que explica a infecção de crianças que não são amamentadas pelas mães infectadas pelo HTLV. Essa infecção então depende da imunidade protetora do feto e da proteção dada pelos anticorpos maternos adquiridos através da placenta (Takahashi et al. 1991, Ureta-Vidal et al. 1999, Bittencourt et al. 2002). A transmissão sexual do HTLV-1 é mais eficaz do homem para a mulher do que vice-versa. Estima-se que em dez anos de relacionamento sexual, a probabilidade de transmissão do homem para a mulher é de 60,8%, enquanto que o inverso é de apenas 0,4% (Kajiyama et al. 1986, Kaplan et al. 1996, Roucoux et al. 2005). Estudos têm mostrado que tempo de duração do relacionamento, múltiplos parceiros, sexo desprotegido e DSTs são fatores que podem favorecer a eficácia da transmissão sexual do HTLV (Nakano et al. 1984, Moriuchi & Moriuchi 2004, Roucoux et al. 2005). Além disso, nota-se uma maior prevalência para essa infecção em mulheres, principalmente em idades avançadas (Kajiyama et al. 1986, Mueller et al. 1996, Giuliani et al. 2000, Dourado et al. 2003, Moxoto et al. 2007). A transmissão parenteral ocorre por meio de transfusão de sangue ou hemocomponentes contaminados (concentrados de hemáceas, de plaquetas e leucócitos), por objetos perfuro-cortantes contaminados e compartilhamento de agulhas entre indivíduos sadios e infectados (Pennington et al. 2002, Lairmore et al. 2011, Carneiro-Proietti et al. 2012). A transmissão do HTLV-1 por transfusão sanguínea foi descrita primeiramente no Japão, em 1984 (Okochi & Sato 1986, Lopes & Proietti 2008). Okochi et al. (1984) revelaram que 63,4% da população receptora de produtos sanguíneos contaminados mostraram produção de anticorpos anti-HTLV. A transfusão sanguínea é uma importante forma de disseminação do HTLV-1, porém tem sido minimizada após a introdução dos programas de triagem para essa infecção em bancos de sangue. Kamihira et al. (1987) observaram que houve um declínio das taxas de infecção por HTLV-1 de 53,6% para 0,9% após a introdução da triagem em doadores de sangue. Em países como Japão, Estados Unidos, Canadá, França, Suécia, Portugal, Holanda, Dinamarca, Reino 11 Unido e Finlândia, os candidatos à doação de sangue são rotineiramente submetidos a testes para a detecção de anticorpos anti-HTLV-1/2 (Zervou et al. 2004). No Brasil, a triagem para HTLV-1/2 tornou-se obrigatória em banco de sangue por meio da portaria nº 1376 de 19 de novembro de 1993, do Ministério da Saúde (Brasil 1993). Outro mecanismo de transmissão parenteral do HTLV ocorre pelo compartilhamento de seringas e agulhas contaminadas, principalmente entre usuários de drogas injetáveis (Khabbaz et al. 1992, Barcellos et al. 2006). 1.3.2. Prevalência da Infecção pelo HTLV-1 A infecção pelo HTLV-1 possui uma ampla distribuição geográfica, sendo endêmica em regiões como a África, o sudoeste do Japão, em áreas do Caribe, nas Américas Central e do Sul, além de algumas regiões da Melanésia (Figura 4) (Proietti et al. 2005, Gonçalves et al. 2010). Estima-se que 15-25 milhões de pessoas estejam infectadas em todo o mundo, sendo que aproximadamente 5-10% podem desenvolver doenças graves como ATL e HAM/TSP (Edlich et al. 2000, Brasil 2004a, Proietti et al. 2005). Figura 4 - Distribuição geográfica da prevalência da infecção pelo HTLV-1 em diferentes regiões Fonte: Gonçalves et al. 2010 (modificada) A primeira região a ser identificada como endêmica para o HTLV-1 foi o sudoeste do Japão, com taxas de prevalências que variam de 0 a 37% (Yamaguchi 1994, 12 Mueller et al. 1996, Proietti et al. 2005, Watanabe 2011). Outras regiões geográficas também foram identificadas como endêmicas, como o Caribe, com índice de positividade de 5%, e alguns países da África, onde a soroprevalência foi superior a 5% (Reeves et al. 1988, Dumas et al. 1991, Andersson et al. 1997, Proietti et al. 2005, Forbi et al. 2007). A Europa, América do Norte e parte da Ásia são consideradas áreas de baixa endemicidade, com taxas de prevalência inferiores a 1%. Nessas regiões, a infecção é encontrada, principalmente, nos grupos em alto risco como os imigrantes, profissionais do sexo e usuários de drogas injetáveis (Catalan-Soares et al. 2001, Vrielink & Reesink 2004, Proietti et al. 2005, Carneiro-Proietti et al. 2006). No Brasil, uma investigação epidemiológica estima que existe aproximadamente 2,5 milhões de pessoas infectadas pelo HTLV-1, tornando o país com maior número absoluto de casos dessa infecção (Carneiro-Proietti et al. 2002). Segundo CatalanSoares et al. (2005), em um estudo conduzido em doadores de sangue nas 26 capitais do Brasil e Distrito Federal, a prevalência para HTLV-1/2 variou de 0,04% a 1% em Florianópolis-SC e São Luís-MA, respectivamente. Na Região Centro-Oeste, a prevalência para HTLV-1/2, em doadores de sangue, variou de 0,2% a 0,7% (Catalan-Soares et al. 2005). Em gestantes, a soropositividade para HTLV-1/2 foi de 0,1% em Goiás e Mato Grosso do Sul (Oliveira & Avelino 2006, Figueiró-Filho et al. 2007), e de 0,2% em Mato Grosso (Ydy et al. 2009). Já uma investigação conduzida em remanescentes de quilombos no Brasil Central observou uma positividade de 0,5% para HTLV-1 (Nascimento et al. 2009). Em populações que constituem grupos em risco elevado para HTLV-1, os índices de prevalência são relevantes. Uma investigação conduzida em 171 usuários de drogas injetáveis no Rio de Janeiro-RJ encontrou uma soropositividade de 17% para HTLV-1/2 (Guimarães et al. 2001). Em São Paulo-SP, a soroprevalência foi de 10% em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e 4% em homens que fazem sexo com homens, no Rio de Janeiro-RJ (Brasil 2004a). Um estudo conduzido em populações atendidas em Unidades de Saúde Pública em São Paulo-SP (Centro de Refência para AIDS e HTLV), verificou um índice de positividade para HTLV-1 de 29,1% (Jacob et al. 2008). 13 1.3.3. Distribuição dos Subtipos Análises filogenéticas da região LTR do genoma viral têm mostrado a distribuição dos sete subtipos do HTLV-1: 1a, ou Cosmopolita, com distribuição mundial, 1b encontrado na África Central, 1c, ou Malanésico, isolado na Melanésia e na Austrália, 1d e 1g em Camarões, 1e na República Democrática do Congo e 1f em Gabão (Figura 5) (Komurian-Pradel et al. 1992, Miura et al. 1994, Mahieux et al. 1997, Salemi et al. 1998, Mota et al. 2007, Rego et al. 2008). Figura 5 - Distribuição geográfica dos subtipos do HTLV-1 Fonte: Lima 2006 (modificada) O subtipo HTLV-1a, ou Cosmopolita, de acordo com a distribuição geográfica, é dividido em cinco subgrupos (A-E) (Miura et al. 1994, Van Dooren et al. 1998). O subgrupo A, ou Transcontinental, tem sido observado em áreas endêmicas e não endêmicas, porém isolados foram encontrados principalmente no Japão, Caribe, Irã, África do Sul, extremo Oriente da Rússia e vários países da América do Sul. Já o subgrupo B foi encontrado no Japão e na Índia, o C, no Oeste da África e Bacia das Caraíbas, o D, no Marrocos, Argélia e Mauritânia e norte da África, enquanto o subgrupo E, no Peru (Miura et al. 1994, Vidal et al. 1994, Van Dooren et al. 1998, Carneiro-Proietti et al. 2006). 14 No Brasil, assim como em outros países da América do Sul, o HTLV-1a, ou Cosmopolita, do subgrupo A, ou Transcontinental, é predominante, isso provavelmente devido à migração de escravos africanos do Novo Mundo por volta dos séculos XVII e XVIII (Carneiro-Proietti et al. 2006, Mota et al. 2007, Rego et al. 2008). Porém, pesquisas têm sugerido a entrada do vírus nas Américas a partir da hipótese de migrações pelo Estreito de Bering há aproximadamente 12.000 anos e que imigração japonesa no início do século XX promoveu o isolamento do subgrupo B nas Américas (Song et al. 1995, Yamashita et al. 1999, Valllinoto et al. 2004, De Queiroz et al. 2007). Na Região Centro-Oeste do Brasil, uma investigação conduzida em comunidade afro-brasileira isolada identificou amostras do HTLV-1 como do subtipo Cosmopolita (HTLV-1a), subgrupo Transcontinental (A) (Martins et al. 2010). 1.4. Aspectos Clínicos da Infecção pelo HTLV-1 A infecção pelo HTLV-1, não necessariamente, induz ao desenvolvimento de manifestações clínicas. A maioria dos portadores é assintomático, assim, apenas 5-10% dos indivíduos infectados desenvolvem doenças como leucemia de células T do adulto ou mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (Barmak et al. 2003, Proietti et al. 2005, Champs et al. 2010). Diferentes fatores na interação vírus/hospedeiro/ambiente, como a carga do DNA viral e susceptibilidade do hospedeiro podem favorecer ao desenvolvimento de doenças. As patologias mais estudadas associadas ao HTLV-1 são as neurológicas e as hematológicas, porém podem ser encontradas manifestações dermatológicas, oftalmológicas, reumatológicas, endocrinológicas, urológicas e gastrointestinais (Carneiro-Proietti et al. 2002, Castro et al. 2002, Brasil 2004a, Cruz et al. 2005, Carvalho et al. 2006, Araújo et al. 2009, Primo et al. 2009, Rathsam-Pinheiro et al. 2009, Alves & Dourado 2010). A ATL foi descrita no Japão em 1977, representando uma “entidade” dentre as leucemias linfóides. Foi também a primeira neoplasia humana relacionada a retrovírus que causa proliferação maligna de linfócitos T maduros (Uchiyama 1997, Borducchi et al. 1999, Brand et al. 2009). Estima-se que apenas 1% a 5% de indivíduos infectados desenvolvem leucemia, porém permanece um longo período em latência antes da manifestação clínica e, por isso a ATL geralmente ocorre na idade adulta, por volta de 15 20 a 30 anos após a infecção (Proietti et al. 2005). Já indivíduos infectados na infância, principalmente pelo aleitamento materno, possuem maior chance de desenvolver a leucemia (Murphy et al. 1989b, Proietti et al. 2005). Os principais sintomas e sinais da ATL são: astenia, dor abdominal, tosse, artropatia, ascite, diarréia e episódios de infecções repetidas. A leucemia pode ser classificada em quatro subtipos: smoldering (pré-leucêmica), uma forma sintomática da doença, sendo caracterizada por manifestações cutâneas, mas sem lesões viscerais, com uma contagem de leucócitos normal do sangue periférico e algumas células leucêmicas circulantes. Apresenta também a forma aguda, ou fulminante da doença, com síndrome tumoral e expectativa média de vida de 11 meses, possuindo envolvimento cutâneo e visceral, leucocitose, elevados níveis de lactato desidrogenase e aumento de bilirrubina, além da hipercalcemia. O tipo linfomatoso é semelhante ao linfoma com a ausência de células malignas circulantes. A doença ainda apresenta a forma crônica, que é marcada pelo envolvimento visceral e evidenciada pela linfoadenopatia, hepatoesplenomegalia e leucocitose (Shimoyama 1991, Marsh 1996, Brasil 2004a, Owen & Connor 2008). A doença neurológica, paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 é o quadro neurológico mais frequente dentre as síndromes associadas a esse vírus. Essa doença foi reconhecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1988, como uma doença de evolução lenta e progressiva caracterizada por acometimento insidioso e progressivo de fraqueza muscular nos membros inferiores e espasticidade, associada em grau variado a distúrbios esfincterianos e sensitivos (WHO 1989, Brasil 2004a, Martins et al. 2012). No entanto, menos de 5% dos indivíduos infectados desenvolve a doença anos ou até décadas após a exposição ao vírus (Marsh 1996, Brasil 2004a, Montanheiro et al. 2005). Estudos têm revelado que HAM/TSP é mais prevalente em mulheres do que em homens e, além disso, a presença de hormônios feminios em níveis elevados pode estar associada a uma rápida evolução clínica da doença (Levin & Jacobson 1997, Gotuzzo et al. 2004, Lima et al. 2005). O mecanismo pelo qual a infecção pelo HTLV-1 contribui para a patogênese HAM/TSP ainda é desconhecido, porém estudos propõem que a expressão de uma única sequência pX dentro do genoma proviral contribui para o desenvolvimento dessa patogenia. A região pX codifica um ativador de transcrição (Tax), o que pode iniciar um 16 processo de ativação das células T (CD4+ e CD8+) e a proliferação de eventos subsequentes, levando a danos no sistema nervoso central (HAM/TSP), ou transformação maligna em ATL. (Tendler et al. 1990, Marsh 1996, Levin & Jacobson 1997). O fator HBZ é indispensável para o desenvolvimento de ATL, sendo reconhecido nas células leucêmicas de pacientes com leucemia de células T do adulto, podendo induzir a imortalização de linfócitos T primários. A síntese dessa proteína está relacionada com a carga proviral, e em muitos casos de ATL, o HBZ é a única proteína viral sintetizada (Matsuoka & Green 2009). Na fase inicial da infecção, o HBZ e a tax são necessários para a proliferação e manutenção das células infectadas. Posteriormente, somente o HBZ é essencial para a manutenção da oncogênese, enquanto a tax contribui com o crescimento celular, o que provoca a instabilidade genética. O HBZ promove a proliferação de células T infectadas pelo HTLV-1 implicando, assim, na patogênese de HAM/TSP. Com isso, essa proteína pode ser alvo para terapia de ATL e HAM/TSP (Matsuoka & Green 2009, MacNamara et al. 2010). 1.5. Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo HTLV-1 O diagnóstico atual da infecção pelo HTLV-1 baseia-se principalmente na triagem para detecção de anticorpos específicos. Os primeiros testes para detecção dos anticorpos anti-HTLV foram introduzidos na metade da década de 1980, e utilizavam antígenos de lisado viral do HTLV-1 e antígenos específicos para HTLV-2. Ensaios com antígeno recombinante e/ou peptídeo sintético, derivado da porção intracelular do envelope viral (gp21), só ou em combinação com o lisado viral, foram introduzidos aumentando a sensibilidade de detecção em 100% para HTLV-1. Além disso, antígenos HTLV-2 específicos foram incluídos, o que levou a melhoria da sensibilidade para a detecção de anticorpos anti-HTLV-1/2 (Thorstensson et al. 2002, Brasil 2004a, Jacob et al. 2007). O diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 tem sido realizado em duas etapas: a triagem e a confirmação, sendo que as amostras reagentes pelos testes de triagens devem ser submetidos aos testes confirmatórios (Williams et al. 2000, Brasil 2004a). Os 17 ensaios de triagem rotineiros não discriminam as infecções pelo HTLV-1 e HTLV-2, porém detectam anticorpos contra esses vírus, fazendo-se necessária a realização de ensaios com alta especificidade e capazes de distinguir os tipos virais. As infecções recentes podem não ser identificadas, uma vez que a quantidade de anticorpos específicos nem sempre são suficientes para sua detecção (Brasil 2004a, Jacob et al. 2007, Berini et al. 2008). O ensaio imonoenzimático (ELISA) é o principal teste utilizado na triagem sorológica do HTLV que, com adição de antígenos recombinantes, houve um aumento da especificidade e sensibilidade do teste (Thorstensson et al. 2002, Brasil 2004a, Santos & Lima 2005). Os testes de terceira geração (testes com antígenos recombinantes) possuem sensibilidade superior a 96,5% e especificidade maior que 92,9% para detecção de HTLV-1/2, porém não ocorre a distinção da infecção por HTLV-1 ou HTLV-2 (Jacob et al. 2007, 2009). As reações de aglutinação são ensaios sorológicos, que utilizam partículas de gelatina ou látex sensibilizadas com antígenos inativados, capazes de se aglutinarem na presença de anticorpos específicos. Assim como o teste de ELISA, as reações de aglutinação são altamente específicas e sensíveis (Karopoulos et al. 1993, Fujiyama et al. 1995, Brasil 2004a). O western blot (WB), imunofluorescência (IFA) e ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) são considerados testes sorológicos confirmatórios, sendo o WB o mais utilizado. Esse teste utiliza como antígeno o lisado viral total, acrescido de epítopos imunodominantes recombinantes, correspondentes à porção Nterminal da proteína transmembrana (gp21) do HTLV-1/2. Esse teste apresenta alta sensibilidade para detectar anticorpos contra o epítopo recombinante, porém apresenta uma freqüência menor de reações inespecíficas, reduzindo a possibilidade de resultados falso-positivos, além de possibilitar a diferenciação da infecção por HTLV-1 e HTLV-2 (Lal et al. 1992, Brodine et al. 1993, Santos & Lima 2005, Costa et al. 2011). Os testes confirmatórios podem apresentar resultados indeterminados, devido a reações cruzadas com outros antígenos, que é representado pela detecção de bandas inespecíficas, sendo necessária a utilização testes moleculares para esclarecer o diagnóstico (Zaaijer et al. 1994, Vandamme et al. 1997, Thorstensson et al. 2002). 18 As técnicas de biologia molecular, para diagnóstico confirmatório, fudamentamse na detecção do ácido nucléico viral na forma de DNA proviral, extraído de células mononucleares do sangue periférico, pois há uma pequena circulação do RNA viral no plasma (Vandamme et al. 1997, Poiesz et al. 2000, Brasil 2004a). Dentre as técnicas de biologia molecular, a mais utilizada para a detecção do genoma do HTLV no sangue ou em outros tecidos, é a reação em cadeia da polimerase (PCR), que amplifica sequências específicas no genoma viral, utilizando primers correspondente às regiões conservadas do genoma tax/rex. Essa técnica apresenta maior especificidade e sensibilidade que os métodos sorológicos, por isso é capaz de confirmar e discriminar os dois tipos virais, que possuem aproximadamente 70% de homologia na sequência de nucleotídeos (Poiesz et al. 2000, Brasil 2004a, TamegãoLopes et al. 2006, Costa et al. 2011). 1.6. Prevenção e Controle da Infecção pelo HTLV-1 O desenvolvimento de uma vacina para HTLV-1 é importante para a prevenção e o controle da infecção por esse vírus, porém até o momento não temos uma vacina disponível. A estabilidade do genoma viral e a presença de anticorpos neutralizantes em indivíduos infectados pelo HTLV-1 são fatores que colaboram para a elaboração de uma vacina eficiente. No entanto, a falta de um modelo animal apropriado para testar vacinas candidatas, além de interações vírus-hospedeiro podem ser obstáculos para o desenvolvimento desse imunobiológico (Kazanji et al. 2006). A triagem sorológica para HTLV nos bancos de sangue representa a principal medida de prevenção e controle dessa infecção (Catalan-Soares et al. 2005, Gonçalves et al. 2010). O primeiro país que adotou a triagem para HTLV foi o Japão, em 1986; seguido dos Estados Unidos, em 1989, e Canadá, em 1990 (Osame et al. 1990, Abbaszadegan et al. 2003). No Brasil, a portaria nº 1.376 de 19 de novembro de 1993 tornou obrigatória a triagem para HTLV-1/2 em todos os bancos de sangue do território nacional (Brasil 1993). Considerando que a transmissão vertical também representa um importante meio de disseminação da infecção, medidas como acompanhamento de gestantes, suspensão do aleitamento, ou redução do tempo de amamentação das crianças de mães 19 soropositivas, podem reduzir o risco de transmissão do HTLV (Carneiro-Proietti et al. 2002, Kashiwagi et al. 2004, Mylonas et al. 2010). Programa de Proteção à Gestante tem sido implantado em alguns estados brasileiros, como Goiás, Mato Grosso do Sul e Alagoas, com o objetivo de acompanhar o status sorológico da mãe e contribuir com adequado aconselhamento pré e pós-parto (Dal Fabbro et al. 2008). Embora a taxa de transmissão sexual do HTLV pareça ser baixa, essa via apresenta o maior desafio de todos, devido às dificuldades de modificar os comportamentos sexuais, como uso de preservativos durante as relações sexuais e redução do número de parceiros. As pessoas positivas para esse vírus devem ser acompanhadas quanto ao seu status sorológico, além de serem aconselhadas quanto aos comportamentos sexuais (Figueroa et al. 1997, Roucoux et al. 2005). Outras medidas devem ser tomadas, como o não compartilhamento de seringas e agulhas, e aconselhamento de usuários de drogas injetáveis. Além disso, é necessário orientações sobre a transmissão do vírus e possíveis fontes de infecção (Edlich et al. 2000, Gonçalves et al. 2010). Considerando a distribuição mundial do HTLV-1, a falta de tratamento eficaz e vacina, a prevenção se torna fundamental no controle da transmissão do HTLV-1. Para que ocorra a redução da morbidade e mortalidade associada a esse vírus, são necessárias estratégias de saúde pública que tenha como objetivo diminuir a transmissão viral e esclarecimento da população e profissionais da saúde sobre a infecção (Verdonck et al. 2007). 20 1.7. Profissionais do Sexo e a Infecção pelo HTLV-1 A prostituição constitui-se como uma prática milenar, porém a organização das mulheres profissionais do sexo (MPS) coincidiu com um período de mobilização de diferentes acontecimentos sociais, como o movimento pelas eleições diretas para presidente e a consolidação da mulher no mercado de trabalho (Guimarães & MerchánHamann 2005, Amorin et al. 2008). Além disso, a Portaria Ministerial nº. 397, de 09 de outubro de 2002, incluiu o exercício da prostituição na Classificação Brasileira de Ocupações (CBO) (Brasil 2002). Na sociedade brasileira, a sexualidade feminina está ligada à condição biológica, que é vinculada aos fins reprodutivos e associada à tradicional estrutura familiar, à maternidade. Com isso, a prostituição é vista como atividade contrária às regras sociais, pois busca pelo prazer irrestrito, e as mulheres expressam sua sexualidade de forma explícita em desrespeito aos limites impostos pela sociedade conservadora, acarretando assim a discriminação e marginalização dessa população (Aquino et al. 2008, Lutnick & Cohan 2009). Atividades, como a exploração comercial, incitamento à prostituição e o envolvimento com tráfico humano e de drogas ilícitas são condutas comumente associadas à prostituição e condenadas pelo Código Penal Brasileiro (Código Penal Brasileiro 1940). Dessa forma, as várias atividades ilegais associadas à prostituição no Brasil contribuem para maior vulnerabilidade dessas mulheres a violência física e moral e a exclusão social, fazendo com que elas tenham dificuldades de acesso aos sistemas de educação e de saúde pública (Correa et al. 2008). O conceito de vulnerabilidade pode ser entendido como: “uma conjunção de fatores individuais, programáticos, sociais e culturais” que, relacionados entre si, podem ter pesos diferentes para aumentar ou diminuir a exposição da mulher ao risco de aquisição de doenças, principalmente às DSTs (Amorin et al. 2008). Considera-se que as profissionais do sexo são mais vulneráveis às infecções por patógenos transmitidos sexualmente do que a população em geral, devido a fatores diretamente ligados à prostituição, como elevado número de parceiros e relações sexuais de risco, além de práticas e situações a elas associadas, incluindo o consumo de drogas ilícitas e de bebidas alcoólicas, histórico de prisões, a falta de conhecimento sobre as 21 DSTs e a marginalização socioeconômica (Passos & Figueiredo 2004, Correa et al. 2008). A falta de conhecimento sobre as DSTs é agravada pelo fato de geralmente serem assintomáticas e, mesmo quando ocorrem sintomas dessas doenças, esses podem não despertar suspeitas. Assim, aquelas que estão infectadas podem inadvertidamente disseminar as doenças por não saberem de sua condição. Estes dados são preocupantes porque as DSTs são responsáveis por problemas relacionados à diminuição da fertilidade em homens e mulheres, além de neoplasias do colo de útero, vagina, vulva e pênis (Fernandes et al. 2000, Correa et al. 2008). Estudos realizados em mulheres profissionais do sexo têm sugerido a transmissão sexual e parenteral da infecção pelo HTLV-1 como os principais mecanismos de disseminação do vírus nessa população, pois apresentam com frequência comportamentos de risco, como atividades relacionadas ao uso de drogas e sexo sem proteção (Berini et al. 2007, Sousa 2007, Bautista et al. 2009). A prevalência da infecção pelo HTLV-1 em MPS varia de 0,3% a 21,8% em investigações conduzidas em diferentes regiões geográficas, no período de 1990 a 2009 (Quadro 1). 22 Quadro 1 - Prevalências da infecção pelo HTLV-1 em MPS em outros Países, no período de 1990 a 2009 Autor/ano Local N Prevalência HTLV-1 (%) Wiktor et al. 1990 Zaire 377 3,2 Wignall et al. 1992 Peru 467 21,8 Dada et al. 1993 Nigéria 885 2,8 Hyams et al. 1993 Peru 966 17,6 Delaporte et al. 1995 Zaire 1183 7,3 Mauclere et al. 1995 Camarões 332 0,9 Nakashima et al. 1995 Japão 409 5,1 Zurita et al. 1997 Peru 51 13,7 Chen et al. 1998 Taiwan 2245 1,6 Trujillo et al. 1999 Peru 158 3,8 Belza 2004 Espanha 3149 0,3 Pando et al. 2006 Argetina 614 1,1 Berini et al. 2007 Argentina 613 1,5 Bautista et al. 2009 Argentina 625 1,4 No Brasil, estudos de soroprevalência para infecção pelo HTLV-1 em profissionais do sexo são raros. A prevalência tem variado de 1,0% a 2,8% dependendo da região estudada, no período de 1989 a 2007(Quadro 2). Quadro 2- Prevalências da infecção pelo HTLV-1 em MPS, no Brasil, no período de 1989 a 2007. Autor/ano Local N Prevalência HTLV- 1 (%) Cortes et al. 1989 Rio de Janeiro/São Paulo 101 1,0 Bellei et al. 1996 Santos/São Paulo 653 2,8 Broutet et al. 1996 Fortaleza/Ceará 496 1,2 Sousa 2007 Pará 339 1,8 23 1.8. Justificativa A infecção pelo HTLV-1 possui uma ampla distribuição geográfica, com uma estimativa de 15-25 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo (Proietti et al. 2005, Gonçalves et al. 2010). O Brasil é o país com maior número absoluto de casos dessa infecção (Carneiro-Proietti et al. 2002, Dourado et al. 2003, Catalan-Soares et al. 2005). Na Região Central do Brasil, poucos estudos epidemiológicos foram realizados para a infecção pelo HTLV (Oliveira & Avelino 2006, Figueiró-Filho et al. 2007, Dal Fabbro et al. 2008, Nascimento et al. 2009). Grupos populacionais, como usuários de drogas injetáveis, pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e profissional do sexo são considerados em alto risco para aquisição dessa virose (Lee et al. 1990, Dourado et al. 1999, Etzel et al. 2001, Gutiérrez et al 2004). Mulheres profissionais do sexo compõem uma população vulnerável às infecções de transmissão sexual e parenteral, pois apresentam com freqüência comportamentos de risco, que incluem atividades relacionadas ao uso de drogas e sexo sem proteção (Belza 2004, Bautista et al. 2009). A soroprevalência para infecção pelo HTLV-1 em profissionais do sexo tem variado de 0,3% na Espanha a 21,8% no Peru (Wignall et al. 1992, Belza 2004). No Brasil, poucos estudos foram realizados nessa população e, o índice de positividade variou de 1,0% em Rio de Janeiro/São Paulo a 2,8% em Santos-SP (Cortes et al. 1989, Bellei et al. 1996). Apesar de a literatura indicar que a prevalência do HTLV-1 é mais elevada em mulheres, os estudos envolvendo mulheres que se prostituem são escassos, e na Região Centro-Oeste do País nenhum estudo soroepidemiológico sobre a infecção pelo HTLV1 em MPS foi realizado. Assim, o presente estudo foi desenvolvido com o intuito de conhecer o perfil epidemiológico e molecular dessa infecção em mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO, com vistas para fornecer subsídios que possam auxiliar no desenvolvimento de estratégias de saúde pública visando à prevenção e o controle desta virose. 24 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Investigar o perfil soroepidemiológico e molecular da infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia, Goiás. 2.2. Objetivos Específicos Estimar a prevalência da infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO; Analisar os comportamentos de risco para esta infecção; Caracterizar os subtipos virais circulantes neste grupo. 25 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Natureza, Local de Estudo, População-Alvo e Amostra Estudo descritivo, de corte transversal conduzido em MPS que exerciam atividades laborais em locais públicos (praças, parques, ruas, avenidas, dentre outros) e/ou privados (casas fechadas, boates, cinemas, casas de espetáculos eróticos, dentre outros) em Goiânia, Goiás. O período de coleta foi maio de 2009 a junho de 2010. Foram incluídas no estudo mulheres com idade igual ou superior a 18 anos, que faziam sexo em troca de dinheiro e/ou presentes, apresentavam o cupom recrutador no momento da entrevista e se prostituiam em Goiânia, Goiás. As mulheres sem condições mentais e físicas para responder ao questionário, por excesso de droga ou álcool, e os transgênicos femininos foram excluídos do estudo. Para amostra mínima necessária, foi considerado um poder estatístico de 80% (β=20%), um nível de significância de 95% (α<0,05), precisão de 1% e uma prevalência para HTLV-1 de 1,0% (Cortes et al. 1989). Assim, no mínimo 400 mulheres eram necessárias para o estudo. Em observância ao disposto na Resolução nº 196/96, do Conselho Nacional de Saúde (Brasil 1996), este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, sob o protocolo CEPMHA/HC/UFG Nº 001/09. 3.2. Coletas de Dados 3.2.1. Respondent-Driven Sampling e Profissionais do Sexo Foi utilizada uma abordagem metodológica baseada na indicação dos participantes pelos pares, denominada Respondent-Driven Sampling (RDS) ou “Amostragem dirigida pelos participantes”, a qual foi desenvolvida para amostragem de população de difícil acesso que estão conectadas por meio de redes sociais (Volz & Heckathorn 2008, Uusküla et al. 2010). 26 Em 1997, foi proposto por Douglas Heckathorn, nos EUA, um método de amostragem probabilística, não só para aliviar as dificuldades em acesso, mas também para permitir a estimativa estatística das variáveis alvos. O método denominado RDS facilita o recrutamento dos grupos de difícil acesso, uma vez que utiliza cadeias de referência para a obtenção da amostra, semelhante à amostragem “bola de neve” e, permite a inferência estatística da população alvo por meio do controle para as fontes de viés geralmente associadas à amostragem por cadeia de referência. Assim, vários estudos com populações de difícil acesso têm sido realizados utilizando a metodologia RDS (Heckathorn 1997, 2002, Volz & Heckathorn 2008, Wejnert 2009, Goel & Salganik 2010, Damacena et al. 2011a, Júnior et al. 2011). O Programa Nacional de DST e Aids do Brasil (PN-DST/AIDS) promoveu, em uma parceria com o Global AIDS Program-Brazil do Centers for Disease Control and Prevention (CDC/GAP), a University of California San Francisco (EUA), Tulane University (EUA) e a Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), a transferência de métodos de amostragem específicos para subgrupos de populações de difícil acesso (Júnior 2008). Para iniciar o estudo foram feitos contatos com instituições que atendem de forma direta ou indireta as profissionais do sexo, tais como: Organizações Não Governamentais (ONG) e Coordenações de DST/HIV/AIDS nas Secretarias Municipal (SMS) e Estadual de Saúde (SES), a fim de mapear os principais pontos de prostituição em Goiânia e estabelecer parcerias. Juntamente com uma ONG, realizou-se o recrutamento de um pequeno número de profissionais do sexo, denominadas de “sementes”, integrantes do público-alvo. Na abordagem inicial, foi entregue um convite personalizado. A seleção e o recrutamento das “sementes” ocorreram por meio de uma pesquisa formativa com as mesmas, realizada entre os meses de maio e junho de 2009, tendo como objetivo definir os locais e horários de coletas de dados, formas de ressarcimentos/incentivo e divulgação do estudo nos locais de prostituição. Um total de sete “sementes” foi recrutado. As características destas mulheres são apresentadas no Quadro 3. 27 Quadro 3 - Características das profissionais do sexo selecionadas não aleatoriamente (sementes) para o estudo Semente Local de Prostituição 1 2 3 Rua Rua Rua 4 Casa fechada Casa de Espetáculos Rua Cinema 5 6 7 Horário de trabalho Ambos Ambos Diurno Idade 53 38 50 Anos de estudo 4 2 7 Religião Estado civil Separada Solteira Solteira Separada R$ 150,00 11 Católica Protestante Sem religião Sem religião Católica Renda no último dia de trabalho R$ 20,00 R$ 40,00 R$ 175,00 Ambos 34 13 Ambos 28 Solteira R$ 200,00 Ambos Diurno 37 34 12 6 Protestante Protestante Separada Solteira R$ 150,00 R$ 70,00 Ficou estabelecido que cada “semente” receberia três cupons para recrutar seus pares (colegas/amigas/conhecidas de profissão) para o estudo. As mulheres que chegassem ao local de estudo com um cupom válido e que cumprissem os critérios de inclusão no estudo, eram consideradas elegíveis, formando assim, a primeira onda. As profissionais do sexo recrutadas na primeira onda, também recebiam três cupons para recrutar seus pares, que formaram a segunda onda. Essa dinâmica ocorreu sucessivas vezes até a saturação da rede ou alcance da amostra desejada. Cada participante que completasse o protocolo do estudo recebia o incentivo primário e, para cada recruta elegível da mesma participante, que se alistava no estudo, recebia o incentivo secundário, como prevê a metodologia RDS. No presente estudo, foi utilizado como incentivo/ajuda de custo, sugerido pelas “sementes”, o vale transporte válido para o transporte urbano em Goiânia e para regiões Metropolitanas. Para a realização das entrevistas e coleta de amostras clínicas, no início do estudo, foi utilizado o espaço físico do centro de convivência da ONG parceira. No entanto, a adesão das MPS foi relativamente baixa, devido à distância e diferenças entre os grupos, então foram criados novos locais de coletas, próximos aos pontos de prostituição. Parcerias foram feitas com os comerciantes locais para a obtenção desses novos pontos de coletas que se caracterizavam pela neutralidade, considerando as diferenças entre os grupos de mulheres que se prostituiam na região. 28 As coletas ocorreram durante dias úteis da semana, nos períodos matutino, vespertino ou noturno, considerando as características do local e a segurança da equipe. Em cada local, a equipe permanecia, em média, quatro semanas. O cupom recrutador continha dados do projeto, tais como: local de coleta e número de telefone para contato livre de custo (ligações a cobrar). Para a realização das coletas, as mulheres se dirigiam aos pontos de coleta ou ligavam para a equipe, a fim de agendar data e horário. No momento da coleta, as profissionais do sexo apresentavam o cupom para o membro da equipe responsável pela recepção das participantes, que avaliava a elegibilidade da profissional do sexo para o estudo e certificava a validade do cupom. Todas as participantes elegíveis foram esclarecidas quanto à finalidade e aplicabilidade do estudo, posteriormente foi disponibilizado, pelo entrevistador, o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Um instrumento de coleta de dados padronizado foi utilizado na entrevista, baseado no módulo “mulheres trabalhadoras do sexo” do “Family Health International Behavioral Surveillance Surveys” (Family Health International 2000), contendo questões sobre dados sociodemográficos (idade, escolaridade, religião, cor, local de residência, dependentes econômicos e estado civil) e comportamento de risco para a infecção pelo HTLV (número de clientes nos últimos sete dias de trabalho, número de clientes no último dia de trabalho, fuso de preservativo com clientes nos últimos 30 dias, uso de preservativo na última relação com parceiros não pagantes, presença de corrimento vaginal ou ferida/úlcera na genitália nos últimos 12 meses, uso de droga injetável e não injetável nos últimos 12 meses, história de transfusão sangúinea e tatuagem e/ou body piercing). O questionário foi aplicado por membros (alunos de pósgraduação e/ou de iniciação científica), devidamente capacitados, do núcleo de Estudo em Epidemiologia e Cuidados em Agravos Infecciosos, com ênfase em hepatites virais (NECAIH) da Faculdade de Enfermagem/UFG e do Laboratório de Virologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG). Após a entrevista, o questionário era revisado por uma mestranda, para avaliação prévia da qualidade de dados obtidos e identificação de lacunas/missing no preenchimento. 29 Realizada a entrevista, a participante era encaminhada para coleta de 10 ml de sangue, por meio de punção venosa periférica, utilizando agulhas e seringas descartáveis. As amostras sanguíneas foram colocadas em dois tubos, um com anticoagulante (etilenodiaminotetra cético - EDTA - sangue total) e outro sem anticoagulante (soro). Este foi centrifugado e separado em duas alíquotas. Todas as alíquotas foram armazenadas a -20ºC até a realização dos ensaios. Posteriormente, a participante era conduzida a outro membro da equipe, responsável pela distribuição e controle dos cupons, quando então eram fornecidos os três cupons recrutadores e os vales transportes. Ainda, por meio do Programa de Extensão “Sempre Viva” do NECAIH/FEN/UFG em parceria com a equipe do Laboratório de Virologia do IPTSP/UFG, era desempenhado atividades de educação em saúde, enfocando as doenças sexualmente transmissíveis e medidas higiênico-sanitárias, havendo distribuição de preservativos e folders ilustrativos sobre prevenção e controle de DST/HIV/AIDS e hepatites virais, que eram disponibilizados pela Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia e Secretaria da Saúde do Estado de Goiás. Além disso, vacinação contra hepatite B, tétano, febre amarela, sarampo e rubéola (dupla viral) era realizada nas participantes sem história e/ou comprovação vacinal. 3.3. Testes Sorológicos 3.3.1. Ensaio de Triagem Todas as amostras de soro foram testadas pelo ensaio imunoenzimático (ELISA), qualitativo de terceira geração, para a detecção de anticorpos contra HTLV-1 e HTLV-2, empregando reagentes comerciais (Murex HTLV-I+II, GE80/81, Murex Diagnostics, UK). Resumidamente, as amostras e controles foram incubados por 30 minutos a 37ºC, em placas sensibilizadas com proteínas transmembrana, peptídeos sintéticos do envelope do HTLV-1 e HTLV-2, e uma proteína transmembrana recombinante do HTLV-2. Posterior à lavagem, adicionou-se o conjugado (antígenos de HTLV marcados 30 com peroxidase) e procedeu a incubação por 30 minutos a 37ºC. Após incubação a placa foi submetida a uma lavagem. Em seguida, foi adicionada a solução cromógena de tetrametilbenzidina (TMB) juntamente com o substrato da enzima (peróxido de hidrogêneo) e incubado por 30 minutos a 37ºC. Após esse período, reação foi interrompida com adição de ácido sulfúrico 0,5 M a 2 M e leitura da placa foi realizada em um leitor de ELISA. A leitura da reação foi realizada, conforme as instruções do fabricante, com uso de um filtro de 450 nm. Amostras que apresentaram absorbâncias maiores ou igual ao valor do cut-off, obtido pela média das absorbâncias dos controles negativos + 0,200, foram consideradas positivas. 3.3.2. Ensaio Confirmatório As amostras reagentes pelo ELISA foram testadas pelo ensaio confirmatório western blot, utilizando reagentes comerciais (HTLV Blot 2.4, Genelabs, Cingapura). Foram utilizadas fitas individuais de nitrocelulose com proteínas virais nativas e recombinantes das regiões gag e env do HTLV-1 e HTLV-2, para confirmar e identificar o tipo viral. A diferenciação é feita por meio das proteínas recombinantes MTA-1 e K55, exclusivas do HTLV-1 (rgp-I) e HTLV-2 (rgp-II), respectivamente. Resumidamente, as amostras e controles foram adicionados às fitas re-hidratadas com solução tampão e incubadas a temperatura ambiente (25ºC - ±3ºC) sobre a plataforma de agitação (velocidade de 12 a 16 oscilações por minuto). Em seguida procedeu-se a lavagem das tiras e, adicionou-se o conjugado (anticorpo caprino anti-IgG humana conjugado à fosfatase alcalina) e a reação foi incubada por 60 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, acrescentou-se o substrato (5 bromo - 4 cloro - 3 indolil - fosfato - BCIP e azul de nitrotetrazólio –NBT) e incubou-se por 15 minutos, sob agitação. Após a incubação a reação foi interrompida pela remoção do substrato e lavagem das fitas. Os resultados do western blot foram interpretados conforme as instruções do fabricante (Quadro 4). 31 Quadro 4 – Interpretação dos resultados no teste Western blot Padrão Interpretação Ausência de reatividade às proteínas específicas do Soronegativo HTLV Reatividade às proteínas codificadas pelo gene gag (p19 Soropositivo para HTLV-1 e/ou p24) e env (GD21 e rgp46-I) Reatividade às proteínas codificadas por gag (p19 e/ou Soropositivo para HTLV-2 p24) e env (GD21 e rgp46-II) Reatividade às proteínas codificadas por gag (p19 e Soropositivo para HTLV p24) e env (GD21) Reatividade com bandas específicas para o HTLV, mas Indeterminado que não preenchem os critérios de soropositividade para HTLV-1, HTLV-2 ou HTLV 3.4. Testes Moleculares 3.4.1. Extração do DNA Amostras de sangue total das participantes que obtiveram resultados reagentes no ELISA foram submetidas à extração do DNA utilizando os reagentes da Qiagen (QIAamp DNA Minikit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook), conforme as instruções do fabricante. Inicialmente, foram adicionados 200 µl de sangue total em um tubo de 1,5 ml contendo 20 µl de proteinase K e 200 µl de tampão de lise, procedendo à homogeneização por 15 segundos e incubação a 56ºC por 10 minutos. Em seguida, foi submetido a uma rápida centrifugação para remoção de gotículas existentes na tampa do tubo. Posteriormente, adicionou-se 200 µl de etanol e homogeneizou por 15 segundos. Uma breve centrifugação foi realizada, e a solução foi transferida para uma coluna. Após centrifugação e troca de sua base, foi acrescentado 500 µl de tampão de lavagem 1 e centrifugado por 1 minuto. Novo procedimento de lavagem foi realizado, usando o tampão de lavagem 2 (500 µl) e centrifugado por 3 minutos. 32 O DNA retido na coluna foi eluído com 200 µl do tampão de eluição, e incubado a temperatura ambiente (15-25ºC) por 1 minuto. Em seguida, foi realizado centrifugação, por 1 minuto, resultando em uma série de 100 µl, sendo esta, armazenada a -20ºC. O DNA obtido foi amplificado com iniciadores genéricos para identificação do HTLV (Quadro 5) pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Quadro 5 - Iniciadores genéricos para a região tax do HTLV Sentido Localização Sequência 5’-3’ Ptlvpt Sense 7481-7505 TYACCTRGGACCCCATCGATGGACG Pgtaxr1 Antisense 8138-8116 GAIGAYTGIASTACYAAAGATGGCTG Ph2REV Sense 7530-7553 CCTTATCCCTCGICTCCCCTCCTT Pgtaxr2 Antisense 8108-8086 TTIGGGYAIGGICCGGAAATCAT PCR-2 PCR-1 Iniciadores 3.4.2. Nested-PCR Uma nova amplificação do DNA viral foi realizada por nested-PCR com iniciadores para as regiões tax (Quadro 6), LTR (Quadro 7) e env (Quadro 8) do genoma do HTLV-1. As reações de amplificação (tax, LTR e env), na primeira PCR (PCR-1), foram realizadas com 2 µl de cada iniciador externo em uma concentração de 200 ng, 1 µl de dNTP’s (deoxinucleotídeos trifosfatados – 0,4 mM), 10 µl de tampão (1x), 4 µl de MgCl2 (cloreto de magnésio - 2,0 mM), 0,5 µl de Taq DNA polimerase (2,5 U) e 26,5 µl de água milliQ, totalizando um volume de 46 µl. Em seguida, adicionou-se à mistura da reação 4 µl do DNA de cada amostra e o mesmo foi realizado para os controles negativos e positivos. Posteriormente, foram colocados no termociclador utilizando o seguinte programa: 96ºC por 3 minutos (desnaturação inicial), 45 ciclos de 96ºC por 30 segundos (desnaturação), 50ºC por 30 segundos (anelamento) e 72ºC por 1 minuto (extensão) (Liu et al. 1994). 33 Quadro 6 - Iniciadores específicos para a região tax do HTLV-1 Sentido Localização Sequência 5’-3’ Taxhtlv1f2 Sense 7297-7316 ATACAAAGTTAACCATGCTT Taxhtlv1r1 Antisense 8470-8490 TGAGCTTATGATTTGTCTTCA Taxhtlv1f1 Sense 7280-7299 TCGAAACAGCCCTGCAGATA Taxhtlv1r2 Antisense 8397-8416 AGACGTCAGAGCCTTAGTCT Internos Externos Iniciadores Quadro 7 - Iniciadores específicos para a região LTR do HTLV-1 Sentido Localização Sequência 5’-3’ Hfl1 Sense 24-39 GACAATGACCATGAGC Hfl6 Antisense 881-901 GTTAAGCCAGTGATGAGCGGC Hfl9 Sense 124-144 AAGGCTCTGACGTCTCCCCCC Hfl10 Antisense 779-796 TCCCGGACGAGCCCCCAA Internos Externos Iniciadores Quadro 8 - Iniciadores específicos para a região env do HTLV-1 Sentido Localização Sequência 5’-3’ Hfl71 Sense 5111-5129 CCAGTGGATCCCGTGGAGA Hfl72 Antisense 6729-6747 AGGAGGATTTGATGGGAGA Hfl75 Sense 6049-6065 GCTATAGTCTCCTCCCC Hfl76 Antisense 6591-6610 GGTGTCGTAGCTGACGGAGG Internos Externos Iniciadores 34 Na segunda PCR (PCR-2), 3 µl do produto obtido foi novamente amplificado utilizando iniciadores internos para as regiões tax, LTR e env, nas mesmas condições descritas acima, exceto pelo acréscimo de 1 µl no volume água milliQ (Liu et al. 1994). 3.4.3. Eletroforese em Gel de Agarose Os produtos PCR-2 foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão Tris-Acetato EDTA (TAE), corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta com o auxílio de um transluminador, e comparados aos controles positivos, com aproximadamente 1136 pb, 672 pb e 561 pb para as regiões tax,LTR e env, respectivamente. 3.4.4. Purificação do DNA Os produtos da segunda amplificação da região LTR foram purificados utilizando o Ilustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, em tubo tipo eppendorf, foi adicionado 500 µl do tampão de captura e 100 µl do produto obtido da PCR-2 de cada amostra. Esta mistura foi homogeneizada, e em seguida transferida a uma coluna fornecida pelo Kit, a qual foi centrifugada por 30 segundos. Posteriormente, o líquido centrifugado foi descartado, e acrescentou-se à coluna 500 µl de tampão de lavagem, sendo esta submetida à nova centrifugação (30 s). O líquido residual foi descartado e adicionou-se 40 µl do tampão de eluição no centro da membrana da coluna, seguido de incubação em temperatura ambiente (1525ºC) por 1 minuto e centrifugação (1 min). Ao final do processo o DNA purificado foi armazenado a -20ºC. 35 3.4.5. Sequenciamento e Análise Filogenética O produto purificado foi sequenciado utilizando-se os iniciadores internos para a região LTR (Quadro 7) e o Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Boisystems Foster City, CA, USA). Foi preparada uma mistura de reagentes para cada iniciador utilizado 1 µl do BigDye Terminator, 1,5 µl tampão BigDie , iniciador na concentração de 3,2 pmol ou 100 ng (1 µl), produto purificado (2 µl) e completar a reação com água milliQ até 10 µl. Posteriormente, a placa foi colocada no termociclado. Foram programados 25 ciclos de 96ºC por 15 segundos (desnaturação), 50ºC por 10 segundos (anelamento) e 60ºC por 4 minutos (extensão). As amostras foram precipitadas utilizando isopropanol (80 µl) a 75%, e incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente, logo após foi centrifugada por 45 minutos a 4000 rpm a 21ºC. A seguir, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi seco no termociclador a 75ºC por 5 minutos. Posteriormente, foi realizada a desnaturação, em que o DNA foi ressuspenso em 10 µl de formamida (HD especial para sequenciamento), e centrifugado por 1 minuto a 900 rpm a 21 ºC. Em seguida, foi incubado no termociclador a 95ºC por 5 minutos para desnaturar. Imediatamente após a incubação a placa foi colocada no gelo por 5 minutos e em seguida, no seqüenciador automático. A sequência obtida foi lida e editada pelo programa CHROMAS versão 1.45 (Griffith University) e SEQMAN II versão 5.01 (DNASTAR). Posteriormente, a mesma foi alinhada usando o programa Clustal X e para editar o alinhamento foi utilizado o programa BIOEDIT. Uma árvore foi construída, para análise filogenética, pelo método de Neighbor-joining, usando o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versão 4.0, e o modelo de substituição de nucleotídeos KIMURA 2 parâmetros. A caracterização do subtipo do HTLV-1 foi determinado acrescentando-se sequências de referência representativas dos principais subtipos do vírus, disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Além disso, a robustez dos grupos filogenéticos foi avaliada utilizando bootstrap de 1025 repetições. 36 3.5. Processamento e Análise de Dados Os dados das entrevistas e os resultados dos testes sorológicos e molecular foram digitados em microcomputador utilizando os programas estatísticos “Epiinfo 6.0”, desenvolvido pelo “Centers for Disease Control and Prevention” e o pacote estatístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versão 15.0 for Windows. Em seguida, ocorreu a verificação dos dados e a limpeza do banco. Os dados foram transferidos para o programa estatístico Respondent-Driven Sampling Analysis Tool (RDSat) versão 5.6, onde foram analisados por estatística descritiva, a fim de gerar estimativas de prevalência com intervalo de confiança 95%. As prevalências são ajustadas segundo os padrões de recrutamento e tamanho da rede em relação aos outros recrutas, levando em consideração a homofilia e o alcance do equilíbrio das variáveis (Volz & Heckathorn 2008, Uusküla et al. 2010). O software ArcView GIS 3.2 foi usado para identificação e referenciamento dos pontos de prostituição primários, por meio de coordenadas espaciais, e o desenho das redes sociais formadas pelas profissionais do sexo recrutadas foi obtido por meio do aplicativo Netdraw versão 2.084. 37 4. RESULTADOS 4.1. Distribuição Espacial dos Pontos de Prostituição das Mulheres Profissionais do Sexo em Goiânia-GO A Figura 6 mostra a distribuição dos locais de prostituição referidos pelas mulheres que participaram do estudo. Por meio das coordenadas espaciais no mapa da cidade de Goiânia-GO, nota-se que a prostituição foi predominante nas regiões sul e central do município. Figura 6 - Distribuição espacial dos pontos de prostituição das profissionais do sexo estudadas em Goiânia-GO, 2009-2010 38 4.2. Características Sociodemográficas das Mulheres Profissionais do Sexo Foram entrevistadas e testadas para a infecção pelo HTLV 402 mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO. Destas, sete mulheres (sementes) foram retiradas da análise de dados por recomendação da metodologia RDS, uma vez que foram recrutadas de forma intencional. A Tabela 1 mostra as características sociodemográficas de 395 mulheres. Observou-se que 31,7% da população estudada possuíam idade entre 21 e 25 anos e, que praticamente a metade das mulheres (47,3%) possuía entre 10 e 12 anos de estudo. Quanto à religião, verificou-se que a maioria das MPS era cristã, com predominância da religião católica (59,9%), seguida da evangélica (18,8%). Nota-se, ainda, que mais da metade das mulheres (67,1%) eram solteiras, autodeclararam de cor parda (59,5%), residiam em Goiânia (75,4%) e que possuíam dependentes econômicos (69,9%). 39 Tabela 1 - Características sociodemográficas de 395 mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO, 2009-2010 RDS* Estimativa ajustada (%) IC 95%** n/N Idade (anos) <21 21-25 26-30 31-35 36-40 >40 13,8 31,7 25,2 12,2 5,8 11,3 9,4 – 19,8 24,5 – 40,3 18,3 – 32,6 7,1 – 16,3 3,2 – 8,8 5,4 – 18,3 58/395 106/395 95/395 55/395 32/395 49/395 Escolaridade (anos) ≤4 5-9 10-12 >12 9,7 40,6 47,3 2,3 6,3 – 15,1 32,2 – 47,3 40,4 – 56,9 0,4 – 2,4 40/395 163/395 181/395 11/395 Religião Sem religião Católica Evangélica Espírita Outra 17,2 59,9 18,8 4,0 0,1 10,8 – 21,1 53,4 – 68,0 13,7 – 25,2 1,4 – 7,5 0,1 – 0,5 76/395 207/395 92/395 19/395 1/395 Cor Branca Negra Parda Outra 27,3 12,5 59,5 0,7 20,5 – 35,4 8,3 – 17,5 51,4 – 66,8 0,1 – 0,9 97/395 57/395 234/395 7/395 Local de Residência Goiânia Outros 75,4 24,6 68,2 – 81,9 18,1 – 31,8 291/395 104/395 Dependentes econômicos Não Sim 30,1 69,9 23,2 – 38,5 61,5 – 76,8 97/395 298/395 Estado Civil Casada Solteira Separada Viúva 15,7 67,1 14,4 2,8 10,6 – 21,7 60,2 – 75,2 7,8 – 20,1 0,6 – 6,3 64/395 270/395 53/395 8/395 Variável *Estimativas ajustadas pelo RDSat; **Intervalo de Confiança 40 4.3. Características Laborais das Mulheres Profissionais do Sexo Das 395 mulheres entrevistadas, observa-se que 62,4% relataram ter exercido atividade profissional em outra cidade, e 41% trabalhavam em boates, 27,7% em bares e 25% em rua (Tabela 2). Em relação ao horário de trabalho, 26,9% se prostituiam no período diurno, 41,3% noturno e 31,8% em ambos os turnos. Quando questionadas sobre o valor recebido no último dia de trabalho, houve uma variação entre 15,00 e 1500,00 reais, sendo que 41,4% afirmaram ter recebido entre 200,00-1.500,00 reais, seguido de 100,00-199,00 reais (28,7%) e 15,00-50,00 reais (16,8%). Além disso, 94,3% das mulheres afirmaram já ter exercido outras atividades profissionais para obtenção de renda. 41 Tabela 2– Análise das características laborais das mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO, 2009-2010 Variável RDS* Estimativa IC 95%** ajustada (%) n/N Trabalhou como profissional do sexo em outra cidade Não Sim 37,6 62,4 30,8 – 45,5 54,5 – 69,2 185/395 210/395 Tipo de local que prostitui*** Rua Boate Bar Casa de espetáculo erótico Cinema erótico Casa fechada 25,0 41,0 27,7 5,5 3,8 5,3 10,1 – 43,2 28,4 – 53,7 15,4 – 41,8 0,2 – 17,1 0,4 – 11,6 0,9 – 9,4 126/451 123/451 100/451 40/451 39/451 23/451 Horário de trabalho Diurno Noturno Diurno e Noturno 26,9 41,3 31,8 16,6 – 35,1 30,9 – 55,6 23,1 – 40,3 137/395 111/395 147/395 Valor recebido no último dia de trabalho (R$) 15,00-50,00 51,00-99,00 100,00-199,00 200,00-1.500,00 16,8 13,1 28,7 41,4 11,7 – 22,9 8,5 – 18,8 21,1 – 35,1 32,8 – 50,8 75/392b 63/392 104/392 150/392 Já teve outra fonte de renda Não Sim 5,7 94,3 2,7 – 9,7 90,3 – 97,3 23/395 372/395 *Estimativas ajustadas pelo RDSat; **Intervalo de Confiança; ***Mulheres referiram a mais de um local, três mulheres não responderam. b 4.4. Características de Risco para a Infecção pelo HTLV-1 Relatadas pelas Mulheres Profissionais do Sexo em Goiânia-GO A Tabela 3 mostra a análise descritiva das características de risco para infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO. Verificou-se que, nos últimos sete dias de trabalho, aproximadamente a metade da população, 51,9%, 42 informaram ter tido mais de sete clientes sexuais e, no último dia, 52,6% das mulheres relataram dois ou mais clientes. Do total de mulheres, a maioria (87,1%) afirmou o uso frequente de preservativo com os clientes nos últimos 30 dias. Em relação aos parceiros não pagantes, 63,7% das MPS informaram o uso do preservativo na última relação sexual. Nos últimos 12 meses, foi relatado corrimento vaginal por 49% profissionais do sexo e feridas ou úlceras na genitália por 8,6% das mulheres. Das 395 mulheres profissionais do sexo entrevistadas, 65,9% negaram o uso de drogas, porém 12,9% já fizeram uso de cocaína, 9,3% maconha e cocaína e 7,6% afirmaram uso apenas de maconha. Quanto a drogas ilícitas injetáveis no último ano, apenas 2,7% das mulheres relataram essa prática. Na população esudada, transfusão sanguínea e presença de tatuagem e/ou body piercing foram referidas por 10,6% e 58,3 % das MPS, respectivamente. 43 Tabela 3 – Análise descritiva das características de risco para infecção pelo HTLV1 em mulheres profissionais do sexo de Goiânia-GO, 2009-2010 RDS* Estimativa ajustada (%) IC 95%** n/N Número de clientes nos últimos sete dias de trabalho >7 ≤7 51,9 48,1 44,4 – 62,0 38,0 – 55,6 181/392 211/392 Número de clientes no último dia de trabalho 1 2 ≥3 47,4 21,5 31,1 38,7 – 57,2 15,5 – 27,8 22,6 – 39,1 174/392 89/392 129/392 Frequência do uso de preservativo com clientes nos últimos 30 dias Sempre Quase sempre Algumas vezes Nunca 87,1 7,2 5,6 0,1 80,7 – 92,3 3,2 – 12,5 2,1 – 10,1 0,1 – 0,3 355/388 21/388 11/388 1/388 Uso de preservativo na última relação com parceiros não pagantes Não Sim 36,3 63,7 28,6 – 44,9 55,1 – 71,4 117/386 269/386 Corrimento vaginal nos últimos 12 meses Não Sim 51,0 49,0 43,5 – 59,0 41,0 – 56,5 200/395 195/395 Ferida ou úlcera na genitália nos últimos 12 meses Não Sim 91,4 8,6 87,2 – 94,8 5,2 – 12,8 356/395 39/395 Uso de algum tipo de droga Nunca Maconha Cocaína Maconha e cocaína Outras 65,9 7,6 12,9 9,3 4,3 58,9 – 73,8 4,6 – 11,3 7,5 – 17,4 5,4 – 14,1 1,7 – 7,8 237/395 37/395 61/395 42/395 18/395 Uso de drogas ilícitas injetáveis nos últimos 12 meses Não Sim 97,3 2,7 - 72/74 2/74 História de transfusão sanguínea Não Sim 89,4 10,6 84,9 – 93,2 6,8 – 15,1 340/395 55/395 Tatuagem e/ou body piercing Não 41,7 Sim 58,3 *Estimativas ajustadas pelo RDSat; **Intervalo de Confiança 34,1 – 50,9 49,1 – 65,9 154/395 241/395 Variável 44 4.5. Detecção de Anticorpos Anti-HTLV e do DNA Viral Todas as 402 amostras das MPS foram triadas para detecção de anticorpos para HTLV-1/2, sendo três reagentes pelo ELISA (Figura 7). A figura mostra sete cadeias de recrutamento de MPS. Cada círculo representa uma mulher incluída no estudo. Os círculos maiores representam as sementes e as setas indicam o sentido do recrutamento. As mulheres positivas para HTLV pelo ELISA estavam distribuídas em redes isoladas conforme a ilustração abaixo. Figura 7 - Rede social das mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO As três amostras reagentes pelo ELISA (3) foram testadas por Western blot, apenas uma (X-100) apresentou reatividade para as proteínas codificadas por gag (p19 e p24), bem como para as proteínas codificadas por env (GD21 e rgp46-I), sendo classificada como HTLV-1. As amostras sororeagentes pelo ELISA também foram submetidas à detecção do HTLV-DNA para as regiões tax, env e LTR, somente a amostra X-100 foi amplificada para as regiões analisadas, resultando em uma prevalência de 0,2% (IC 95% 0,0-1,6) para a infecção pelo HTLV-1 em MPS em Goiânia-GO (Tabela 4). 45 Tabela 4 - Detecção de anticorpos anti-HTLV por Western Blot e do HTLV-DNA pela PCR nas três amostras reagentes pelo ELISA Amostras Anti-HTLV-1 (Western Blot) X-100 X-160 X-234 +: positivo; -: negativo + - HTLV-DNA Tax + - Env + - LTR + - 4.6. Características da Mulher Profissional do Sexo Infectada pelo HTLV-1 A mulher profissional do sexo (X-100) infectada pelo HTLV-1, possuía 28 anos de idade, nove anos de escolaridade e referiu ser solteira. Iniciou a vida sexual aos 15 anos de idade, se prostituía em bar nos períodos diurno e noturno, relatou nunca ter usado nenhum tipo de droga ilícita. Porém, fazia ingestão de bebida alcoólica pelo menos três vezes por semana. Possui tatuagem e/ou body piercing e não tinha histórico de transfusão sanguínea. Informou o contato com oito parceiros na última semana, incluindo parceiros pagantes e não pagantes, referiu também o uso frequente de preservativo com ambos os parceiros. Relatou que apresentou corrimento no último ano, porém não teve ferida ou úlcera genital no mesmo período, mas procurou uma unidade de saúde para tratamento. 4.7. Análise Filogenética A única amostra positiva (X-100) para as regiões tax, env e LTR foi genotipada por sequenciamento direto para região LTR. Baseada na análise de seqüências nucleotídicas, identificou-se o subtipo HTLV-1a (Cosmopolita), subgrupo A (Transcontinental) (Figura 8). 46 X100 73 DQ471204 HB3102 69 JF271845 BRSP20608 Transcontinental 98 EU108724 CA423 91 GQ443755 k344 MT2 Japao 70 Cosmopolita ATM Japao HTLV1aB 49 77 94 H5 Japao HTLV1aB RKI4 Peru htlv1aE BO Argelia HTLV1aD 99 100 62 PR52 Marrocos HTLV1aD HS35 Caribe HTLV1aC ITIS Republica Democratica do Congo HTLV-1d 47 PYG19 Africa Central HTLV-1d Efe1 HTLV-1e Mel5 Melanesia HTLV1c 0.01 Figura 8 – Análise filogenética da região LTR do HTLV-1, incluindo isolados e sequências do GenBank dos subtipos a-e 47 5. DISCUSSÃO Na Região Centro-Oeste do Brasil, para nosso conhecimento, o presente trabalho representa o primeiro estudo sobre a infecção pelo HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo e também o primeiro que utilizou a metodologia RDS para análises de populações de difícil acesso em Goiás. Analisando as características sociodemográficas das MPS de Goiânia-GO, observou-se que a maioria das mulheres possuía a idade igual ou inferior a 30 anos, com mediana de 27,5 anos (DP: 9,1 anos), e predomínio de mulheres solteiras. Estes dados foram semelhantes aos encontrados em outros estudos conduzidos na mesma população no Brasil e outros países (Belza 2004, Caterino-de-Araújo et al. 2006, Inciardi et al. 2006, Aquino et al. 2008, Correa et al. 2008). Também, aproximadamente 70% das mulheres referiram dependentes econômicos, evidenciando-as como provedoras de suas famílias. Outros estudos mostraram resultados similares (Torres et al. 1999, Esposito & Kahhale 2006, Silva et al. 2010). Exercer a prostituição em outras cidades é prática comum entre essas profissionais, não só pela busca por melhores rendimentos, mas também para preservarem a identidade junto à sociedade e a própria família (Belza 2004, Passos & Figueiredo 2004, Aquino et al. 2008). De fato, aproximadamente 62,4% da população estudada relataram trabalhar ou já ter trabalhado em outras cidades, o que reforça a grande mobilidade geográfica desta população que, consequentemente, deve dificultar a realização de programas de educação em saúde e prevenção de infecções nesta população alvo. Ao contrário de um estudo conduzido no Brasil (Brasil 2004b), as mulheres entrevistadas exerciam suas atividades predominantemente em locais privados (casas fechadas, boates, cinemas, dentre outros), sendo as boates os principais pontos de encontros com clientes (41%) e essa parece ser uma característica comum da prostituição em Goiânia. Realmente, um estudo, conduzido por Lima & Silva (2008), sobre o turismo sexual na cidade, mostrou também que as MPS se prostituíam predominantemente em lugares fechados, como boates. Acredita-se, que esses ambientes ofereçam melhores condições de segurança, uma vez que proporcionam às mulheres menor exposição e mais anonimato (Bautista et al. 2009). 48 Em relação ao exercício do trabalho formal e informal, 94,3% das mulheres entrevistadas informaram já ter exercido outras atividades para obtenção de renda, sendo o trabalho doméstico o mais referido (37,6%) (dado não apresentado). O Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) relatou que a renda média mensal de um trabalhador doméstico no ano de 2009 era de R$ 395,20 (IBGE 2010), enquanto a renda referente ao último dia de trabalho na prostituição, relatada no presente estudo foi entre R$ 15,00 e R$ 1.500,00. Observa-se, então, que os ganhos com a prostituição oferecem para as mulheres melhor acesso aos bens de consumo e, consequentemente, melhor forma de sustento quando comparado ao valor recebido no mercado de trabalho formal. O contexto local e as circunstâncias do trabalho sexual são importantes para estimar os potenciais riscos à saúde, sendo o número de parceiros atendidos durante o trabalho uma variável importante, uma vez que a multiplicidade de parceiros pode favorecer a transmissão sexual do HTLV (Giuliani et al. 2000, Roucoux et al. 2005, Moxoto et al. 2007). Nesta investigação, 51,9% das mulheres entrevistadas afirmaram ter atendido mais de sete clientes na última semana de trabalho, incluindo parceiros pagantes e não pagantes. Também, um terço das mulheres relatou ter atendido três ou mais clientes por dia. Essa variável parece ser constante entre profissionais do sexo em diferentes países do mundo (Pando et al. 2006, Bautista et al. 2009, Qyra et al. 2011). Os resultados do presente estudo estão de acordo com o perfil elevado de atendimento das MPS no Brasil, tendo em vista que Damacena et al. (2011b) verificaram em dez capitais brasileiras que a metade das mulheres, atendia no mínimo três clientes por dia. Ainda, em relação transmissão sexual desse vírus, fatores como sexo sem proteção e histórias de DSTs podem estar associados à soropositividade ao HTLV-1 (Murphy et al. 1989b, Roucoux et al. 2005). Nas MPS estudadas, 49% relataram sinais sugestivos de infecções sexualmente transmissíveis e 8,6% referiram presença de ferida/úlcera na genitália nos últimos 12 meses. No presente estudo, a maioria das mulheres (87,1%) referiu o uso de preservativo com clientes pagantes nos últimos 30 dias, entretanto 36,3% deixaram de usar com parceiros não pagantes. Uma investigação conduzida pelo Ministério da Saúde em populações de risco, como MPS, afirma que o uso de preservativo nas relações sexuais está diretamente relacionado ao tempo médio de escolaridade, ou seja, quanto maior a escolaridade, maior será a frequência do uso de preservativo. Neste estudo, as 49 MPS de Goiânia-GO possuíam uma média de nove anos de estudo, e a maioria relatou o uso frequente de preservativo. Contudo, deve-se ressaltar que pressões sofridas no ambiente de trabalho como, concorrências entre colegas para a realização de programas e condições de vida podem afetar a negociação do programa com o cliente, comprometendo, assim, a regularidade do sexo seguro (Brasil 2004b). O uso de drogas lícitas e ilícitas está diretamente relacionado ao cotidiano das profissionais do sexo. A maioria usa drogas psicoativas como “instrumentos de trabalho”, pois facilita a entrega do corpo como mercadoria, e o seu efeito “tranquilizador/sedativo” minimiza as pressões emocionais e morais que a prostituição proporciona (Nunes & Andrade 2009, Moura et al. 2010). Nesta investigação, 85,2% das mulheres referiram a ingestão de bebida alcoólica nas quatro últimas semanas (dado não apresentado). O efeito do álcool pode proporcionar um estado de despreocupação e, consequentemente, diminui a capacidade de discernir situações de risco para a aquisição e transmissão de doenças (Passos & Figueiredo 2004, Chiao et al. 2006, Correa et al. 2008, Samet et al. 2010, Silverman et al. 2011). Interessante, o uso de drogas injetáveis parece infrequente na população de MPS do Brasil (Trevisol & Silva 2005, Sousa 2007, Miranda 2008). De fato, nas mulheres profissionais do sexo de Goiânia-GO, 34,1% relataram o uso de drogas ilícitas, mas apenas 2,7% afirmaram o uso de drogas injetáveis nos últimos 12 meses, e um estudo financiado pelo Ministério da Saúde revelou que a prevalência de MPS usuárias de drogas injetáveis foi de 3,0% na região Sul, declinando para 0,5% na região Sudeste (Brasil 2004b). A transfusão de sangue, antes da implantação da triagem sorológica para antiHTLV nos bancos de sangue, era considerada uma via importante de infecção desse agente viral (Catalan-Soares et al. 2003, Catalan-Soares et al. 2005, Moxoto et al.2005). De fato no Japão, a taxa de soroconversão para HTLV antes da triagem era de 60% (Okochi et al. 1984). Nesta investigação, história de hemotransfusão foi referida por apenas 10,6% da população estudada, dado inferior ao reportado por Bautista et al. (2009) em uma investigação conduzida na Argentina em MPS imigrantes e nativas (22,2%). O uso de tatuagem parece uma prática comum entre profissionais do sexo, que por sua vez pode contribuir para aquisição de patógenos de transmissão parenteral como 50 HTLV, apesar de muitas investigações não evidenciarem essa associação (Sodré et al. 2010, Rafatpanah et al. 2011). Entretanto, Chen et al. (1994) relataram prevalência duas vezes maior para infecção por esse vírus em usuários de drogas tatuados quando comparados aos não tatuados (2,7% vs. 1,4%). Neste estudo, a presença de tatuagem e/ou body piercing foi reportada por 58,3% das MPS, inclusive pela única profissional do sexo infectada pelo HTLV-1. No presente estudo a prevalência desta infecção em MPS de 0,2% (IC 95%: 0,01,6) foi concordante com as observadas em doadores de sangue da Região Centro-Oeste (0,2% a 0,7%) (Catalan-Soares et al. 2005) e em gestantes em Goiás (0,1%; IC 95%: 0,1-0,2) e Mato Grosso do Sul (0,1%; IC 95%: 0,1-0,2) (Oliveira & Avelino 2006, Dal Fabbro et al. 2008), como também a verificada em mulheres remanescentes de quilombos no Brasil Central (0,7%; IC 95%: 0,3-1,4) (Nascimento et al. 2009). Na Espanha, em investigação conduzida com esse grupo, a soroprevalência para HTLV-1 foi semelhante (0,3%; IC 95%: 0,1-0,6) (Belza 2004). Enquanto taxas superiores foram encontradas no Zaire (3,2%; IC 95%: 1,7-5,6 e 7,3%; IC 95%: 5,9-8,9) (Wiktor et al. 1990, Delaporte et al. 1995), Japão (5,1%; IC 95%: 3,3-7,9) (Nakashima et al. 1995) e Peru (21,8%; IC 95%: 1,2-25,9 e 3,8%; IC 95%: 1,5-8,4) (Wignall et al. 1992, Trujillo et al. 1999). No Brasil, estudos de prevalência para HTLV-1 em MPS são raros. Uma investigação conduzida nesse grupo em Santos-SP (2,8%; IC 95%: 1,7-4,4) (Bellei et al. 1996) mostrou uma taxa de soropositividade superior à encontrada em nossa região. No entanto, dados semelhantes ao do presente foram encontrados em Fortaleza (1,2%; IC 95%: 0,5-2,7) (Broutet et al. 1996) e Pará (1,8%; IC 95%: 0,7-4,0) (Sousa 2007). A análise filogenética do HTLV-1 identificou o subtipo Cosmopolita (HTLV-1a) do subgrupo Transcontinental (A), resultado similar ao reportado em MPS imigrantes na Espanha (Gutiérrez et al. 2004). No Brasil, este também foi o subtipo encontrado em uma comunidade afro-brasileira no Brasil-Central e em mulheres coinfectadas com HIV-1, em Feira de Santana-BA (De Almeida Rego et al. 2010, Martins et al. 2010). Nosso resultado corrobora com estudos anteriores que demonstraram maior frequência desse subtipo viral no Brasil (Segurado et al. 2002, Kashima et al. 2006, Santos et al. 2009). 51 Estudos têm mostrado que aspectos referentes ao comportamento sexual, como sexo sem proteção, sexo pago, múltiplos parceiros e presença de DST têm sido associados à soropositividade ao HTLV (Catalan-Soares et al. 2003, Belza 2004, Moxoto et al. 2005, Roucoux et al. 2005). Na presente investigação, apenas uma mulher foi DNA-HTLV positiva, tinha 28 anos de idade, baixa escolaridade, residia em Goiânia-GO, não se prostituía em outra cidade e o local de trabalho era um bar. Ela era solteira, bebia pelo menos três vezes por semana, relatou contato com oito clientes na última semana de trabalho, afirmou o uso frequente de preservativos com clientes pagantes e não pagantes, porém referiu corrimento nos últimos 12 meses, mas sem o desenvolvimento de feridas/ulcerações na genitália. Além disso, relatou possuir tatuagem e/ou body piercing. A baixa prevalência da infecção pelo HTLV observada nas profissionais do sexo em Goiânia-GO pode ser reflexo da baixa endemicidade do vírus em nossa região, além de outros fatores como a triagem clínica epidemiológica e sorológica do anti-HTLV nos bancos de sangue desde novembro de 1993 (Brasil 1993), a elevada frequência de uso de preservativos com clientes e baixo consumo de drogas injetáveis. Apesar da baixa circulação do HTLV em MPS em Goiânia-GO, estudos epidemiológicos sobre essa infecção são importantes para reforçar a necessidade de estratégias de prevenção baseadas na divulgação dos modos de transmissão e acompanhamento do status sorológico dos infectados, principalmente mulheres, minimizando, assim, a transmissão vertical e consequentemente à disseminação do vírus. 52 6. CONCLUSÕES A prevalência para HTLV-1 em mulheres profissionais do sexo em Goiânia-GO de 0,2% (IC 95%: 0,0-1,6), indica a baixa endemicidade para esta infecção na população estudada; Múltiplos parceiros, sintomas de DST, possuir tatuagem e/ou body piercing foram características de risco para infecção pelo HTLV-1 relatadas pela MPS infectada; Análise filogenética do HTLV-1 identificou o subtipo Cosmopolita (HTLV-1a), subgrupo Transcontinental (A), corroborando com outros estudos realizados no Brasil, comprovando a predominância deste na Região Centro-Oeste e no Brasil. 53 7. 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