Eletroforese em Agarose
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IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica 05/02/2013 Eletroforese de DNA Elisa Beatriz Prestes Arne Tiselius Prêmio Nobel de Química – 1948 Eletroforese de DNA A partir de 1970, após advento da eletroforese de proteínas Estrutura de um nucleotídeo Qual a carga elétrica dos ácidos nucléicos? Base nitrogenada Grupo fosfato Pentose Em pH neutro, DNA tem carga elétrica negativa. – Cátodo + Ânodo Eletroforese de ácidos nucléicos Agarose Poliacrilamida Eletroforese de ácidos nucléicos Agarose Poliacrilamida Eletroforese de ácidos nucléicos Tipo de gel Poliacrilamida Moléculas pequenas Moléculas médias Moléculas grandes 10 pb – 3 Kb Agarose 100 pb – 60 Kb PFGE* 50 Kb – 10 Mb Fragmentos de DNA Fragmentos de DNA Cromossomos Plasmídeos *Eletroforese de Campo Pulsado (do inglês Pulsed Field Gel Electrophoresis) Eletroforese em Agarose Agarose Polissacarídeo composto por subunidades de galactose Obtida a partir do ágar Compõe a parede celular de algas Gel horizontal Eletroforese em Agarose Tamanho dos poros na matriz é determinado por % de agarose Concentração do gel (%) Faixa de separação (Kb) 0,3 5 – 60 0,6 1 – 20 0,7 0,8 – 10 0,9 0,5 – 7 1,2 0,4 – 6 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2 Eletroforese em Poliacrilamida Poliacrilamida Acrilamida é monômero neurotoxina absorvida pela pele, com efeitos cumulativos 29 monômeros acrilamida: 1 Bis-acrilamida Gel vertical Eletroforese em Poliacrilamida Polimerização da poliacrilamida depende de radicais livres (persulfato – APS), estabilizados por TEMED. Reação rápida de polimerização. Fatores que influenciam a migração Tamanho do DNA Migração de forma end-on Fragmentos pequenos percorrem maiores distâncias que fragmentos grandes Fatores que influenciam a migração Conformação do DNA Migração mais rápida de moléculas mais condensadas: supercoiled > linear > circular Observação de 3 bandas no gel: Fatores que influenciam a migração Voltagem Taxa de migração do DNA linear é proporcional à voltagem baixa aplicada Faixa de separação diminui com o aumento da voltagem Fatores que influenciam a migração Direção do campo elétrico Direção única em géis de agarose e poliacrilamida Mas moléculas > 50-100 Kb tendem a migrar na mesma taxa se direção do campo for igual... Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Direção do campo elétrico muda, forçando moléculas a mudar de curso moléculas maiores demoram mais para serem realinhadas Separação de moléculas de até 10 Mb! Fatores que influenciam a migração Composição de bases e temperatura Mais importante para géis de poliacrilamida, em agarose estes fatores influenciam pouco Presença de corantes intercalantes Brometo de etídio (grupo planar que se intercala entre as bases nitrogenadas) reduz a mobilidade do DNA em 5% É vantajoso realizar a coloração após a corrida! Corantes de ácidos nucléicos Brometo de Etídio Agente que se intercala ao DNA luz UV (laranja) Carcinogênico, mutagênico e teratogênico Corantes de ácidos nucléicos SYBR Green Agente que se intercala ao DNA luz UV (verde) Potencialmente carcinogênico Aplicação em PCR em tempo real (qPCR) Fatores que influenciam a migração Composição do tampão Força iônica. Resistência ~ igual ao gel Poucos íons: DNA migra pouco ou nada Íons demais: condutância gera muito calor (gel derrete e DNA desnatura) Aplicações da eletroforese Separação de DNA por tamanho: Análise de resultado (PCR, diagnóstico) Purificação de fragmentos de interesse Blotting Obrigada!
