Apresentação Ferritin and the response to oxidative stresshot!
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António A. V. Pacheco 3º ano Bioquímica 2007/2008 Grupo Heme Ferro Hemoglobina Transporte de O2 Mioglobina Armazenamento de O2 Citocromos Respiração celular Grupo prostético de enzimas Rinonucleotídeo redutase NADH desidrogenase, succinato desidrogenase O aumento do ferro livre pode levar à formação de ROS (espécies reactivas de oxigénio) Fe2+ + H2O2 . Fe3+ + OH + OH- Reacção de Fenton Danos em Proteínas, Lípidos e ADN (ROS) stress oxidativo Captação Metabolismo do Ferro Transporte Armazenamento Mobilização Tf – Transferrina; TfR - Receptor de transferrina; Heme OX – Heme Oxidase; DMT – Transportador de iões divalentes A ferritina é uma proteína composta por 24 subunidades de 2 tipos (H e L), com peso molecular com cerca de 450 kDa e que pode conter até 4500 átomos de Fe (III). É responsável pelo controlo do ferro a nível intracelular (reserva de ferro, fornecimento de ferro…) e encontra-se essencialmente no fígado. Função de detoxificação e reserva de ferro A razão das subunidades H e L é variável. Homeostasia do ferro Subunidade L: tem um papel importante na nucleação do ferro e na estabilidade da proteína Subunidade H: tem uma forte actividade catalítica como ferroxidase, na oxidação do ferro ferroso. Mecanismos de regulação (Torti e Torti, 2002) Regulação transcricional Regulação pós-transcricional independente do IRP, incluindo a estabilidade do RNAm e a estabilidade da proteína Regulação traducional mediada por IRPs Trabalhos anteriormente efectuados indicavam que: Tratamento de células com agentes oxidantes Indução das subunidades L e H da Ferritina (Tsuji, T. et al., 2000) Superexpressão da subunidade H Aumenta a resistência das células HeLa à toxicidade do H2O2 (Cozzi, A. et al., 2000) Objectivo: Verificar o efeito do stress oxidativo na expressão da ferritina e qual o papel das subunidades H e L na resposta ao stress oxidativo em células HeLa. Efeito do H2O2 na expressão da ferritina em células HeLa Análise da expressão da ferritina Determinação dos níveis de RNAm Determinação dos níveis de proteína Análise da expressão da ferritina na defesa contra o stress oxidativo Superexpressão da Ferritina H e L em células HeLa Clonagem dos cDNAs da Ferritina H e L de rato em vectores de expressão Efeito da expressão da Ferritina H e L (FH e FL) na formação de ROS Tratamento das células HeLa com H2O 2: Northern-blot Aumento dos níveis de RNAm da ferritina H SDS-PAGE de proteínas imunoprecipitadas Aumento dos níveis de proteína da FH e da FL H2O2 induz a expressão da ferritina em células HeLa Ensaio de retardação em gel dos IREs Incubação H2O2 (125 µM) Isolamento de proteínas solúveis Incubação Controlo positivo (agente quelante de ferro activador do IRP) Tempo de incubação com H2O2 RNA ligado à IRP IRP Activa IRP Total RNA não degradado e não ligado RNA degradado ME – Mercaptoetanol D- Desferrioxamina Aumento da fracção do IRP activo/IRP total até às 4 h, diminuindo depois até aos valores basais H2O2 tem um efeito transitório na activação de IRPs em células HeLa Northern-Blot Transfecção de células HeLa com plasmídeo de expressão regulado pela Tc, contendo o cDNA de FH de rato Plaqueamento em meio sem Tetraciclina Imunoprecipitaçao e SDS-PAGE Análise do RNAm e proteína Aumento da expressão de Ferritina H nas células HeLa transfectadas Transfecção transitória de células com FH na presença e ausência de tetraciclina Tratamento das células com H2O2 Efeito na Viabilidade RESULTADOS não concordantes Diferentes eficiências na transfecção Objectivo: Obtenção de uma população de células que expressasse uniformemente ferritina Sistema de expressão genética induzida Tet-off ______ __________ P – Promotor; TetR – Repressor Tet; Da – Domínio de activação; tTa – Proteína transactivadora; Dox – Doxiciclina (análogo não tóxico da tetraciclina); Tet Op – Operador Tet Utilização de células HeLa Tet-off que expressem de modo estável o transactivador tet, para a transfecção com vector de expressão, contendo a ferritina H e L, a jusante do operador tet. Síntese de ferritina é reprimida pela tetraciclina ou doxiciclina, mas induzida pela remoção de doxiciclina Imunoprecipitação + SDS-PAGE Ferritina H Ferritina L Ferritina de Rato Ferritina Humana (+) adição de doxiciclina; (-) remoção de doxicilina H46 e H66 – Indução da síntese da ferritina H após remoção da doxiciclina L6 e L46 - Indução da síntese da ferritina L após remoção da doxiciclina H2DCF – DA (molécula não fluorescente lipossolúvel) Esterases intracelulares H2DCF + ROS Ferritina H DCF Fluorescente Ferritina L RFU – Relative Fluorescence Units RFU – Relative Fluorescence Units A super-expressão de Ferritina H ou L reduz, mas não evita a formação de ROS, por resposta à adição de agentes oxidantes Expressão da ferritina H ou L diminui a produção de ROS em células tratadas com H2O2 Efeito do H2O2 na expressão da ferritina em células HeLa H2O2 induz a expressão da ferritina H e L em células HeLa Ferritina é sujeita à regulação traducional Ligação dos IRPs a IREs H2O2 tem um efeito transitório na activação de IRPs na célula HeLa Síntese de ferritina aumentada apesar de uma activação inicial do IRP pelo H2O2 H2O2 induz a expressão da ferritina, independentemente da acção dos IRPs. Análise da expressão da ferritina na defesa contra o stress oxidativo Aumento da expressão de Ferritina nas células HeLa transfectadas Utilização de um sistema indutível Transfecção transitória ferritina em cultura de células HeLa crescidas na ausência de Tc resultados não reprodutíveis Utilização de células Tet-off para a expressão da ferritina Superexpressão quer da FH quer da FL conduziu à diminuição dos níveis de ROS Ambas as subunidades da ferritina contribuem para a defesa contra o stress oxidativo A expressão da ferritina reduz mas não evita a formação de ROS A ferritina é componente de uma resposta multifactorial anti-oxidante (e que envolve por exemplo os níveis de glutationa, SOD, catalase), com uma grande complexidade a nível de regulação transcricional e póstranscricional. António Pacheco
