universidade federal de minas gerais - Genética

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
MLPA-Discalc-Turner: Desenvolvimento de um sistema
baseado em MLPA para detecção da região candidata da
discalculia na Síndrome de Turner
Gutemberg Eloi de Sousa
Belo Horizonte, março de 2010
I
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
MLPA-Discalc-Turner: Desenvolvimento de um sistema
baseado em MLPA para detecção da região candidata da
discalculia na Síndrome de Turner
Dissertação apresentada ao Curso de Pós
Graduação em Genética do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Genética
Aluno: Gutemberg Eloi de Sousa
Orientadora: Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho
II
Dedico este trabalho a minha família,
principalmente a minha mãe, que soube me preparar
para os desafios da vida, e a minha esposa Nilda, com
quem compartilho os melhores momentos da minha
vida.
III
Agradecimentos
À Professora Maria Raquel por ter me recebido em seu Laboratório de
braços abertos, pela paciência demonstrada na minha orientação, por ter me
proporcionado indispensável crescimento profissional e científico;
Á Marlene de Miranda, pelo apoio nos momentos difíceis e presteza nas
horas de aperto;
Á equipe do Ambulatório São Vicente por ter ajudado a localizar as
pacientes, principalmente ao Dr. Rodrigo Arantes, à Dra Letícia Leão e ao Dr.
Marcos Aguiar;
Aos pacientes do Ambulatório São Vicente por terem aceitado gentilmente
participar do projeto;
Aos amigos da Pós Graduação pela convivência durante esses anos;
Aos professores da Pós-Graduação pelo aprendizado proporcionado;
Aos amigos do LGHM, Luciana, Raphael, Flávia, Izinara, Gustavo e Latife,
pela convivência, pelo carinho, pela amizade e por momentos de descontração;
Aos vários estagiários que passaram no LGHM, durante o mestrado.
À Deus por ter me dado forças e iluminado meu caminho, para que eu
pudesse continuar na luta, acreditando sempre que o futuro seria melhor.
A todos que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho;
A todos o meu muito obrigado.
I
INDICE
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................................................VII
LISTA DE TABELAS..................................................................................................................................VIII
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES..............................................................................IX
RESUMO...........................................................................................................................................................X
ABSTRACT......................................................................................................................................................XI
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................................................1
1.1 DEFINIÇÃO....................................................................................................................................................1
1.2 HISTÓRICO....................................................................................................................................................1
1.3 MANIFESTAÇÕES CLINICAS..............................................................................................................................2
1.3.1 Fenótipo............................................................................................................................................2
1.3.2 Fenótipo Comportamental................................................................................................................2
1.3.2.1 Habilidade aritmética humana...................................................................................................................4
1.3.2.2 Discalculia do Desenvolvimento na ST.....................................................................................................4
1.4 DIAGNÓSTICO................................................................................................................................................5
1.4.1 Diagnóstico Citogenético..................................................................................................................5
1.4.2 Diagnostico Pré-natal.......................................................................................................................8
1.4.3 Diagnóstico Neonatal........................................................................................................................8
1.4.4 Diagnóstico na Infância e Adolescência...........................................................................................9
1.4.5 Diagnóstico Molecular......................................................................................................................9
1.5 TRATAMENTO..............................................................................................................................................11
1.5.1 Baixa Estatura e Hormônio do Crescimento..................................................................................11
1.5.2 Falência Ovariana e Hormônios Esteróides...................................................................................12
1.6 OS CROMOSSOMAS SEXUAIS HUMANOS.............................................................................................................13
1.6.1 A evolução dos cromossomos sexuais humanos.............................................................................13
1.6.2 Cromossomo X................................................................................................................................14
1.6.2.1 Estrutura..................................................................................................................................................14
1.6.2.1.1 Região Pseudoautossômica 1 (PAR1).............................................................................................15
1.6.2.1.2 Região X-específica........................................................................................................................15
1.6.2.1.3 Região Pseudoautossômica 2 (PAR2).............................................................................................16
1.6.2.2 Inativação do cromossomo X..................................................................................................................16
1.6.2.3 Impressão genômica no cromossomo X..................................................................................................17
1.6.2.4 Discalculia e cromossomo X...................................................................................................................18
1.6.2.4.1 PLCXD1.........................................................................................................................................20
1.6.2.4.2 GTPBP6..........................................................................................................................................21
1.6.2.4.3 PPP2R3B........................................................................................................................................21
1.6.2.4.4 SHOX.............................................................................................................................................21
1.6.3 Cromossomo Y.................................................................................................................................22
1.6.3.1 Cromossomo Y e Gonadoblastoma.........................................................................................................22
1.6.3.2 Detecção de Cromossomo Y na ST.........................................................................................................23
1.7 MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA)..................................................................23
1.7.1 MLPA: Uma Variação da PCR.......................................................................................................23
1.7.2 A utilização da MLPA.....................................................................................................................24
1.7.3 Descrição das Sondas.....................................................................................................................26
1.7.4 A Técnica MLPA.............................................................................................................................26
1.7.5 MLPA-Discalc-Turner....................................................................................................................29
1.8 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA........................................................................................................................30
1.9 OBJETIVOS..................................................................................................................................................32
1.9.1 Objetivo geral..................................................................................................................................32
1.9.2 Objetivos específicos.......................................................................................................................32
2 MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................................................33
2.1 AMOSTRA...................................................................................................................................................33
V
2.1.1 Coleta de Material Biológico..........................................................................................................33
2.2 EXTRAÇÃO DE DNA....................................................................................................................................34
2.3 ESTUDOS MOLECULARES................................................................................................................................36
2.3.1 Kit MLPA SHOX P018B.................................................................................................................36
2.3.2 MLPA-Discalc-Turner....................................................................................................................36
2.3.2.1 Seleção das sondas..................................................................................................................................36
2.3.2.3 Montagem das Sondas.............................................................................................................................37
2.3.3 MLPA - Hibridização, ligação e PCR.............................................................................................39
2.3.4 Detecção de fragmentos .................................................................................................................40
2.3.5 Análise de Dados.............................................................................................................................41
2.4 DETECÇÃO DE FRAGMENTO DO CROMOSSOMA Y................................................................................................41
3. RESULTADOS.............................................................................................................................................43
3.1RESULTADOS DO MLPA-DISCALC -TURNER......................................................................................................43
3.1.1 Grupo controle................................................................................................................................43
3.1.2 Grupo ST 45,X.................................................................................................................................43
3.1.3 Grupo ST com outros cariótipos.....................................................................................................45
3.2 RESULTADOS DO KIT SHOX P018B...........................................................................................................45
3.2.1 Grupo controle................................................................................................................................45
3.2.2 Grupo ST 45,X.................................................................................................................................46
3.2.3 Grupo ST com outros cariótipos.....................................................................................................48
3.3 RESULTADOS DO SRY.................................................................................................................................50
3.3.1 Controles Masculinos......................................................................................................................50
3.3.2 Controles Femininos.......................................................................................................................50
3.3.3 Pacientes com ST............................................................................................................................51
4 DISCUSSÃO..................................................................................................................................................52
5 CONCLUSÕES.............................................................................................................................................55
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................................56
7 ANEXOS........................................................................................................................................................64
ANEXO 1: APROVAÇÃO NO COEP-UFMG......................................................................................................64
ANEXO 2: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)...............................................................65
ANEXO 3: COMPOSIÇÃO DO KIT SHOX P018B...............................................................................................68
V
LISTA DE FIGURAS
Figura
Figura 1
Título
Genes do intervalo mínimo de sobreposição da Síndrome de
Turner e Discalculia do Desenvolvimento
Figura 2
Espectro de utilização do MLPA
24
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Desenho esquemático das sondas MLPA
Principio do funcionamento da MLPA
Localização das sondas no cromossomo X
Resultado das Pacientes ST 45,X após a normalização dos
dados.
Eletroferograma de um paciente ST 45, X, utilizando o MLPADiscal-Turner
Eletroferograma de uma paciente do grupo controle utilizando o
KIT SHOX P018B
Resultado do KIT SHOX P018B em uma paciente ST 45,X.
Resultado do KIT SHOX P018B em uma paciente ST mosaico
Gel de poliacrilamida 8%, corado com prata, mostrando homens
normais.
Gel de poliacrilamida 8%, corado com prata, mostrando
mulheres ST.
26
27
30
44
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura10
Figura 11
Figura 12
Página
20
44
46
47
49
50
51
LISTA DE TABELAS
Tabela
Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Título
Página
Cariótipos encontrados na Síndrome de Turner
7
Testes neuropsicológicos realizados nas pacientes com
19
Síndrome de Turner
Genes averiguados na MLPA-Discalc-Turner
29
Cariótipos das pacientes com ST do presente Estudo
34
Gene, sequências e tamanhos dos fragmentos da MLPA38
Discal-Turner
Sequência do primer M13 usado para amplificar as sondas
40
MLPA
Sequência dos iniciadores para a PCR do gene SRY
42
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES
45,X
ASMT
ASMTL
CGH
COEP
FISH
FIV
FMR1
GH
GTPBP6
ILR9
LHS
LPO
LWD
Mb
MLPA
RHS
Monossomia do cromossomo X
Acetilserotonina O-Metiltransferase
Acetilserotonina O-Metiltransferase Semelhante
Hibridização Genomica Comparativa
Comitê de Ética em Pesquisa
Hibridização in situ por fluorescência
Fertilização in vitro
Sitio Frágil de Retardo Mental 1
Hormônio do Crescimento
Proteína de ligação ao GTP 6
Receptor 9 da Interleucina
Sonda Hibridizante Esquerda
Sonda Oligonucleotidio Esquerda
Lerí-Weill discondrosteose
Mega bases
Amplificação de Sondas Ligadas em Multiplex
(Multiplex Ligation Probe Amplification)
Pares de bases
Phosphatidylinositol-specific phospholipase C
Falha Ovariana Prematura- 1B
(Premature Ovarian Failure 1B)
Proteína Fosfatase 2R3B
(Protein phosphatase 2R3B)
Sonda Hibridizante Direita
RPO
Ser
Sonda Oligonucleotidio Direita
Serina
SHOX
SRY
Homeobox Baixa Estatura
Região determinante do sexo do cromossomo Y
(Sex – Determining Region of Y chromosome)
Síndrome de Turner
Termo de Concentimento Livre e Esclarecido
Treonina
Unidade Relativa de Fluorecência
Cromossomo X de origem materna
Cromossomo X de origem paterna
Braço curto do cromossomo X
Braço longo do cromossomo X
Pb
PLCXD1
POF1B
PPP2R3B
ST
TCLE
Thr
URF
Xm
Xp
Xp
Xq
RESUMO
A Síndrome de Turner (ST) é uma doença genética causada pela deleção total ou
parcial do segundo cromossomo sexual, podendo esta estar presente em todas as
células ou em parte delas. Na maioria dos casos, resulta em um cariótipo 45,X e em
um fenótipo feminino. Sua incidência tem sido estimada entre 1/2000 e 1/5000
meninas nativivas. Aproximadamente, 99% dos fetos com ST são abortados
espontaneamente e aproximadamente 10% dos abortos espontâneos tem ST. As
principais manifestações clínicas são retardo de crescimento intra-uterino e pós-natal,
pescoço alado, linfedema nas mãos e nos pés, cúbito valgo, malformações cardíacas
e renais e ovários em fita, com consequentes déficit de desenvolvimento puberal e
ausência de menstruação. Ela esta associada à deficiência do hormônio do
crescimento e dos hormônios esteróides. O fenótipo comportamental se caracteriza
por bom domínio verbal. Com relação às tarefas não-verbais, as pacientes
apresentam grande dificuldade no aprendizado da matemática, deficiência nas
habilidades viso-espaciais, coordenação motora e processamento de emoções. A
discalculia do desenvolvimento é um transtorno específico de aprendizagem da
aritmética, que afeta entre 3% e 6% da população em idade escolar, podendo
aparecer isolada ou associada à dificuldade de leitura (dislexia), ao transtorno do
déficit de atenção e hiperatividade e ao transtorno obsessivo-compulsivo. Não há
método disponível para detecção de mutações no intervalo menor de sobreposição
das deleções relacionadas à discalculia na ST. Em função do custo, optamos por
desenvolver um método baseado em Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification (MLPA) para detecção de duplicações/deleções desta região. Ela
permite tanto a detecção de SNPs quanto do número de cópias presentes de uma
determinada sequência. A detecção de do numero de cópias é baseada na utilização
de duas sondas, que vão se hibridizar ao DNA em solução. As sondas são
desenhadas de tal forma que uma delas, a 5', tem sua extremidade 3' pareando com
o alvo. A segunda sonda, a 3', inicia-se na base subsequente ao mesmo. Após a
hibridização, ocorre a ligação das sondas. As sondas ligadas são amplificadas e
posteriormente separadas através de eletroforese capilar. Desenvolvemos uma
metodologia in house MLPA-Discalc-Turner para detecção de deleções do
cromossomo X baseado em MLPA, para o intervalo mínimo de sobreposição das
deleções associadas à discalculia na ST. As amostras de 15 pacientes com
diagnóstico clínico e citogenético (baseado em cariótipo) de ST foram coletas no
Serviço Especial de Genética e no Ambulatório de Endocrinologia, do Hospital das
Clinicas, da UFMG foram usadas para validar o método. A especificidade do método
foi de 100%, já a sensibilidade foi de 90% para pacientes ST 45,X e de 63% para
pacientes ST com outros cariótipos. A metodologia desenvolvida (MLPA DiscalTurner) é um método rápido, sensível, robusto e específico para a triagem de
meninas com ST.
ABSTRACT
Turner syndrome (TS) is a genetic disease caused by a complete or partial deletion of
the second sex chromosome, which may be present in every cell or some of them.
Most of the cases result in a 45,X karyotype and a female phenotype. Its incidence
has been estimated between 1 / 2000 and 1 / 5000 native girls. Approximately 99% of
fetuses with Turner syndrome are aborted spontaneously, and approximately 10% of
spontaneous abortions have TS. The main clinical manifestations are intrauterine and
postnatal growth retardation, webbed neck, lymphedema in the hands and feet,
cubitus valgus, cardiac and renal defects and fibrosis of the ovaries, leading to deficit
of pubertal development and absence of menstruation. It is associated with deficiency
of growth hormone and steroid hormones. The behavioral phenotype is characterized
by good verbal domain. In the case of non-verbal tasks, the patients have great
difficulty in learning mathematics and visual-spatial skills, motor coordination, and
emotion processing deficiencies. The developmental dyscalculia is a specific disorder
in learning arithmetic, which affects between 3% and 6% of school-age population,
and may appear isolated or associated with reading difficulties (dyslexia), attention
deficit disorder and hyperactivity and obsessive-compulsive disorder. There is no
method available for detecting mutations in a smaller range of overlapping regions of
deletions related to dyscalculia in TS. Because of the cost, we chose to develop a
method based on Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) to detect
duplications / deletions in this region. It allows detection of both SNPs and copy
number present in a particular sequence. The detection of the number of copies is
based on two probes that will hybridize to the DNA in solution. The probes are
designed such that one of them, 5', has its 3' end pairing with the target. The second
probe, 3', starts on the same basis thereafter. After hybridization, the binding of the
probes occurs. The bound probes are amplified and subsequently separated by
capillary electrophoresis. We developed an in-house methodology Discalc-TurnerMLPA to detect deletions of X chromosome based on MLPA, for smaller range of
overlapping regions of deletions associated with dyscalculia in TS. Samples from 15
patients with clinical and cytogenetic (based on karyotype) diagnosis of TS, collected
at the Special Service of Genetics and at the Clinic of Endocrinology, Hospital das
Clinicas, UFMG were used to validate the method. The method specificity was 100%,
the sensitivity was 90% for patients with TS-45,X and 63% for patients with other TS
karyotypes.The developed methodology (MLPA Discal-Turner) is a fast, sensitive,
robust and specific method for girls with TS screening.
1. Introdução
1.1 Definição
A Síndrome de Turner (ST) é uma doença genética causada pela deleção total
ou parcial do segundo cromossomo sexual, podendo esta deleção estar presente em todas as células ou em parte delas. Na maioria dos casos, resulta em um genótipo 45,X o
que difere do esperado para um genótipo feminino (46,XX) e ou genótipo masculino (46,
XY) (LIPPE, 1991; SAENGER, 1996; GRAVHOLT et al., 1996; RANKE e SAENGER,
2001).
A provável falha genética responsável pela gênese de um individuo 45,X
resulta de uma perda cromossômica durante a gametogênese em qualquer um dos
genitores ou de um erro mitótico durante um das divisões de clivagem do embrião
fertilizado (GRAVHVOLT et al., 1998; SUTON et al., 2005). Essa ausência do segundo
cromossomo sexual permite o diagnostico molecular da ST.
A incidência da ST tem sido estimada entre 1/2000 e 1/5000 meninas
nascidas. Aproximadamente, 99% dos fetos com ST são abortados espontaneamente
principalmente no primeiro trimestre de gestação e aproximadamente 10% dos abortos
espontâneos tem ST (HALL et al., 1982; GONZALEZ, 1991).
1.2 Histórico
A ST foi descrita pela primeira vez pelo anatomista Giovanni Morgangni, em
1768, que relatou achados posmortem de uma mulher com baixa estatura, que
apresentava ainda malformação renal e disgenesia gonadal (citado por ELSHEIKH, 2002)
Em 1930 o pediatra alemão Otto Ullrich fez descrição das características
clinicas desta síndrome em uma paciente de 8 anos de idade. Posteriormente, o médico
americano Henry Turner descreveu o fenótipo na sua mulher e ainda reconheceu esse
fenótipo em um grupo de sete pacientes, caracterizado por baixa estatura, ausência de
desenvolvimento das mamas e pelos pubianos, pescoço alado, implantação baixa dos
1
cabelos na nuca e uma posição anormal dos cotovelos (TURNER, 1938). E somente em
1959, o fenótipo foi correlacionado com o cariótipo 45,X (FORD et al., 1959). De acordo
com estas descrições a ST também pode ser chamada de Síndrome de Ullrich-Turner ou
ainda de monossomia do cromossomo X.
1.3 Manifestações Clinicas
1.3.1 Fenótipo
A ST tem como principais manifestações clínicas o retardo de crescimento
intra-uterino e pós-natal, pescoço alado, linfedema nas mãos e nos pés, cúbito valgo,
malformações cardíacas e renais e ovários em fita, com consequentes déficit de
desenvolvimento puberal e ausência de menstruação. Ela esta associada à deficiência do
hormônio do crescimento e dos hormônios esteróides (KESLER, 2007).
O fenótipo pode ser diagnosticado ao nascimento, se as manifestações
clínicas forem muito evidentes, principalmente se houver malformações cardíacas,
linfedema ou pescoço alado. Não sendo feito o diagnóstico no período neonatal, o
mesmo só será realizado posteriormente, em função da baixa estatura ou da ausência de
menstruação, quando já é tarde para o tratamento (BONDY, 2005).
Nas mulheres com ST, as gônadas se diferenciam normalmente até o terceiro
mês de gestação. A partir deste período, a ausência de todo o cromossomo X ou de parte
dele, consequêntemente ausência de genes necessários para a manutenção dos folículos
ovarianos fazem com que as gônadas se tornam disgenéticas, ou seja, ocorrem
alterações nas células germinativas e nas células responsáveis pela produção de
esteróides, resultando em um acelerado processo de degeneração dos oócitos, seguido
por fibrose ovariana (WEISS, 1971; ELSHEIKH et al., 2002).
1.3.2 Fenótipo Comportamental
O fenótipo da ST se caracteriza por bom domínio verbal. Com relação às
tarefas não-verbais, as pacientes apresentam grande dificuldade no aprendizado da
2
matemática,
deficiência
nas
habilidades
viso-espaciais,
coordenação
motora
e
processamento de emoções (SKUSE, 1987; SAENGER 1996; MCCAULEY et al. 2001;
ROSS, 2001; SYBERT 2001; ROSS et al. 2002, ELSHEIKH et al. 2002; FRIAS &
DAVENPORT, 2003, KESLER, 2007).
Embora a prevalência do retardo mental em mulheres com ST seja pouco
maior do que na população em geral, 10% e 3%, respectivamente (SYBERT e
MCCAULE, 2004), vários estudos demonstraram a presença de deficiência cognitiva ou
dificuldade de aprendizado. Foram identificados deficiência na organização viso-espacial,
cognição social, resolução de problemas não verbais e funcionamento psicomotor
(ROMANS, 1997; ROSS, 2000; SYBERT e MCCAULE, 2004).
Aproximadamente, 70% das mulheres com ST apresentaram dificuldade de
aprendizado (ROSS, 2000).
Os problemas mais comuns começam a aparecer durante a infância,
dificuldades motoras e demora no aprendizado da linguagem (STARK, 2003).
Durante a adolescência, desatenção, imaturidade, isolamento social e
ansiedade são os problemas mais comuns (MCCAULEY et al., 2001).
A explicação para essas dificuldades é que meninas com ST são
haploinsuficientes para produtos gênicos ligados ao cromossomo X, que escapam a
inativação em meninas normais. Ou seja, meninas normais têm dois alelos funcionais
com seus respectivos produtos, enquanto meninas com ST têm somente um (ZINN e
ROSS, 1998).
Além disto, meninas com ST têm os níveis de leitura e a compreensão
melhores, quando comparadas com controles normais (SKUSE, 1997). Mas, por outro
lado meninas com ST apresentam deficiência viso-espacial, na qual destacamos a
dificuldade com distâncias e viso-perceptiva e a orientação direito-esquerda (TEMPLE,
1995; KESLER, 2007).
As deficiências nas funções executivas também são comuns em pessoas com
ST. Dentre elas, destacam-se os déficits de atenção, habilidade de resolver problemas,
organização, memória de trabalho, controle do comportamento, velocidade de
processamento e controle da impulsividade (ROSS et al., 2002).
3
Estudos comparando as diferenças do fenótipo, dependendo da herança
cromossômica materna ou paterna, sugerem que garotas que herdam o cromossomo X
materno (Xm) apresentam maiores dificuldades em relações sociais e escores verbais
menores do que as que herdam o cromossomo X paterno (Xp) (SKUSE et al., 1997).
Pessoas com ST apresentam também grande dificuldade de enquadramento
social. Adolescentes com ST apresentam baixa atividade social, imaturidade,
hiperatividade e impulsividade comparadas com controles normais. Elas tem mais
dificuldade de manter relacionamentos, tem poucos amigos e tendem a serem mais
isoladas (MCCAULEY et al., 2001; KESLER, 2007).
1.3.2.1 Habilidade aritmética humana
Apesar de a aritmética ser uma construção cultural adquirida na escola, o
senso elementar de números, faz parte da nossa constituição genética. A capacidade de
reconhecer numerosidade aproximada, presente em todas as culturas, surge nos
primeiros anos de vida. O layout básico dos circuitos neurais no lobo parietal está sob o
controle genético e fornece ao bebê humano a capacidade entender parâmetros de
numerosidade do conjunto do seu ambiente. Modificações epigenéticas desta
representação e sua conexão com outros circuitos da linguagem ou reconhecimento
visual dos símbolos arábicos fornecem a base para a aquisição das ferramentas culturais
aritmética na infância. A partir disso, é possível identificar os defeitos genéticos ou
mutações, que perturbem os circuitos do lobo parietal e interferem no desenvolvimento
normal da criança, principalmente na aritmética (BRUANDET, 2004).
1.3.2.2 Discalculia do Desenvolvimento na ST
A discalculia do desenvolvimento é um transtorno específico de aprendizagem
da aritmética, que afeta entre 3% e 6% da população em idade escolar, podendo
aparecer isolada ou associada à dificuldade de leitura (dislexia), ao transtorno do déficit
de atenção e hiperatividade e ao transtorno obsessivo-compulsivo. O fenótipo cognitivo4
comportamental associado a ST se caracteriza por desempenho na matemática
particularmente deficiente, em especial em tarefas aritméticas. Dificuldades específicas
em cálculos, subitizing (estimativa automática de pequenas quantidades, independente
de contagem) e estimativa de quantidade e numerosidade, fazem parte deste perfil (ZINN
et al., 2007; KESLER, 2007).
Alguns sintomas da discalculia, tais como alterações da orientação direitoesquerda, agnosia digital e apraxia visoconstrutiva, constituem o chamado transtorno
não-verbal de aprendizagem (TNVA), o qual tem uma prevalência de 1% da população
escolar normal. O TNVA caracteriza o fenótipo cognitivo da ST, na qual há grande
variação alélica, originando consequentemente, as mais diversas correlações genótipofenótipo (ZINN et al., 2007). O componente primário da dificuldade de aprendizado nãoverbal é a dificuldade em matemática (ROURKE, 1995).
O desenvolvimento cognitivo de mulheres com ST é influenciado por ambos os
fatores, genético e hormonal. A influência hormonal é atribuída à falha ovariana na produção de estrógenos e andrógenos, ou ambos. Pesquisas anteriores demonstraram os efeitos do estrogênio na função motora e na velocidade de processamento e efeitos do andrógeno na memória de trabalho. Além disto, estas deficiências não são vistas em mulheres com falência ovariana prematura e cromossomo X intacto, sugerindo um papel predominante do fator genético na etiologia da deficiência cognitiva na ST (ROSS et al., 1998;
ROSS et al., 2000; ZINN, 2007).
1.4 Diagnóstico
1.4.1 Diagnóstico Citogenético
A ST, também chamada de monossomia do cromossomo X, citogeneticamente
é caracterizada pela presença de apenas um cromossomo X funcionante nas mulheres,
sendo que o outro pode estar ausente, ser anormal ou presente apenas em algumas células (mosaicismo).
O cariótipo, considerado padrão-ouro na confirmação do diagnóstico da ST,
consiste na observação morfológica e numérica dos cromossomos. Ele é considerado um
5
exame valioso, pois permite diagnosticar diversas alterações genéticas, como, por exemplo, translocações, deleções, inversões, duplicações e mosaicismos cromossômicos. Porém, é uma técnica trabalhosa, de alto custo, e que requer a experiência do citogeneticista. Requer ainda cuidados na obtenção das amostras, pois a demora entre a coleta e o
início da cultura, os erros durante o processamento do material ou mesmo a quantidade
insuficiente de material impedem a obtenção de metáfases suficientes para a análise.
Sua principal limitação é o fato de poder ser aplicado apenas a células que possam ser
induzidas à divisão in vitro (SYLBERT, 2004).
Das mulheres com ST, 50% apresentam cariótipo 45,X; 25% tem uma
anomalia estrutural do segundo cromossomo X, tais como isocromossomo, translocação
ou deleção parcial; e em 25% há mosaicismo (Tab. 1) (GONZALEZ, 1991; NUSSBAUM
et al., 2002; KESLER, 2007).
A ST pode surgir pela perda de um cromossomo sexual em um dos gametas
ou no embrião inicial. Quando a perda acontece no gameta, o cromossomo sexual
perdido é o paterno em cerca de 60% a 80% dos casos. Já as perdas pós-zigóticas são,
provavelmente, a causa dos mosaicismos 45,X/46,XY ou 45,X/46,XX, entre outros
(JACOBS, 1997; RANKE, 2001).
Pacientes com microdeleções do cromossomo X, frequentemente, não são
diagnosticados por cariótipo, e as metodologias existentes atualmente para esse
diagnóstico são muito caras e dispendiosas tais como Fluorecent in situ Hybridisation
(FISH) e Comparative Genomic Hybridisation (CGH). Nestes casos, as pacientes podem
receber o diagnóstico tardiamente, o que causa grande prejuízo com relação à estatura,
se a microdeleção tiver ocorrido nos genes SHOX e a falência ovariana caso ela ocorra
no gene POF, respectivamente (BONDY, 2006).
6
TABELA 1: Cariótipos encontrados na Síndrome de Turner pelo serviço de diagnóstico
citogenético do Ambulatório São Vicente do Hospital das Clínicas da UFMG.
Cariótipo
45,X
45,X inv 9
45,X/46,X i(Xq) (q10)
45,X/46,X r(X)
45,X/46,XX
45,X/47,XXX
45,X /46,X i(Xq)
45,x/ 46,X,+ mar
45,X/46,X i (Xq)/47,XX, i (Xq)/47,X i(Xq)
46,XX/45,X
46,X i(Xq)/45,X
46,X, r (XouY)
45,X/46,XY
46, XY/45,X
46,X i (Xq)
46,X, der(X) com del Xp12-pter e dup Xq
TOTAL
n
26
1
1
1
2
1
4
6
1
2
1
1
1
1
2
1
52
%
50
1,9
1,9
1,9
3,8
1,9
7,8
11,7
1,9
3,8
1,9
1,9
1,9
1,9
3,8
1,9
100
7
1.4.2 Diagnostico Pré-natal
Exames citogenéticos e ultrassonográficos estão cada vez mais disponíveis,
embora necessitem de mais estudos. Os achados mais comuns à ultra-sonografia são o
higroma cístico, a hidrópsia fetal e o aumento da translucência nucal. Menos de 10%
dessas gestações chegam a termo e em aproximadamente 20% delas o cariótipo 45,X é
confirmado. Dos diagnósticos citogenéticos de 45,X realizados por biopsia de vilosidade
coriônica ou amniocentese, em torno de 80% chegam a termo, e destes, 30% tem
cariótipo normal em análises posteriores. Portanto, verifica-se um alto índice de falsopositivo nestas analises, especialmente quando não relacionadas aos achados
ultrassonográficos (GRAVHOLT,1996; BONDY, 2005; ZILZ, 2006).
O diagnóstico pré-natal da ST usualmente é baseado em edema fetal à
ultrassonografia, níveis anormais de gonadotrofina coriônica humana (HCG), estriol nãoconjugado e alfafetoproteína, em triagens do soro maternas, ou em cariótipo fetal
realizado devido à idade avançada da mãe (SYLBERT, 2004).
1.4.3 Diagnóstico Neonatal
Achados como higroma cístico e linfedema de pés e mãos são altamente
sugestivos de ST. Malformações congênitas, como hipoplasia ventricular, também são
sugestivas de ST (SAVENDAHL et al., 2000; RANKE e SAENGER, 2001). O sinal mais
frequente no período neonatal é a baixa estatura. Esta, entretanto, raramente é
investigada, em parte, em função do custo dos exames de cariótipo.
8
1.4.4 Diagnóstico na Infância e Adolescência
Na ausência da maioria das características ou falha na identificação clínica dos
sinais, o diagnóstico acaba ocorrendo tardiamente. Geralmente é na adolescência que a
maior parcela de pacientes com ST busca auxílio médico, pela associação de baixa estatura e falta de desenvolvimento puberal, quando as adolescentes apresentam principalmente, ausência de desenvolvimento das mamas, amenorréia, primária ou secundária, ou
ainda, infertilidade. Esta falha no diagnóstico ocorre em cerca de 10% a 25% das mulheres, resultando em uma idade média de diagnóstico de 15 anos (SÄVENDAHL e
DAVENPORT, 2000; ELSHEIKH, 2002).
1.4.5 Diagnóstico Molecular
O cariótipo é utilizado rotineiramente para o diagnóstico da ST. Entretanto,
frequentemente, pacientes apresentando dificuldades mentais com ou sem outras
anormalidades não são diagnosticados por esta metodologia. Para estes pacientes, é
necessário aumentar a resolução do exame, ou seja, realizar um exame, que seja capaz
de diagnosticar rearranjos cromossômicos. Rearranjos cromossômicos foram relatados
em pacientes com cariótipo aparentemente normal, mas com fenótipo inexplicavelmente
alterado.
A técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) associa um método citogenético a uma técnica de biologia molecular, utilizando, como princípio básico, a capacidade de uma fita simples de ácido desoxirribonucléico (DNA) de parear com uma sequência complementar, formando, assim, uma fita dupla (PINKEL et al, 1986).
Estas sequências complementares de DNA, denominadas sondas, são marcadas com compostos fluorescentes e podem identificar segmentos específicos, distribuídos
em todo o cromossomo. A análise é realizada em microscópio, por meio de geração de
sinal luminoso, e colorido (HACKEL e VARELLA-GARCIA, 1997).
9
A técnica de FISH tem se mostrado uma técnica de grande importância, pois
auxilia tanto no mapeamento gênico, como na identificação de alterações cromossômicas, nem sempre identificadas pela citogenética clássica. Neste método, o cromossomo é
fixado em uma lâmina, desnaturado e exposto a uma sonda específica, desenhada para
hibridizar com a região de interesse na fita simples de DNA. A sonda geralmente é marcada com fluorescência, de forma que possa ser detectada ao microscópio. Este método
permite a avaliação de anomalias cromossômicas, tanto numéricas quanto estruturais,
sendo possível, também, a avaliação de células interfásicas, o que dispensa a necessidade da cultura celular. Possui alta sensibilidade, podendo ser analisadas cerca de 100,
200, ou até 1000 células em um único experimento. Como inconveniente, a FISH é um
processo longo, dispendioso, que exige controle rigoroso da qualidade das lâminas e necessidade de um profissional especializado para realização das análises. Neste método,
o tamanho do segmento a ser identificado é uma limitação, não sendo possível identificar
microdeleções ou mutações de ponto (SIEGEL e SYBERT, 2005).
Nos últimos anos análises em arranjos genômico (aCGH) se tornou disponível
e parece ser mais robusto para determinar desequilíbrios genômicos nos pacientes, com
maior resolução do que a análise citogenética baseada em bandamentos cromossômicos
(4-10 Mb). Estudos usando aCGH com marcadores espaçados em média a intervalos de
1 Mb mostraram que, aproximadamente, 25% dos pacientes com deficiência mental
associada a dimorfias e um cariótipo aparentemente normal apresentam deleções ou
duplicações abaixo do nível de resolução da citogenética clássica (VISSERS et al. 2003;
SHAW-SMITH et al., 2004).
1
1.5 Tratamento
A ausência da exposição adequada aos hormônios ovarianos, estrógenos e
progesterona, contribui para o padrão de comportamento observado na ST (ROSS et al.,
1998). A terapia com reposição de estrogênio está associada com melhora na percepção
visual, nas tarefas motoras, processamento cognitivo e na memória, mas, sem melhora
na função viso-espacial (ROSS et al., 2000). A exposição a andrógenos está associada
com alguma melhora na memória de trabalho, mas sem efeito nas habilidades verbais,
cognição espacial ou funções executivas (ROSS et al., 2003).
A ST é tratada, antes da adolescência, com suplementação de hormônio do
crescimento, e na puberdade, com suplementação de estrógeno e progesterona. O
tratamento é feito com o objetivo de se obter uma estatura mais próxima da normal e o
desenvolvimento do útero (ZINN et al., 2007; BONDY, 2007).
Um estudo recente em mulheres adultas demonstrou que elas apresentam
ansiedade social e depressão associadas à falência ovariana prematura (SCHMIDT et al.,
2006). O tratamento hormonal adequado em pacientes com falência ovariana pode
permitir a gestação com óvulos doados (FOUDILA, 1999).
1.5.1 Baixa Estatura e Hormônio do Crescimento
Uma característica clinica comum entre as mulheres com ST é a baixa estatura,
que pode afetar também os relacionamentos afetivos e a adaptação social. Estudos realizados em pacientes portadores de deleções parciais em cromossomos sexuais permitiram caracterizar o gene denominado SHOX (Short stature HomeoboX-containing gene OMIM 312865), considerado fundamental para o desenvolvimento da estatura normal
(RAO et al, 1997; JORGE et al, 2008).
A prescrição do hormônio do crescimento (GH) é feita para aumentar a
estatura final das mulheres com ST. Meninas tratadas com GH durante um ano têm a
estatura final maior do que as meninas não-tratadas. Para obter-se um aumento
1
significativo na altura, o tratamento deve ser iniciado por volta dos 4 a 6 anos de idade
(MUASHER et al., 1980; KESLER, 2007).
O efeito do GH no tamanho pode diminuir após os primeiros dois anos de
administração e um aumento progressivo da dosagem se faz necessário, atingindo-se
altas doses na adolescência (BAUDIER et al., 1985; KESLER, 2007).
1.5.2 Falência Ovariana e Hormônios Esteróides
A falência ovariana ocorre nos primeiros meses de vida e está presente em
90% das mulheres com ST. A ultra-sonografia da pélvis de mulheres com ST revela
ovários em fita ou muito pequenos para serem identificados (MASSARANO et al., 1989;
ELSHEIKH, 2002).
As mulheres com ST, que não receberam tratamento com estrogênio,
apresentam útero hipoplásico, e devido à falência ovariana e à posterior deficiência de
estrogênio, não entram na puberdade espontaneamente. O desenvolvimento das mamas
é mínimo ou ausente, e a amenorréia primária é frequente. Entretanto, aproximadamente
5% a 10% das adolescentes com ST apresentam algum grau de puberdade espontânea.
A gravidez espontânea ocorre em 2% a 7% das mulheres com ST, estando associada a
um alto índice de perda fetal (LIVADAS et al., 2007; KESLER, 2007). Anormalidades
cromossômicas e congênitas estão presentes em quase metade dos bebês sobreviventes
(ELSHEIKH, 2002).
A terapia de reposição de estrogênio, tratamento utilizado em casos de
deficiência ou insuficiência de estrogênio, inicia-se por volta dos 12 anos de idade,
coincidente com o inicio da puberdade (GRASVHOLT, 2005). Segundo SHERNAUSEK
(2000), a terapia com estrogênio pode diminuir o efeito da terapia com GH e,
consequentemente, diminuir a altura final da mulher adulta.
1
1.6 Os cromossomas sexuais humanos
1.6.1 A evolução dos cromossomos sexuais humanos
Existem várias síndromes envolvendo perdas ou ganhos de parte ou de
cromossomos inteiros. Enquanto a ST é causada pela perda de cromossomo X inteiro ou
parte, a Síndrome de Klinefelter é causada por ganho de um ou mais cromossomos X
(SIMPSON et al., 2003; BONDY, 2006; CRESPI, 2008). Essas síndromes são de grande
interesse no estudo da evolução humana, já que o cromossomo X concentra grande
quantidade de genes relacionados à reprodução e à cognição (VALLENDER e LAHN
2004; NIELSEN et al., 2005; CRESPI 2008). Os fenótipos de ambas as síndromes
envolvem alterações do desenvolvimento gonadal e alterações no perfil cognitivo
(MONEY, 1993; SIMPSON et al., 2003; BONDY, 2006; KESLER, 2007; CRESPI, 2008).
Em 1967, foi proposto que os cromossomos sexuais humanos evoluíram de um
par de autossomos há mais de 300 milhões de anos. Neste processo, elementos
funcionais foram conservados no cromossomo X, mas o cromossomo Y perdeu a maioria
dos traços do ancestral autossomo (OHNO, citado por ROSS, 2005).
Os humanos e chipanzés compartilharam um ancestral comum entre 5 e 7
milhões de anos atrás, e ainda mantém cerca de 99% do DNA idêntico. Em outras
palavras, podemos dizer que somente 1% de diferença genética entre homens e
chipanzés é capaz de causar grande diferença fenotípica observada (SKUSE, 2006).
O processo evolucionário erradicou a maioria das relações ancestrais entre os
cromossomos X e Y. No nível Citogenético, o cromossomo Y tem um grande e variável
bloco heterocromático e é consideravelmente menor do que o cromossomo X: a parte de
eucromatina do cromossomo X é seis vezes maior do que a do Y. Poucos genes no
cromossomo X têm equivalentes ativos no cromossomo Y e a maioria destes estão
contidos na região de homologia XY, que é de origem relativamente recente. Uma
comparação detalhada das sequências dos cromossomos humanos X e Y revela a
extensão da deterioração do cromossomo Y na região não-recombinante e grande parte
das homologias entre X e Y são descendentes do material adicionado ao longo do
1
processo de especialização destes cromossomos, que levou ao estabelecimento dos
cromossomos sexuais (ROSS et al., 2005).
.
1.6.2 Cromossomo X
O cromossomo X apresenta muitas características, que são únicas no genoma
humano. Mulheres herdam um cromossomo X da mãe e um do pai, mas os homens
herdam somente o cromossomo materno. A expressão de genes em um dos
cromossomos X femininos é silenciada em estágios iniciais do desenvolvimento por um
processo chamado de inativação do cromossomo X, descrito abaixo. O cromossomo
inativado permanece neste estado nas células somáticas. Já nas células germinativas ele
é reativado, durante a meiose, o que permite a recombinação.
As anormalidades genéticas da ST são determinadas pela ausência de uma
cópia dos genes no cromossomo X. Tem sido proposto, que a maioria dos aspectos
fenotípicos da ST seja devida à haploinsuficiência dos genes ligados ao X, que escapam
da inativação (ZINN e ROSS, 1993).
O cromossomo X teve um papel histórico na genética médica. Doenças
ligadas ao X tiveram certa facilidade no reconhecimento devido ao modelo de herança.
Homens portadores de alelos recessivos ligados ao cromossomo X manifestam sempre o
fenótipo, facilitando a averiguação da mutação e a correlação genótipo-fenótipo. Assim,
embora o cromossomo X contenha 5% de todos os genes humanos, estima-se que quase
10% das doenças monogênicas conhecidas têm herança ligada ao X (ROSS et al., 2005).
Estima-se que no cromossomo X existam 1098 genes codificadores de
proteínas, aproximadamente 700 pseudogenes, além de genes codificadores de RNA's
(ROSS, 2005). Em 2006, estavam registradas no OMIM 1329 entradas para “retardo
mental” Destas, 342 (25%) mapeavam no cromossomo X, sugerindo que os genes
ligados ao X têm um importante papel no desenvolvimento da inteligência humana, já que
são preferencialmente expressados no cérebro (SKUSE, 2006).
1.6.2.1 Estrutura
1
1.6.2.1.1 Região Pseudoautossômica 1 (PAR1)
Na extremidade do braço curto do cromossomo X (Xp), está localizada a região
pseudoautossômica 1 (PAR1), que contém 24 genes distribuídos em 2,7 Mb. Os genes
presentes nessa região têm uma cópia no cromossomo Y e, portanto, estão presentes em
cópia dupla tanto nos homens como nas mulheres. Estes genes não estão sujeitos a
compensação de dose pelo processo de inativação do cromossomo X. A recombinação
meiótica nas PARs é essencial a segregação independente dos cromossomas sexuais
(BLASCHKE, 2000; ROSS et al., 2005).
Essa região é caracterizada por alto conteúdo GC e, além disso, apresenta
uma das mais altas taxas de recombinação do genoma humano. Por isso, representa um
modelo excepcional para a investigação da correlação entre recombinação meiótica e
forças evolutivas, tais como mutação e conversão gênica (BLASCHKE, 2006).
1.6.2.1.2 Região X-específica
Além das PARs, há homologias entre os cromossomos X e Y em sua fração
não recombinante. Essa região contém 25 genes com homólogos funcionais no
cromossomo Y e ainda outros 1044 genes sem homólogos em Y (ROSS et al., 2005).
1
1.6.2.1.3 Região Pseudoautossômica 2 (PAR2)
Localizada na extremidade do braço longo cromossomo X (Xq), está a região
pseudoautossômica 2 (PAR2), com 330 Kb e 5 genes. Esta região foi criada por
duplicação de X e Y, desde a divergência da linhagem dos humanos e chimpanzés.
Alguns genes na PAR2 são sujeitos a inativação, provavelmente refletindo o status do
cromossomo X antes do evento de duplicação (ROSS et al., 2005).
1.6.2.2 Inativação do cromossomo X
No desenvolvimento normal das mulheres, um dos cromossomos X é inativado
durante os estágios iniciais do período embrionário. Este fenômeno é conhecido como
compensação de dose. Este mecanismo epigenético tem como função igualar a dosagem
dos genes X-específicos entre homens e mulheres (LYON et al., 1961; CHANG 2006).
A inativação é um processo ao acaso, que acontece nas células somáticas
femininas, onde o X inativo pode ser o X paterno (X p) ou materno (Xm). Depois que o
cromossomo X fica inativo em uma célula, todas as células descendentes desta terão o
mesmo X inativo. Além dos genes localizados nas PARs, vários genes da porção Xespecífica escapam da inativação (NUSSBAUM et al., 2002; ROSS et al., 2005;
CARREL, 2005).Tem sido bastante discutido por que há manifestações fenotípicas na
ST, uma vez que um dos cromossomos X é inativado. De acordo com Elsheikh (2002),
Carrel (2005) e Kesler (2007), há três hipóteses possíveis:
1. A falta da expressão bialélica dos genes das PARs;
2. A falta da expressão bialélica dos genes X-específicos, que escapam à
inativação;
3. A falta da expressão bialélica, no desenvolvimento inicial, de genes que
posteriormente serão inativados.
A inativação do cromossomo X se dá no começo do desenvolvimento
embrionário das mulheres e é coordenada a partir de um centro de inativação (XIC). O
transcrito específico do X inativo (XIST), gene localizado na região proximal do braço
1
longo do cromossomo X (Xq13.2), e necessário para o inicio da inativação do
cromossomo X, é expresso somente a partir do X inativo. XIST codifica um RNA, que se
mantém associado ao X inativo. Logo após, o cromossomo X sofre uma série de
mudanças na estrutura da cromatina, condensando-se. Além disso, as ilhas CpG dos
genes do X tornam-se metiladas, o que, por si, é suficiente para manter a inativação.
Além disto, o X inativo apresenta replicação tardia, quando comparado ao X ativo, e
também em relação aos demais cromossomos (BROWN et al., 1991; ROSS et al., 2005;
CHANG et al., 2006).
Em mulheres normais, aproximadamente 65% dos genes do X são
completamente inativados, 20% são inativados em algumas células e 15% escapam
completamente da inativação, a maioria destes situada em Xq (CARREL e WILLARD,
2005).
O processo de inativação em mulheres com um cromossomo X anormal,
resulta em um fenótipo de ST, similar ao observado na presença do cariótipo 45,X
(LEPPIG et al., 2004).
1.6.2.3 Impressão genômica no cromossomo X
Recentemente, foi proposta a existência de impressão genômica no
cromossomo X. Impressão genômica é o processo no qual a expressão do gene depende
da sua origem parental, paternal ou maternal. Somente um dos genes é expresso,
enquanto o outro é inativado. A impressão genômica tem um papel importante na ST.
Garotas com ST, que tem o cromossomo X derivado de seu pai, são melhores na função
verbal e nas funções executivas, e tem menos problemas de integração social.
Entretanto, elas têm dificuldade para memorizar figuras. Garotas com ST e com
cromossomo X derivado da mãe têm acentuada tendência ao esquecimento verbal
(JACOBS et al., 1997; SKUSE et al., 1997).
1
1.6.2.4 Discalculia e cromossomo X
A Discalculia do Desenvolvimento é uma desordem cognitiva que afeta
crianças, impedindo a aquisição normal da aritmética (MAZZOCCO, 2001).
Ela é uma doença genética que se caracteriza pela deficiência desproporcional
em cálculos aritméticos que afetam de 3 a 6% de crianças em idade escolar. Pode
aparecer isolada ou em conjunto com dificuldade de leitura e/ou déficit de atenção,
podendo estar associada à prematuridade ou ainda a causas desconhecidas
(BRUANDET et al. 2004).
Segundo Bruandet et al. (2004), crianças com Síndrome de Turner que
apresentam Discalculia do Desenvolvimento não tem problemas de compreensão e
produção de números, elas apresentam contagem e leituras normais. Não apresentam
deficiência significativa em comparação numérica, estimativa de numerosidade e
bissecção. Apresentam deficiência em subtizing (estimativa de pequena quantidade) e
estimativa cognitiva. Apresentam deficiência em tarefas aritméticas, exceto multiplicação.
Com o objetivo de caracterizar as pacientes do presente estudo, elas foram submetidas a
testes, de inteligência, memória, aritmética, leitura e compreensão de textos, alem de
outros (Tab. 2) para avaliação do estado neuropsicológico.
1
TABELA 2: Testes neuropsicológicos realizados nas pacientes com ST pelo LND
Avaliação
Inteligência
Triagem para detecção
de comprometimentos
cognitivos
Funções motoras e
somatosensoriais
Coordenação motora
fina
Habilidades
visoespaciais
Produtividade de
associação semânticolexical
Capacidades
fundamentais para o
desempenho escolar
Habilidades aritméticas
Atenção e funções
executivas
Memória
Teste
Referência
Matrizes progressiva e Escala de
Inteligência
Mini-exame do Estado Mental –
versão infantil (MEEM).
Raven 1947
Sperman, 1927
Folstei et al., 1975
Lateralidade manual, discriminação
direita esquerda,
gnosias digitais
Nine-Hole Peg Test (9-HPT)
Gerstmann, 1930
Schilder, 1931
Benton, 1959
Mathiowetz,1985
Figura Complexa de Rey
Ray, 1941
Fluência verbal
Regard et al., 1982
Avaliação do Desempenho Escolar
(TDE)
Viana, 1976
Avaliação da cognição matemática
Fluência de desenhos e pelo teste
de trilhas.
LND
LND
Subteste dígitos da Escala de
inteligência Wechsler- 3ª edição
(WISC-III) e
Cubos de Corsi
Corsi, 1972
*LND: Laboratório de Neuropsicologia do Desenvolvimento
O fenótipo cognitivo da ST é semelhante à dificuldade de aprendizado não
verbal (LND). LND é caracterizada por deficiência escolar em Matemática (aritmética) e
Ciências. Adicionalmente, apresentam dificuldade de adaptação a novas situações,
competências sociais, podem ainda apresentar ansiedade e depressão (HARNADEK e
ROURKE, 1994).
O padrão da deficiência na LND e em crianças e adolescentes com ST podem
ser devidos a um ou uma combinação de fatores genéticos, ambientais ou endócrinos
(ROSS et al., 1995).
1
Segundo Zinn (2007), a menor deleção no cromossomo X em que o paciente
apresenta as características fenotípicas da ST e LND acontece na sequência que
compreende os genes PLCXD1, GTPBP6, PPP2R3B e SHOX (Fig 1).
FIGURA 1: Genes do intervalo mínimo de sobreposição da Síndrome de Turner e
Discalculia do Desenvolvimento (adaptado de ZINN et al., 2007).
1.6.2.4.1 PLCXD1
PLCXD1 é uma fosfolipase específica do fosfatidilinositol. As fosfolipases são
um grupo de enzimas que hidrolisam fosfolipídios em ácidos graxos e outras moléculas
lipofílicas. Elas são ubiquamente expressas e tem diversas funções biológicas, incluindo
papeis na inflamação, crescimento celular, sinalização e morte e manutenção dos
fosfolipídios da membrana.
2
1.6.2.4.2 GTPBP6
GTP binding protein 6 codifica uma proteína que sua superexpressão é
inversamente proporcional a habilidade verbal. As GTP’s atuam como mensageiros
transmebranas com importantes papeis na comunicação celular.
1.6.2.4.3 PPP2R3B
Proteína Fosfatase 2 (PPP2R3B) é uma das quatro mais importantes
serina/treonina fosfatases e está implicada no controle negativo do crescimento e divisão
celular.
1.6.2.4.4 SHOX
O gene SHOX (Short Stature Homeobox) foi identificado como candidato à
baixa estatura e anormalidades esqueléticas (ELLISON et al., 1997; RAO et al., 1997;
KESLER, 2007). Tal gene localiza-se, nos braços curtos dos cromossomos sexuais, na
região pseudo-autossômica 1 (PAR 1), nas posições (Xp22.3 e Yp11.3). Os genes
localizados na PAR 1 não são inativados no cromossomo X, definindo duas cópias
funcionais. Nesta região, os cromossomos X e Y pareiam-se na prófase I masculina,
realizando uma permuta (crossing-over) obrigatória (RAO et al., 1997).
O gene SHOX é um segmento de DNA com 170 kb, que durante sua expressão
possui um splicing alternativo capaz de codificar uma proteína com 292 aminoácidos
(SHOXa) ou uma proteína com 225 aminoácidos (SHOXb), que diferem na região Cterminal e são expressas em diferentes tecidos. Uma sequência de 180 pares de bases
codifica um resíduo de 60 aminoácidos conhecido como homeodomain, que tem
capacidade de ligação ao DNA e ação na regulação da transcrição. Em geral, os genes
homeobox regulam o desenvolvimento embrionário e sua ação inadequada se relaciona
ao desenvolvimento de múltiplas doenças (RAO et al., 1997).
2
Duas cópias do gene SHOX, ativas, são fundamentais para o crescimento normal.
Na ST existe a presença de somente uma cópia do cromossomo X, portanto as anormalidades esqueléticas estão diretamente ligadas à haploinsuficiência deste gene (RAO et
al., 1997).
Deleções no SHOX e/ou em seus elementos regulatórios localizados a
downstream do SHOX, na PAR1, são responsáveis por aproximadamente 60% dos casos
de Léri-Weill Dyschondrosteosis (LWD), que é uma doença dominante caracterizada por
baixa estatura e anormalidades ósseas (BENITO-SANZ et al., 2006).
1.6.3 Cromossomo Y
Por ser haplóide, o cromossomo Y apresenta caráter dominante na
determinação do sexo em humanos. Ele apresenta duas regiões pseudoautossômicas,
PAR1 e PAR2, localizadas no braço curto (Yp) e no braço longo (Yq), que fazem
recombinação com o cromossomo X. Além dessas regiões, somente alguns poucos
genes participam da recombinação meiótica, por isso, aproximadamente 95% do
cromossomo Y é não recombinante (TILFORD et al. 2001).
1.6.3.1 Cromossomo Y e Gonadoblastoma
Aproximadamente, 6% dos casos de ST apresentam uma segunda linhagem
celular
com
cromossomo
Y
estruturalmente
anormal
(mosaicos).
As
técnicas
citogenéticas não são capazes de detectar muitos desses mosaicos. O desenvolvimento
de testes baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR) tem permitido estudos
mais detalhados em pacientes com ST (LARSEN, 1995; JACOBS, 1997).
A detecção de sequências derivadas do cromossomo Y em mulheres com ST
é de grande importância devido ao alto risco (10-30%) de desenvolvimento de tumor
gonadal (Gonadoblastoma) naquelas que apresentam fragmentos do cromossomo Y
(PAGE, 1987; SIMPSON, 1990; GRAVHOLT, 2000).
2
1.6.3.2 Detecção de Cromossomo Y na ST
O gene SRY está localizado na região distal do braço curto do cromossomo Y
e é responsável codificar uma proteína (Fator Determinante de Testículos- TDF) que
inicia a diferenciação sexual masculina. Mutação no gene SRY causa falha no
desenvolvimento testicular e está presente em 15% dos pacientes com 46,XY com
inversão de sexo e disgenesia gonadal. No período neonatal estes pacientes apresentam
fenótipo feminino normal. Na puberdade não há o desenvolvimento normal das
características sexuais secundárias, apresentam amenorréia e tem o risco aumentado de
desenvolvimento de Gonadoblastoma (SINCLAIR, 1990).
1.7 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
Não há método disponível para detecção de mutações no intervalo menor de
sobreposição das deleções relacionadas à discalculia na ST no cromossomo X. Em
função do custo do FISH ou aCGH, optamos por desenvolver um método baseado em
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA; SCHOUTEN et al., 2002) para
detecção de duplicações/deleções da região de sobreposição da ST com a LND na
PAR1.
1.7.1 MLPA: Uma Variação da PCR
A MLPA é uma variação da PCR, o que facilita a amplificação e detecção de
múltiplas sequências (multiplex) com um único par de primer. Em uma reação de PCR
comum, cada fragmento necessita de um par de primer para ser amplificado. Este primer
deve estar presente em grande quantidade resultando em vários problemas, tais como a
dimerização. Com a MLPA, o que é amplificado é a sonda. Assim, umas das grandes
vantagens do MLPA é que mais de 40 sequências podem ser amplificadas e
quantificadas com um único par de primer (SCHOUTEN et al, 2002). Outra vantagem do
2
MLPA é que ele pode ser utilizado para detectar SNP chegando até a identificação
cromossômica, ou seja, um amplo espectro de utilização (Fig. 2).
FIGURA 2: Espectro de utilização do MLPA, comparado com outras metodologias.
1.7.2 A utilização da MLPA
A MLPA permite tanto a detecção de SNPs quanto do número de cópias
presentes de uma determinada sequência. A detecção de SNPs é baseada na utilização
de duas sondas, que vão se hibridizar ao DNA em solução. As sondas são desenhadas
de tal forma que uma delas, a 5', tem sua extremidade 3' pareando com o SNP. A
segunda sonda, a 3', inicia-se na base subsequente ao mesmo (Figura 3). Diferentemente
das DNA polimerases, a DNA ligase não atua se houver mau pareamento. Isto confere
fidedignidade ao método. A especificidade é obtida pelo fato de a amplificação por PCR,
que se segue a ligação, usar os oligonucleotídios iniciadores da PCR universais (M13forward e M13-reverse), que não tem homologia com o genoma humano. A estimativa do
número de cópias é feita pela comparação com amplicons gerados a partir de outras
regiões do genoma, conforme análise estatística descrita (GERDES et al., 2004).
2
Estas sondas podem ser clonadas em M13 ou geradas sinteticamente. A
clonagem em M13 permite a utilização de fragmentos diferindo 2 pb em tamanho e
variando de 130 e 480 pb. Quando as sondas são geradas sinteticamente, o sistema
funciona com fragmentos diferindo de tamanho por 4 pb e variando de 92 a 450 bp.
A sonda 5` tem geralmente uma sequência específica de 20 a 30 nucleotídeos
enquanto a sonda 3` tem uma sequência específica de 25 a 43 nucleotídeos. O
espaçador, que pode ser colocado na sonda 3’ (LPO) ou na sonda 5` (RPO), vai variar de
tamanho de forma a gerar fragmentos de comprimentos diferentes, para permitir
resolução na eletroforese (SCHOUTEN et al., 2002).
A parte hibridizante das sondas é desenhada para detectar sequências
humanas em cópia única (genoma haplóide). Entretanto, a intensidade relativa do sinal
de diferentes sondas não são iguais. Eles sofrem influência direta da quantidade de taq
polimerase usadas na PCR, além da natureza do primeiro nucleotídeo do primer
marcado, sabendo-se que a intensidade do sinal aumenta no sentido A, T, G, C
(SCHOUTEN et al., 2002).
Já estão disponíveis kits para detecção de mutações e/ou triagem de
deleções/duplicações para diversas doenças. As vantagens da MLPA em relação ao
FISH ou aCGH são o baixo custo e a facilidade de operação (GERDES et al., 2005;
WILLEN et al., 2006).
O método MLPA não tem patente para a América Latina. A patente que existe
nos EUA e Europa cobre apenas distribuição dos kits produzidos pela MRC Holland b. v.,
não impedindo a comercialização do exame ou a publicação de novos métodos. Ao
contrário, a empresa que retém a patente do método (MRC Holland b. v.) oferece
orientação para interessados em montar novos métodos e disponibiliza protocolos em
seu site (www.mlpa.com).
2
1.7.3 Descrição das Sondas
As Sondas MLPA consistem em dois oligonucleotídios: Sonda oligonucleotídio
Esquerda (LPO) e Sonda Oligonucleotídios Direita (RPO). Cada oligonucleotídio contem
duas partes: A LPO contém a sequência de reconhecimento do primer forward na
extremidade 5’ e a sequência hibridizante esquerda (LHS) na extremidade 3’. A RPO
contém a sequência hibridizante direita (RHS) na extremidade 5’ e a sequência
reconhecida pelo primer reverse na extremidade 3’. A sequência dos primers é usada
para amplificação das sondas durante a reação de PCR. As sondas LPO e RPO podem
conter uma sequência stuffer no meio (Fig. 3).
Desenho das sondas
1
2
1 Sequencia
2 Sequência
3 Sequencia
4 Sequencia
5 Sequência
3
4
5
primer forward
hibridizante (LHS)
hibridizante (RHS)
Stuffer
primer reverso
FIGURA 3: Desenho esquemático das sondas MLPA
1.7.4 A Técnica MLPA
A técnica é muito simples: O DNA é aquecido e desnaturado, as sondas
MLPA, cada uma contendo dois oligonucleotídios, hibridizam no DNA. Quando os dois
oligonucleotídios de cada sonda estão hibridizado na sequência alvo, elas são ligadas por
uma reação enzimática para formar uma sonda completa. Durante a reação de PCR,
2
somente
sondas
completas
são
amplificadas
exponencialmente.
Os
produtos
amplificados são separados e quantificados através de eletroforese capilar (Fig. 4).
AMPLIFICAÇÃO
HIBRIDIZAÇÃO
ANÁLISE DE FRAGMENTO
LIGAÇÃO
FIGURA 4: Principio do funcionamento e detecção da MLPA. Hibridização: Y-primer
forward, X-primer reverse, A1-B1 sequências hibridizante esquerda, A2-B2 sequências
hibridizante direita. Ligação: As sequências hibridizantes esquerda e direita são ligadas.
Amplificação: As sondas ligadas são amplificadas em multiplex por um único par de
primer. Análise de Fragmentos: Os fragmentos são separados por eletroforese capilar.
2
O kit comercial SALSA MLPA KIT P018B SHOX (MRC Holland b. v.) detecta
deleções na região Xp22.3, associadas à baixa estatura (Síndrome de Léri–Weill ou
discondrosteose). Entretanto, esse kit não tria o intervalo mínimo de sobreposição das
deleções associadas à discalculia do desenvolvimento na ST, identificado recentemente,
e que contém os genes PLCXD1, GTPBP6, PPP2R3B e SHOX (GERDES et al., 2004;
ZINN et al., 2007).
O Kit SHOX P018 contém sondas para cada um dos éxons do gene SHOX
humano, sondas para a região promotora e sondas em autossomos que servem como
controle interno.
Para detecção de deleções nestas regiões, desenvolvemos in house, um
sistema diagnóstico baseado em MLPA. Doravante, nos referiremos a este método como
MLPA-Discalc-Turner.
O método desenvolvido, futuramente, será usado para triagens de ST em
crianças com dificuldade de aprendizado da matemática nas escolas de Belo Horizonte,
sendo esta, parte de outro projeto, atualmente em desenvolvimento no Laboratório de
Genética Humana e Médica (LGHM), do Departamento de Biologia Geral.
2
1.7.5 MLPA-Discalc-Turner
Para o desenvolvimento de um método de detecção de deleções do
cromossomo X baseado em MLPA, para o intervalo mínimo de sobreposição das
deleções associadas à discalculia na ST, optamos por incluir sondas ancoradas a (Tab 3
e Fig. 5):
1.
Genes da PAR 1, do intervalo mínimo de sobreposição das deleções: PPP2R3B,
PLCXD1, GTPBP6 e SHOX;
2.
Gene fora do intervalo mínimo, mas ainda dentro da PAR1: ASMTL;
3.
Gene na região X-específica, próximo ao bordo da PAR1: ASMT;
4.
Genes em outras regiões do cromossomo X: POF1B e FMR1;
5.
Genes na PAR 2: ILR9
6.
Gene em autossomo (normalizador): PAH.
TABELA 3: Genes averiguados no MLPA-Discalc-Turner, localização cromossômica
Gene
Nome
Localização
cromossômica
PLCXD1
Phosphatidylinositol-specific
phospholipase C
GTP binding protein 6
Protein phosphatase 2
Short stature Homeobox
Acetylserotonin OMethyltransferase-like
Acetylserotonin OMethyltransferase
Premature Ovarian Failure, 1B
Fragile Mental Retardation 1
Interleukin 9 receptor
Phenylalanine Hydroxylase
GTPBP6
PP2R3B
SHOX
ASMTL
ASMT
POF1B
FMR1
IL9R
PAH
•
Acessado em
Xp22.33/Y 11.32
Número de
acesso no
GenBank*
NM_018390
Xp22.33/Y11.32
Xp22.33/Y11.3
Xp22.33/Y11.3
Xp22.3/ Yp11.3
NM_012227
NM_013239
NM_000451.3
NM_004192.2
09/11/08
09/11/08
09/11/08
12/12/08
Xp22.3/Yp11.3
NM_004043.2
12/12/08
Xq21.1 q21.2
Xq27.3
Xq28/Yq12
12q22-q2401
NM_024921.3
NM_002024.4
NM_002186.2
HSU49897.1
09/11/08
09/11/08
13/02/09
09/11/08
09/11/08
Nota: GenBank: www.ncbi.nlm.nih.gov
2
PAR 1
PLCXD1 Xp22.33
GTPBP6 Xp22.33
PP2R3B Xp22.33
SHOX Xp22.33
ASMTL Xp22.3
ASMT
Xp22.3
POF1B Xq21.1 q21.2
FMR1 Xq27.3
PAR 2
IL9R Xq28/Yq12
FIGURA 5: Localização das sondas no cromossomo X.
1.8 Relevância e Justificativa
A triagem e diagnóstico correto da Síndrome de Turner são de extrema
importância principalmente com relação ao tratamento. Meninas com ST têm baixa
estatura e, quando são tratadas com hormônio do crescimento, chegam a atingir estatura
próxima do normal. Com relação às características sexuais secundárias, meninas com ST
apresentam infantilismo, mas com a terapia hormonal (estrógeno e progesterona) podem
também apresentar um fenótipo próximo do normal, exceto pela infertilidade. Vale
destacar que a suplementação hormonal deve ser iniciada antes do começo da
puberdade, e o diagnóstico tardio prejudica, e muito, o tratamento. Foi estimado que o
diagnóstico é tardio em 40-60% das crianças com ST (BONDY, 2007).
3
O desenvolvimento de metodologia diagnóstica para a ST, eficiente e de baixo
custo, pode significar um grande avanço nos métodos de triagem para a doença,
permitindo o diagnóstico mais precoce e o inicio do tratamento mais cedo, o que vai
minimizar as alterações fenotípicas, trazendo grandes benefícios para as mulheres
portadoras da doença.
Estas características fazem com que um exame de triagem neonatal seja de
grande utilidade possibilitando o tratamento adequado da baixa estatura, no início da desaceleração do crescimento, o que secundariamente permite a indução puberal na idade
adequada. Com a identificação precoce da síndrome, é possível ainda investigar anormalidades associadas a esta, bem como fornecer às pacientes um acompanhamento multidisciplinar capaz de proporcionar melhor qualidade de vida.
3
1.9 Objetivos
1.9.1 Objetivo geral
O objetivo geral do presente estudo é desenvolver ferramenta para a detecção
no cromossomo X da região candidata da discalculia do desenvolvimento na TS.
1.9.2 Objetivos específicos
1. Desenvolver sistema baseado em MLPA para detecção de deleções no
intervalo menor de sobreposição de deleções do cromossoma X na discalculia do
desenvolvimento;
2. Validar esta ferramenta em pacientes com o diagnóstico de Síndrome de
Turner baseado em cariótipo;
3. Validar a ferramenta em uma amostra de indivíduos normais, do sexo
feminino e do sexo masculino;
4. Desenvolver método para detecção de fragmento do gene SRY.
5. Validar o kit MLPA SHOX-P018B1 em uma amostra de mulheres, homens e
meninas/mulheres com ST da população de Minas Gerais.
3
2 Materiais e Métodos
2.1 Amostra
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da UFMG
previamente ao início dos trabalhos (ver anexo 1). A participação dos pacientes e
controles ocorreu após esclarecimento sobre a pesquisa e uma vez tirado todas as
dúvidas, foi assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE, ver anexo
2).
As amostras de 15 pacientes com diagnóstico clínico e citogenético (baseado
em cariótipo) de Síndrome de Turner foram coletas no Serviço Especial de Genética e no
Ambulatório de Endocrinologia, do Hospital das Clinicas, da UFMG. O cariótipo destas
pacientes é informado na Tabela 4. Estas pacientes foram também avaliadas (Tab. 2)
pela equipe do Laboratório de Neuropsicologia do Desenvolvimento, do Departamento de
Psicologia da Faculdade de Filosofia e Ciências Humanas da UFMG, coordenado pelo
Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase.
Como controles da amplificação do gene SRY foram testadas 10 mulheres e
35 homens, normais. Como controles do kit MLPA SHOX-P018B e da MLPA-Discalc/ST
foram testados 10 mulheres e 10 homens normais. Em ambos os casos foram testadas
as 15 meninas/mulheres com ST.
2.1.1 Coleta de Material Biológico
Foram coletados amostras de sangue de vaso periférico em 15 pacientes com
ST (Tab. 4) e 45 de pacientes controles, com técnica asséptica, em frasco tipo
vacuumtainer com EDTA. O material foi armazenado à temperatura ambiente, se a
extração for feita no mesmo dia, ou a 4°C para extrações em até 72 horas. Por períodos
maiores o sangue foi estocado a -20°C
3
TABELA 4: Cariótipos das pacientes com ST do presente Estudo
Numero de
pacientes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Número do DNA
no LGHM
3303
3304
3305
3306
3311
3355
3356
3435
3436
3444
3500
3522
3523
3930
3966
Cariótipo
45,X
46,XX (96%) / 45,X (4%)
46,XX (92%) / 45,X (8%)
45,X (84%) / 46,X + mar (16%)
45,X (91%) / 46,X, r (X) (9%)
46,XY (64%) / 45,X (36%)
46,X, i (Xq) (88%) / 45,X (12%)
45,X
45,X
45,X
45,X (93%) / 46,XX (7%)
45,X
45,X
45,X
45,X
2.2 Extração de DNA
A extração de DNA das amostras de sangue periférico foi feita conforme
descrito abaixo (adaptado de MILLES et al., 1988):
1 - Verter 5 mL de sangue em 1 tubo Falcom de 15 mL;
2 - Completar o volume para 15 mL com Ery-lise Buffer Ph 7,4;
3 - Misturar cuidadosamente por inversão;
4 - Incubar por 20 minutos em banho de gelo, invertendo o tubo
ocasionalmente;
5 - Centrifugar por 10 min. a 2500 rpm (em centrifuga refrigerada);
6 - Desprezar o sobrenadante;
3
7 - Afrouxar o pellet (desprender) do fundo do tubo;
8 - Repetir do passo 2 ao 7;
OBS: Se o pellet estiver limpo não precisa deixar por mais de 20 min na
segunda vez. Desprezar o sobrenadante. Descolar o pellet, com leves toques
no fundo do tubo.
9 - Adicionar 1,5 mL de SE; 75 µL de SDS (20%) e 4 µL de proteinase K 20
mg/mL (homogeneizar entre uma solução a outra);
Incubar overnight a 56°C em Banho-Maria ou 48 horas à temperatura
ambiente.
No dia seguinte:
10 - Adicionar 0,75 mL de NaCl 5 M e agitar no vórtex rapidamente;
11 - Centrifugar a 10 min por 5000 rpm (não há necessidade de refrigerar).
Caso as proteínas não precipitem, repetir o procedimento adicionando 75 µL
de NaCl 5 M (1/10 do volume inicial);
12 - Transferir o sobrenadante para outro tubo Falcon. Precipitar o DNA com o
dobro do volume de etanol absoluto gelado (-20°C);
13 - Pescar o pellet com micropipeta e transferir para um microtubo de 1,5 mL.
Lavá-lo duas vezes com etanol 70% gelado (-20°C);
14 - Secar o pellet por mais ou menos 20 mim. Não deixar o secar demais;
15 - Ressuspender o DNA com 300 µL de TE (10 mM Tris; 1 mM EDTA). Este
DNA é o estoque.
16 - Quantificar a concentração do DNA por espectrofotometria (Nanodrop ND1000, Bradford, BCA and Lowry assays);
17 - Diluir o DNA a 20 ng/µL com low TE (1 mM Tris; 1 mM EDTA) (para uso
na MLPA);
17 - Guardar o DNA na geladeira a 4°C (estoque e uso).
3
2.3 Estudos moleculares
2.3.1 Kit MLPA SHOX P018B
O Kit SHOX P018B é capaz detectar mudanças no número de cópias nas
regiões cobertas pelas sondas. Em sequências dentro da PAR1 e nas sondas controles
autossômicas, deleções heterozigóticas são reconhecidas por uma redução de 35-50%
da área do pico relativa ao produto amplificado. Deleções de sequências no cromossomo
X fora da PAR1 levam a ausência de amplificação em homens e a uma redução de 3550% da área do pico relativa ao produto amplificado.
O Kit SHOX P018 contém 43 sondas com fragmentos entre 130 a 490 nt. Além
desses contém 10 fragmentos-controle que geram fragmentos menores que 120 pb. A
relação das sondas, região cromossômica e tamanho dos fragmentos do KIT SHOX P018
é apresentada no anexo 3.
Os dados foram analisados pelo Coffalyser VBA analysis software V8
(www.mlpa.com).
2.3.2 MLPA-Discalc-Turner
2.3.2.1 Seleção das sondas
As sondas foram feitas de acordo com recomendação da MRC-Holland b.v
(www.mlpa.com). Após determinarmos os genes de interesse, conferimos os nomes em
http://www.genenames.org .
Localizamos o numero de referência das sequências do mRNA em
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene e ao final desse processo obtivemos a
sequência do gene.
Após a montagem de cada sonda foi feito BLAST (www.ncbi.org) para verificar
sua homologia com o gene de interesse.
3
2.3.2.3 Montagem das Sondas
A montagem das sondas obedeceu a um conjunto de critérios propostos pela
MRC Holland bv.
•
As sequências hibridizante LPO (LHS) e a sequências hibridizante RPO
(RHS) devem ser diretamente adjacentes, sem sobreposição, para que durante a
etapa de ligação elas possam ser unidas corretamente;
•
Ao fazer a contagem de nt para formar a sonda, incluir os 42 nt dos
primers de PCR no comprimento total das sondas;
•
Para evitar interferências de uma sonda na outra durante a etapa de
hibridização o intervalo mínimo entre sondas deve ser de 4 nt;
•
A MRC Holland bv oferece Kits com controles internos para a
montagem de MLPA sintético, e para que possam ser utilizados o tamanho mínimo
das sondas é de 88 nt e o máximo é de 168 nt;
•
O Tm de cada sequência de hibridização (LHS E RHS) deverá ser maior
que 70ºC e sem limite máximo;
•
As sondas não devem formar estruturas secundárias;
•
O conteúdo de GC deve ser de aproximadamente 50%, sendo indicado
iniciar e terminar a sonda com uma das duas bases.
Os genes escolhidos, as sequências de cada sonda e o tamanho dos
fragmentos são apresentados na Tabela 5.
3
TABELA 5: Genes, sequências e tamanhos dos fragmentos
para os genes-alvo da MLPA-Discalc-Turner
GENE
SEQUÊNCIA DA SONDA
Frag.
(pb)
LPO 5`gggttccctaagggttggagcacccagagatagttgggtg 3’
ILR9
RPO P 5`acaaatcacctccaggttggggatgcctctctagattggatcttgctggcac 3
92
LPO 5`gggttccctaagggttggacgtttccgcgcgtctctttct 3`
SHOX
RPO P 5`actgcaaacagaaatgggagggtggacaggcggtctagattggatcttgctggcac 3
96
LPO 5`gggttccctaagggttggagctgcacaggtcgaacttgaa 3`
GTPBP6
RPO P 5`aagggacgtcgcccacctgtaccgaggagtcggctcgtctagattggatcttgctggcac 3`
100
LPO 5`gggttccctaagggttggaggaagagtgtcccgcagagac 3`
PLCXD1
RPO P 5`ccggcgggagctgccaggagctctgggattccagcggctggtctagattggatcttgctg
104
gcac 3'
LPO 5`gggttccctaagggttggacacgagccaaagcattccgac 3`
PPP2R3B RPO P 5`cttctacttccccagaggacgcccgcaggactccgtcaacgtggatctagattggatcttgc
108
tggcac 3`
LPO 5`gggttccctaagggttggaacaagatgggatcctcagagg 3`
ASMT
RPO P5`accaggcctatcgcctccttaatgactacgccaacggcttcatggtgtcccagtctagattgg
116
atcttgctggcac 3`
LPO 5` gggttccctaagggttggagagctcgagctattggagtga 3`
POF1B
RPO P5`gacgagcagcagcagctgtggaacccagcagctcccagaggtgctgcagtgccagcctc
120
tagattggatcttgctggcac 3`
LPO 5`gggttccctaagggttggaccactgcggtcctggaaaacc 3`
PAH
RPO P5`caggcttgggcaggaaactctctgactttggacaggaaacaagctatattgaagacaac
124
tgtctagattggatcttgctggcac 3
LPO 5` gggttccctaagggttggaggaggagctggtggtggaagt 3`
FMR1
RPO P5`gcggggctccaatggcgctttctacaaggcatttgtaaaggatgttcatgaagattcaataa
128
cagtctagattggatcttgctggcac 3`
LPO 5`gggttccctaagggttggaggtgctgtgcccggtgattgg 3`
ASMTL
RPO P5`gaagctgctgcacaagcgcgtggtgctggccagcgcctccccacgccgtcaggagat
132
cctcagcaacgctctagattggatcttgctggcac 3`
3
2.3.3 MLPA - Hibridização, ligação e PCR
Observações importantes:
Para realização do teste é essencial a utilização de termociclador com tampa
aquecida (105ºC) e tubos de 0,2 μL;
Os procedimentos foram os mesmos tanto para o Kit SHOX 018B como para o
MLPA-Discalc-Turner;
A MRC Holland b. v. fornece um Kit somente com os reagentes utilizados na
MLPA, bastando somente incluir as sondas;
Os procedimentos a seguir podem ser executados em placa, ao invés de tubo
0,2 μL, o que proporciona mais segurança e agilidade ao processo.
Desnaturação e Hibridização
•
Desnaturar o DNA pipetando 5 μL, perfazendo um total de 100 ng,
colocar no termociclador e aquecer 5 minutos a 98ºC. Deixar baixar a temperatura
até chegar a 25º antes de abrir o termociclador;
•
Adicionar 1,5 μL do mix das sondas e 1,5 μL de tampão de MLPA;
•
Misturar com cuidado e incubar a 60ºC por 18 horas (pode variar de 16
a 20 horas);
Ligação
•
Reduzir a temperatura do termociclador para 54ºC e adicionar 32 μL do
mix de ligase-65 (3 μL de tampão A da ligase, 3 μL de tampão B da ligase, 25 μL
de água milli-Q e 1 μL de ligase-65, misturar com cuidado - preparados no
momento do uso e conservados em gelo por até 1 hora);
•
Incubar 15 minutos a 54ºC. Este produto de ligação pode permanecer
por até uma semana a 4ºC ou por até 20 dias a -20ºC.
3
Reação de PCR
•
Misturar em outro tubo 4 μL de tampão de PCR, 26 μL de água milli-Q e
10 μL do produto de ligação;
•
Colocar os tubos no termociclador a 60ºC e adicionar o mix da
polimerase 2 μL de primers (Tab. 6), 2 μL de tampão de diluição, 5,5 μL de água
mili-Q, 0,5 μL de SALSA DNA polimerase (preparados no momento do uso e
conservado em gelo por até 1 hora);
TABELA 6: Sequência do primer M13 usado para amplificar as sondas MLPA
Primer's
Primer M13-FOR
Sequência
5`FAM - gggttccctaagggttgga 3’
Primer M13 REV
5`gtgccagcaagatccaatctaga 3’
Condições da PCR
•
A PCR foi executada no termociclador modelo Veriti (Applied
Biosystems) de acordo com o seguinte programa: 35 ciclos de 30 segundos a
95ºC, 30 segundos a 60ºC e 60 segundos a 72ºC. Terminar com 20 minutos a
72ºC e 15 minutos a 4ºC.
2.3.4 Detecção de fragmentos
Após a PCR, foi separada uma alícota de 1 μL do produto, a qual foi
acrescentado 8,7 μL de Hi Di formamida e 0,3 μL de Gene Scan ROX500 (Applied
Biosystems). Os produtos das reações de MLPA foram separados em sequenciador
automático ABI 3130 (Applied Biosystems). O tamanho dos fragmentos foi estimado com
os softwares GeneMapper e PeakScanner (Applied Biosystems).
4
2.3.5 Análise de Dados
A característica de perda parcial ou total do segundo cromossomo sexual
pode potencialmente ser utilizada no diagnóstico molecular da ST. Utilizando-se genes
que apresentam duas cópias nos cromossomos sexuais, corrigidas pela quantidade do
gene normalizador, também em duas cópias, é possível, após a amplificação das sondas,
identificar a quantidade de cópias do gene em estudo
Existem vários métodos para normalização do MLPA, e de acordo a MRCHolland cada Kit de MLPA descreve o método que melhor representou os resultados do
referido produto.
A escolha da área sob a curva se deveu por que reflete melhor a quantidade
de fluorescência, ao invés da altura do pico.
A área sob a curva do pico de cada fragmento foi estimada com o software
PeakScanner, estabelecendo-se média e desvio padrão. Primeiro foi feita uma
normalização intra-amostra onde a área sobre o pico de cada paciente foi dividida pela
área sobre o pico da sonda controle (PAH) do teste. Em seguida foi feita uma
normalização inter-amostra e o valor resultante foi dividido pelo resultado da área relativa
dos controles normais. O valor normal, presença de duas cópias das sondas, é dado pela
proporção pacientes/controles próxima a 1. Valores próximos a 0,7 são compatíveis com
deleções e valores próximos a 1.3 são compatíveis com duplicações (SCHOUTEN et al.,
2002).
2.4 Detecção de fragmento do cromossoma Y
O gene SRY foi escolhido para identificar nas pacientes com ST possíveis
resquícios do cromossomo Y. Do mesmo modo que para as sondas MLPA, foi feito
BLAST para verificar homologia desta sequência. Para este gene, foi feito um par de
primer (Tab. 7) cuja uma amplificação por PCR comum gerou um fragmento de 88 pb. A
PCR foi executada nas seguintes condições: 94ºC por 5 minutos, seguidos de 25 ciclos
de 94ºC por 30 segundos, 62ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos, uma etapa de
4
alongamento final de 72ºC por 10 minutos e uma etapa final de 4ºC por 20 minutos. A
PCR foi executada no equipameto Verity (Applied Biosystems).
TABELA 7: Sequência dos iniciadores para a PCR do gene SRY
Primer's
Sequência
SRY Yp11.3
FOR - 5`tggcgattaagtcaaattcgc 3’
(NM_003140)
REV - 5`ccccctagtaccctgacaatgtatt 3’
4
3. Resultados
3.1Resultados do MLPA-discalc-Turner
3.1.1 Grupo controle
Neste grupo foram testados 10 homens e 10 mulheres normais e em todos
eles houve amplificação de todas as sondas. Os valores médios do pico relativo para os
homens foram: ILR9 1,03 (variação de 0,93 a 1,14); SHOX 1,05 (variação de 0,91 a 1,09);
GTPBP6 1,01 (variando de 0,98 a 1,05); PLCXD1 1,08 (variando de 0,90 a 1,18);
PPP2R3B 1,10 (variando de 1,01 a 1,13); ASMT 0,99 (variando de 0,95 a 1,03); POF1B
1,08 (variando de 1,03 a 1,12); PAH 1,06 (variando de 0,96 A 1,13); FMR1 1,02 (variando
de 0,88 a 1,14); ASMTL 1,06 (variando de 0,99 a 1,12). Os valores médios do pico
relativo para as mulheres foram: ILR9 1,06 (variação de 0,99 a 1,12); SHOX 1,03
(variação de 0,96 a 1,11); GTPBP6 1,09 (variando de 0,94 a 1,14); PLCXD1 1,05
(variando de 0,93 a 1,12); PPP2R3B 1,07 (variando de 0,91 a 1,13); ASMT 0,95 (variando
de 0,91 a 1,05); POF1B 1,09 (variando de 1,00 a 1,14); PAH 1,03 (variando de 0,91 A
1,11); FMR1 1,01 (variando de 0,98 a 1,04); ASMTL 1,03 (variando de 0,96 a 1,10).
3.1.2 Grupo ST 45,X
Neste grupo foram testadas 8 mulheres ST 45,X e como podemos verificar na
figura 6 que após a normalização dos dados é possível verificar a diminuição dos genes
estudados nas pacientes ST 45,X, exceto para o gene normalizador PAH.
4
1.20
92 ILR9
1.00
96 SHOX
0.80
100 GTPBP6
104 PLCXD1
0.60
108 PPP2R3B
0.40
116 ASMT
0.20
120 POF1B
124 PAH
0.00
45, X
45, X
45, X
45, X
45, X
45, X
45, X
45, X
45,XX
3303
3435
3436
3444
3522
3523
3930
3966
Controle
128 FMR1
132 ASMTL
FIGURA 6: Resultado das Pacientes ST 45,X após a normalização dos dados.
Os valores médios do pico relativo foram: ILR9 0,79 (variação de 0,70 a 0,87);
SHOX 0,82 (variação de 0,76 a 0,85); GTPBP6 0,79 (variando de 0,78 a 0,83); PLCXD1
0,76 (variando de 0,70 a 0,87); PPP2R3B 0,78 (variando de 0,74 a 0,87); ASMT 0,76
(variando de 0,71 a 0,80); POF1B 0,78 (variando de 0,69 a 0,83); PAH 1,05 (variando de
0,93 A 1,10); FMR1 0,73 (variando de 0,68 a 0,82); ASMTL 0,79 (variando de 0,71 a
0,87). Vale destacar que na avaliação dos eletroferograma todos os picos estavam acima
de 200 Unidades Relativas de Fluorescência (URF) (Fig. 7)
FIGURA 7: Eletroferograma de uma paciente ST 45, X, utilizando o MLPA-DiscalcTurner.
4
3.1.3 Grupo ST com outros cariótipos
Neste grupo foram testados 7 pacientes que apresentavam cariótipo com
mosaico e os valores médios do pico relativo foram: ILR9 0,89 (variação de 0,74 a 1,09);
SHOX 0,88 (variação de 0,76 a 1,05); GTPBP6 0,84 (variando de 0,68 a 0,99); PLCXD1
0,86 (variando de 0,70 a 1,07); PPP2R3B 0,88 (variando de 0,74 a 1,07); ASMT 0,86
(variando de 0,71 a 1,00); POF1B 0,88 (variando de 0,84 a 1,08); PAH 1,08 (variando de
0,98 A 1,11); FMR1 0,81 (variando de 0,65 a 1,08); ASMTL 0,89 (variando de 0,91 a
1,07).
3.2 Resultados do KIT SHOX P018B
O KIT SHOX P018B possui 53 sondas (anexo 3) distribuídas da seguinte
maneira:
•
10 sondas controles;
•
21 sondas no gene SHOX na PAR1;
•
6 sondas na PAR1 fora do gene SHOX;
•
4 sondas em Xp fora da PAR1;
•
1 sonda em Xq fora da PAR2 ;
•
1 sonda na PAR2;
•
10 sondas de referência em outros cromossomos.
3.2.1 Grupo controle
Foram analisados neste grupo 10 homens e 10 mulheres normais e em todos
eles houve amplificação de todas as sondas. Como podemos verificar na figura 8 todos
os picos estavam acima de 200 URF.
4
FIGURA 8: Eletroferograma de uma paciente do grupo controle utilizando o KIT SHOX
P018B.
3.2.2 Grupo ST 45,X
Os resultados analisados pelo Coffalyser VBA analysis software V8 (Fig. 9)
neste grupo permitiram identificar diminuição dos picos produzidos pelas sondas que reconhecem o gene SHOX (todos abaixo de 0,85). Os genes na PAR2, VAMP7, e o gene
em Xq AIFM1 também estavam diminuídos (0,76 e 0,75 respectivamente). As sondas referências estavam normais (por volta de 1).
4
-fr
ag
m
en
ts
88
92
9
10 6
0
10 X
5
11 Y
SH
8
O
Y
XXp Re
SH R 22 f
O ef 1 .32
X- 6
X p1
SH R p22 3
e
O f 1 .32
X
SH - X 1q 1
IL OX p22 3
3R
.3
SH A E xo 2
O Xp n 1
SH X- 22
O Xp .3 2
X- 22
19
X .3
6
S R p22 2
H ef .
2
O
21 0
1 3
1 4 S X - 3q 2
P H X 14
PP O p2
2 R X 2.3
3 B Ex 2
on
22
6 R Xp2 2
S
e
23 H f 2.
2 O 13 32
23 S H X E q 34
8 O x
24 K X on
6 AL Ex 7
S 1 on
H X
O p2 6
X 2
SH R Ex .3
O ef on
X 18 3
be q
N ST f P 21
LG S A
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SH 4X p2 1
O X 2.3
X p
SH - X 22
p .
AS OX 22 3
.
E
M
G S T x 32
PR H X on
14 OX p2 4
8- - X 2.
O p 32
A
SH 1 22 .
VA
O Xp 32
M
X 22
P7
E .
(S R xo 3
Y ef n 5
BL 3
1) p2
S R X 1
C HO ef 1 q2 8
S
SH F2 X- X 6p
O RA p2 13
X
2
9 X .
H 33 p2 32
D 8 2.
H 3
AI C D1 L 12 2
FM D A 9
7
1 KL X p 8
(P 5 22
X
SH DC p2 .3
O D8) 2.3
X
SH - X
O Xp q2
AR X- 22 5
X .3
SH SF p22 2
O X p .32
X- 22
Xp .32
R 22 .
e 3
R f 1p 2
ef 3
er 3
en
ce
Q
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
FIGURA 9: Resultado do KIT SHOX P018B em uma paciente ST com cariótipo 45,X. As sondas dos genes SHOX (SHOXXp22.32, SHOX-Exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) não amplificaram adequadamente. Observe que os picos desses genes se
encontram abaixo de 0,85 URF, enquanto os genes referências (16p13, 11q13, 13q14, 13q34, 18q21, 3p21, 16p13, 1p33)
ficaram na faixa normal entre 0,85 e 1,15 URF. Os genes da PAR2 (VAMP7 e AIFM1) também apresentavam diminuição.
Desta maneira, excluindo-se os fragmentos que não amplificaram adequadamente, foi possível confirmar o diagnóstico de
ST obtido ao cariótipo.
47
3.2.3 Grupo ST com outros cariótipos
Neste grupo, somente duas sondas (IL3RA Xp33.32 e SHOX-Exon 3) não
amplificara adequadamente (abaixo de 0,85 UFR). As demais sondas se mantiveram
dentro da faixa considerada como normal, entre 0,85 e 1,15 URF (Fig. 10).
48
O
96
10
0
X
10
5
Y
11
8
Y
92
88
-fr
ag
m
en
ts
R
Xe
Xp f
2
Re 2 .3
f1 2
SH
6
O
X- p 13
Xp
22
R
.3
SH ef 1 2
1
O
X- q 1
3
SH Xp2
2.
O
3
IL X E 2
3R
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A
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SH Xp 1
2
O
X- 2.3
SH Xp 2
2
O
X- 2 .3
Xp 2
2
19
Re 2 .3
6
S
f1 2
H
3q
O
X
20
14
21 4 S X p
22
H
1
O
P
.3
PP X
2
2 R Ex
3 B on
2
Xp
22
22
R
.3
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6
S
13 2
H
q3
O
23
X
4
2
S
Ex
H
on
O
23
X
7
8
Ex
K
24 AL1 on
6
6
X
S
p2
H
2.
O
X
3
Ex
on
R
ef
3
18
q2
1
SH
S
O
X
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X
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3
SH
Xp
O
22
X.
3
X
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T
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32
14
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O
2.
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32
1
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22
O
X
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E
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5
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3
Y
BL p2
1
1)
Xq
R
2
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6
O
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C
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2
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3
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X
22
93
.3
38
2
H
-L
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12
H
D
1A 978
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5
1
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X- X q
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2
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22
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22
O
X.3
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22
Re .32
f1
p
R
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er
en
ce
SH
Q
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
FIGURA 10: Resultado do KIT SHOX P018B em uma paciente ST mosaico. Observe que os picos dos genes do SHOX
(SHOX-Xp22.32, SHOX-Exons 1, 2, 4, 5, 6, 7), e da PAR2 (VAMP7 e AIFM1) estão na faixa da normalidade. O único gene
que apresentou diminuição foi o SHOX-Exon 3. Portanto, o Kit MLPA SHOX P018B não foi capaz de detectar a ST,
causada por mosaicismo cromossômico quando este apresenta mais de 90% de células normais.
49
3.3 Resultados do SRY
3.3.1 Controles Masculinos
Foram testados 35 homens normais e em todos houve amplificação do
fragmento do gene SRY (Fig. 11).
1
2
3
4 5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
SRY88 pb
50 pb
FIGURA11: Gel de poliacrilamida 8%, corado com prata. Na canaleta 1, marcador de
peso molecular (50 pb) e na canaleta 2, branco. Houve amplificação por PCR do
fragmento do gene SRY em todos os homens normais (canaletas 4 a 19). Na canaleta
16 não foi aplicado amostra.
3.3.2 Controles Femininos
Foram testadas 10 mulheres normais e em nenhuma delas houve
amplificação do gene SRY.
50
3.3.3 Pacientes com ST
Foram testadas 15 pacientes com Síndrome de Turner (Fig. 12). O produto
de amplificação do gene SRY foi identificado em uma paciente com Síndrome de
Turner. Nesta paciente, havia sido identificado um mosaicismo cromossômico, com o
cariótipo 46,XY/45,X. A linhagem 46,XY foi identificada em 64% das células
examinadas.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
FIGURA 12: Gel de poliacrilamida 8%, corado com prata, mostrando a amplificação por
PCR do fragmento do fragmento do gene SRY. Na canaleta , marcador de peso
molecular (50 pb) e na canaleta 2, branco. A seta indica banda correspondente ao
fragmento de 88 pb presente em uma única paciente. Este resultado corrobora os
resultados obtidos nos cariótipos destas pacientes, onde apenas a paciente da
canaleta 14 apresenta mosaicismo cromossômico, com o cariótipo 46,XY/45,X.
51
4 Discussão
Foi descrito variação de rendimento entre amostras de diferentes indivíduos
e entre picos em um mesmo indivíduo (SCHOUTEN et al., 2002). Também foi descrito
que picos próximos apresentam variações similares. Como estas variações podem
representar artefatos, foi necessária a normalização dos dados e neste trabalho foram
utilizados dois procedimentos de normalização (GERDES et al., 2005).
No primeiro, normalização intra-amostra, cada área do pico de um indivíduo
é normalizada ao ser dividida pela área do pico da sonda controle (PAH) do teste
(SCHOUTEN et al., 2002). No segundo, foi feita uma normalização inter-amostra onde
a média normalizada da área do pico de cada paciente foi dividida pela média da área
do pico das amostras de referência (GERDES et al., 2005). Estes autores também
ressaltaram que picos muito desviantes, com mais de 4 desvios padrão (dp) acima da
média das amostras de referência, devem ser considerados cuidadosamente.
Uma das grandes vantagens da utilização do MLPA é a pequena quantidade
de DNA necessária para sua realização, apenas 20 ng. Neste trabalho foram utilizadas
100ng de DNA. Outra vantagem é a quantidade de lócus estudados. Na MLPA, podem
ser analisadas em multiplex até 40 lócus de uma vez, além dos controles.
O processamento de amostras foi altamente flexível, pois foi utilizada placa
de PCR de 96 poços que se adaptam diretamente no termociclador e no sequenciador.
Esta simplicidade torna o processo, desnaturação, hibridização, ligação, amplificação,
separação e análise de fragmentos, bastante rápido, já que é evitada ao máximo a
manipulação de amostras. Foi estimado um tempo de 24 horas para a liberação do
resultado, já inclusos a hibridização overnigth, etapa que pode ser reduzida a um
mínimo de 3 horas caso seja requerida urgência no resultado, além de ser um
processo bastante robusto, o que em diagnóstico clínico é essencial. A separação dos
produtos por eletroforese capilar foi consistente entre as amostras. O pico foi facilmente
identificado usando size standards interno, permitindo identificação automática pelo
software Peak Scaner.
52
O diagnóstico precoce da ST torna possível o tratamento adequado da baixa
estatura, com isso, permite a indução puberal na idade adequada. Possibilita, ainda, a
investigação de anormalidades associadas, como as cardiopatias congênitas e
malformações renais, bem como identificação de marcadores que reconheçam maior
risco de tumores gonadais. Novos métodos de preservação da função gonadal tornam
o diagnóstico precoce da ST ainda mais importante, por abrir novas perspectivas em
relação à fertilidade nestas pacientes. Em conjunto, tais medidas procuram estabelecer
metas para proporcionar melhor qualidade de vida para as meninas afetadas pela
síndrome.
O presente estudo é apenas uma parte do projeto, que visa identificar
crianças com dificuldade de aprendizado da matemática nas escolas de Minas Gerais.
O projeto ainda está em andamento e uma análise criteriosa só será possível ao final
do mesmo.
Schouten et al (2002) estabeleceram como valor normal, presença de duas
cópias das sondas, dado pela proporção pacientes/controles próxima a 1. Valores
próximos a 0,7 são compatíveis com deleções e valores próximos a 1.3 são
compatíveis com duplicações.
No presente estudo, estabelecemos para o MLPA Discal-Turner o ponto de
corte em 0,85 para deleções e 1,15 para duplicações. Com isso a especificidade do
método foi de 100%, já a sensibilidade foi de 90% para ST 45,X e de 63% para ST com
outros cariótipos. Vale ressaltar que, dos 7 pacientes com mosaicismo cromossômico,
existem 3 que apresentam menos de 10% das células alteradas, o que torna difícil o
diagnóstico por essa metodologia. Com as sensibilidades e especificidades indicadas
acima, o MLPA Discal-Turner foi capaz de identificar a ST nas pacientes ST com
cariótipo 45,X. Já nas pacientes ST com outros cariótipos, foi possível identificar a ST
somente nas pacientes que tem grande numero de células alteradas, portanto ao
analisar esses resultados deve-se ter muito cuidada, principalmente entre o numero de
células alteradas da paciente e o resultado esperado com este método.
53
Os resultados do KIT SHOX P018B foram similares ao MLPA Discal-Turner
A especificidade foi de 100%. A sensibilidade foi 100% nas pacientes ST com cariótipo
45,X e de 60% nas pacientes com ST com outros cariótipos.
Levando em conta os cariótipos das pacientes com ST, as que apresentam
cariótipo 45,X apresentaram redução da amplificação, devido a falta de um
cromossomo sexual. Portanto, os resultados do MLPA-Discalc-Turner e do KIT SHOX
P018B foram compatíveis com as alterações das pacientes. Já nas pacientes que
apresentavam mosaicismo cromossômico não foi possível verificar claramente essa
redução da amplificação quando a presença de células anormais foi menor que 10%.
54
5 Conclusões
O MLPA-Discal-Turner é um método rápido, sensível e robusto para a
triagem de meninas com ST. Sua aplicação no diagnóstico de ST em pacientes com
cariótipos ST 45,X mostrou-se bastante eficaz. Com relação aos pacientes ST com
outros cariótipos ainda requer modificação para melhorar e sensibilidade.
Da mesma maneira o KIT SHOX P018B foi capaz de diagnosticar
corretamente pacientes com cariótipos ST 45,X, mostrando um pequena redução da
sensibilidade com relação as pacientes ST com outros cariótipos.
A metodologia utilizada para detecção do gene SRY em pacientes com ST
mostrou-se altamente sensível e especifica.
Portanto, o MLPA-Discalc-Turner e a PCR para SRY podem ser aplicados
na detecção no cromossomo X da região candidata da discalculia do desenvolvimento
na ST e na pesquisa do cromossomo Y respectivamente.
55
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63
7 Anexos
ANEXO 1: Aprovação no COEP-UFMG
64
ANEXO 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para os pais ou responsáveis de
crianças portadoras de síndromes genéticas
Título da Pesquisa:
Discalculia do desenvolvimento em crianças com Síndrome de Turner: triagem
populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares
Prezado(a) Responsável,
Este é um convite para você participar voluntariamente em uma pesquisa que irá avaliar algumas
habilidades cognitivas do seu filho. Estamos à disposição para esclarecer quaisquer dúvidas em
relação à pesquisa antes e durante a execução da mesma.
Leia as informações abaixo antes de expressar ou não o seu consentimento para participar da
pesquisa.
1. Objetivos do estudo
A pesquisa objetiva avaliar as habilidades matemáticas de seu filho e os fatores que podem estar
influenciando o seu aprendizado. Acreditamos que esses dados podem contribuir para conhecer como
está a aprendizagem da matemática entre as crianças de Belo Horizonte, permitindo a realização de
um planejamento educacional que favoreça a aprendizagem das crianças com dificuldades de
aprendizagem e crianças com síndromes genéticas.
2. Procedimento da avaliação
Algumas informações sobre a história da criança serão solicitadas através do preenchimento de
questionários e por meio de entrevistas sobre o estado de saúde e educação do seu filho. As
entrevistas e testes serão utilizados para a avaliação da saúde e aprendizagem do seu filho. Os testes
serão realizados aproximadamente em duas sessões de 1h30min cada, sendo divididas em testes
para a avaliação das funções relacionadas com a aprendizagem, que são tarefas de lápis e papel, que
investigam a aprendizagem da leitura, da matemática e habilidades como memória e atenção.
Adicionalmente serão coletados 10 ml de sangue de uma veia do braço para análises genéticas.
3. Realização da pesquisa
A pesquisa está sendo conduzida pelo Programa de Pós Graduação de Saúde da Criança e
Adolescente da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais.
4. Participação voluntária e sem compromisso financeiro
Como sua participação é voluntária, não implica em nenhum compromisso financeiro entre você e a
equipe do Departamento de Saúde da Criança e Adolescente da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Minas Gerais.
65
5. Riscos
O risco biológico envolvido é mínimo. A coleta de sangue pode deixar uma mancha no local e doer um
pouco. Caso isso aconteça você será orientado sobre os cuidados necessários.
6. Liberdade de recusa e de desistência
Você poderá negar o consentimento ou mesmo retirar a criança em qualquer fase da pesquisa, sem
nenhum prejuízo para a criança.
7. Coleta e análise do material genético
Serão coletados 10 ml de sangue de uma veia do braço. A coleta será realizada por profissional de
saúde habilitado e com experiência na coleta de sangue de crianças. O sangue será utilizado para
análises genéticas no Laboratório de Genética Humana e Molecular do ICB-UFMG. As análises
genéticas têm o objetivo de verificar se existe algum padrão de variação nos genes que se associa
com dificuldades de aprendizagem da matemática. O sangue será armazenado em um banco de
material biológico sob a responsabilidade da Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho,
regulamentado pelo Conselho de Ètica em Pesquisa (COEP) da UFMG, e poderá ser utilizado em
outras pesquisas eventualmente aprovadas pelo COEP.
8. Garantia do sigilo
Os resultados da pesquisa serão utilizados em trabalhos científicos, publicados ou apresentados
oralmente em congressos e palestras, sem revelar sua identidade e da criança ou adolescente.
7. Benefícios em participar da pesquisa
Ao final, você obterá oralmente e por escrito, sob forma de aconselhamento e de um relatório os
resultados da análise dos seus dados por profissionais das áreas da neurologia, genética e psicologia.
Caso seja identificado algum problema de saúde ou alguma necessidade educacional, a família será
orientada e criança será encaminhada para os serviços disponíveis na comunidade, com o objetivo de
otimizar a saúde, bem-estar e as capacidades de aprendizagem de seu filho. Assim, você receberá
informações sobre o desenvolvimento de seu filho e níveis de aprendizagem, identificando pontos
positivos e limitações que podem ser trabalhadas. A coleta de sangue permitirá eventualmente o
diagnóstico de alguma alteração genética associada com dificuldades de aprendizagem da
matemática.
Agradecemos a sua atenção e valiosa colaboração, subscrevendo-nos
Atenciosamente,
__________________________
Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase
CRM-MG 29960-T
Coordenador da Pesquisa
Professor Adjunto do Departamento de Psicologia da UFMG
Av. Antônio Carlos 6627, FAFICH-UFMG, Sala 4060
Tel 0xx31/34096295, 0xx3191059589, email [email protected]
Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho
Pesquisadora responsável pela parte de genética do projeto
Professora Adjunta do Departamento de Biologia Geral da UFMG
Av. Antônio Carlos 6627, ICB-UFMG, Laboratório de Genética Humana e Molecular
Tel 0xx31/34092598, email: [email protected]
66
Fernanda de Oliveira Ferreira
CRP 04/22247
Doutoranda em Ciências da Saúde pela Faculdade de Medicina da UFMG
Av. Antônio Carlos 6627, FAFICH-UFMG, Sala 4060
Tel 0xx31/34096295, 0xx3191059589, email [email protected]
Gutemberg Eloi de Sousa
Mestrando em Genética pelo Departamento de Biologia Geral do ICB/UFMG
Av. Antônio Carlos 6627, ICB-UFMG, Laboratório de Genética Humana e Molecular. Sala E3-175
Tel 0xx31/34092598, email: [email protected]
Para maiores esclarecimentos você pode consultar também o
Comitê de Ética em Pesquisa (COEP-UFMG)
Av. Antônio Carlos, 6627- Unidade Administrativa II- 2º andar- Campus Pampulha-UFMG tel. 34094592
Tel. 0xx31/3409-4592, email [email protected]
Responsável
Eu,..........................................................................................................................,responsável
pela
criança ..........................................................................................................., abaixo assinado, declaro
ter sido informado sobre os procedimentos e propostas da pesquisa " Discalculia do
desenvolvimento em crianças de idade escolar: triagem populacional e caracterização de
aspectos cognitivos e genético-moleculares
” e concordo em participar voluntariamente na mesma.
Belo Horizonte, ......... de ......................... de ............
_______________________________________
Assinatura
67
ANEXO 3: Composição do Kit SHOX P018B
68
69