Estudo da Modulação Exercida pela Sinalização

BD Biosciences Pesquisador SBI 2015
Projeto Ganhador Categoria Pesquisador SBI
ESTUDO DA MODULAÇÃO EXERCIDA PELA SINALIZAÇÃO
POLARIZAÇÃO E FUNÇÕES DE MACRÓFAGOS IN VITRO E IN VIVO
ADRENÉRGICA
NA
Juliana Terzi Maricato - Pós-Doutoranda
Abstract: Catecholamines, mainly noradrenaline, released from the sympathetic nervous system
(SNS) are sensed by adrenergic receptors (mainly β2-adrenergic receptor or β2AR) expressed by
immune cells, constituting one of the mechanisms by which these two systems crosstalk to modulate
immune responses. In macrophages, β2AR-stimulation seems to be related with the induction of a
more regulatory profile (M2) and increased phagocytosis; whereas, stimulation via adrenergic
receptors α (αAR) might drive these cells towards a more pro-inflammatory profile (M1). The aim of
the present study is to investigate the influence of the adrenergic signaling in M1/M2 polarization and
macrophage functions in vitro and in vivo. For the in vitro studies, the effects of adrenergic signaling
on M1/M2 polarization and function will be evaluated in both Bone Marrow-derived (BMDM) and
peritonial (PM) macrophages from WT, β2AR knockout and α2a/cAR knockout mice. In the in vivo
approach we will perform the acute peritonitis induced by enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in WT,
β2AR knockout and α2acAR knockout mice and subsequent analisys of the macrophage population
profiles, cytokine production and bacterial load in peritonial lavage fluid.
Introdução
Está bem estabelecido na literatura que alterações na atividade do SNS que ocorrem de maneira
sistêmica ou diretamente nos órgãos linfóides podem modular a qualidade e magnitude da
resposta imune a um determinado estímulo imunológico. Essas interações possuem grande
importância biológica no curso de doenças autoimunes, câncer e, também, em infecções
microbianas. Dentre os receptores de catecolaminas expressos em células do sistema imune, os
adrenérgicos são os mais abundantes. Os receptores α1-adrenérgicos (α1AR) estão associados
com a subunidade Gq da proteína G e ativam a PLC. Já os receptores α2AR estão ligados à
porção Gi da proteína G, inibem a enzima adenilato-ciclase, levam à diminuição do AMP cíclico
(AMPc) intracelular e regulam os canais de K+ e Ca++. Os βAR estão associados à fração Gs da
proteína G e sua ativação pela via canônica leva ao aumento intracelular de AMPc, subsequente
ativação da PKA, levando à fosforilação do fator de transcrição CREB. No que se refere aos
macrófagos, os dados da literatura que a estimulação via β2AR parece estar relacionada à
indução de um perfil mais regulador (M2-like) e ao aumento da fagocitose; ao passo que, a
estimulação dos receptores αAR direciona essas células a um perfil mais pró-inflamatório (M1like). No entanto, os estudos anteriores carecem de uma caracterização mais completa do perfil
M1/M2 dos macrófagos, além de apresentam importantes diferenças metodológicas quanto aos
estímulos adrenérgicos. Ademais, são poucos os trabalhos que abordam essa questão in vivo.
Objetivos
O objetivo do projeto proposto é investigar a influência da sinalização adrenérgica na polarização
M1/M2 e funções de macrófagos in vitro, com a utilização de células knockout para os receptores
adrenérgicos β2 (β2AR) e α2a/c (α2a/c AR) e in vivo no modelo de peritonite aguda induzida por
E. coli entero-hemorrágica (EHEC) em camundongos WT e knockout (KO) para os receptores
β2AR e α2a/cAR.
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BD Biosciences Pesquisador SBI 2015
Projeto Ganhador Categoria Pesquisador SBI
Metodologia
Experimentos in vitro - serão utilizados macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) e
peritonias (PM), estes serão coletadas do peritônio dos animais, marcadas com anticorpo antiCD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), em seguida, com anticorpos monoclonais anti-camundongo
e a população CD11b+F4/80+CD19- será purificada por citometria de fluxo. Para os experimentos
de polarização, os BMDM e PM serão incubados em condições que favoreçam o perfil M1 (LPS,
IFN-γ ou LPS+IFN-γ) ou M2 (IL-4), com adição de agonistas e antagonistas dos receptores
adrenérgicos, além disso, serão realizados experimentos de polarização com macrófagos
provenientes de camundongos β2AR KO e α2a/cAR KO. A polarização M1/M2 será avaliada por
meio dos seguintes parâmetros: (i) citometria de fluxo para avaliar expressão das seguintes
moléculas na população CD11b+F4/80+: MHC-II, CD40, CD80, CD86, CD25hi, CD40, CD28 e
NFkB para M1 e CD206, CD163, MHCIIlo, CD86lo, CD40lo e arginase-1 para M2; (ii) produção
das citocinas IL-12p70, IL-6, TNF-α e IL-10 por citometria de fluxo (marcação intracelular) e por
CBA Flex dos sobrenadantes das culturas. Serão avaliados também os níveis de expressão dos
transcritos para M1 (iNOS, IL-12p40, IL-12p35, TNF-α, PD-L1 e IRF5) e M2 (Arginase-1, MCR-1,
Clec10a, IRF-4 e IL-10) por qPCR. Para avaliar a sinalização adrenérgica nos macrófagos será
utilizada a metodologia BD Phosflow™ para análise das proteínas fosforiladas após adição dos
estímulos adrenérgicos em BMDM e PM de camundongos WT, β2AR-KO e α2a/cAR-KO. Serão
avaliados os níveis de fosforilação das moléculas: Akt (pS473), CREB (pS133), p38 MAPK
(pT180/pY182), ERK1/2 (pT202/pY204), NF-κB p65 (pS529), Stat1 (pY701) e Stat6 (pY641).
Experimentos in vivo – Avaliação influência da sinalização adrenérgica será na polarização
M1/M2 será avaliada na resposta à peritonite induzida por EHEC em camundongos WT, β2AR KO
e α2a/cAR KO. Os camundongos serão infectados intraperitonialmente com 108 CFU de EHEC
WT (cepa 86-24) e os seguintes parâmetros serão analisados: (i) curva de sobrevivência dos
animais (em média 7d); (ii) citometria de fluxo para análise fenotípica e determinação do número
absoluto de macrófagos M1 e M2 na população CD45+CD11b+F4/80+, presentes no lavado
peritoneal. A caracterização fenotípica M1/M2 será realizada conforme descrito na etapa anterior;
(ii) dosagens dos fatores MCP-1 e citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL1-β, IL-10, IL12p70, IFN-γ,
TNF-α) no lavado peritoneal e no soro dos animais, após a infecção com a utilização do CBAMouse Inflammation Kit; (iv) determinação das unidades formadoras de colônias (CFU) no lavado
peritoneal e soro dos animais, ao longo da infecção.
Todos os experimentos de purificação de células serão realizados no equipamento FACSAria™ II
e as aquisições serão realizadas no FACSCanto™ II. Os dados serão analisados no software
FlowJo v.9.7.5 e a análise estatística no software GraphPad Prism 5.
O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos pesquisadores
que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica de Citometria de Fluxo
com Múltipla Marcação no Brasil.
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