título do resumo

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EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM ÓLEO DE PEIXE SOBRE O CURSO
DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL in vivo E in vitro POR Trypanosoma cruzi.
2015-2016
Helena Tiemi Suzukawa, Maria Isabel Lovo-Martins, Phileno Pinge Filho,
[email protected]
Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas (CCB)
Área e subárea do conhecimento: Ciências Biológicas/Imunologia.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi; óleo de peixe; Células Dendríticas.
Resumo
A resposta imune inata na fase aguda da infecção por Trypanosoma cruzi, com
participação de macrófagos e células dendríticas, é importante para o controle
da carga parasitária e desenvolvimento da resposta imune adaptativa contra o
parasito. A suplementação com fontes de ácidos graxos poli-insaturados n-3
(PUFAs n-3), ou ômega-3, está associada com redução da inflamação e
diminuição da resistência a doenças infecciosas. O objetivo deste trabalho foi
investigar a influência dos PUFAs n-3 na infecção experimental in vivo e in vitro
por T. cruzi. Camundongos C57BL/6 foram suplementados diariamente por
gavagem com PBS, óleo de milho (rico em PUFAs n-6) ou óleo de peixe (rico
em PUFAs n-3) (0,6% v/w) por 15 dias antes da infecção por T. cruzi Y e
durante o curso da infecção. Para posteriores estudos in vitro foram testados
protocolos de derivação de células dendríticas a partir da medula óssea de
camundongos C57BL/6. No 7º dia pós infecção (dpi), camundongos tratados
com óleo de peixe apresentaram maior parasitemia (p<0,0001), melhora na
contagem de plaquetas (p<0,001) e de leucócitos (p<0,0001) e menor
parasitismo cardíaco (p<0,001) no 12º dpi. A obtenção de células dendríticas a
partir da medula óssea de camundongos está sendo padronizada utilizando a
metodologia descrita por Lutz e cols. (1999), com modificações. Nossos
resultados indicam que a suplementação com óleo de peixe apresenta
potencial em atenuar o curso da infecção por T. cruzi em camundongos.
Introdução
A Doença de Chagas (DC) é uma doença tropical negligenciada que acomete
cerca de 6 a 7 milhões de pessoas na América Latina, entretanto têm sido
relatados casos de pacientes chagásicos em outros continentes em que a
doença não é endêmica (WHO, 2016).
1
O uso de suplementos à base de PUFAs n-3 ou popularmente conhecido
como ômega-3, é largamente utilizado pelas pessoas visando a redução de
triglicerídeos, diminuição de arritmias cardíacas, tromboses, diminuição da
pressão arterial e pelo seu próprio efeito anti-inflamatório (BRADBERRY;
HILLEMAN, 2013), entretanto ainda não são bem elucidados seus efeitos em
doenças infecciosas, onde uma resposta imunológica eficiente é necessária
para controlar e eliminar o agente etiológico da doença, como no caso da DC, o
protozoário T. cruzi.
Procedimentos metodológicos
Foram utilizados camundongos isogênicos das linhagens C57BL/6 machos de
8 a 12 semanas de idade (Processo 111/2015), tratados via gavagem com óleo
de milho, óleo de peixe e PBS por 15 dias antes da infecção por 5x10 3 formas
tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 3 dias pós infecção (dpi), foi
realizada parasitemia em dias alternados, sendo os resultados expressos por
números de parasitas/ml de sangue. A hematologia dos animais experimentais
foi realizada no 5º, 7º, 12º dpi. Para análise histológica, foram coletados os
corações no 12º dpi, sendo as lâminas contadas em aumento de 400x. Para
derivação de células dendríticas de medula óssea foi testado o protocolo
descrito por Lutz (1999). Protocolos com alterações estão sendo padronizados
em nosso laboratório. Para a análise estatística foram empregados testes de
Análise de Variância (ANOVA), seguido do pós-teste de comparação múltipla
Bonferroni. Os dados foram analisados no programa de computador PRISM
(versão 5.0, GraphPad, San Diego, USA). Valores de p<0,05 foram
considerados significativos.
Resultados e Discussão
No 7º dia após a infecção, camundongos tratados com óleo de peixe
apresentaram maior parasitemia (p<0,0001) como pode ser observado na
Figura 1.
Figura 1: Efeito da suplementação com PUFAs no curso da infecção por T. cruzi.
Segundo Marcondes e colaboradores (2000), a infecção por T. cruzi pode estar
associada à anemia, trombocitopenia, leucopenia e aplasia medular, aliado a
2
isso, PUFAs n-3 podem ser substratos para as enzimas cicloxigenases 1 e 2
(COX-1 e COX-2) e 5-lipoxigenase (5-LO), produzindo eicosanoides e
leucotrienos menos inflamatórios (CALDER, 2002). Além disso, PUFAs n-3
também possuem a capacidade de suprimir monócitos de sintetizarem citocinas
pró-inflamatórias, importantes para o controle do parasito na fase aguda da
doença (PUERTOLLANO et al., 2005). No entanto, em nossos experimentos o
tratamento com óleo de peixe demonstrou uma melhora na contagem de
plaquetas (p<0,001) e de leucócitos (p<0,0001), além de menor parasitismo
cardíaco (p<0,001) no 12º pós-infecção (Figura 2).
Figura 2: I) Efeito da suplementação com PUFAs na leucopenia (A) e trombocitopenia (B) em camundongos
infectados por T. cruzi (Y) no 5º, 7º e 12º dia após a infecção. II) Efeito da suplementação com PUFAs nos
ninhos de amastigotas no tecido cardíaco de camundongos C57BL/6 infectados por T. cruzi (12º dia após a
infecção).
A padronização dos protocolos de células dendríticas provindas da medula
óssea, seguiu o protocolo proposto por Lutz (1999), com alterações. Resultando
em duas fenotipagens. Na Figura 3B, foram obtidas células através do protocolo
original e fenotipadas com os marcadores CD11c (marcador de células dendríticas)
e CD45 (molécula coestimulatória), mostrando que 33,2% das células obtidas
selecionadas no gate R2 são CD11c+ e 1,8% CD11C+/CD45+. A fenotipagem
seguinte foi feita a partir de células que foram diferenciadas pelo mesmo protocolo,
mas com redução dos dias de cultivo e estímulo. As marcações foram feitas com
CD11c, CD11b (marcador de monócitos e macrófagos, mas pode estar presente
em células dendríticas também) e MHCII. Entretanto, obtivemos alta concentração
de células marcadas com CD11b+, indicando a predominante presença de
macrófagos na cultura. A caracterização mostra que 51,3% das células obtidas
selecionadas no gate R2 são CD11b+/MHCII+(Figura 4B).
Figura 3: Caracterização de células dendríticas diferenciadas a partir da medula óssea de camundongos
C57BL/6. A) Estratégia de gate. B) Células de R2 analisadas por citometria de fluxo (Accuri C5, BD
biosciences) para a presença de marcadores CD11c e CD45 (eBioscience).
3
Figura 4: Caracterização de células dendríticas diferenciadas a partir da medula óssea de camundongos
C57BL/6. A) Estratégia de gate. B) Células de R2 analisadas por citometria de fluxo (Accuri C5, BD
biosciences) para a presença de marcadores CD11b e MHCII (eBioscience).
Conclusões
Nossos resultados indicam que a suplementação com óleo de peixe apresenta
potencial em atenuar o curso clínico da infecção por T. cruzi em camundongos. A
investigação dos efeitos dos PUFAs em células do sistema imune inato, como
células dendríticas, é pertinente para elucidar os mecanismos que levam aos
fenômenos observados in vivo.
Referências
WHO. American Tripanosomiasis (Chagas Disease). Disponível em:
<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/> Acesso em: 05 abr.
2016.
BRADBERRY, J. C.; HILLEMAN, D. E. Overview of Omega-3 Fatty Acid
Therapies. P&T, v. 38, n. 11, 681-691, 2013.
LUTZ, M. B.; KUKUTSCH, N.; OGILVIE, A. L. J.; RÖBNER, S.; KOCH, F.;
ROMANI, N.; SCHULER, G. An advanced culture method for generating large
quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of
Immunological Methods, v. 223, n. 1999, 77-92, 1999.
CALDER, P. C. Dietary modification of inflammation with lipids. Proceedings of
Nutricion Society, v. 61, n. 3, 58-345, 2002.
MARCONDES, M. C. G.; BORELLI, P.; YOSHIDA, N.; RUSSO, M. Acute
Trypanosoma cruzi infection is associated with anemia, thrombocytopenia,
leucopenia and boné marrow hypoplasia: reversal by nifurtimox treatment.
Microbes and Infection, v. 2, 347-352, 2000.
PUERTOLLANO, M. A.; CRUZ-CHAMORRO, L.; PUERTOLLANO, E.; PÉREZTOSCANO, M. T.; ALVAREZ, D. E.; CIENFUEGOS, G.; DE PABLO, M. A.
Assessment of interleukin-12, gamma interferon, and tumor necrosis factor
alpha secretion in sera from mice fed with dietary lipids during different stages
of Listeria monocytogenes infection. Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology, v. 12, n. 9, 1098-1103, 2005.
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