Cinética e Regulaç o Enzimática/Cinética e regulaç o
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Cinética e regulação enzimática IST – FML 2º Semestre 2007/2008 Trabalho realizado por: Miguel Amador nº58484 Joana Nunes nº58497 João Marques nº58513 Cinética Enzimática Estrutura Enzimática Constituição em Aminoácidos influenciam Mecanismos de Acção Enzimática São difíceis de definir quantitativamente Pelo que é necessário Determinar constantes da reacção catalisada Cinética Enzimática Cinética Enzimática Estudo da velocidade de uma reacção química que ocorre na presença de um enzima Permite elucidar sobre: •Os pormenores do mecanismo catalítico das enzimas •O papel das enzimas no metabolismo •Controle da actividade •Mecanismos de inibição Velocidade vs. Concentração A concentração de substrato influencia a velocidade de uma reacção Estudo da relação entre a concentração e a velocidade: . No inicio da reacção a quantidade de substrato é constante, já que a quantidade de substrato é muito maior do que a de enzima. .Determina-se a velocidade inicial de reacção, Vo ,para uma determinada [S]. .Obtêm-se valores para várias concentrações de substrato, mantendo constante a concentração de enzima. Assim podemos traçar os valores num gráfico, em que exprimimos Vo como função de [S] Velocidade vs. Concentração Dados: •Para [S] baixas, Vo aumenta quase linearmente •Para [S] maiores, Vo aumenta mais gradualmente •Para [S] mais elevadas, atinge-se uma velocidade máxima, Vmáx. Equação de Michaelis-Menten Comportamento é explicado pela formação do complexo enzima-substrato ES 1. O enzima liga-se ao substrato reversivelmente formando o complexo ES Reacção rápida 2. O complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reacção Reacção mais lenta .A reacção 2, mais lenta, limita a velocidade global da reacção. .A velocidade é proporcional à concentração do complexo ES. .A cada momento o enzima existe na forma livre e no complexo ES. .A velocidade máxima (Vmáx) da reacção ocorre quando todos os enzimas estão associadas a moléculas de substrato. Dedução da Equação Michaelis-Menten A curva que representa a relação entre [S] e Vo tem forma idêntica para a maior parte dos enzimas. Esta curva pode ser descrita algebricamente pela equação de Michaelis-Menten. A equação de Michaelis-Menten é Hipótese: o passo limitante da velocidade das reacções enzimáticas é a desassociação do complexo ES Dedução da Equação Michaelis-Menten Presuposto: não há transformação de produto em substrato Reacções de formação e desassociação do complexo ES: Vo pode ser considerado como a velocidade com que ocorre a quebra da ligação ES Não é fácil determinar [ES]! [ET] - concentração total da enzima A concentração de enzima livre é, assim, [ET]-[ES] Dedução da Equação Michaelis-Menten .Passo 1 Velocidade de formação de ES Velocidade de degradação de ES .Passo 2 [ES] é constante, ou seja, a velocidade de degradação e formação de ES são iguais. .Passo 3 Dedução da Equação Michaelis-Menten .Passo 4 Obtemos Vo, substituindo [ES] A velocidade é máxima quando [ES]=[ET]! Equação de Michaelis-Menten Análise da Equação Michaelis-Menten A equação de Michaelis-Menten, que nos dá a relação quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade máxima Vmáx e a quantidade inicial de substrato [S], todas relacionadas pela constante de Michaelis Km Km – unidades de concentração No caso de V0 ser exactamente metade de Vmax: Km corresponde à concentração de substrato para a qual V0 é metade da velocidade máxima Análise da Equação Michaelis-Menten A equação de Michaelis-Menten é muito útil para determinar os valores de Km e Vmáx das reacções. Os enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 em função de [S] diz-se que seguem a cinética de Michaelis-Menten. Enzimas cujo mecanismo obedeça às duas reacções anteriores podemos dizer que o valor de Km está relacionado com a afinidade do enzima para o substrato, e logo é diferente de substrato para substrato e de enzima para enzima. O Vmáx é a velocidade máxima que a reacção pode alcançar, na situação virtual em que todos os enzimas se encontram ligados ao substrato. Equação de Lineweaver-Burk Podemos transformar a equação de Michaelis-Menten, invertendo-a: Esta forma da equação de Michaelis-Menten chama-se equação de Lineweaver-Burk Equação de Lineweaver-Burk Gráfico de 1/[V0] em função de 1/[S] Obtém-se uma função linear! .Esta recta tem um declive Km/Vmáx .A intersecção da recta no eixo 1/V0 corresponde ao valor 1/Vmáx .A intersecção com o eixo 1/[S] corresponde a -1/Km Permite uma determinação de Vmáx precisa! Inibição enzimática • Reversível Competitiva Anti-Competitiva Mista • Irreversível Inibição Reversível Competitiva • Há competição pelo centro activo do enzima • O inibidor é estruturalmente semelhante ao substracto • A inibição pode ser contrariada adicionando mais substracto ao meio • O Km aumenta e o Vmax não se altera Inibição Reversível Competitiva Inibição Reversível Competitiva Inibição Reversível Competitiva Inibição Reversível Anti-Competitiva • O inibidor liga-se a um local específico do enzima (que não o centro activo) • O inibidor liga-se apenas ao complexo ES, formando o complexo ESI • O Km diminui e o Vmax diminui Inibição Reversível Anti-Competitiva Inibição Reversível Anti-Competitiva Inibição Reversível Anti-Competitiva Inibição Reversível Mista • O inibidor liga-se a um local específico do enzima (que não o centro activo) • O inibidor liga-se tanto ao enzima livre como ao complexo ES • Vmax diminui • Km pode aumentar, diminuir ou manter-se Inibição Reversível Mista Inibição Reversível Mista Inibição Reversível Mista Inibição Reversível Vmax aparente Km aparente Sem inibição Vmax Km Inibição competitiva Vmax αKm Inibição AntiCompetitiva Vmax/α’ Km/α’ Inibição Mista Vmax/α’ αKm/α’ Quando α = α’, a Inibição Mista tem o nome de Inibição Não Competitiva Inibição Irreversível • O inibidor combina-se permanentemente ao enzima de uma das seguintes formas: Ligação covalente Destruição de um grupo funcional essencial ao funcionamento do enzima Ligação não covalente particularmente estável Hexocinase • A hexocinase fosforila a glucose para glucose-6-fosfato • Reacção ocorre com consumo de ATP juntamente com um ião Mg2+ • O Km para a glucose é 0.1mM, e a concentração de glucose na célula é 4mM • A hexocinase é regulada alostericamente pelo produto da sua própria reacção Hexocinase • A hexocinase é uma enzima do tipo indutivo Hexocinase • Fosforilação impede a saída de glucose da célula Hexocinase • Reacção catalisada pela hexocinase Hexocinase • No fígado também existe uma hexocinase, mas com menor afinidade para com a glucose • Esta só está activa quando a concentração de glucose no sangue é muito elevada • Quando a concentração de glucose no sangue é baixa, o fígado não compete com outros tecidos • No fígado, a glucose é convertida em glicogénio Hexocinase • A fosforilação • A conversão da glucose é reversível! da glucose-6-fosfato em glucose ocorre no fígado durante a gluconeogénese. Enzimas Reguladores • Enzimas que aumentam ou diminuem a sua actividade em reacção a determinados factores. • Fazem normalmente parte de sequências metabólicas. Permitem regular a actividade de toda a sequência metabólica e possibilitam à célula ajustar-se às suas necessidades energéticas e biomoléculares. Tipos de Moduladores Mecanismos que regulam a actividade enzimática: •Variação da concentração de substrato •Variação de pH e temperatura •Inibição enzimática •Modulação alostérica •Modulação covalente Modulação alostérica Ocorre em enzimas que possuem um local de modulação alostérico Heterotropismo (o modulador é diferente do substrato) Homotropismo (o modulador é igual ao substrato) Modulador alostérico Positivo (activam o enzima) Negativo (inibe o enzima) A ligação entre o modulador e o enzima é não-covalente e o local de modulação é especifico para cada modulador, no caso dos enzimas heterotrópicos Modulação alostérica Induz: Modificações conformacionais na estrutura espacial do enzima Modifica a afinidade do enzima para com os seus substratos Modulação alostérica Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição por retroalimentação, onde o próprio produto da reacção actua como modulador da enzima que a catalisa. Cinética •Não seguem a cinética de Michaelis-Menten •Comportamento sigmóide •[S] para a qual V0=Vmáx/2 não corresponde ao Km O comportamento sigmóide é explicado pela interacção entre as subunidades das proteínas, já que mudanças estruturais numa subunidade são transferidas para as adjacentes, através de interacções não covalentes entre elas. Cinética Enzimas homotrópicas pequenas variações na concentração do modulador podem provocar grande variações na actividade do enzima. Enzimas heterotrópicasÉ dificil generalizar a forma como se comportam . Apresentam uma grande variabilidade no comportamento. Cinética Modulação covalente Grupos adicionados ou retirados do enzima através de modificações covalentes •Fosforilação •Adenilação •Urinilação •ADP-ribosilação •Metilação Fosforilação Ligação de um grupo Fosforil a determinados resíduos de aminoácidos •É catalisada por quinases •É um processo reversível •Fosfatase remove os grupos fosforil adicionados Fosforilação O grupo fosforil: Influencia a polaridade dos aminoácidos Permite o estabelecimento de pontes hidrogeniónicas Importantes para a estrutura e conformação da molécula Adenilação É adicionado um grupo Adenil à tirosina Uridilação É adicionado um grupo uridil à tirosina ADP-Ribosilação É acresentada uma ADP-Ribose, com incidência nos resíduos Arginina, Glutamina, Cisteína e Histidina alterada (diftamida-a) Metilação É adicionado um grupo metil em resíduos de glutamato Zimogénios A regulação enzimática pode passar ainda pela existência de um precursor, sem capacidade catalítica, que, no caso das proteases, são chamados zimogénios. Zimogénio Clivagem proteolítica Enzima activa
