indice

Abstrat....................................................................................................................................I
Resumo..................................................................................................................................II
1. Lista de Figuras..............................................................................................................III
2. Lista de tabelas...............................................................................................................IV
3. Abreviatura utilizadas no texto........................................................................................V
4. Introdução
4.1 Biologia da aranha Phoneutria nigriventer
4.2 Bioqímica e farmacologia do veneno da aranha P. nigiventer
4.3 Canais iônicos
4.3.1.Canais de sódio
4.3.2.Canais de cálcio
4.3.3.Canais de potássio
4.4 Toxinas ativas em canais iônicos
4.5 Filogenia das toxinas
5. Objetivos
5.1.Objetivos gerais
5.2.Objetivos específicos
6. Material e Métodos
6.1.Equipamentos utilizados no laboratório
6.2.Reagentes e material de uso
6.3.Meios de cultura e soluções
6.4.Genótipo e fenótipo da linhagens de bactérias utilizadas no trabalho
6.5.Técnicas
6.5.1.Preparação de células competentes de E.coli da linhagem DH5 e
transformação
6.5.2.Extração de plasmídeos dos clones isolados
6.5.2.1.Dosagem do DNA
6.5.3.Digestão com enzimas de restrição
6.5.4.Sequenciamento de DNA
6.5.4.1.Sequenciamento automático pharmacia
6.5.4.2.Sequenciamento automático ABI PRISM
6.5.4.2.Purificações de DNA testada para o sequenciamento
6.5.5.Análise das seqüências de nucleotídeos obtida
6.5.5.1.Análise pela internet
6.5.5.2.Análise por softwear
6.5.6.Purificação do cDNA
6.5.7.Marcação do cDNA purificado
6.5.8.Pré-hibridização/Hibridização
6.5.8.Rastreamento das bibliotecas de cDNA da glândula de veneno da P.
nigriventer utilizando a sonda de cDNA radioatíva
6.5.9.Subclonagem da isoforma
6.5.9.1.Manipulação dos sistemas de expressão
6.5.9.2.Construção dos vetores de expressão c2pMAL-Isoforma e p2pMaLisoforma
6.5.9.3.O vetor pMAL
6.5.9.4.Preparação do vetor pMAL
6.5.9.5.Preparação do inserto Tx2-6 recombinante e ligaçãoao vetor
6.5.9.6.Amplificação da isoforma no plasmídeo pBluescript da biblioteca de
cDNA
6.5.9.7.Ligação do produto de PCR ao vetor pMAL digerido
6.5.9.8.Transformação em bactérias eletrocompetentes
7.Resultados
7.1. Rastreamento das bibliotecas de cDNA da glândula de Veneno da aranha P.
nigriventer
7.2.Sequenciamentos dos clones da biblioteca
7.3.Análise dos sequenciamentos realizados no sequenciados ABI PRISM
7.3.1.Metódos de purificação de DNA utilizados
7.3.2.Reação de PCR para o sequenciamento automático
7.3.3.Precipitação do produto de PCR
7.4.Sequencia de nucleotídeos dos cDNAs selecionados
7.5.Sequencia de aminoácidos dos precursores de toxina da aranha P. nigriventer
7.6.PCR de colônia das bactérias transformadas com o pMAL recombinate
8.Discussão
8.1.Estrutura dos clones selecionados
8.2.Processamento das toxinas do veneno da aranha P. nigriventer
9.Conclusões
10.Programas utilizados
11.Bibliografia
12.Anexo
13.Trabalhos publicados