AULA-P5 Conc._prot._ plasmáticas_Eletroforese_2011_12

Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Ano Lectivo 2011/2012
Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I
Mestrado Integrado em MEDICINA
1º Ano
ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO
5ª AULA PRÁTICA
Determinação da concentração das proteínas plasmáticas (proteinémia)
Electroforese de proteínas plasmáticas- Interpretação do proteinograma
● As proteínas
As proteínas são polímeros de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas.
Existem 20 aminoácidos diferentes constituintes das proteínas, com uma característica
estrutural comum: são alfa-aminoácidos, ie ácidos carboxílicos com um grupo amina ligado
ao carbono 2 (ou alfa). Todos os aminoácidos, com exceção da glicina (ou glicocola),
podem existir como estereoisómetros D ou L (à semelhança do gliceraldeído).
NH2
R-C
COOH
Os aminoácidos constituintes das proteínas são L-aminoácidos.
Os grupos R conferem aos aminoácidos propriedades características, que
dependem do pH da solução.
Com base na interacção dos grupos R com a água a pH 7,0, os aminoácidos
classificam-se em famílias:
•Não polares
sem carga
•Polares
positiva
com carga
negativa
Os aminoácidos existem como moléculas dipolares e anfotéricas (têm pK e pI
característicos).
A forma iónica de um aminoácido (ou a carga global de uma proteína) pode ser
influenciada pelo pH. O ponto isoeléctrico (pI) é o pH ao qual um determinado aminoácido
(ou proteína) é electricamente neutro e existe na sua forma de zwitterião (ião “híbrido”, com
duas cargas opostas).
A carga eléctrica a um determinado pH permite a separação de aminoácidos ( e das
proteínas) por electroforese ou por cromatografia de troca iónica.
O grupo amínico (NH2) dos aminoácidos pode ser identificado por duas reacções
químicas importantes: reacção com a ninhidrina e reacção com 1-fluoro-2,4 dinitrobenzeno
(FDNB).
1
● Os aminoácidos
São as cadeias laterais (grupos R) que definem as características de cada um dos
aminoácidos.
Classificação dos vinte aminoácidos constituintes das proteínas, de acordo com as
cadeias laterais
com cadeia com grupo
com
com grupos
com
com grupos iminoácidos
alifática
enxofre
carboxilo ou
grupos
aromáticos
suas amidas
básicos
hidroxilo
(OH)
Glicina
Serina
Cisteína
Àcido aspártico
Arginina
Histidina
Alanina
Treonina
Metionina
Asparagina
Lisina
Fenilalanina
Valina
Tirosina
Ácido glutâmico
Histidina
Tirosina
Leucina
Glutamina
Prolina
Triptofano
Isoleucina
● A ligação peptídica
Os aminoácidos ligam-se entre si formando longas cadeias (polipeptídeos). Todos os
peptídeos têm um NH2 terminal e um COOH terminal, excepto alguns peptídeos que têm um
grupo
terminal
cíclico:
inóforos
(valinomicina),
antibióticos
(penicilina),
hormonas
(vasopressina).
Os aminoácidos de um peptídeo chamam-se resíduos. A cadeia polipeptídica
principal repete-se regularmente, enquanto as cadeias laterais variam, consoante o
aminoácido a que pertenciam.
A cadeia polipeptídica tem uma determinada direcção: o grupo amina terminal
localiza-se à esquerda e grupo carboxilo terminal à direita (Fig. 1).
Fig. 1- Estrutura de um dipeptídeo: dois aminoácidos unidos pela ligação peptídica
2
Do mesmo modo que os aminoácidos, as proteínas têm comportamento ácido/ base
devido à presença de grupos NH2 e COOH livres.
A ligação peptídica é planar e rígida e tem um carácter parcial de dupla ligação.
O comprimento da ligação C-N na ligação peptídica é de 1,32 A°, isto é, está entre C-N
(1,49 A°, ligação simples) e C=N (1,27 A°, ligação dupla).
● Os estados estruturais das proteínas
1. Estrutura primária
É a estrutura química básica que resulta da sequência dos aminoácidos. Na
manutenção desta estrutura são importantes as ligações peptídicas.
2. Estrutura secundária
É o arranjo regular da cadeia polipeptídica ao longo de uma determinada dimensão.
Na manutenção desta estrutura são importantes as ligações dissulfito e ligações de
hidrogénio.
A molécula pode arranjar-se em:
A. HÉLICE:
- hélice α (a mais comum) - Na hélice α, o grupo NH do resíduo n está ligado
ao grupo CO do resíduo (n - 4) por uma ligação de hidrogénio.
- ribão
- hélice 3
- hélice TT
B. FOLHA β
Este tipo de estrutura é estabilizada por ligações de hidrogénio entre C=O e N-H de
cadeias polipeptídicas diferentes, enquanto na hélice α elas se formavam entre aminoácidos
da mesma cadeia polipeptídica.
Polipeptídeo em folha β “pregueada”: as cadeias adjacentes numa folha β podem
estar orientadas na mesma direcção (folha β paralela) ou em direcções opostas (folha β
antiparalela).
3
Estrutura terciária
Diz respeito ao arranjo das estruturas secundárias no espaço.
4. Estruturas superiores
Arranjo das estruturas terciárias em supraestruturas, por ligações de subunidades
monoméricas. Nem todas as proteínas exibem esta estrutura.
O arranjo das estruturas terciárias é determinado por:
- Característica dos resíduos laterais dos aminoácidos polares, apolares, polares
com carga, conteúdo em enxofre e comportamento em solução aquosa.
- Tipos de ligações intra-moleculares por interacção dos grupos laterais R
- Interacção de resíduos hidrofílicos com água.
CLASSIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS
Holoproteínas: compostas apenas por cadeias polipeptídicas.
Heteroproteínas: compostas por uma ou mais cadeias polipeptídicas e uma parte não
proteica (grupo prostético):
Grupos prostéticos:
- Fosfato: fosfoproteínas
- Ácido nucleico: nucleoproteínas
- Glícido: glicoproteínas
- Lípido: lipoproteínas
- Pigmento: cromoproteínas
- Metais (Cu, Fe, Zn): metaloproteínas
4
As proteínas representam cerca de 50% do peso seco das células e desempenham
importantes funções em todos os processos biológicos, nomeadamente:
1. Catálise enzimática
• Quase todas as reacções químicas nos sistemas biológicos são catalizadas por
enzimas. Quase todas as enzimas são proteínas. Ex: glicose-6-fosfatase, piruvato
desidrogenase.
2. Transporte e armazenamento
• Pequenas moléculas e iões são transportados por proteínas.
Ex: hemoglobina (transporta O2 no sangue), mioglobina (transporta O2 no músculo),
transferrina (transporta ferro), ferritina (armazena ferro no fígado), ceruloplasmina
(transporta cobre).
3. Movimento
• As proteínas são componentes do músculo.
• O movimento dos cromossomas na mitose, bem como a propulsão dos
espermatozóides, deve-se à acção de proteínas contrácteis.
Ex: actina e miosina.
4. Suporte mecânico
• Resistência à tensão da pele e do osso. Ex: colagéneo.
5. Respostas imunológicas
• Os anticorpos são proteínas altamente específicas.
• Defesa contra a infecção e reconhecimento de self-not self.
Ex: imunoglobulinas (IgA, IgE).
6. Geração e transmissão do impulso nervoso
• A maior parte dos receptores são proteínas.
• Alguns aminoácidos são neurotransmissores.
Ex: receptores α e β adrenérgicos. Os aminoácidos glutamato e aspartato.
5
7. Controlo do crescimento e diferenciação
• Algumas hormonas são proteínas.
• A informação genética traduz-se na sequência proteica.
• Controlo da informação genética.
• Factores de crescimento.
• Hormonas e coordenação da actividade celular.
Ex:
somatostatina
(hormona
do
crescimento),
insulina
(hormona
hipoglicemiante), hormonas tiroideias, histonas (protecção de informação genética).
8. Manutenção da pressão osmótica
- No plasma, a mais importante é a albumina.
9. Tampões de pH
- Todas as proteínas.
Classificação das proteínas plasmáticas:
1) Proteínas simples - albumina
2) Glicoproteínas
A maioria das proteínas plasmáticas faz parte do grupo das glicoproteínas, à
excepção da albumina.
As proteínas da coagulação e as imunoglobulinas são proteínas plasmáticas
importantes na manutenção da homeostase do organismo.
As proteínas responsáveis pelo sistema AB0 (A, B, zero) do sangue, e pela
histocompatibilidade são glicoproteínas. A porção glucídica da proteína é responsável pelo
código de superfície da célula tendo, portanto, influência na regulação do crescimento
celular. Alterações de glicoproteínas de membrana estão relacionadas com tumorigénese e
neoplasias.
3) Lipoproteínas
Estas proteínas têm várias funções no sistema circulatório, transportando lípidos
entre os vários tecidos e participando no metabolismo lipídico.
Classificam-se pela sua densidade, obtida por ultracentrifugação: HDL, IDL, LDL, VLDL e
quilomicra.
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CORRELAÇÕES CLÍNICAS
Hiperproteinémia:
1. A relação albumina/ globulina é normal: hemoconcentração
2. A relação albumina/ globulina é anormal:
a) aumento de albumina ⇒ erro técnico
b) aumento das globulinas:
- ex: síndromes infecciosas, mieloma múltiplo, etc
Hipoproteinémia / Hipoalbuminémia:
1. Diminuição de síntese
- nutrição / absorção deficiente - malnutrição proteica
- insuficiência hepática
2. Aumento da excreção ou degradação
- perdas renais: síndrome nefrótica
- perdas intestinais: gastroenteropatias exsudativas
- perdas cutâneo-mucosas: queimaduras
3. Aumento do volume de distribuição ex: na hiperhidratação
● Determinação da concentração de proteínas plasmáticas
A concentração de proteínas é habitualmente determinada por espectrofotometria de
absorção.
As proteínas apresentam uma banda de absorção ao nível dos 280 nm (ultravioleta).
Para utilização do espectrofotómetro de luz visível recorre-se à utilização de um reagente
que permita “corar” as proteínas presentes numa solução. Um dos reagentes mais
frequentemente utilizados é o reagente do biureto.
O reagente do biureto é uma solução alcalina de sulfato de cobre (azul) que reage
com o biureto (ou biureia) originando um produto arroxeado. Não exite biureia circulante no
plasma (apenas ureia).Por outro lado, há uma semelhança estrutral entre o biureto e as
ligações peptídicas, pelo que compostos que as contenham, como os polipeptídeos e as
proteínas dão uma reação do biureto positiva, ie dão origem ao aparecimento de um
composto arroxeado em presença do reagnete de sulfato de cobre.. A reacção do biureto é
assim “específica” para as ligações peptídicas e ocorre quando um composto tem pelo
menos duas ligações peptídicas, ou seja, a cadeia peptídica deve ter pelo menos três
aminoácidos. A cadeia peptídica reage com o cobre do reagente num meio bastante
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alcalino e forma um complexo de cor violeta cuja intensidade de coloração é proporcional à
quantidade de proteínas existentes na solução.
Existem outros métodos espectrofotométricos que podem ser aplicados, consoante a
quantidade de proteína presente na solução (Tabela I).
TABELA I- MÉTODOS COLORIMÉTRICOS MAIS FREQUENTES USADOS PARA A
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS
MÉTODO
Fundamento
λ
Sensibilidade
Biureto
Ligações peptídicas
540 nm
Moderada (1000 - 10000 µg)
Lowry
Grupos fenólicos
700 nm
Elevada (10 - 300 µg)
595 nm
Muito elevada (2 - 5 µg)
(tirosina e triptofano)
Bradford
Grupos amínicos (NH3+)
Em qualquer dos casos há que conhecer o espetro de absorção das proteínas ou
dos compostos corados delas derivados de modo a selecionar o comprimento de onda ao
qual a absorvância é máxima. Consegue-se assim uma escala mais sensível, ie para uma
determinada variação de concentração, a variação de densidade ótica é a máxima.
As proteínas plasmáticas estão livres no plasma, sob a forma de dispersão coloidal,
não necessitando de prévio tratamento com detergente para a sua quantificação.
Pelo constrários, no caso das proteínas membranares, há que libertá-las dos
lípidos que constituem as membranas celulares. Para tal é imperativo o uso de um
detergente (p.e. dodecil sulfato de sódio, SDS), que separa os constituintes das membranas
e desnatura as proteínas, permitindo uma interacção mais eficaz com o reagente de
deteção.
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Ano Lectivo 2011/2012
BIOQUÍMICA I
1º Ano
PROTOCOLO DE BANCADA - 5ª AULA PRÁTICA
Determinação da proteinémia
Grupos 1 a 4:
1. Fazer uma curva padrão segundo o esquema:
TUBOS
Albumina 0,4%
H2O
Reagente do
DO (540 nm)
biureto
1
0
ml
2,00 ml
2 ml
2
0,25 ml
1,75 ml
2 ml
3
0,45 ml
1,55 ml
2 ml
4
0,65 ml
1,35 ml
2 ml
5
0,85 ml
1,15 ml
2 ml
2. Ler a DO a 540 nm. O tubo 1 deve ser ajustado a zero de absorvância, passando a funcionar
como branco, para que a curva padrão passe na origem do gráfico.
3. Preparar as amostras fazendo uma diluição do soro sanguíneo de 20 vezes com soro
fisiológico.
As amostras devem ser feitas em duplicado e determinada a média.
DO (540 nm)
0,5 ml amostra
1,5 ml H2O
2 ml reagente
0,5 ml amostra
1,5 ml H2O
2 ml reagente
média
Esperar 10 minutos.
4. Ler a DO a 540 nm.
5. Fazer os cálculos para a determinação da quantidade de proteína no soro sanguíneo (mg/ ml;
g/ l), tendo em conta o factor de diluição (20 x). [N 60-80 g/l]
Electroforese de proteínas plasmáticas- Interpretação do proteinograma
CONSIDERAÇÕES GERAIS
A electroforese é a designação genérica de um método que tem como objectivo a
separação e identificação dos constituintes de uma fase sólida com carga, em suspensão numa
fase líquida tamponada, quando se lhe aplica um campo eléctrico contínuo.
Princípio fundamental
As partículas carregadas electricamente deslocam-se num campo eléctrico para o
eléctrodo de sinal contrário; iões positivos (catiões) para o cátodo e iões negativos (aniões) para
o ânodo.
Os aminoácidos, os peptídeos ou as proteínas apresentam carácter anfotérico devido à
coexistência, em cada molécula, de funções ácidas (-COOH) e básicas (-NH2). Assim, as
substâncias anfotéricas, em meio ácido, comportam-se como bases fracas, captando iões H+, e,
em meio alcalino, pelo contrário, actuam como ácidos fracos, libertando protões.
Raramente os grupos -NH2 e -COOH existem em número igual na forma livre. Neste caso,
é ainda mais raro que estes grupos funcionais sejam ionizados igualmente [pK (COOH) = 2,4 e
pK (NH2) = 9-12]. Assim, cada molécula anfotérica possui o seu ponto isoeléctrico
característico. O ponto isoeléctrico é o pH em que uma substância não se desloca sob a
influência do campo eléctrico, ou seja, é electricamente neutra, (tendo o mesmo número de
cargas positivas e negativas).
As propriedades do meio líquido são essenciais na separação electroforética: o pH, a força
iónica, a viscosidade, a constante dieléctrica, a temperatura, conjugam as suas acções para
conferir à espécie molecular que se pretende separar, a mobilidade electroforética dependente
do campo eléctrico do meio tamponado.
A carga eléctrica das proteínas do soro depende do pH do meio. Se o pH é superior ao
ponto isoeléctrico, a proteína fica com carga negativa e migra para o ânodo, mas se o pH é
inferior ao ponto isoeléctrico, a proteína é carregada positivamente e migra para o cátodo. A
velocidade de migração das proteínas na electroforese é directamente proporcional à sua carga
eléctrica e inversamente proporcional ao seu peso molecular. A deslocação das partículas é
ainda influenciada pela força iónica do meio (número de iões do meio) e pela temperatura. Deste
1
modo, numa electroforese mantêm-se constantes o pH e a força iónica do meio, através de uma
solução tampão.
MODALIDADES DE ELECTROFORESE
1) Electroforese livre (de Tiselius), realizada em meio líquido
2) Electroforese de zona ou de suporte, realizada sobre diversos materiais de suporte:
a) Papel de filtro
b) Agarose
c) Acetato de celulose
d) Gel de amido
e) Poliacrilamida
Electroforese de zona
Na electroforese de zona, utilizada em bioquímica clínica, a fase aquosa é estabilizada
sobre um suporte poroso impregnado de solução tampão condutora. A maior aplicação deste
processo diz respeito ao fraccionamento das proteínas e lipoproteínas séricas e acessoriamente
às urinárias e raquidianas.
A electroforese inclui 3 fases:
1ª fase- electroforese propriamente dita, em que há separação das diferentes fracções
proteicas.
2ª fase- revelação (coloração e lavagem dos meios de suporte)
3ª fase- leitura (avaliação quantitativa das diversas fracções).
Quando colocamos as proteínas do soro num campo eléctrico com meio a pH 8,6 (tampão
veronal ou de Michaelis), elas comportam-se como aniões e deslocam-se portanto para o pólo
positivo (pI albumina= 4,5; pI γ-globulina≈ 7,5).
Podemos, em seguida, revelar a electroforese, utilizando corantes específicos, conforme
queremos evidenciar:
2
a) Apenas as cadeias peptídicas – usa-se um corante específico, por exemplo, o amidoschwartz (negro de amido), e obtemos um proteinograma;
b) As fracções glucosídicas das glicoproteínas – usa-se um corante para glúcidos, por
exemplo,
o
Mac.
Manus
(reagente
de
Shiff)
e
obtemos
um
glucidograma
(glicoproteinograma);
c) As estruturas lipídicas das lipoproteínas – usa-se um corante para lipídos, por exemplo, o
negro de Sudão, e obtemos um lipidograma (lipoproteinograma).
PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO – Aplicabilidade clínica
Num proteinograma, observam-se 5 zonas de migração, ou bandas, em que a mais
aniónica corresponde à albumina (menor peso molecular e maior carga eléctrica negativa) e as
seguintes, respectivamente, às globulinas α1, α2, β e γ. Os valores normais destas fracções
proteícas no soro (em %) são:
Albumina
57,1 - 74,3 %
Globulina α1
2,9 - 5,7 %
"
α2
"
β
10,0 - 12,9 %
"
γ
10,0 - 20,0 %
5,7 - 10,0 %
A Albumina é a proteína plasmática que existe em maior quantidade e tem funções
importantes como a regulação da pressão oncótica e o transporte de moléculas.
Das α1 globulinas fazem parte, entre outras, proteínas importantes da fase aguda da
inflamação como é o caso da α1 antitripsina.
Do grupo das α2 globulinas fazem parte proteínas como a haptoglobina, a α2
macroglobulina e a ceruloplasmina.
A transferrina e o fibrinogénio são exemplos de proteínas plasmáticas que migram na
banda das β globulinas.
Das γ globulinas fazem parte as proteínas responsáveis pela resposta imune
(imunoglobulinas, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).
O proteinograma electroforético é solicitado na prática clínica como auxílio diagnóstico,
permitindo avaliar o estado funcional do indivíduo.
3
Estão descritos perfis electroforéticos “típicos” de determinadas situações clínicas.
No caso de tumores produtores de plasmócitos (plasmocitomas) este tipo de estudo
permite identificar o tipo de proteína que é segregada pelas células tumorais.
Muitas doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas estão associadas a um distúrbio
não específico das proteínas séricas, caracterizado por hipoalbuminémia e aumento da
concentração de α-globulina.
A análise electroforética das proteínas do líquido céfalo-raquídeo é um exame
laboratorial útil no diagnóstico de várias doenças neurológicas. Pode dar indicação de alteração
da integridade da barreira hematoencefálica e ainda do funcionamento celular do sistema
nervoso central, nomeadamente se existe ou não síntese intratecal de proteínas, como por
exemplo, de Ig G, na esclerose múltipla.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA
1) Depósito da amostra (soro, LCR, urina) sobre a linha de partida: Deposita-se a
amostra num ponto do suporte e faz-se passar uma corrente contínua através deste. A
"natureza do suporte" é variável, em função da separação que se pretende efectuar. Na maior
parte das vezes procura-se a separação das cinco grandes famílias proteicas do soro
sanguíneo, utilizando-se então como suporte o acetato de celulose.
2) Migração electroforética: As proteínas migram em função da carga e dos factores
atrás referidos parando em diferentes zonas, obtendo-se uma separação na forma de "bandas".
A designada "mobilidade electroforética" exprime a velocidade de migração das partículas e,
consequentemente, a distância de migração relativamente ao ponto de aplicação em função do
campo eléctrico. A superfície carregada da partícula, em contacto com o meio líquido
tamponado, rodeia-se de uma camada de iões cuja concentração e mobilidade variam em
relação com numerosos factores, nomeadamente, a ionização variável dos grupos carboxilo e
amina das proteínas.
3) Fixação e coloração das fracções proteicas.
4) Integração das bandas coloridas - obtenção do perfil electroforético por leitura num
densitómetro a determinado comprimento de onda. A cada banda corresponde um pico cuja
altura é proporcional à intensidade da coloração e cujo integral da superfície é proporcional à
quantidade relativa de proteínas. Assim, num soro normal desenha-se um perfil electroforético
4
com cinco picos, correspondentes a cada uma das fracções proteícas: albumina, α1-globulina,
α2-globulina, β-globulina e γ-globulina.
5) Expressão dos resultados - os resultados de uma electroforese devem ser sempre
acompanhados do teor de proteínas totais do fluído biológico estudado. Assim, será possível
exprimir por cada banda colorida e pela superfície abrangida por cada pico, o coeficiente de
repartição em relação ao conjunto, facto que permite o cálculo de cada fracção em g/l,
conhecendo o teor de proteínas totais.
Tabela I - VALORES NORMAIS* DAS PROTEÍNAS DO SORO PLASMÁTICO E SUAS
PROPORÇÕES
Média (g/dl)
Limites Ns
Média (%)
Limites Ns (%)
(g/dl)
ALBUMINA
4,5
4,0 - 5,2
64,3
57,1 – 74,3
GLOBULINAS
2,5
1,9 - 2,7
35,7
27,1 – 38,6
GLOB. α
0,79
0,6 - 0,9
11,3
8,6 – 12,9
GLOB. α1
0,31
0,2 - 0,4
4,4
2,9 – 5,7
GLOB. α2
0,48
0,4 - 0,7
6,9
5,7 – 10,0
GLOB.β
0,81
0,7 - 0,9
11,6
10,0 – 12,9
GLOB. γ
0,90
0,7 - 1,4
12,9
10,0 – 20,0
TOTAL
7,0
6,0 – 8,0
_______
_______
ALB/GLOB
1,8
1,4 - 2,7
_______
_______
*OS VALORES NORMAIS PODEM VARIAR CONSOANTE O LABORATÓRIO QUE REALIZA A ANÁLISE
Nas globulinas γ, individualizaram-se imunologicamente diversos tipos, que se designam,
actualmente, como sistema das globulinas γ, ou simplesmente, sistema das imunoglobulinas:
IgG, IgA, IgM, IgD e IgE.
5
Aplicações Clínicas da Electroforese
Todos os fluídos biológicos contêm uma mistura heterogénea de proteínas. A
electroforese tem sido aplicada ao estudo de proteínas séricas, proteínas da urina, proteínas do
líquido céfalo-raquídeo, lipoproteínas e glicoproteínas séricas.
A análise electroforética das proteínas séricas ou proteinograma electroforético é um
exame frequentemente requisitado na prática clínica diária, devido ao seu valor no auxílio do
diagnóstico de variadas doenças. O aspecto global do perfil electroforético é por vezes suficiente
para referenciar de imediato algumas anomalias proteicas características de diferentes
entidades nosológicas.
A electroforese desempenha um papel importante, por exemplo, no diagnóstico de
mieloma múltiplo, macroglobulinémia, enteropatia exudativa, sindroma nefrótico, cirrose,
sarcoidose e variadas doenças do colagéneo. Muitas doenças neoplásicas, metabólicas e
infecciosas estão associadas a um distúrbio não específico das proteínas séricas, caracterizado
por hipoalbuminémia e aumento da concentração de α-globulina. Por exemplo, o proteinograma
sérico na cirrose hepática apresenta alterações úteis para o diagnóstico (Fig. 1). A par com uma
diminuição da síntese hepática da albumina, há, em simultâneo, uma subida nas proteínas que
migram nas fracções β e γ (o característico “planalto β- γ”) por diminuição da catabolização das
globulinas no fígado cuja função está deficiente (insuficiência hepática). No caso do síndrome
nefrótico, há perda de proteínas pelo rim, sede inicial desta doença. Simultaneamente, dá-se a
produção de proteínas inflamatórias, que migram normalmente na fracção α2-globulina e que
originam um pico no proteinograma.
A análise electroforética das proteínas do líquido céfalo-raquídeo é um exame
laboratorial útil no diagnóstico de várias doenças neurológicas. Pode dar indicação de alteração
da integridade da Barreira Hemato-Encefálica e ainda do funcionamento celular do Sistema
Nervoso Central, nomeadamente se existe ou não síntese intratecal de proteínas, como por
exemplo, de Ig G, na esclerose múltipla.
Quase todas as proteínas do liquor provêm do soro. Exceptuam-se a β , a γ (gama) e a τ
(Tau) globulinas, a proteína básica da mielina e a proteína fibrilhar glial que são de síntese
intratecal. Entram por pinocitose através dos endotélios capilares e a velocidade de entrada
depende do ponto isoeléctrico das proteínas.
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Proteinograma electroforético Normal:
Fracção α1:
α1-microglobulina
α1–antitripsina
α1–glicoproteína ác.
Fracção β :
Transferrina
β–lipoproteína
β2-microglobulina
Complemento C3
Fracção α2:
α1-macroglobulina
Ceruloplasmina
Haptoglobina
α–fetoproteína
Proteína C-reactiva
Albumina α1
α2
Fracção γ:
IgG, IgA, IgM, IgD, IgE
Paraproteínas
(crioglobulinas)
γ
β
Proteinograma electroforético Anormal:
Alb.
Albumina
α1
α2
β
γ
α1
FRACÇÃO (%)
36,6
3,1
10,9
18,6
30,8
Total
A/G
α2
β
g/dl
3,4
0,9
1,0
1,7
2,8
γ
Valores Referência
4,0 - 5,2
0,2 - 0,4
0,4 - 0,7
0,7 – 0,9
0,7 - 1,4
9,8
0,58
6,0 - 8,0
1,4 - 2,7
Fig. 1- Perfil electroforético das proteínas do soro sanguíneo de um doente com cirrose
hepática (diminuição da albumina, aumento das gamaglobulinas, planalto beta-gama). Em baixo
está representado o gel respectivo.
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Ano Lectivo 2011/2012
BIOQUÍMICA I
1º Ano
PROTOCOLO DE BANCADA - 5ª AULA PRÁTICA
ELECTROFORESE DAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
- Marcar as tiras de acetato e mergulhá-las lenta e cuidadosamente em tampão deixando
embeber pelo menos durante 2 horas ou, de preferência, de um dia para o outro no frigorífico.
- Deitar 500 ml de tampão frio em cada um dos compartimentos da tina e ligá-la durante 15
minutos a 200 V para estabilizar.
- Encher os poços do porta-amostras com os soros ou plasmas a analisar.
- Retirar as tiras do tampão, enxugá-las entre 2 folhas de papel de filtro e colocá-las nas pontes
respectivas.
- Mergulhar os aplicadores nas amostras e fazer uma aplicação prévia sobre papel de filtro para
verificar o bom funcionamento do aplicador.
- Mergulhar de novo nas amostras e aplicar sobre o acetato deixando permanecer durante ± 10
segundos.
- Abrir a tina, introduzir as pontes com as tiras, fechar, verificar de novo a voltagem (200 V) e
deixar correr durante 50 minutos.
- Retirar as tiras de electroforese, cortar as pontas do acetato e corar em Ponceau S a 0,5 %
(em TCA a 5 %) durante 6 minutos.
- Lavar em 2 banhos sucessivos de ácido acético a 5 % até o acetato ficar branco.
- Desidratar em Metanol cerca de 4 minutos.
- Retirar do Metanol, deixar ao ar uns segundos e colocar em solução diafanizadora durante 5
minutos.
- Escorrer as tiras e aplicá-las sobre lâminas de vidro cuidadosamente lavadas com álcool e
secas.
- Secar em placa térmica ou estufa a 50-60 °C duran te ± 10 minutos.
- As tiras são lidas em densitómetro a 525 nm.
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