ESTUDO CINÉTICO DA ENZIMA INVERTASE Estudo laboratorial

ESTUDO CINÉTICO DA ENZIMA INVERTASE
Estudo laboratorial da actividade enzimática
A caracterização cinética de um enzima em laboratório pode ser feita de várias
maneiras. Podemos, no entanto, começar por referir alguns aspectos importantes para a
maioria das estratégias.
Em primeiro lugar, é preciso que a mistura de reacção contenha todos os
ingredientes necessários, ou seja, um tampão que mantenha o pH pretendido, o substrato
e os cofactores necessários para a catálise. É também indispensável o controlo da
temperatura, recorrendo-se em geral a um banho termostatizado.
Quanto a cada ensaio de actividade propriamente dito, distinguem-se:
(i) ensaios contínuos: segue-se a reacção em contínuo, à medida que ela ocorre ,
(ii) ensaios descontínuos: deixa-se decorrer a reacção, e vão-se retirando amostras a
intervalos de tempo conhecidos;
posteriormente determina-se a concentração do
produto formado ou substrato gasto.
A Fig. 1 representa um exemplo de um ensaio enzimático contínuo:
1. Preparar a mistura
de reacção (menos
um componente)
2.
colocar
no
espectrofotómetro
a estabilizar a
temperatura
3.adicionar o
componente que
falta e registar a
variação de
absorvância durante
um intervalo de
tempo.
Fig. 1. Ensaio enzimático contínuo, seguido no espectrofotómetro. A reacção só é iniciada no ponto 3,
com a adição do substrato ou do enzima.
Um ensaio enzimático contínuo só é possível quando o método de medição não interfere
com a reacção. Nalguns casos, como nos chamados métodos colorimétricos, o método
de medição destrói o enzima , e portanto é necessário utilizar um método descontínuo
(Fig. 2).
Fig. 2. Ensaio enzimático descontínuo para a invertase. A reacção só é iniciada no ponto 3, com a adição
do substrato ou do enzima. A reacção é terminada em 4, ao fim de 10 minutos de reacção,
quantificando-se em seguida o produto formado (neste caso, a glucose e a frutose, que são açúcares
redutores).
Acção enzimática da invertase
A enzima sacarase ou invertase (β-fructofuranosidase) é uma enzima que catalisa a
hidrólise da sacarose (açúcar não redutor) em glucose e frutose (dois açúcares redutores,
capazes de reduzir os iões férrico ou cúprico, presente no reagente de Fehling):
Sacarose + H2O
Glucose + Frutose
Por definição, 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 µmol de sacarose a glucose e
frutose por minuto, a pH 4,6 (25ºC).
A reacção pode seguir-se facilmente determinando a quantidade de açúcares redutores
libertados por acção do enzima, utilizando, por exemplo, a reacção do ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS).
A invertase existe no fermento do pão, sendo possível obter um extracto não purificado
desta enzima destruindo as células por autólise e removendo os detritos celulares por
centrifugação, após a qual a invertase ficará no líquido sobrenadante. Nesta aula
utilizar-se-á a invertase comercial.
Neste trabalho efectua-se o estudo cinético da actividade do enzima sacarase em função
da concentração de substrato, de forma a determinar os valores de Vmax e Km.