Infecções por bactérias formadoras de biofilme

REV. BRAS. MED. INTERNA 2015; 2(1):37-­‐47. REVISTA BRASILEIRA DE MEDICINA INTERNA www.rbmi.com.br Artigo de Revisão
Infecções por bactérias formadoras de biofilme: breve revisão
Infections caused by biofilm forming bacteria: a brief review
Arlindo Schiesari Junior, Amanda Melim Bento, Ana Carolina Monezi Alvares
de Abreu e Silva, Cláudia Mendonça Xavier, Rebeca Florence Portaro Blum
Instituição Proponente: Divisão de Infectologia das Faculdades Integradas Padre Albino,
Catanduva-SP.
RESUMO
Objetivo: revisar a literatura médica e analisar a formação do biofilme, sua regulação, seus
mecanismos patogênicos e as implicações médicas relacionadas a ele, assim como abordar métodos
diagnósticos e terapêuticos das infecções causadas por bactérias formadoras de biofilme. Método:
foi realizado um estudo de revisão narrativa através de levantamento bibliográfico com
os descritores "biofilm", "implant infections", "antibiotic resistance", "medical device infections" e
"chronic infections" nas bases de dados Medline, Lilacs e Scielo. Conclusão: novas pesquisas nessa
área e o desenvolvimento de novos medicamentos capazes de tratar infecções por bactérias
formadoras de biofilme são importantes a fim de evitar cirurgias corretoras que podem ter um
impacto psicológico e físico para o paciente.
PALAVRAS-CHAVE: biofilme, bactérias, implante
ABSTRACT
Objective: to review the medical literature and analyze biofilm formation, its regulation, its
patogenic mechanisms and medical implications related to it, as well as the diagnosis methods and
therapy approaches of the infections caused by biofilm producers bacteria. Method: a study of
narrative review was conducted through a literature review with the descriptors "biofilm", "implant
infections", "antibiotic resistance", "medical device infections" and "chronic infections" in the
Medline, Lilacs and Scielo data. Conclusion: new research on this area and the development of new
medication capable of treating infections by biofilm producers bacteria are important to avoid
correcting surgeries that might have a physical and psicological impact to the patient.
KEYWORDS: biofilm, bacterias, medical implants
Artigo recebido em: 06/01/2015
Aceito para publicação: 15/03/2015
Autor para correspondência:
E-mail: [email protected] (Rebeca F P Blum)
REV. BRAS. MED. INTERNA 2014; 2(1): 2 INTRODUÇÃO
O termo biofilme refere-se a uma
comunidade microbiana caracterizada por
células que estão irreversivelmente aderidas a
um substrato ou interligadas entre si,
embebidas por uma matriz extracelular
polimérica produzida por elas, e apresentam
fenótipo alterado em relação à taxa de
crescimento e transcrição genética. As células
aderidas e envoltas por essa matriz são
conhecidas como “microrganismos sésseis”,
enquanto que aquelas que se encontram livres
(fora dessa estrutura) são chamadas de
“micro-organismos planctônicos”.1 Estima-se
que aproximadamente 60% das infecções
adquiridas em hospitais sejam causadas por
biofilmes que se aderem aos dispositivos
médicos.2
Essas comunidades de microrganismos têm a capacidade de se aderirem às
superfícies inertes ou vivas.3 Apesar do
biofilme ser, na maioria das vezes, formado
por bactérias (Gram positivas e/ou Gram
negativas), também pode conter fungos , algas
e protozoários. Dentre as espécies bacterianas
mais estudadas nessas estruturas encontram
se: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa.
O biofilme, que está em muitos casos
aderido a instrumentos da área médica, como
próteses, cateteres, stents,etc, tem alguns
mecanismos patogênicos que justificam sua
gravidade. Esses mecanismos são: (1)
permitir a adesão irreversível d microorganismos às superfícies sólidas; (2) a
eficiência metabólica da comunidade; (3)
evitar a ação das defesas do hospedeiro, tal
como a fagocitose; (4) agrupar uma alta
densidade de organismos; (5) os microorganismos trocam genes que podem resultar
em uma virulência maior e maior resitência
antimicrobiana; (6) produção de uma grande
concentração de toxinas; (7) a matriz
extracelular
protege
contra
agentes
microbianos; (8) fragmentos de biofilme
podem se destacar e se disseminar a outros
locais4.Quando uma parte dos patógenos se
destaca, alguns organismos que eram sésseis
tornam- se planctônicos, aumentando a
virulência dessa colônia.
Esse estudo tem como objetivo
discutir a formação do biofilme, sua
regulação, seus mecanismos patogênicos e as
implicações médicas relacionadas a ele.
Aborda também métodos diagnósticos e
terapêuticos das infecções causadas por
bactérias formadoras de biofilme.
MÉTODOS
Trata-se de um estudo de revisão
narrativa realizado através de levantamento
bibliográfico com os descritores “biofilm”,
“implant infections”, antibiotic resistance”,
“medic device infections” e “chronic
infections” nas bases de dados Medline,
Lilacs e Scielo. Foram selecionados os artigos
publicados entre 2006 e 2014, em língua
inglesa, com ênfase em publicações dos
últimos cinco anos.
MECANISMOS DE FORMAÇÃO
REGULAÇÃO DE BIOLFILMES
E
A formação de biofilmes é complexa e
ocorre ao longo do tempo como qualquer
comunidade biológica. Para fins didáticos, foi
dividida em etapas que basicamente
consistem na fixação das bactérias em um
material de um determinado meio, na
agregação dessas bactérias, uma às outras e
seu crescimento. A formação ocorre em cinco
etapas: a primeira, induzida por sinais como
concentração de nutrientes, ferro, mudanças
de temperatura e pH, entre outros fatores, é a
fase de fixação; a segunda seria a fase de
ligação irreversível das bactérias ao material
colonizado e sua multiplicação por meio da
emissão de mediadores químicos que
funcionam como um tipo de comunicação
entre essas células; na fase três, o agregado
celular cresce em camadas e atinge cerca de
10µm, caracterizando a fase de maturação.
Nas fases seguintes, quatro e cinco, as
camadas atingem espessura de mais de 100µm
e, a partir daí passam a se descolar do
biofilme adquirindo uma forma planctônica
(fase de dispersão).
Outros estudos, trazem essa divisão
em duas, ou quatro etapas, que incluem
também todas as fases descritas, mas
embutidas umas às outras7,8. A respeito da
REV. BRAS. MED. INTERNA 2015; 2(1):37-­‐47. fixação em materiais, estudos mostram que
em superfícies ásperas essa fase ocorre com
maior facilidade já que há redução das forças
de cisalhamento e aumento da superfície de
contato. Além disso, materiais hidrofóbicos
como teflon e outros plásticos são mais
susceptíveis à formação de biofilmes4. Essas
interações iniciais são inespecíficas e contam
com proteínas próprias para a fixação6,7. A
fase de adesão intercelular depende da
formação de adesinas microbianas, tal como a
PIA (adesina intracelular polissacarídea)
produzida por Staphylococcusepidermidis. A
síntese desses polissacarídeos é mediada pelos
genes icaA, icaD, icaB, icaC e genes
regulatórios içaR. Mutações em icaADBC
resultam em redução da capacidade de formar
o biofilme em S. epidermidits, conforme
dados dos estudos 6,7 e 8.
Quanto à estrutura, em resumo, o
biofilme maduro é formado por uma
arquitetura tridimensional composta por três
camadas e micro-colônias aderidas ao
substrato, rodeadas por exopolissacarídeo
(EPS). A matriz do biofilme contém EPS,
proteínas e DNA. Entre as micro-colônias e o
aglomerado de bactérias são formados canais
de água que protegem as bactérias celulares
do acúmulo de metabólitos tóxicos e
proporcionam uma fonte de nutrientes4.
Todo esse processo de formação do
filme depende da interação com o hospedeiro
e é controlado pelo “quorum sensing”. Tratase de um mecanismo de comunicação
interbacteriano relacionado à densidade
populacional associada à alterações na
expressão de proteínas4,7. Nesse meio de
comunicação estão presentes feromônios,
fatores genéticos que estimulam a produção
de exopolissacarídeos (EPS) para a captação
de nutrientes e bactérias planctônicas,
mediadores químicos, peptídeos como o
RNAIII que induz o crescimento do biofilme,
N-acylhomoserinelactone (AHL) de Gram
negativos, que coordenam o crescimento e o
comportamento durante a invasão e a
colonização de organismos superiores entre
outros fatores4,5,6,7 e 8.
A maioria dos biofilmes em implantes
são formados por Staphylococcus aureus
(30%) seguido por biofilmes polimicrobianos
(27%), Staphylococcus coagulase-negativos
(22%) e bacilos Gram negativos (10%)9.
BIOFILME COMO NICHO PROTETOR
PARA GERAÇÃO DE RESISTÊNCIA
BACTERIANA
O próprio biofilme em si é uma das
estratégias conhecidas pela qual as bactérias
toleram a exposição aos antimicrobianos6.
Existem múltiplos mecanismos pelos quais os
biofilmes promovem proteção das bactérias
aos agentes antimicrobianos, tais como:
- O agente não consegue penetrar profundamente no biofilme, pois as células bacterianas
ficam enclausuradas em uma substancia
polimérica extracelular.
- Apresentam células persistentes, conhecidas
como “persisters” que ficam em estado de
limitação nutricional e em baixo crescimento
o que as torna muito pouco suscetíveis aos
antibióticos10.As células persistentes são uma
pequena fração da população bacteriana que
fica inativa e que, portanto, fica protegida dos
radicais livres de oxigênio, produzido na ação
da maioria dos antibióticos. Essas células
também funcionam como um reservatório de
bactérias que podem adquirir resistência por
mutação ou transferência de genes de forma
horizontal, formando uma geração de
mutantes antibiótico-resistentes6.
- O biofilme facilita a diferenciação celular e
especialização bacteriana9. Os biofilmes são
um ambiente ideal para a transferência de
genes, principalmente por contar com grande
quantidade de elementos genéticos móveis
que podem intercambiar de uma bactéria à
outra, por troca de plasmídeos, conjugação ou
transposons. A proximidade física das células
dentro da colônia favorece esse mecanismo.
Como exemplo, temos as diferentes espécies
de Pseudomonas, onde a taxa de conjugação
se mostrou ser muito maior nos organismos
agregados em biofilmes do que naqueles nas
condições planctônicas8.
- O sistema de “quorum sensing” (QS) de
comunicação
intercelular
também
é
responsável pela formação de resistência
antimicrobiana. Uma fração significante de
fatores de virulência é controlada por esse
sistema, que consiste na produção de
pequenas moléculas sinalizadoras, chamadas
REV. BRAS. MED. INTERNA 2014; 2(1): 4 de auto-indutoras (AIs) e cuja concentração
o crescimento da biomassa (maturação).
aumenta com o crescimento. Ao atingirem
Alguns componentes da matriz,como por
uma concentração crítica, essas moléculas
exemplo o DNA extracelular e alginato,são
sinalizadoras podem se ligar e ativar
quelantes de antibióticos. Além disso, a
receptores dentro das células bacterianas,
matriz do biofilme tem limitações na difusão
alterando a transcrição de genes para ativar
que provém um efeito protetor de curto prazo
comportamentos benéficos ou não, de acordo
contra componentes antimicrobianos, mas não
com as condições particulares encontradas.
apresenta efeito a longo prazo.
Interferir no sistema QS faz com que a
O mecanismo de tolerância fisiológica
bactéria se torne mais sensível aos
é determinado pelo status metabólico da
antibióticos, estratégia que tem sido cada vez
bactéria. Nos biofilmes, o gradiente de
mais pesquisada para combater os biofilmes.
atividade metabólica e a taxa de crescimento
- O biofilme apresenta um padrão natural de
da camada interna diminuem pelas limitações
destacamento programado, de modo que
aos nutrientes e oxigênio. Por conta disso, os
células ligadas ao biofilme se destacam e são
biofilmes consistem de duas subpopulações:
convertidas na forma planctônica, num
uma em crescimento aeróbico e outra em
mecanismo reversível, e que permite a
crescimento anaeróbico, “dormente”. Antibicolonização de novos ambientes6. Os
óticos como aminoglicosídeos, fluoroquiantibióticos conseguem erradicar os sintomas
nonas e betalactâmicos não funcionam bem
provocados pelas bactérias planctônicas que
em condições de hipóxia, e agem somente na
se destacam do biofilme, mas não conseguem
camada externa, na porção em crescimento
matar os biofilmes como um todo. É por essa
aeróbico. Já os antibióticos de parede – como
razão que as infecções por biofilme cursam
a colistina – são também efetivos em baixas
com recorrência dos sintomas, mesmo depois
concentrações de oxigênio e, portanto são
de ciclos de antibioticoterapia, até que a
capazes de agir no interior do biofilme.
população
séssil
seja
cirurgicamente
Entretanto, uma combinação de aminogliretirada10.
cosídeos, fluoroquinolonas e polimixinas não
A tolerância do biofilme aos
apresenta potencial completo para erradicar as
antimicrobianos é multifatorial e envolve uma
bactérias, uma vez que uma pequena fração
mistura de mecanismos físicos, fisiológicos e
da bactéria sempre sobrevive, devido ao
de tolerância adaptativa que permite a
fenômeno de persistência. A bactéria
sobrevivência das subpopulações e faz com as
persistente se protege do sistema imune e
células suportem um longo tempo de
consegue reestabelecer a infecção. A
11
exposição
aos
antibióticos .
O
dispersão do biofilme cessa esse mecanismo,
desenvolvimento de tolerância não é
evidência mostrada pelos agregados de P.
imediato. Os biofilmes recém-formados são
aerugionosa mecanicamente destruídos cujas
muito mais suscetíveis aos antibióticos no
células dispersas são facilmente atingidas pela
primeiro dia de formação do que três a cinco
tobramicina12.
dias depois. A concentração inibitória mínima
A tolerância adaptativa dos biofilmes
de antimicrobianos necessária para inibir e
se refere à indução de mecanismos de
extinguir os patógenos do biofilme é, pelo
resistência que deixam a população bacteriana
menos, 100 vezes maior que aquela necessária
temporariamente refratária à ação dos
para causar os mesmos efeitos nos
antimicrobianos. É um mecanismo adquirido
microrganismos planctônicos. Ou seja,
e depende da presença do agente antimicrosomente uma a concentração extremamente
biano. Isso não requer mudanças genéticas,
elevada de antimicrobianos dentro do
mas é mediado por conexões e reversível
biofilme poderia combater com eficácia essa
quando a exposição ao antibiótico cessa. A
colônia.
tolerância adaptativa pode ser específica ou
Os mecanismos físicos no desenvolnão, dependendo do tipo ou classe do
vimento da tolerância dependem da matriz
antibiótico. Um exemplo de tolerância
(quantidade de material) e da estrutura
específica é a indução da transcrição da
tridimensional do biofilme, que aumenta com
betalactamase na resposta à presença de
REV. BRAS. MED. INTERNA 2015; 2(1):37-­‐47. antibiótico betalactâmico. A betalactamase é
secretada dentro do biofilme e dificulta a
penetração de moléculas através das camadas.
Nos biofilmes de P. aeruginosa resistente a
beta lactâmicos,a expressão de altos níveis de
beta lactamase nos biofilmes mudou os
parâmetros
farmacocinéticos
e
farmacodinâmicos dos beta-lactâmicos de
uma destruição tempo-dependente para uma
destruição concentração-dependente.
O “upregulation” de bombas de efluxo
é um exemplo de mecanismo adaptativo não
específico, que pode ser desencadeado pela
presença dos antibióticos ou pela resposta
bacteriana ao estresse oxidativo. Trata-se de
um mecanismo para eliminação de
componentes tóxicos que se acumulam nos
biofilmes, e foi evidenciado em várias
espécies de bactérias, afetando a tolerância à
antibióticos como o macrolídeo azitromicina.
A bactéria planctônica que sofre
mutações e se torna resistente aos antibióticos
pode formar biofilmes depois da aquisição
dessas mutações, mas o próprio modo de
crescimento dos biofilmes pode promover a
ocorrência de mutações. A exposição aos
antibióticos
desencadeia
um
estresse
oxidativo que leva ao aumento da expressão
do fator RpoS sigma na fase estacionaria do
biofilme, relacionado ao aumento das
mutações. No sítio de infecção, as células
inflamatórias que circundam o biofilme
liberam espécies reativas de oxigênio
mutagênicas que também estimulam a
mutabilidade, levando ao aparecimento de
resistência antimicrobiana.
A resistência genética também pode ser
transmitida pela transferência horizontal de
genes, que é mais efetiva nos biofilmes do
que nas bactérias planctônicas. Esse
mecanismo parece ter um papel no
desenvolvimento
da
resistência
aos
antibióticos,principalmente se o plasmídio
determinante da resistência está presente na
fase inicial da formação do biofilme.Nos
biofilmes maduros, a transferência horizontal
de genes pode ser prejudicada por restrições
espaciais e nutricionais.
As drogas antibióticas que ainda
expressam atividade contra as bactérias
resistentes só são eficientes para as bactérias
planctônicas, por isso a dificuldade no
tratamento antimicrobiano
organizadas em biofilmes12.
BIOFILME
EM
TECIDOS MOLES
das
bactérias
IMPLANTES
E
A formação de biofilme sobre
implantes ortopédicos oferece um grande
risco para o sucesso desse tipo de cirurgia,
podendo necessitar substituição do implante e
em casos graves, amputação e mortalidade.
Em resumo, os maiores problemas desse tipo
de infecção são que essas bactérias são
altamente resistentes a antimicrobianos
convencionais, podem atingir outros tecidos
causando infecção crônica e, como são
dificilmente
eliminadas,
a
resposta
inflamatória sobre esse local pode conduzir
uma falha do implante.
Infecções dos tecidos ósseos como
osteomielite, artrite séptica e as infecções de
próteses articulares, ainda representam as
piores complicações da cirurgia ortopédica e
traumatologia6. As principais vias de infecção
são resultantes de bacteremia direta e por
contígua, quando a infecção é transmitida a
partir do tecido local9,10. Os agentes
etiológicos mais comuns que causam
osteomielite são Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
epidermidis e Escherichia coli. Biomateriais
implantados podem atuar como um meio para
a contaminação bacteriana e colonização
culminando para o desenvolvimento de
osteomielite. Se as condições são favoráveis,
bactérias criam uma adesão inicial à
superfície através de uma ligação permanente
que desenvolve-se a partir da proteína de
adesina e à receptores específicos e, formam
então uma película de polissacarídeo. Esse
mecanismo permite que a distância entre a
célula bacteriana e a superfície do material se
reduza consideravelmente. Por fim, essa
adesão protege de uma reação não fagocítica
aos patógenos, o que os leva a se multiplicar e
colonizar livremente a superfície de
implantes.
Um número limitado de espécies estão
envolvidas na formação do biofilme, mais
amplamente conta-se com infecções por
Staphylococcus aureus e Staphylococcus
epidermits, isoladas ou em conjunto. A
REV. BRAS. MED. INTERNA 2014; 2(1): 6 ADESÃO BACTERIANA À SUPERFÍCIE
grande versatilidade do S. Aureus em causar
DE IMPLANTES
manifestações clinicas se dá pela alta
capacidade de mutação e adaptação desse
patógeno10. Muitas vezes pode ser encontrado
Estudos realizados sugerm que implantes
como um comensal e uma parte transitória ou
contendo nanoestruturas de ZnO e TiO2
persistente da flora residente da pele e narinas
podem reduzir a adesão de S. epidermidis e
anteriores de uma grande percentagem (20aumentar o desempenho osteoblástico
50%) da população humana. S. aureus possui
necessário para promover a eficácia dos
diversas moléculas de adesão da superfície
implantes6. Essa premissa parte do fato que
celular, que facilitam a sua ligação a uma
superfícies metálicas têm uma energia de
matriz óssea. Algumas destas adesinas já
superfície elevada e são carregadas
foram estudadas e identificadas como fatores
negativamente, além de serem hidrofílicos
de virulência importantes implicados em
como mostrado por ângulos de contato de
várias fases da infecção, incluindo a
água, enquanto que os polímeros têm baixa
colonização precoce, invasão, localização do
energia de superfície e são menos carregados
11,13
tecido e internalização celular
.
de energia eletrostática e hidrofóbica.
Já o Staphylococcu sepidermidis é o
Dependendo da hidrofobicidade de
membro mais frequentemente isolado do
bactérias e superfícies de materiais, as
grupo de estafilococos coagulase-negativos
bactérias aderem de forma diferente para
(ECN) de infecções associadas aos implantes
diferentes materiais. Um microrganismo pode
e eles estão associados a infecções
aderir a um substrato por meio do efeito
nosocomiais ou adquiridas no hospital, e
hidrofóbico se os sítios associados possuírem
foram encontrados para ser mais resistente
altas densidades de domínios apolares. Já
aos antibióticos do que S. aureus6. A
carga superficial das bactérias pode ser um
patogênese de infecções por S. epidermidis
outro fator físico importante para a adesão
associados com implantes é caracterizado pela
bacteriana. A carga atrai a carga oposta do
sua capacidade de colonizar a superfície e
meio e resulta na formação de uma dupla
formar, um biofilme de múltiplas camadas de
camada elétrica10. A maioria das partículas
espessura, frequentemente referido como
adquire uma carga elétrica superficial em
lodo. A diferença entre essas espécies é que o
suspensão aquosa, devido à ionização dos
S. epidermitis não possui tantas enzimas de
seus grupos de superfície. Bactérias em
adesão e toxinas como oS. aureus, por outro
suspensão aquosa são quase sempre
lado
foram
identificados
adesinas
carregadas negativamente. E essa carga de
relacionadas à fibronectina, fibrinogênio e
superfície das bactérias varia de acordo com a
colágeno para o S. epidermitis.
espécie bacteriana e é influenciado pelo meio
Outro exemplo de infecção por
de crescimento, o pH e a força iônica do
biofilme é a artrite séptica. Trata-se de uma
tampão de suspensão e idade bacteriana.
doença
articular
caracterizada
pela
OTITES
E
A
FORMAÇÃO
DE
colonização bacteriana e destruição da
BIOFILMES
articulação. A manifestação é rápida e
caracteriza-se como uma infecção grave com
dor, febre, inchaço e até mesmo a perda da
Adenóides têm sido associadas com a
8
função em uma ou mais articulações .Vários
patogênese de doenças infecciosas agudas,
fatores diferentes foram identificados para o
recorrentes e crônicas do sistema respiratório
desenvolvimento de artrite séptica. Esses
superior. Podem causar obstrução mecânica
fatores incluem a artrite reumatoide ou
da nasofaringe, desempenham um papel
osteoartrite, prótese articular, baixo nível
importante na patogênese da otite média ou
socioeconômico, abuso de drogas injetáveis,
tornar-se um reservatório de bactérias
alcoolismo, diabetes, injeção de corticóide
patogênicas,
especialmente
bactérias
6
intra-articular anterior e úlceras .
resistentes que podem causar infecções
recorrentes e muito afetar tratamentos
médicos8. Foram analisados os biofilmes em
REV. BRAS. MED. INTERNA 2015; 2(1):37-­‐47. adenóides para os patógenos mais comuns do
ouvido médio (S. pneumoniae, H. influenzae,
M. catarrhalis e S. aureus), empregando
multiplex-PCR em paralelo para ajudar a
esclarecer o relacionamento e dar crédito ao
que tem sido previamente inferido a partir de
dados de SEM na presença destes agentes
patogênicos no interior da matriz do
biofilme10. Noventa e seis por cento das
amostras de adenóide tinha ouvido médio
patógenos presentes, mostrando a colonização
poli-microbiana. Oitenta por cento das
amostras de fluido do ouvido médio
apresentaram, pelo menos, um dos seguintes
agentes patogénicos do ouvido médio: S.
pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, e
S. aureus13. Os microrganismos encontrados
na biopelícula adenoidea detectados por PCR
são os mesmos dos agentes patogénicos
comuns do ouvido médio. Estes resultados
suportam a hipótese de que pode haver uma
associação entre a formação de biofilme na
adenoide e infecções respiratórias.
(starters) são usados para amplificar por PCR
sequências
específicas
de
DNA.
Notavelmente, as sequências de DNA
ribossomal 16S que codificam o gene de
rRNA 16S são utilizados porque o gene 16S
rRNA é universal para procariotas e é
amplamente utilizado como uma "impressão
digital"
filogenética
para
identificar
organismos ao nível da espécie, gênero ou
filo. Outros genes de interesse, como genes de
virulência podem ser sondados para
identificar a resistência aos antibióticos
(iemecA para MRSA). Após a PCR, o
fragmento amplificado resultante deve conter
material suficiente para análise. A presença e,
em alguns casos, a abundância relativa de
sequências de genes amplificados, podem ser
medidos usando uma série de técnicas
incluindo a eletroforese em gel e
espectrometria de massa de ionização de
pulverização.
Quantitativamente o PCR em tempo
real pode ser utilizado para quantificar o DNA
através da monitorização da amplificação14.
No caso de procura de RNAm para
demonstrar, não só a presença de uma espécie
bacteriana, mas também a sua atividade, o
RNAm é convertido em DNAc por
transcriptase reversa antes da amplificação
por PCR7. É útil para visualizar uma possível
mistura de DNA bacteriano e do hospedeiro
que tenham sido extraídos da amostra. Caso
tenha ocorrido essa interação, pequenos
primers procuraram sequências de bases
correspondentes e, quando localizam e
cruzam com eles, produzem um grande
número de ampliações idênticos. O ciclo
repetido deste processo produz um grande
número de sequências-alvo idênticas.
O método de PCR para esse
organismo particular será suficiente. A
microbiologia médica requer a detecção muito
rápida e a identificação de uma gama
relativamente larga de bactérias e fungos, e
um certo grau de quantificação, que permite
que o clínico possa distinguir entre
contaminação e infecção efetiva. Estes
critérios foram indescritíveis, mas o recente
desenvolvimento da tecnologia altamente
múltiplo baseado em PCR quantitativa rápida
Ibis, que conta com spray de ionização de
elétrons e tempo de espectrometria de massa
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Os métodos moleculares para detecção e
identificação de bactérias
Métodos moleculares à base de ácidos
nucléicos para a detecção e identificação de
bactérias começam com a extração de DNA e
/ ou RNA a partir da amostra a ser analisada.
Esta extração será mais eficiente, e vai
proporcionar a quantificação mais precisa, se
os ácidos nucléicos não forem degradados por
conservantes químicos ou por enzimas de
endonuclease.
Assim, as amostras frescas ou
congeladas produzem os melhores resultados
e o processamento rápido é essencial. Outro
passo fundamental é obter exteriormente os
ácidos nucléicos das bactérias; Isto pode ser
particularmente problemático em bactérias
Gram-positivas, que têm uma parede espessa
de peptidoglicano, que é difícil de lise9,14. O
problema é agravado quando o biofilme está
associado ao tecido, pois este pode sofrer
perda contínua (lise) para que o processo de
liberação de bactérias se torne efetivo. Uma
vez que os ácidos nucleicos são extraídos e
purificados, os ácidos nucleicos iniciadores
REV. BRAS. MED. INTERNA 2014; 2(1): 8 de vôo, para fornecer índices altamente
uma bateria de iniciadores de PCR apoiada
precisos de base de nucleotídeos (em vez de
com dados de sequenciamento que pode
sequências de bases) de todos os produtos de
fornecer um nível muito melhor de detecções
amplificação7,14.
bacterianas e identificação do que fornecida
por culturas; no entanto, essa abordagem
Métodos moleculares Broad focados
baseia-se no a priori seleção de alvos e,
portanto, sofre com o 'se você não olhar para
Nos métodos de Broad focados, o
ele você não vai encontrá-lo’ síndrome7.
objetivo é separar todas as ampliações da
grande quantidade de DNA misturado e, por
O método molecular Bis
um método de separação física que é baseado
em variações da composição de bases e
Quando a ameaça iminente de ataque
consequentes variações no seu de peso e / ou
com armas de bioterrorismo foi realizado, a
carga e propriedades moleculares. No
Defesa Projetos de Pesquisa Avançada
primeiro método, tais bibliotecas de clones
Agência do Departamento de Defesa dos
produzidos a partir dos produtos de
EUA iniciou uma busca urgente de novos
amplificação, são separados por eletroforese
métodos para a ampla detecção e
em gel com gradiente. Este método foi
identificação de bactérias. Em resposta a este
amplamente
utilizado
em
ecologia
apelo, a equipe de David Ecker, no Ibis,
microbiana, uma vez que era quantitativa e
desenvolveu uma nova estratégia em que as
produziu bandas de diferentes intensidades de
ampliações produzidas pelo PCR serão
cada conjunto de produtos de amplificação,
ponderados por espectroscopia de massa e seu
proporcionando, assim, uma estimativa do
peso exato seria usado para calcular sua
número de espécies de bactérias presentes na
composição base7,14.
amostra. O processo foi utilizado para estudar
Para fornecer a identificação de todas
as populações microbianas mistas presentes
as bactérias, ambos conhecidos ou
em feridas crônicas humanos, e rapidamente
desconhecidos, tanto patógenos e nãopercebemos que as úlceras do pé diabético e
patógenos, vários conjuntos de primers foram
úlceras de pressão venosa continham muitas
desenhados para detectar múltiplas classes de
espécies bacterianas mais do que nunca foram
genes, incluindo aqueles que são altamente
detectados por culturas7.
conservadas entre domínios inteiros (por
exemplo, 16S e 23S rRNA) bem como como
Método molecular de String focado
sequência que são de filo ou classe específica,
e outros que são específicos para grupos
Todos os métodos de PCR usam
taxonômicos menores.( Cada conjunto de
primers com seqüências de bases que
)iniciadores foram concebidos para hibridar
correspondem a uma região-alvo no DNA
com uma região conservada de um gene que
procariotas ou eucariotas, e estes primers
flanqueia uma região variável. Assim, cada
sempre produzirão amplicons quando
espécie que é amplificada por cada par de
"encontrar" essa sequência particular. Assim,
iniciadores vai produzir um fragmento
em técnicas de PCR, você encontra ou não o
amplificado que é diferente de diagnóstico ou
que está procurando. Por exemplo, se
parcialmente de diagnóstico para a espécie.
iniciadores específicos para S. aureus são
Esta abordagem é extremamente flexível,
usados para sondar uma amostra a partir de
permitindo a criação de diferentes conjuntos
uma prótese infectada, este patógeno será
de iniciadores para uma variedade de
detectado quando presente, mas não irá
aplicações tais como a detecção ampla de
detectar até mesmo um número muito grande
todas as bactérias, para a vigilância muito
de células de S. epidermidis, na mesma
mais específica de estirpes de influenza.
amostra14. Se você conhece uma área médica
O resultado é que o sistema de
muito bem, e sei que as bactérias e fungos
detecção de biosensor universal Ibis pode
normalmente causam infecções nesta
identificar as ampliações produzidas por um
população de pacientes, você pode montar
conjunto
de
primers
cuidadosamente
REV. BRAS. MED. INTERNA 2015; 2(1):37-­‐47. projetados, com um alto grau de precisão que
se afirma como um percentual nos dados
'lidos' e com uma sensibilidade que detecta
todos os organismos presentes. Até 41% da
população total de microrganismos na
amostra. O sistema também detecta e
identifica os fungos e vírus, e detecta a
presença de genes bacterianos que controlam
a resistência a antibióticos13,14. Conjuntos de
primers podem ser projetados para focar os
patógenos geralmente vistos em uma situação
médica especial, como infecções ortopédicas,
de modo que a sensibilidade e precisão podem
ser melhoradas nas partes da 'árvore da vida'
bacteriana, na qual o maioria dos "suspeitos
de costume" está localizada. O tempo
necessário para a extração do DNA é curto,
exceto em casos excepcionais, e o processo de
amplificação por PCR é rápido e automático,
de modo que o sistema Ibis pode detectar e
identificar todas as bactérias presentes em
uma amostra em 6h, e as células do biofilme
são detectados com a mesma sensibilidade
que as células planctônicas7.
quantificação do número de microrganismos
no fluido da sonificação permite distinguir
uma prótese infectada de uma contaminada e
adequar a conduta após cirurgia15.
TRATAMENTO
Biofilmes são capazes de sobreviver na
presença de altas concentrações de agentes
microbianos. Porém, novos antimicrobianos
estão sendo produzidos com o objetivo de
substituir essas substâncias que são capazes
de propiciar aos microorganismos resistência.
Para a maioria dos microorganismos a terapia
farmacológica consiste em rifampicina
combinada com ciprofloxacino ou norfloxacino, ou ainda vancomicina nos casos de
Staphylococos aureus resistentes à meticilina.
Para estreptococos e enterococos resistentes à
penicilina G está indicada a associação com
ceftriaxona e ampicilina, respectivamente.
Clindamicina é o recomendada para infecções
por anaeróbios e a associação de amoxicilina
com clavulanato está indicada para infecções
mistas que não contenham MRSA22.
Daptomicina (um lipopeptídeo) e a linezolida
(oxazolidinona) são drogas aprovadas para
oferecer novas opções para o tratamento de
infecções causadas por bactérias Gram
positivas resistentes e possivelmente para
infecções de biofilme causadas pelo S.
epidermites. A daptomicina mostrou-se a
melhor opção para o combate dessa infecção
no lugar da monoterapia com rifampcina no
estudo de Bruna Leite11.
Quando a infecção está relacionada
com fraturas e instrumentos fixadores, o
objetivo do tratamento é a consolidação óssea
e evitar o desenvolvimento de osteomielite
crônica. Para se obter sucesso no tratamento é
necessário
procedimentos
cirúrgicos
adequados associados com antibioticoterapia
de seis a doze semanas10.
O tratamento cirúrgico é fundamental
e consiste no desbridamento e na remoção do
implante infectado. Se após o procedimento e
a antibioticoterapia o paciente ainda
apresentar áreas de necrose ou com
abundancia de material purulento, um novo
desbridamento deve ser feito. Se as margens
de um ferimento estiverem necrosadas, um
enxerto é indicado para a área. O desbri-
SONIFICAÇÃO
A sonificação é um método físico que
envolve a aplicação de ultrassom para
quebram interações intermoleculares. A
cultura do liquido em contato com o biofilme
quebrado, em tese, pode gerar melhor
acuidade na pesquisa do fator etiológico da
infecção. A sonificação de próteses removidas
pode ser feita por meio da utilização de 400
mL de solução Ringer lactato e submetida à
vortificação, usando um Vortex-Genie e, em
seguida, submetida a sonificação numa
frequência de 40± 2kHz por 5 minutos,
seguido de agitação em vórtice durante 30
segundos adicionais. O método de sonicação
preserva a variabilidade microbiana e após tal
procedimento é realizada a identificação dos
microrganismos para adequar um tratamento
específico. Pode ocorrer de a cultura da
sonificação ser positiva e do tecido negativa,
mostrando que a cultura da sonificação é mais
sensível que a do tecido e especula-se que
isso se deva ao fato de as bactérias
planctônicas presentes no tecido serem mais
suscetíveis a agentes anti-infectíveis que a
bactéria no biofilme. Além disso, a
REV. BRAS. MED. INTERNA 2014; 2(1): 10 damento de biofilme imaturos são mais
Como resultado, a DNase mostrou-se capaz
sensíveis ao tratamento.
de se dispersar biofilmes de S. aureus.
Novas substâncias químicas tem sido
Abordagens de bioengenharia também tem
identificadas como inibidores do gene da
sido aplicadas para tentar controlar o biofilme
expressão da virulência de patógenos Gram
com o revestimento de superfícies com
positivos como o Streptococcus pyogenes e o
substâncias bacteriostáticas e bactericidas
S. aureus. Um composto benzimidalózico
(antibióticos, prata, furanonas), porém essa
mostrou um amplo espectro de inibição do
técnica pode gerar uma resistência ao
biofilme para diversas bactérias Gram
antibiótico utilizado e até induzir a formação
positivas e negativas, como a P. aeruginosa e
de biofilme. As propriedades de superfície
o S. aureus. A P.aeruginosa produz um
dos biomateriais, dispositivos médicos podem
composto orgânico ácido cis-2-decenóico
ser alterados por aplicação de revestimento ou
capaz de dispersar biofilmes estabelecidos e
modificação de superfície para criar as
inibir o desenvolvimento do biofilme por
características de anti-aderência desejadas,
várias bactérias, como a por E. coli, K.
sem alterar as propriedades dos materiais
pneumoniae, P. mirabilis, S. pyogenes, B.
(composição química e reatividade dos
subtilis, S. aureus e C. albicans . Da mesma
materiais). A rugosidade da superfície dos
forma, as bactérias produzem d-amino ácidos,
biomateriais influencia fortemente o grau de
que inibiram a formação de biofilme por S.
aderência bacteriana a superfícies. O
aureus e P. aeruginosa. A N-acetilcisteína é
polimento do material gera características de
um agente mucolítico que poderia interferir
superfície em nanoescala sobre as superfícies
com a formação de polissacárido em
de titânio com um padrão característico mais
biofilmes e inibir a formação de biofilmes de
adequado para a ancoragem de células de S.
S. epidermidis. Cátions metálicos, tais como
aureus esféricas. O organosselênio pode
2+
2+
Ca e Mg desempenham um papel na
catalisar a formação de radicais superóxido a
adesão microbiana e a formação de biofilme.
prevenir a colonização bacteriana em
Como resultado, os quelantes que podem
superfícies de biomateriais. Os revestimentos
remover estes cátions e também podem inibir
anti-adesão impedem a formação de biofilmes
a formação de biofilme. O número de
em fases iniciais, o que deve ser mais
moléculas que podem interferir com a
desejável em contextos clínicos. No entanto, a
formação de biofilme e, portanto, servir como
eficácia in vivo de sucesso é ainda ilusória
vantagem para o desenvolvimento de agentes
com muitos dos revestimentos. Devido à
anti-biofilme está a crescendo rapidamente .
complexidade da interação entre o
No entanto, os mecanismos de ação de muitas
revestimento de superfícies com as bactérias e
dessas moléculas pequenas ainda não estão
proteínas do hospedeiro, o mecanismo de
claros o que dificulta o desenvolvimento.
revestimentos anti-adesão é também difícil de
Mais estudos in vivo e de farmacocinética são
identificar .Em resumo, as abordagens de
necessários para otimizar estas ligações para
bioengenharia poderiam impedir a formação
satisfazer os critérios necessários para a
de biofilmes que é mais desejável do que o
aplicação médica. Há também enzimas que
tratamento da infecção. Apesar das
atacam a matriz polissacarídea interrompendo
deficiências de muitas das abordagens,
ou degradando a matriz polimérica
melhorar as propriedades anti-biofilme do
extracelular dos biofilmes. Bacterias Gram
biomaterial continua a ser a estratégia mais
negativas,
como
a
Actinomyces
eficaz e promissora para prevenir a morbidade
comitans produzem a dispersina B que
e mortalidade associada a infecções
poderia dispersar biofilmes por outras
biofilme17.
bactérias. Kaplan et al. descobriu que
dispersina B poderia interromper a produção
CONCLUSÃO
da matriz extracelular e dispersar o biofilme.
O DNA genômico extracelular é libertado
Dessa
forma,
vê-se
que
o
pela bactéria como um componente
reconhecimento da existência do biofilme é
importante da matriz extracelular do biofilme.
importante na área médica, assim como seu
REV. BRAS. MED. INTERNA 2015; 2(1):37-­‐47. mecanismo de formação e manutenção. A
partir dessa realidade, novos métodos
diagnósticos puderam ser desenvolvidos o que
permite tratamentos mais específicos e
certeiros. A importância de novas pesquisas
nessa área e o desenvolvimento de novos
medicamentos capazes de tratar bactérias
formadoras de biofilme, se dão no aspecto de
evitar cirurgias corretoras que podem ter um
impacto psicológico e físico para o paciente.
Assim reside no futuro da microbiologia
entender de forma mais abrangente essa
patologia bacteriana que tantas afecções
podem causar no ser humano.
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