Uso da técnica BOX-PCR na caracterização molecular de isolados

55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Uso da técnica BOX-PCR na caracterização molecular
de isolados rizosféricos de plantas de milho
Fernandes, GC; Souza, JAM; Campanharo, JC
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias UNESP-Jaboticabal.
[email protected]
Palavras-chave: PCR; Primer BOX; Caracterização Molecular; RPCPs; Milho
A cultura do milho representa grande importância para o Estado de São Paulo e para o país devido sua grande
utilização. O estudo dos microrganismos endofíticos é de grande importância para elucidação da interação
endófito-planta e por serem potencialmente vantajosos em diversos aspectos. Vários trabalhos têm utilizado a
técnica BOX-PCR para tipificação de diferentes organismos, tais como, Brucella spp., Rhizobium e Bradyrhizobium.
O primer BOX (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’), amplifica regiões conservadas e repetitivas do DNA
cromossômico bacteriano. A amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase), destas regiões genômicas da
subunidade BOXA, produz um padrão de bandas semelhante a um fingerprinting. Este trabalho teve por objetivo
a caracterização genética de dez estirpes de bactérias promotoras de crescimento de plantas, isoladas da rizosfera
de plantas de milho cultivadas em diferentes solos brasileiros. As células bacterianas armazenadas a -80ºC foram
crescidas em meio DYGS (Glicose – 2g/L; Peptona – 1,5g/L; Extrato de Levedura – 2 g/L; KH2PO4 – 0,5g/L;
MgSO4.7H2O – 0,5g/L; Ácido Glutâmico – 1,5g/L; H2O q.s.p. 1000 ml e pH de 6,8). Extraiu-se os DNAs bacterianos
(o pellet celular (0.05g) foi ressuspenso em 400 μL de solução salina 0.85%; 40 μL de solução lisozima (20 mg/
mL); 13 μL de solução RNAse (10 mg/mL); 44 μL de SDS a 20%; 158 μL de solução acetato de Sódio 3M; 650 μL de
clorofórmio: Álcool Isoamílico (24:1); dois volumes de etanol absoluto; 1 mL de Etanol 70% e 100 μL de TE (10:1).
Para verificação da integridade, os DNAs extraídos foram quantificados em gel de agarose 0,8%. A análise molecular
foi realizada por PCR através do oligonucleotídeo iniciador BOX-A1R (Tampão 10X – 2.0 μL; MgCl2 (25mM) – 1.6
μL; DNTP- 0.4 μL; primer 5pmol- 1.0 μL; DNA Taq-Polimerase- 0.5 μL; DNA (30ng) – 1.5 μL e água Milli-Q estéril
e filtrada q.s.p. 20 μL. A amplificação dos DNAs foi realizada usando um ciclo a 95°C por 5 min.; 40 ciclos por 1
min. a 95°C; 1 min. a 60°C e 5 min. a 72°C e manutenção a 4°C. Os fragmentos amplificados foram separados por
eletroforese a 50 V em gel de agarose a 1.5%. Após seis horas o gel foi visualizado em fotodocumentador (GEL
DOC 200 – BioRad). Observou-se que a ampliação dos DNAs pela técnica BOX-PCR, indicou uma alta diversidade
genética entre os isolados bacterianos, revelando que essa metodologia é eficiente, rápida e de baixo custo para
caracterização das estirpes.