Desenvolvimento de um protocolo para a transformação genética

55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Desenvolvimento de um protocolo para a transformação
genética do fungo Moniliophthora perniciosa, causador
da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro
Minete-Cardozo, L¹; Grassi, MCB¹; Rincones, J¹; Pereira, GAG¹
¹Laboratório de Genômica e Expresão - Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes - Instituto de Biologia, Universidade Estadual
de Campinas
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Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, Vassoura-de-bruxa, transformação genética, Agrobacterium tumefaciens, fitopatógeno
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro
(Theobroma cacao). Esta doença afeta a produção de cacau nas ilhas do Caribe e em países da América do Sul, entre
eles o Brasil, onde tem causado grandes prejuízos socioeconômicos. O estudo funcional e a manipulação genética
de M. perniciosa são essenciais para aumentar o conhecimento biológico sobre a interação planta-patógeno e
auxiliar o desenvolvimento de estratégias de combate à doença. Para tanto, a transformação genética do fungo
apresenta-se como ferramenta fundamental. Neste trabalho, procuramos desenvolver um protocolo eficiente
para a transformação do fungo M. perniciosa, de fácil reprodução, e que gerasse transformantes estáveis. Dentre
os métodos utilizados atualmente para a transformação de fungos filamentosos, foram testados a eletroporação,
a transformação de protoplastos utilizando PEG, e a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens
(ATMT). O único sistema que se mostrou eficaz foi a ATMT do micélio dicariótico do fungo, tendo a higromicina
como marcador de resistência. A eficiência obtida esteve entre 5 e 40%. A transformação foi confirmada por PCR, e
o southern blot indicou inserção única no genoma. Os transformantes mostraram estabilidade mitótica e meiótica,
mantendo o DNA exógeno em meio não seletivo. A obtenção de esporos a partir do micélio transformado permitiu
regenerar hifas com todas as células transformadas. Para aperfeiçoar o protocolo de transformação, foi analisada a
influência de parâmetros como a linhagem de M. perniciosa, cepa de A. tumefaciens, tempo de cocultivo, e volume
de suspensão de A. tumefaciens. Dentre os parâmetros analisados, os que demonstraram exercer a maior influência
sobre a eficiência do protocolo foram as linhagens do fungo e as cepas de A. tumefaciens. Os resultados obtidos,
sobretudo a obtenção de um micélio com todas as células transformadas e a ocorrência de integração única no
genoma, indicada pelo southern blot, são promissores e representam a base para o desenvolvimento de sistemas
de silenciamento de genes específicos. O projeto representa um grande avanço na manipulação genética de M.
perniciosa e no desenvolvimento de estratégias para o combate à Vassoura-de-bruxa.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.