Trabalho nº. 1 - Universidade Fernando Pessoa

UNIVERSIDADE FERNANDO PESSOA
Faculdade de Ciências da Saúde
Trabalhos Práticos
Bioquímica Fisiológica
Licenciaturas em:
Fisioterapia
Enfermagem (Ponte de Lima)
2007/08
Índice
Trabalho nº. 1 – Doseamento de glucose em plasma humano ......................................... 3
Trabalho nº. 2 - Respiração mitocondrial ......................................................................... 6
Trabalho nº. 3 - Metabolismo de Aminoácidos: Determinação da actividade da
transaminase glutâmico-pirúvica em músculo cardíaco ................................................... 9
Trabalho nº. 4 – Digestão de hidratos de carbono .......................................................... 12
Trabalho nº. 5 – Quantificação do colesterol total e do colesterol HDL ........................ 20
Trabalho nº. 6 – Análise de hormonas esteróides por TLC ............................................ 25
Trabalho nº. 1 – Doseamento de glucose em plasma
humano
Introdução
A determinação da glicemia faz parte das análises laboratoriais mais importantes e
mais frequentes. Os métodos enzimáticos para o doseamento da glucose têm sobre
os outros métodos (processos de redução) a inestimável vantagem de serem simples
e rigorosamente específicos da glucose.
Os resultados das campanhas de despistagem precoce mostram que, em cada dois
diabéticos, um não está ainda reconhecido. Mas, quanto mais cedo se estabelece o
diagnóstico, tanto melhor é o prognóstico. Afecções tardias, principalmente macroe microangiopatias, podem ser evitadas ou, pelo menos, detidas pelo tratamento
dietético e medicamentoso.
A pesquisa de diabetes é especialmente importante em doentes com antecedentes
familiares de diabetes, obesidade, lipémia, perturbações circulatórias coronária,
periférica e cerebral, hipertensão, pielonefrite, durante a gravidez, em afecções
crónicas cutâneas, prurido, furunculose, micose e neuropatias.
As determinações da glicemia são indispensáveis tanto para o reconhecimento,
como para o controle da terapêutica e da evolução de diabetes mellitus. Cerca de
um terço dos diabéticos não apresentam temporariamente glicosúria, apesar de
terem hiperglicemia significante.
Ainda mais importante que a análise da glicemia em jejum, que na diabetes ligeira
pode estar dentro dos limites normais, é a determinação da glicemia duas horas
depois duma refeição rica em hidratos de carbono. Reconhece-se mais exactamente
uma perturbação metabólica diabética com o “teste de sobrecarga de glucose” que
permite verificar a presença não só da diabetes manifesta, como também da latente.
Como método simples de pesquisa de diabetes, depois da realização do teste de
sobrecarga de glucose pode determinar-se somente o importante valor da glicemia
após 2 horas.
Teste oral de tolerância à glucose.
Sobrecarga de glucose com 50 g de glicose
Em jejum
Após 1 hora
Após 2 horas
< 100 mg/dl
< 160 mg/dl
< 120 mg/dl
valores normais
100-130 mg/dl
160-220 mg/dl
120-150 mg/dl
suspeito
> 130 mg/dl
> 220 mg/dl
> 150 mg/dl
diabético
Tabela nº 1. Valores obtidos no teste oral de tolerância à glucose em jejum e 1 ou
2 horas após a ingestão de 50 g de glucose.
No ser humano, as concentrações normais de glicemia oscilam nos seguintes
valores: 70 - 110 mg/dl pela manhã e em jejum.
Objectivo
Neste trabalho prático será efectuada a determinação enzimática da concentração de
glucose em duas amostras de plasma provenientes do mesmo indivíduo, colhidas em
jejum e 60 min após a ingestão de 100 g de glucose. O aluno deverá saber interpretar o
significado clínico e patológico dos resultados obtidos.
Princípio
O método utilizado é um método indirecto e enzimático em que a glucose é
inicialmente oxidada a ácido glucónico e peróxido de hidrogénio numa reacção
catalisada pela glucose oxidase:
glucose + 2 H2O + O2
glucose oxidase
ácido glucónico + H2O2
O peróxido de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a 4aminoantipirina e o p-hidroxibenzenossulfonato para formar a quinoneimina, que
possui um máximo de absorção ao comprimento de onda de 505 nm. A intensidade
da cor produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de
glucose na amostra:
2H2O2 + p-hidroxibenzenossulfonato + 4-aminoantipirina
peroxidase
quinoneimina + 4H2O
Material
. Espectrofotómetro UV/Vis
. Células (acrílico, volume reduzido)
. Pipetador
. Micropipeta automática de 1000 l
. Micropipeta automática de 20 l
. Suporte para tubos eppendorf
. Tubos eppendorf
. Cronómetro
Reagentes
. 2 Amostras de plasma humano liofilizado e reconstituído, identificadas
como:
- J (amostra colhida em jejum);
- 1H (amostra colhida ao fim de 1 hora após ingestão de 100 g de
glucose);
. Solução padrão de glucose (100 mg/dl)
. Reagente para a determinação de glucose com a seguinte composição
(pH=7,0  0,1):
- 4-aminoantipirina
5 x 10-4 mol/l
- p-hidroxibenzenossulfonato 2 x 10-2 mol/l
- glucose oxidase
15 000 U/l
- peroxidase
10 000 U/l
Procedimento experimental
1. Ligar o espectrofotómetro e ajustar o comprimento de onda para 505 nm
2. Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância
3. Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações:
Branco; Padrão; J e 1H
4. Pipetar 1 mL da solução “reagente para a determinação de glucose” para cada
um dos tubos
5. Pipetar 5 l de água desionisada para o tubo com a designação Branco e
inverter para agitar
6. Aguardar 45 seg e pipetar 5 l de solução padrão de glucose para o tubo com
a designação Padrão, agitar por inversão.
7. Respeitando um intervalo de 45 seg, pipetar também 5 l de cada uma das
amostras de plasma para os respectivos tubos (J e 1H). Misturar por inversão
suave dos tubos
8. Incubar à temperatura ambiente durante exactamente 16 min (contando o
tempo a partir da última adição de plasma).
9. Ler as absorvâncias (a 505 nm) segundo a ordem de preparação dos tubos e
respeitando um intervalo de 45 seg entre as amostras.
Resultados
Determine a concentração de glucose para cada amostra usando uma interpolação
linear:
- A cada medição, subtrair a absorvância do tubo “branco”, a fim de
eliminar a contribuição da cor do reagente.
- Calcular a concentração de glucose nas amostras, por proporcionalidade
directa com o padrão.
Diga se o plasma testado lhe parece pertencer a um indivíduo com um distúrbio
metabólico.
Trabalho nº. 2 - Respiração mitocondrial
Introdução
Este exercício serve para examinar várias reacções da respiração mitocondrial. A
preparação foi feita a partir de bife de coração de vaca. Preparou-se uma solução de
citoplasma, uma de mitocôndrias e uma que é a mistura das duas. A transferência de
electrões é evidenciada pela redução (descoloração) do DCIP (2,6-dicloroindofenol)
que, tal como o azul de metileno, é azul escuro na sua forma oxidada e passa a
transparente na sua forma reduzida.
Procedimento Experimental
Parte I – Preparação dos extratos celulares de coração de vaca
1.
Retirar toda a gordura e fibras de
cerca de 200 g de bife de coração de vaca
2.
Cortar o músculo aos pedaços
pequenos
Feito pelo professor
3. Separar 5,0-7,5 g de músculo e colocar num copo de vidro;
4. Adicionar 50 mL de fosfato de potássio, 0.1 M a pH=7.4 e liquefazer usando
uma varinha mágica;
5. Transferir a mistura para tubos Falcon de 50 mL;
6. Centrifugar esta solução espessa a 6000 rpm durante 10 minutos;
7. O sedimento forma uma fase compacta e rosada na parte inferior do tubo e uma
fase superior menos compacta e cinzenta (que contém as mitocôndrias) com um
fluído sobrenadante vermelho claro (citosol);
8. Remover o sobrenadante cuidadosamente; distribuir por dois tubos. Um dos
tubos deve ser guardado congelado para o trabalho prático das reacções de
transaminação.
9. Adicionar suavemente 20 mL de tampão fosfato à fase cinzenta contendo as
mitocôndrias. Ressuspender suavemente as mitocôndrias (tendo cuidado para
não ressuspender os detritos celulares) e retirar para novo tubo;
10. Centrifugar o tubo das mitocôndrias e o tubo do citosol a 6000 rpm durante 10
minutos;
11. Depois da centrifugação, o citosol (citoplasma) é transferido para novo tubo,
tentando evitar qualquer contaminação com material insolúvel presente no
primeiro - esta solução será chamada CITOPLASMA;
12. Retirar o sobrenadante do tubo das mitocôndrias e descartar;
13. Ressuspender as mitocôndrias em 15 mL de tampão fosfato – esta solução será
chamada MITOCÔNDRIAS.
14. Se não forem usadas imediatamente, as soluções de citoplasma e mitocôndrias
devem ser guardadas no congelador, devidamente identificadas.
Nota: Normalmente, um eppendorf de cada uma destas soluções é suficiente para cada
grupo.
15. Retirar 5mL da solução de mitocôndrias e 5 mL da solução de citoplasma e
misturar num novo tubo - esta solução será chamada EXTRATO DE
CORAÇÃO DE VACA.
Parte II – Que substratos são oxidados pelo extracto de coração de vaca?


A oxidação é indicada pela redução (descoloração) do DCIP (solução stock:
0.5mM ou 0.145mg/mL).
O tampão é 0.1M fosfato de potássio, pH=7.4.
Protocolo experimental:
1. Preparar 5 tubos de reacção;
2. Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo:
I. Controlo sem substrato: 12 gotas de água;
II. Citrato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de citrato de sódio;
III. -cetoglutarato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de -cetoglutarato (sal
de sódio);
IV. Succinato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio;
V. NADH: 10 gotas de água, 2 gotas de 10mM de NADH (7.09 mg/mL).
3.
4.
5.
6.
As reacções são iniciadas pela adição de 2 gotas de extracto de coração de vaca;
Misturar bem;
Deixar os tubos à temperatura ambiente durante 10 minutos;
Avaliar a mudança de cor nos vários tubos.
Parte III – Identificação das fracções celulares activas que promovem as reacções
de oxidação
Protocolo experimental:
1.




Preparar 3 tubos com a seguinte composição:
4 gotas de tampão
2 gotas de DCIP em cada tubo
10 gotas de água
2 gotas de 0.1M de succinato de sódio;
2.




Preparar 3 tubos com a seguinte composição:
4 gotas de tampão
2 gotas de DCIP em cada tubo
10 gotas de água
2 gotas de 10 mM de NADH;
3. Para cada grupo de 3 tubos adicionar:
 2 gotas de extracto de coração de vaca no primeiro tubo;
 2 gotas de solução de citoplasma no segundo tudo;
 2 gotas de solução de mitocôndrias no terceiro tubo.
4. Avaliar a mudança de cor nos vários tubos.
Parte IV– Identificação da especificidade de inibição pelo malonato
Preparar uma solução stock de 0.1M de malonato de sódio.
Protocolo experimental:
1. Preparar 4 tubos de reacção;
2. Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo:
I. Succinato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio;
II. Succinato+malonato: 8 gotas de água, 2 gotas de succinato, 2 gotas de
malonato;
III. NADH: 10 gotas de água, 2 gota de NADH;
IV. NADH+malonato: 8 gotas de água, 2 gotas de NADH, 2 gotas de
malonato;
3.
4.
5.
6.
As reacções são iniciadas pela adição de 2 gotas de solução de mitocôndrias;
Misturar bem;
Deixar os tubos à temperatura ambiente durante 10 minutos;
Avaliar a mudança de cor nos vários tubos.
Relatório
1. Que substratos são usados pelo extracto de coração?
2. Em que compartimento(s) celular(es) decorrem as actividades oxidantes que
foram observadas?
3. Que outros reagentes serão necessários para se ver oxidação do citrato e do cetoglutarato?
4. Comparar as estruturas do succinato e do malonato e sugerir uma explicação
para o comportamento do malonato.
5. Indicar num diagrama da cadeia de transporte de electrões, onde é que o DCIP
está a aceitar electrões e qual é o complexo inibido pelo malonato.
6.
Que inibidor se poderia utilizar para inibir a oxidação do NADH? Como
actuaria?
Trabalho nº. 3 - Metabolismo de Aminoácidos:
Determinação
da
actividade
da
transaminase
glutâmico-pirúvica em músculo cardíaco
Introdução
Numa reacção de transaminação, o grupo -amino de um aminoácido é transferido para
um -cetoácido, produzindo-se os respectivos -cetoácido e -aminoácido
correspondentes.
R1.CHNH3+.COO+
R2.CO.COO-
R1.CO.COO+
R2.CHNH3+.COO-
Muitas reacções de transaminação ocorrem nos tecidos, catalisadas por transaminases
específicas para um determinado par aminoácido/cetoácido. As reacções são reversíveis,
sendo o equilíbrio da reacção deslocado de acordo com os reagentes em excesso.
As duas transaminases mais importantes, em termos de actividade quantitativa são:
1 - Transaminase glutâmico-oxaloacética (GOT), também designada por
aspartato transaminase, que catalisa a reacção:
L-Aspartato + -cetoglutarato
Oxaloacetato + L-glutamato
2 - Transaminase glutâmico-pirúvica (GPT), também designada por alanina
transaminase, que catalisa a reacção:
L-Alanina + -cetoglutarato
Piruvato + L-glutamato
Estas transaminases utilizam como grupo prostético o piridoxal-fosfato.
A actividade das transaminases em tecido pode ser investigada, incubando um
homogeneizado com o respectivo par aminoácido-cetoácido. A transaminação ocorrida
pode ser observada por cromatografia pela formação do novo aminoácido. A
reversibilidade da reacção pode ser demonstrada, utilizando o par aminoácido-cetoácido
complementar, como reagentes iniciais.
Procedimento Experimental
Reagentes
Piruvato de sódio 0,1M
L-glutamato 0,1M
Leucina 0,1M
α-cetoglutarato 0.1 M
D-glutamato 0,1 M
Tampão fosfato pH 7,4
Etanol
Padrões: L-alanina e L-glutamato
Placas de T.L.C. (sílica gel)
Solução de naftoquinona
Solvente: propanol:NH4OH a 33% (70:30)
Material
Banho
Material de vidro: tubos de centrífuga e pipetas
Pipeta automática
Método
A - Incubação do extracto com vários substratos
1 - Preparar 8 tubos de centrífuga: A, B, C, D, E, F, G e H.
2 - Pipetar os seguintes reagentes:
Piruvato Na (mL)
L-Glutamato (mL)
L-Leucina (mL)
D-Glutamato (mL)
L-Alanina (mL)
-Cetoglutarato
(mL)
Fosfato 0,05M (mL)
A
0,5
0,5
B
0,5
C
0,5
D
0,5
E
F
G
0,5
0,5
0,5
H
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
3 - Adicionar 0,5 mL de extracto de coração (preparado no trabalho da Respiração
Mitocondrial) a cada tubo.
4 - Incubar a 37ºC, durante 30 minutos.
5 - Parar a reacção com a adição de 1,5 mL de etanol.
6 - Esperar um pouco e centrifugar os tubos.
7 - Testar os sobrenadantes por T.L.C.
C - T.L.C.
1 - Aplicar 5 l das amostras a testar e ao mesmo tempo padrões de L-alanina e Lglutamato de acordo com o esquema:
º
Ala
º
A
º
B
º
C
º
Glu
º
D
º
E
º
F
º
Ala
º
G
º
H
º
Glu
2 - Desenvolver a placa durante pelo menos de 40 min. Secar a placa.
3 - Pulverizar com a solução de naftoquinona e colocar na estufa 3 a 5 minutos.
Resultados
1 - Faça um esquema das placas de cromatografia.
2 - Que conclusões pode tirar no que respeita à especificidade da enzima e
reversibilidade da reacção?
3 - Indique se o extracto utilizado continha quantidades detectáveis de aminoácidos ou
cetoácidos.
Trabalho nº. 4 – Digestão de hidratos de carbono
Introdução
A nutrição é definida como um conjunto de fenómenos físico-químicos e
fisiológicos que ocorrem no interior do organismo e mediante os quais este recebe
e utiliza os materiais fornecidos pelos alimentos, que lhe são necessários para a
formação e manutenção da sua matéria viva e para a realização das actividades,
próprias quer da vida vegetativa, quer da vida de relação e trabalho. No conceito
anglo-saxónico, nutrição é o estudo dos nutrientes contidos nos alimentos, desde
que são ingeridos até que os produtos finais do seu metabolismo são excretados.
Assim, inclui os processos de digestão e absorção, as reacções catabólicas e
anabólicas e o estudo das necessidades de nutrição para todos os segmentos do
organismo da pessoa saudável.
O conjunto de acções sofridas pelos alimentos no tubo digestivo, desde a boca, que
levam ao “desdobramento” dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas
em partículas suficientemente pequenas para passarem a parede intestinal e
entrarem na circulação, corresponde à digestão.
Os sistemas complexos de que dispõem o aparelho digestivo do homem para
separar os alimentos nos seus nutrientes que vão ser, posteriormente, absorvidos,
assentam num processo básico, que consiste na actualização de enzimas
desagregadoras das grandes moléculas dos constituintes alimentares, sendo os
hidratos de carbono convertidos em glicose e outros açucares simples (6 átomos de
carbono), as gorduras em ácidos gordos e glicerol e as proteínas em aminoácidos.
As enzimas estão contidas nos sucos digestivos da boca, estômago e intestino e são
produzidas por glândulas específicas, controladas pelos sistemas nervoso e
endócrino.
As bactérias da parte terminal do intestino podem desempenhar algum papel na
digestão de certos alimentos, em especial dos constituintes do tipo da celulose, ou
fibra, que, resistindo às enzimas digestivas, podem sofrer modificações por acção
das celulases bacterianas.
Normalmente, mais de 90% dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas
que formam os alimentos são completamente digeridos e absorvidos, mas os ácidos
gordos e os aminoácidos essenciais são absorvidos em mais de 98%.
Em fisiologia, a absorção é a penetração de uma substância através das mucosas ou
da pele ou da membrana celular para o meio interno do organismo ou para o
protoplasma celular. Em nutrição, a absorção corresponde à passagem através da
mucosa do tubo digestivo dos nutrientes que fazem parte da constituição dos
alimentos e atingem a corrente sanguínea. A absorção faz- -se, principalmente, ao
nível do intestino delgado e do cólon, de forma selectiva para cada um dos
nutrientes. Os processos fisiológicos da absorção são para certos nutrientes através
de mecanismos simples, por osmose, mas na generalidade envolvem reacções
complexas de passagem para o interior das células da mucosa e, posteriormente, do
meio interno destas para os capilares sanguíneos ou linfáticos. Nestas reacções,
muito delas ainda mal conhecidas, intervêm iões e moléculas ionizadas, enzimas e
hormonas.
Introdução
A maior parte dos alimentos é ingerida sob formas que o organismo não pode
utilizar directamente, por serem sólidos ou não serem absorvidos no tubo digestivo.
Desta forma, os alimentos precisam de sofrer a mastigação para se produzir a
ruptura de parte das suas estruturas e, posteriormente, serem decompostos em
moléculas suficientemente pequenas para passarem a mucosa da parede intestinal e
atingirem a corrente sanguínea.
A desintegração dos alimentos ingeridos em formas assimiláveis é facilitada pelas
operações prévias de cozedura, e constitui o processo inicial de digestão.
Na boca, os alimentos vão libertando os seus hidratos de carbono simples e
complexos, que começam a ser desintegrados pelos processos de trituração e da
digestão enzimática, em resultado dos movimentos de mastigação, pela acção
múltipla da saliva, que actua pela sua qualidade de líquido humidificante e
lubrificante e veículo da enzima amilase e de elementos minerais.
A saliva é produzida por três pares de glândulas salivares e é formada por cerca de
99,5% de água, pelo que favorece a dissolução de moléculas que a mastigação vai
libertando dos alimentos sólidos, e inicia o ataque, pela amilase, dos
polissacarídeos que são sensíveis à sua acção.
A amilase actua sobre o amido e o glicogénio, em presença de cloro, que é
indispensável, desdobrando-os em dextrinas e maltose, de que é corrente
apercebermos o sabor adocicado. Mas este efeito não tem significado relevante em
digestão porque é de curta duração, e cessa quando o bolo entra em contacto com o
suco gástrico estomacal. Este é praticamente inactivo no desdobramento dos
polissacarídeos.
No intestino, o conteúdo do estômago (quimo) chegado intermitentemente, de
consistência cremácea, vai sofrer desde o duodeno, e após se tornar alcalino, a
acção de enzimas pancreáticas (amilase pancreática de efeito semelhante ao da
amilase salivar) e intestinais segregadas pelas glândulas de Brunner do duodeno e
de Lieberkuhn (dissacaridases: sacarase, lactase, maltase e isomaltase).
Sabe-se que existem várias dissacaridases, dentro das designações genéricas
indicadas, sendo quatro particularmente importantes:
- maltase Ia: hidrolisa 50% da maltose e toda a isomaltose.
- maltase Ib (invertase ou sacarase): hidrolisa a totalidade da sacarose e
25% da maltose. Possui uma rápida actividade.
- Maltases II e III: dissociam os restantes 25% de maltose.
No intestino grosso há acção variável da flora intestinal, actuando pelas enzimas
hidrolases sobre alguns polissacarídeos não decompostos na parte superior do
intestino, como a hemicelulose e, em menor extensão, a celulose, que além de
fermentações gasosas, podem produzir alguma glicose.
Princípio
A função aldeídica ou cetónica é susceptível de ser oxidada; as aldoses e cetoses
vão, portanto, comportar-se como redutores e, em particular, vão poder reduzir os
sais metálicos, em solução alcalina, até ao estado de metal ou até ao grau de
oxidação inferior. Um dos reagentes mais utilizados para detectar a presença de
açucares redutores e para os dosear consiste num sal cúprico (Cu2+). O processo de
oxidação das oses ocorre com a redução do hidróxido cúprico, em meio alcalino, de
cor azul e solúvel, em hidróxido cuproso, amarelo e insolúvel. Pelo aquecimento à
fervura, este desidrata-se e converte-se em óxido cuproso, dando origem a um
precipitado vermelho-tijolo:
açúcar reduzido + 2 Cu(OH)2
2 CuOH

açúcar oxidado + CuOH + H2O
Cu2O  + H2O
Esta reacção ocorre com todas as moléculas de aldoses e cetoses que têm, senão um
grupo aldeídico ou cetónico livre, pelo menos pseudoaldeídico ou pseudocetónico
susceptível de fornecer um grupo livre à medida que o estado de equilíbrio da
solução se desloca em função da própria reacção.
A maltose, um di-holósido redutor (a função hemiacetálica de uma das oses está
envolvida numa ligação osídica com um hidroxilo alcoólico da segunda ose), é um
produto intermediário da hidrolise - ácida ou enzimática - de poli-holósidos, tais
como o amido e o glicogénio. É formada pela união de duas moléculas de Dglucose através de uma ligação -1,4-glicosídica.
Figura 1. Estrutura química da maltose.
O amido é a forma de reserva glucídica nos vegetais. Encontra-se em geral na
forma de grãos de amido cuja morfologia só varia de acordo com a espécie vegetal.
Na maior parte dos casos é formado por dois constituintes:
- a amilose, um poli-holósido de cadeias lineares, formada de unidades de Dglucose ligadas entre si por ligações -1,4-glicosídicas. Adimite--se hoje, graças ao
estudo dos espectros de raios-X, que a cadeia está disposta em hélice com 6 anéis
glucopiranósicos, de configuração em cadeira, em cada volta. Esta estrutura explica
a cor azul obtida com o iodo: as moléculas de halogéneo dispor-se-ão ao longo do
eixo da hélice sob a forma de um complexo iodo-amilose devido a forças
dipolares electrostáticas. Esta propriedade desaparece pela fragmentação da
molécula de amilose, na hidrólise.
Figura 2. Estrutura química da amilose.
- a amilopectina, um polissacarídeo cuja massa molecular pode atingir muitos
milhões e é formado de cadeias principais idênticas às da amilose, mas sobre as
quais vêm ligar-se, através de ligações -1,6-glicosídicas, as cadeias laterias que
apresentam estrutura idêntica à das cadeias principais e cujo comprimento varia de
20 a 25 resíduos de glucose.
Material
. Estufa a 37ºC (incubação das amostras)
. Placa de aquecimento com banho-maria (100 ºC)
. Tubos de ensaio em vidro (10 mL)
. Suporte e molas para tubos de ensaio
. Pipetas volumétricas (3 mL, 4 mL, 5 mL)
. Pipetas Pasteur
. Vórtex
. Pipetador
. Cronómetro
Soluções - (já preparadas)
. Solução de amido: dissolver 1 g de amido em 100 mL de H2O destilada
com aquecimento.
. Lugol: dissolver 1 g de iodo e 2 g de iodeto de potássio em 300 mL de
água.
. Reagente de Benedict: Dissolver 5 g de carbonato de calcio; 8,5 g de
citrato de sódio e 0,85 g de sulfato de cobre em 500 mL de H2O.
. Solução de -amilase (tipo VI-B) diluída de forma a ficar 300
unidades/mL (equivalente à saliva).
Experiência 1
Identificação de
amilopectina)
amido
(homopolissacárido
de
glucose;
amilose
T1
0.1 mL de amido diluído
3 mL de H2O
1 gota de lugol
----------------------------------------------Observar a cor
----------------------------------------------Incubar a 37ºC até mudança de cor
Incubar a 100ºC até mudança de cor
----------------------------------------------Observar a cor
----------------------------------------------Arrefecer em H2O fria
Observar a cor
Numa tabela registe as diversas cores obtidas e explique o seu significado.
Experiência 2
Identificação de açúcares redutores
Açúcar redutor + 2 Cu(OH)2
(aldose/cetose)
2 CuOH
açúcar oxidado + CuOH + H2O
Cu2O  + H2O
temperatura
T1
1 mL glucose 0.25 % (m:v)
3 mL de Benedict
agitar e ferver 5’
Observar a cor
Qual a cor final ?
Que conclusão retira quanto à glucose ?
e
Experiência 3
Hidrólise ácida de sacarose (dissacárido não-redutor de glucose + frutose)
T1
T2
T3
3 mL sacarose 0.25 %
3 mL sacarose 0.25 %
3 mL sacarose 0.25 %
0.1 mL HCl conc.
0.1 mL HCl conc.
0.1 mL H2Od
ferver 2’
não ferver
não ferver
---------------------------------------------------------------------------------------------------------Arrefecer o tubo
Adicionar 3 mL de Benedict
Agitar e ferver 5’
Observar a cor
Qual a cor final ?
Que conclusões retira ?
Que conclui acerca da estrutura da sacarose ?
Experiência 4
Hidrólise enzimática do amido pela α-amilase salivar
Lavar a boca com H2Od
Obter saliva e diluir 1:2 com soro fisiológico
T1
T2
T3
1 mL de amido
1 mL de amido
2 mL soro fisiológico
2 gotas de lugol
2 gotas de lugol
2 gotas de lugol
1 mL de saliva diluída
1 mL de soro fisiológico
1 mL de saliva diluída
---------------------------------------------------------------------------------------------------------Observar
Agitar e incubar a 37ºC ou superior
Quando desaparecer a cor num dos tubos fazer
o teste de Benedict (+ 5 mL Benedict./ferver 5’)
Que conclusões retira ?
Qual a natureza do amido ?
Procedimento experimental
1. Identificar 4 tubos de ensaio (A1; A2; A3 e A4).
2. Adicionar a um deles (A1) 2,0 mL de H2O destilada.
3. Colocar nos restantes 2,0 mL de solução de - amilase.
4. Ferver em banho de água o tubo A4 durante 3 min e deixar arrefecer.
5. Adicionar (na hotte) 3 gotas de HCl concentrado ao tubo A3 e agitar.
6. Adicionar a cada um dos 4 tubos 2,0 mL de solução de amido e agitar no
vórtex.
7. Incubar na estufa a 37 C durante 20 min.
8. Identificar mais 4 tubos de ensaio como B1; B2; B3 e B4.
9. Transferir metade do volume existente no tubo A1 (ou seja 2 mL), para o tubo
B1. Repetir o procedimento para os outros tubos.
10. Ao conjunto dos tubos A adicionar 3 gotas de solução de Lugol e observar o
resultado.
11. À serie de tubos B adicionar 2,0 mL de reagente de Benedict e colocar em
banho de água a ferver durante 2 min. Retirar os tubos do banho e observar.
Resultados
Apresente, sobre a forma de tabelas, a cor obtida em cada série de tubos de acordo
com a seguinte escala (exemplo para o teste de Benedict):
- Azul (teste de Benedict negativo)
+ Verde
++ Amarelo
+++ Laranja
++++ Vermelho-tijolo (teste de Benedict positivo)
Identifique, explicando, os tubos que não reúnem as condições experimentais
necessárias para uma eficaz actuação da amilase.
Que conclusões se podem tirar quando o teste de Benedict e o teste do Iodo são
ambos positivos? Estes resultados seriam alterados se o tempo de incubação fosse
prolongado?
Explique, recorrendo aos resultados obtidos, como é que a actividade da amilase é
influenciada pelo pH e pela temperatura.
Apêndice do trabalho prático 5
(Esquematização de experiências)
Experiência 1
A1
A2
A3
2 mL -amilase
2 mL H2Od
2 mL -amilase
adicionar 3 gotas
de HCl conc.,
agitar
2 mL amido dil.
2 mL amido dil.
2 mL amido dil.
A4
2 mL -amilase
ferver 3’
e arrefecer
2 mL amido dil.
Incubar a 37ºC durante 20’
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
A1
B1
(2 mL)
+
3 gotas
de
lugol
(2 mL)
+
2 mL
Benedict
ferver 5’
Observar a cor e concluir
(Repetir o procedimento para os outros tubos)
Trabalho nº. 5 – Quantificação do colesterol total e do
colesterol HDL
Introdução
Como componente de células e tecidos o substracto para a síntese de numerosos
compostos, o colesterol desempenha um papel importante no nosso metabolismo.
Para realizar essas tarefas, o organismo humano dispõe de colesterol quer exógeno
(absorvido com os alimentos), quer endógeno (sintetizado pelo próprio organismo).
Figura 1. Estrutura química do colesterol.
Hábitos alimentares diferentes fazem variar muito a quantidade de colesterol
fornecido pelos alimentos. Uma alimentação exclusivamente vegetariana não
fornece colesterol, enquanto que os produtos alimentares de origem animal
fornecem cerca de 1 g de colesterol por dia.
A síntese endógena do colesterol tem lugar principal no fígado, a partir de acetilCoA que se forma no organismo por degradação dos hidratos de carbono, proteínas
e, principalmente, gorduras. Além disso, são local de síntese a mucosa do intestino
delgado e outros tecidos e órgãos (com excepção do cérebro do adulto).
É possível que entre a absorção fisiológica normal através dos alimentos e a
biossíntese endógena hepática exista um mecanismo de regulação específico que
procure estabelecer o equilíbrio do nível de concentração de colesterol no soro. Um
vegetariano pode ter uma concentração sérica de colesterol que não se distingue da
concentração apresentada por outro indivíduo saudável que faça uma alimentação
mista. Naquele caso, a síntese endógena é reforçada para se atingir o valor normal.
Num indivíduo que absorve grande quantidade de gorduras, principalmente
animais, a síntese endógena fica inibida, mas só para além dos valores normais da
concentração do colesterol no soro. A diminuição da absorção de colesterol
diminui a colesterolémia; o tratamento medicamentoso reforça esta medida. Parte
do colesterol endógeno é lançado na corrente sanguínea através da linfa, parte é
transformado em ácidos biliares e hormonas esteróides e, parte é integrada na
membrana celular e no tecido nervoso.
O colesterol exógeno é emulsionado por sais biliares no intestino, ficando
igualmente ao dispor das vias de síntese atrás referidas.
O colesterol absorvido por biossíntese e o colesterol absorvido com os alimentos
constituem o pool de colesterol que, no adulto, é aproximadamente 130 a 150 g.
Esta quantidade de colesterol distribui-se do seguinte modo: i) cérebro: 30 g; ii)
músculos esqueléticos: 30 g; iii) pele: 15 g; iv) sange: 10 g; v) fígado: 5 g;
vi) glândulas supra-renais: 0,5 g; vii) restantes tecidos: 40 a 60 g.
A parte de colesterol que o organismo utiliza como produto de síntese é excretada
por três vias, de acordo com o metabolismo:
 pelas fezes, sob a forma de sais biliares e de esteróides
 pela urina, como catabolito de hormonas
 pela pele, evidentemente em quantidade insignificante
São as lipoproteínas que fazem o transporte do colesterol no sangue. Existem várias
lipoproteínas (Lps) que podem ser representadas pela estrutura geral demonstrada
na Figura 4.
fosfolípido
Figura 2. Lipoproteína plasmática.
proteína
colesterol
O colesterol é o maior componente das lipoproteínas de baixa densidade (designada por
fracção LDL) e das lipoproteínas de muito baixa densidade (fracção VLDL) e um
componente menor da fracção HDL (lipoproteínas de alta densidade). A designação de
colesterol total inclui todas as formas de colesterol encontradas nas lipoproteínas. Há
evidências científicas de que valores elevados de colesterol no sangue, nomeadamente
da fracção LDL, associados a outros factores de risco como sejam a hipertensão e a
condição de fumador, contribuem para o aparecimento da aterosclerose. Por outro lado,
a concentração da fracção HDL no sangue está inversamente relacionada com o risco de
doenças cardiovasculares.
Todas as Lps são formadas por uma fracção protéica (apoproteina ou apolipoproteina) e
uma fracção lipídica (colesterol livre e esterificado, triglicerídeos e fosfolípidos), em
proporções diferentes, segundo o tipo de Lp:
 -lipoproteínas ou HDl
 pré--lipoproteínas ou VLDL
 -lipoproteínas or LDL
 quilomicras
Do colesterol que aparece no sangue, 70% encontra-se sob a forma esterificada.
Depois da decomposição enzimática do éster, o colesterol esterificado e o colesterol
livre no soro são doseados sob a forma de colesterol total. A sua concentração depende
da idade, sexo e hábitos de vida do indivíduo.
É problemática a fixação de valores normais de colesterol. As chamadas
determinações do valor normal, que se baseiam em análise duma amostra
populacional clinicamente saudável, não excluem que nesta amostra figurem
indivíduos cujas doenças ateroscleróticas não sejam ainda detectáveis e cujo nível
lipídico é, portanto, erradamente considerado normal. Os valores normais indicados
não devem ser interpretados como limites decisivos de opção terapêutica, sendo
sempre necessário considerar o quadro global dos factores de risco. Deve
considerar-se valor limite de risco elevado de enfarte do miocárdio uma
concentração de 220 mg de colesterol/100 mL de soro. Este valor foi obtido do
estudo de Framingham, cujo dispendioso método de doseamento fornece valores
concordantes com os do teste colorimétrico enzimático. O “Adult Treatment Panel
of National Cholesterol Education Program U.S.A.” considera:
 valores desejáveis da concentração de CT: < 200 mg/dl
 limites aceitáveis entre 200 - 239 mg/dl
 valores elevados:  240 mg/dl
 valores desejáveis da concentração de LDLc: < 130 mg/dl
 limites aceitáveis entre 130 - 159 mg/dl
 valores de risco elevado:  160 mg/dl
 valores desejáveis da concentração de HDLc:
H: > 45 mg/dl ; M: > 65 mg/dl
 valores de risco moderado: H: 35 - 45; M: 45 - 65 mg/dl
 valores de risco elevado: H: < 35 mg/dl ; M: < 45 mg/dl
CT: Colesterol Total; H: Homens; M: Mulheres.
Verificou-se que pelo menos 10% da população apresenta hiperlipoproteinémia
que, na maioria dos casos, não provoca perturbações, mas pode produzir graves
alterações patológicas das paredes dos vasos, especialmente, das coronárias, cujas
consequências são insuficiência circulatória e lesão de órgãos de importância vital.
Estudos epidemiológicos revelaram, igualmente, que a hipercolesterolémia,
favorecida por hipertensão e tabagismo, também é responsável pelas
coronariopatias.
Angina do peito, insuficiência coronária, enfarte do miocárdio, morte súbita
manifestam-se tanto mais frequentemente num período de 10 anos, quanto mais
elevada for a concentração sérica de colesterol.
Em caso de hipercolesterolémia, a dieta deve ser rica em ácidos gordos insaturados,
como o ácido linoléico, e pobre em colesterol. Quando a dieta não baixa
suficientemente a concentração, administram-se medicamentos hipolipemizantes.
Objectivo
A determinação quantitativa dos níveis de colesterol total e da fracção HDL são de
grande importância no diagnóstico e avaliação de doenças cardiovasculares, da
aterosclerose, servindo, igualmente, como um indicador das funções hepática e biliar, da
absorção intestinal, do funcionamento tiroidéio e das glândulas adrenais. Diversos
factores como o stress, a idade, a hereditariedade, o (des)equilíbrio hormonal e a
gravidez são susceptíveis de afectar os níveis normais de colesterol num indivíduo.
Neste trabalho utilizar-se-á um kit de diagnóstico, no qual a quantificação do colesterol
em cada uma das fracções é determinada após hidrólise enzimática e oxidação.
A determinação da fracção HDL necessita a prévia separação das fracções VLDL e
LDL. Esta separação pode ser efectuada por ultracentrifugação ou por precipitação
selectiva, sendo o sobrenadante posteriormente analisado. No presente método, são
utilizadas soluções de ácido fosfotúngstico e de cloreto de magnésio como agentes
precipitantes das fracções VLDL e LDL, permanecendo a fracção HDL em suspensão.
O doseamento do colesterol HDL é efectuado a partir deste sobrenadante, recorrendo-se
ao mesmo método enzimático indirecto que foi utilizado para o doseamento do
colesterol total.
Princípio
Os ésteres de colesterol são inicialmente hidrolisados a colesterol e a ácidos gordos
livres por acção da colesterol esterase. O colesterol produzido nesta reacção é
seguidamente oxidado a 4-colesteno-3-ona e peróxido de hidrogénio numa reacção
catalisada pela colesterol oxidase:
ésteres de colesterol + H2O
colesterol + O2
colesterol esterase
colesterol oxidase
colesterol + ácidos gordos
4-colesteno-3-ona + H2O2
O peróxido de hidrogénio de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage
com a 4-aminoantipirina e o ácido hidroxibenzóico para formar a quinoneimina,
um corante que atinge um máximo de absorção ao comprimento de onda de 505
nm. A intensidade da cor produzida pela reacção é directamente proporcional à
concentração de colesterol na amostra:
peroxidase
2H2O2 + p-hidroxibenzenossulfonato + 4-aminoantipirina
4H2O
quinoneimina +
Material
. Espectrofotómetro UV/Vis
. Células (acrílico, volume reduzido)
. Estufa ou incubadora com temperatura constante a 37 ºC
. Vórtex
. Pipetador
. Pipeta volumétrica (1 mL)
. Micropipeta automática (20 l)
. Suporte para tubos eppendorf
. Tubos eppendorf
. Cronómetro
Reagentes - (já preparados)
. 1 Amostra de plasma humano liofilizado e reconstituído
. Solução padrão de colesterol total (200 mg/dl)
. Solução padrão de colesterol HDL (50 mg/dl)
. Solução de ácido fosfotúngstico (30,3x10-3 mol/l) e de cloreto de magnésio
(0,1 mol/l)
. Reagente para a determinação do colesterol com a seguinte composição
(pH 6,6):
- 4-aminoantipirina
2,5 x 10-4 mol/l
-ácido hidroxibenzóico
1,0 x 10-2 mol/l
- colesterol oxidase
100 U/l
- colesterol esterase
1 250 U/l
- peroxidase
800 U/l
Procedimento experimental
a) Determinação de colesterol total:
1. Ligar o espectrofotómetro e ajustar o comprimento de onda para 505 nm
2. Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância
3. Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações:
Branco; Padrão total; Amostra total
4. Pipetar 1 mL da solução “reagente para a determinação do colesterol” para
cada um dos tubos
5. Pipetar 10 l de água desionizada para o tubo com a designação Branco e
inverter para agitar
6. Aguardar 45 seg e pipetar 10 l de solução padrão de colesterol total para o
tubo com a designação Padrão total, agitar por inversão
7. Respeitando um intervalo de 45 seg, pipetar também 10 l da amostra de
plasma para o respectivo tubo. Misturar por inversão suave dos tubos;
8. Incubar à temperatura de 37ºC durante exactamente 5 min
9. Ler as absorvâncias respeitando também um intervalo de 45 seg entre
amostras
10. Garantir que todas as absorvâncias são lidas durante os 45 min após a
incubação
b) Determinação de colesterol HDL:
1. Pipetar 125 l de amostra de plasma para um tubo eppendorf
2. Adicionar 25 l de solução de solução de ácido fosfotúngstico/cloreto de
magnésio
3. Centrifugar a 3 000 rpm durante 10 min
4. Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações:
Padrão HDL; Amostra HDL; Branco HDL
5. Pipetar 1 mL da solução “reagente para a determinação do colesterol” para
cada um dos tubos
6. Pipetar 10 l de água desionizada para o tubo com a designação Branco
HDL e inverter para agitar
6. Aguardar 45 seg e pipetar 10 l de solução padrão de colesterol HDL para o
tubo com a designação Padrão HDL, agitar por inversão
7. Respeitando um intervalo de 45 seg, pipetar também 10 l do sobrenadante
obtido em 3. para o tubo Amostra HDL. Misturar por inversão suave dos
tubos;
8. Incubar à temperatura de 37ºC durante pelo menos 5 min.
9. Ler as absorvâncias respeitando também um intervalo de 45 seg entre
amostras
10. Garantir que todas as absorvâncias são lidas durante os 45 min após a
incubação
Resultados
Determine a concentração de colesterol total e colesterol HDL para a amostra
usando interpolações lineares convenientes, com explicado no trabalho 1.
Diga se algum dos plasmas testados lhe parece pertencer a um indivíduo com um
distúrbio metabólico.
Trabalho nº. 6 – Análise de hormonas esteróides por
TLC
Introdução
O sistema endócrino, com a sua grande quantidade de hormonas, afecta todos os
tecidos do corpo humano. Em resposta a um sinal apropriado, um mensageiro
químico é libertado e transferido para um tecido alvo, cuja actividade é
subsequentemente modificada. Em associação com o sistema nervoso autónomo,
algumas hormonas mantêm a homeostasia; outras, por exemplo, permitem a gestão
do stress. As características sexuais, o tamanho e as formas do corpo humano são
determinas pelas hormonas esteróides.
Estruturalmente, as hormonas esteróides são derivados esteróides dos triterpenos,
possuindo um núcleo ciclopentanoperidrofenantreno, como está representado na
Figura 5.. Este grupo é de natureza alicíclica constituído por três anéis hexagonais
com composição fenantrénica, designados por A,
C
D
B e C, e por um pentagonal, o anel D.
Com base na estrutura e na actividade biológica, as
A
B
hormonas esteróides podem ser agrupadas em 4
categorias
Figura 5. Núcleo esteróide.
funcionais:
androgénios,
estrogénios,
progestogénios e corticosteróides.
Os
androgénios
são
responsáveis
pelo
desenvolvimento dos caractéres sexuais secundários masculinos, sendo o
androgénio mais importante a testosterona, que é segregada principalmente pelos
testículos e, secundariamente, pelo córtex das supra-adrenais.
Os estrogénios promovem o aparecimento dos caractéres sexuais secundários
femininos, sendo a principal hormona o –estradiol. Os estrogénios são
segregados, pelos ovários, ciclicamente, em que níveis elevados destas hormonas
alternam com níveis mais reduzidos. O nível máximo de estrogénios atinge-se na
ovulação.
Os corticosteróides são hormonas do córtex supra-adrenal e podem subdividir-se em
duas classes funcionais: os glucocorticóides e os mineralocorticóides, sendo segregados
por duas regiões distintas do córtex.
Os mineralocorticóides (como por exemplo a aldosterona e a desoxicorticosterona)
são produzidos pela zona glomerulosa e estão envolvidos na regulação dos iões
sódio e, consequentemente, potássio. Níveis elevados destes corticosteróides estão
associados à hipertensão, alterações de níveis de sódio e potássio, cirrose ou
problemas de coração ou de rins.
Os glucocorticóides são segregados pelas zonas fasciculada e reticulada do córtex
supra-adrenal e intervêm no metabolismo dos hidratos de carbono, proteínas e
gorduras. Os glucocorticóides mais potentes são a corticosterona, a cortisona e a
hidrocortisona (ou cortisol). Valores elevados de glucocorticóides no sangue estão
associados com a gravidez, hiperplasia adrenal e stress devido a doença,
intervenção cirúrgica ou queimadura.
Objectivo
Este trabalho compreende a separação, pela cromatografia em camada fina (TLC Thin
Liquid
Chromatography),
de
hormonas
derivadas
do
colesterol,
designadamente, da testosterona (androgénio), –estradiol (estrogénio) e do
hidrocortisona (glucocorticóide) presentes nas amostras fornecidas aos alunos.
Pretende-se, igualmente, proceder à identificação dos compostos analisados,
calcular os respectivos valores de Rf e, finalmente, determinar a solubilidade
relativa das hormonas ensaiadas.
Material
. Placas para TLC (de sílica gel com indicador de fluorescência F-254)
. Câmara cromatográfica
. Lâmpada de luz UV ( = 254 nm)
. Capilares
. Óculos de protecção com filtro UV
. Provetas de vidro
. Régua, lápis
Reagentes - (já preparados)
. Soluções padrão das hormonas esteróides (1,0 mg/mL) nomeadamente:
testosterona, hidrocortisona, -estradiol
. Amostras para análise contendo hormonas esteróides;
. Solvente de desenvolvimento: 160 mL de tolueno/acetato de etilo/acetona
(6:1:1)
Procedimento experimental
1. Sem danificar a placa de TLC, e sem lhe tocar com as mãos, marcar com
um lápis a linha de origem a 1,5 cm de uma das extremidades
2. Aplicar 5 µL de amostra na placa sem ferir o adsorvente: encostar a ponta à
placa mantendo-a quase na vertical e deixar sair o conteúdo.
3. Repetir este procedimento para as restantes soluções padrão e também para
as amostras, respeitando os locais previamente marcados. Devido à sua
difícil detecção, o padrão de estradiol deve ser aplicado novamente (mais 5
µL) exactamente no mesmo local da aplicação anterior, após a evaporação
da primeira gota de solvente.
4. Deixe secar e coloque a placa, cuidadosamente, na câmara cromatográfica
5. Esperar pelo menos 30 min para desenvolver o cromatograma pelo solvente
ascendente
6. Remover a placa e marcar a frente do solvente. Deixe secar na “”hotte”
durante aproximadamente 10 min.
7. Colocar a placa já seca sob a lâmpada de luz UV para observar os pontos de
aplicação.
8. Delimitar com um lápis as manchas observadas. Analisar o cromatograma e
com uma régua medir as distâncias de cada mancha à origem.
Resultados
Calcular os valores dos factores de retenção, Rf, para os padrões e para cada
amostra usando a seguinte expressão:
Rf 
D mancha
D solvente
onde,
Dmancha - distância desde a origem até à mancha em cm
Dsolvente - distância desde a origem até à frente do solvente em cm
Com base nos valores calculados indique qual é a solubilidade relativa dos
esteróides analisados.