Vice-Reitoria para Assuntos Acadêmicos - SOL
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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS Vice-Reitoria para Assuntos Acadêmicos Departamento de Biologia Coloração de Gram Material corante cristal violeta corante fucsina básica solução de iodo (lugol) etanol-acetona (1:1 v:v) bico de Bünsen alça bacteriológica lâmina de microscopia microscópio óptico Procedimento 1. Preparo do esfregaço Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, aquecendo rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bünsen. 2. Aplicação do corante primário Despejar o corante cristal violeta sobre a lâmina cobrindo toda a amostra; deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água para remover o excesso de corante. 3. Aplicação do fixador Despejar lugol sobre a lâmina cobrindo toda a amostra; deixar em repouso por 30 segundos; enxaguar a lâmina com água para remoção do excesso do fixador. 4. Descoloração Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona (1:1 v:v) para remover o complexo cristal violeta-lugol; enxaguar a lâmina com água para remover excesso de solvente. 5. Aplicação do corante secundário Despejar o corante fucsina básica sobre a lâmina cobrindo toda a amostra; deixar em repouso por 30 segundos. Enxaguar a lâmina com água e secar com papel absorvente. 6. Microscopia Examinar a amostra ao microscópio óptico. Composição dos corantes Solução de cristal violeta Solução A cristal violeta etanol:acetona 2,0 g 20 ml Solução B Solução de lugol iodo iodeto de potássio água destilada 1,0 g 2,0 g Solução de fucsina fucsina água destilada 1,0 g 100 ml 100 ml oxalato de 0,8 g amônia água destilada 100 ml Misturar as soluções A e B e deixar em repouso por 24 horas antes do uso. Fontes William R. Mayberry WR, Quillen JH & Catlin K. Gram stain tutorial. MicrobeLibrery: disponível e, <http://www.microbelibrary.org> acesso em 20 de fevereiro de 2006 UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS Vice-Reitoria para Assuntos Acadêmicos Departamento de Biologia Coloração de Gram Método de coloração de Gram Esta técnica foi desenvolvida em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938) e serve para a visualização e diferenciação de bactérias. Parede Celular (PC) Sinônimos: saco murâmico, peptoglicano, mureína, mucocomplexo, mucopeptídeo, peptideoglicano. Características: rígida, inelástica, porém deformável. Funções: - Dá forma à célula; - Promove resistência a choques mecânicos e osmóticos; - Serve de sítio de absorção de vírus; - Determinante da especificidade antigênica; - Responsável pela divisão das bactérias em Gram + e Gran -. Fontes William R. Mayberry WR, Quillen JH & Catlin K. Gram stain tutorial. MicrobeLibrery: disponível e, <http://www.microbelibrary.org> acesso em 20 de fevereiro de 2006 UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS Vice-Reitoria para Assuntos Acadêmicos Departamento de Biologia Coloração de Gram Composição: polimérica, com sub-unidades de ácido murâmico, N-acetil glicosamina (NAGL) e tetrapeptídeo. Antibióticos impedem a formação da parede celular por atuarem na síntese protéica. No espaço periplasmático da PC há enzimas -lactamases que inativam antibióticos como penicilina e cefalosporina, por hidrolisar o anel -lactâmico. Lisosima faz digestão da PC e está presente em saliva, muco e lágrima. Atua destruindo a ligação NAGl - Mureína. Bactérias Gram-positivas: sua parede celular é composta por uma espessa camada de peptideoglicanos (proteínas + carboidratos). Algumas também possuem uma camada de Ácido Teicóico externa à camada de peptideoglicanos. O Lugol (iodo) utilizado no método de coloração de Gram fixa a violeta genciana a este tipo de parede celular. Bactérias Gram-negativas: possuem parede celular composta por lipopolissacarídeos, lipopoliproteínas e fosfolipídeos. Estas bactérias não retém a violeta genciana no método de coloração de Gram. Característica Gram + Gram - Composição Entre 2 ácidos murâmicos da PC há um tetrapeptídeo. Um ácido teicóico está presente. Entre 2 ácidos murâmicos da PC há um tetrapeptídeo Espessura 20nm 10nm Amino ácidos Pouco Muito Lipídeos 2% 20% Peptoglicano 90% (muitas camadas) 5-10% (1-2 camadas) Polissacarídeo Pouco Muito Fontes William R. Mayberry WR, Quillen JH & Catlin K. Gram stain tutorial. MicrobeLibrery: disponível e, <http://www.microbelibrary.org> acesso em 20 de fevereiro de 2006
