PALESTRA OBTENÇÃO DE TRANSFORMANTES EM FUNGOS

PALESTRA
21ª RAIB
OBTENÇÃO DE TRANSFORMANTES EM FUNGOS.
ENTOMOPATOGÊNICOS VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Márcia Cristina Furlaneto
Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Microbiologia, Laboratório de Genética e Biologia
Molecular de Fungos.
Para o controle de pragas da agricultura, uma das
alternativas ao controle químico baseia-se no emprego de biopesticidas a base de microrganismos
entomopatogênicos. Os fungos são potencialmente
os entomopatógenos mais versáteis, pois usualmente
invadem o inseto por penetração da cutícula externa
e são capazes de infectar artrópodes de vários ambientes e em diferentes idades e estágios.
Por transformação genética compreende-se os
processos de inserção de moléculas de DNA exógeno
em células hospedeiras, com a finalidade de alteração
genotípica do organismo receptor e/ou expressão
deste DNA exógeno.
A aplicação das técnicas de transformação genética pode ser útil no desenvolvimento de um
bioinseticida. A incorporação de genes de resistência ou genes repórteres em agentes de controle
microbiano, a exemplo de fungos entomopatogênicos,
pode auxiliar nos estudos de triagem em campo,
facilitando a distinção entre microrganismos aplicados e as populações endógenas, permitindo desta
forma, estudos acerca de sua persistência e
efetividade no campo. Além disso, essas técnicas
representam uma ferramenta no estudo da expressão de genes de interesse, propiciando a obtenção de
linhagens geneticamente modificadas com melhor
efetividade no controle biológico.
O processo de transformação genética pode ser
dividido em três etapas principais: (I) indução da
competência da célula hospedeira; (II) introdução do
DNA exógeno e (III) seleção das células transformadas. A metodologia utilizada na introdução do DNA
exógeno está diretamente vinculada ao tipo de célula
hospedeira. Para fungos filamentosos, as
metodologias de transformação compreendem a obtenção de protoplastos, seguido de tratamento químico ou eletroporação; ou o emprego de conídios intactos
através da biobalística e, mais recentemente, o uso da
capacidade natural de transferência genética da bactéria Agrobacterium tumefaciens.
O método de transformação que se baseia na utilização de A. tumefaciens compreende a transferência
pela bactéria de uma região denominada T-DNA
contendo genes a serem expressos nas células
fúngicas.
O emprego desta metodologia para fungos
filamentosos foi descrito pela primeira por DE GROOT
et al. (1988), e desde então tem sido descrito para
diversas espécies fúngicas (MICHELSE et al., 2005). Algumas razões para esse rápido aumento do número
de espécies fúngicas transformadas viaA. tumefaciens
podem ser apontadas: simplicidade durante a execução da metodologia, a não necessidade de equipamentos caros como o acelerador de microprojéteis ou
o eletroporador, alta eficiência de transformação, o
fato de que qualquer segmento de DNA inserido entre
as bordas esquerda e direita (LB e RB) do T-DNA pode
ser integrado no genoma do hospedeiro e a ocorrência
de integração do T-DNA em cópias simples em sítios
aleatórios e ou em sítios homólogos no genoma.
Independente do objetivo, o sucesso da aplicação
do sistema Agrobacterium na transformação de fungos
pode ser atingido através do uso adequado de variáveis inerentes à metodologia. A alteração de algumas
variáveis pode influenciar a eficiência do sistema
para a obtenção de um maior número de
transformantes, integração do T-DNA em sítios aleatórios ou específicos e maior probabilidade de
integração em cópia única ou múltipla. As variáveis
mais estudadas são o tipo de célula alvo (protoplastos,
conídios e micélio), linhagem de A. tumefaciens, tempo
e temperatura de co-cultivo, razão entre células doadoras e receptoras, pré-tratamento das células de A.
tumefaciens com acetoseringona e, por fim, a estrutura
do vetor binário.
Vários aspectos relacionados a transformação de
fungos entomopatogênicos, dentre os quais, Beauveria
bassiana , Metarhizium anisopliae e Paecilomyces
fumosoroseus via Agrobacterium serão abordados (REIS
et al., 2004; LIMA et al., 2006; DUARTE et al., 2007; STAATS
et al., 2007).
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