Coloração de Gram

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Coloração de Gram
Histórico
Hans Crhistian Joachim Gram (1853 – 1938) , bacteriologista dinamarquês,
graduado em medicina em 1878 em Copenhague, viajou por vários países da Europa entre
1878 e 1885, estudando farmacologia e bacteriologia. Em Berlin, em 1884, descobriu o
método que corava as bactérias, amplamente utilizado para classificá-las, e que leva seu
nome. Gram seguiu o método de Paul Ehrlich, utilizando uma solução de anilina e violeta
genciana, um tratamento com lugol (iodo e iodeto de potássio aquoso) e etanol, e observou
que algumas bactérias retinham o corante, como por exemplo os pneumococos, enquanto
que outras não o faziam. Isto permitiu dividir as bactérias em gram positivas e gram
negativas, classificação que é de grande utilidade até os dias de hoje para auxiliar o
tratamento antibiótico. Em 1891 Gram foi nomeado professor de farmacologia da
Universidade de Copenhague, onde mostrou um grande interesse pelos aspectos clínicos da
farmacologia. Foi médico praticamente durante toda sua vida, sendo presidente da
Farmacopéia de 1901 a 1921 e diretor do Departamento de Medicina Interna do Hospital
Frederick de Copenhague, até sua aposentadoria em 1923.
Considerações Gerais
Apesar de algumas modificações na coloração de Gram clássica, o princípio e
resultados são os mesmos. A coloração de Gram consiste em fixar o material clínico na
superfície de uma lâmina de microscopia limpa, utilizando calor ou metanol a 95%. Após a
fixação, o primeiro passo na coloração de Gram é a aplicação do Cristal violeta. Em
seguida um mordente, a solução de lugol, é aplicado para quimicamente ligar o corante
alcalino (cristal violeta) a parede celular da bactéria. A descoloração distingue as células
gram positivas das gram negativas. Após a descoloração os organismos gram positivos
retém o cristal violeta e coram-se em roxo e aqueles gram negativos são clarificados pelo
descorante soltando o corante violeta. A adição de um contracorante, safranina ou fucsina
fenicada, irá corar as bactérias gram negativas em rosa (fucsina) ou vermelho (safranina).
Princípio
A parede celular das bactérias gram positivas contém uma espessa camada de
peptidíoglicano com numerosas ligações cruzadas de ácido teicóico, ao passo que a parede
celular das bactérias gram negativas consiste de uma delgada camada de peptidíoglicanos.
Esta camada de peptidíoglicanos faz com que as bactérias gram positivas resistam a
descoloração, sendo que o contracorante não cora estes microrganismos, e sua aparência
roxa não é alterada. Os organismos gram positivos perdem a integridade de sua parede
celular em casos de tratamento com antibióticos, células velhas, ou por ação de enzimas
Professora Dra. Andréa Emilia Marques Stinghen
Disciplina de Microbiologia Aplicada à Farmácia
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líticas, permitindo que o cristal violeta seja retirado com a descoloração e podem parecer
gram variáveis, com algumas células coradas em rosa e outras coradas em roxo. Por outro
lado, as bactérias gram negativas raramente retém o cristal violeta (aparecendo em
coloração roxa) se a coloração foi bem realizada. As células hospedeiras, como eritrócitos e
leucócitos, coram-se pelo contracorante (fucsina ou safranina) e apareceram em rosa
(fucsina) ou vermelho (safranina).
Bactéria gram positiva
Etapas da coloração
1.
Bactéria na
Lâmina
2.
Primeiro corante
(Cristal violeta)
Bactéria gram negativa
cora-se em roxo
3.
cora-se em roxo
Mordente
(Lugol)
permanece roxo
4.
permanece roxo
Descorante
(Álcool-acetona)
permanece roxo
5.
torna-se incolor
Contracorante
(Fucsina)
permanece roxo
cora-se em rosa
Uma vez corado o esfregaço deve ser observado em imersão (1000 x). Quando o
material clínico é corado pela técnica de Gram, a lâmina é avaliada a presença de bactérias,
reações tintorias (se a bactéria é gram positiva ou gram negativa), morfologia (ex: cocos,
bacilos, etc....), e arranjo celular (cadeias, pares, cachos, etc...). Estas informações fornecem
um resultado preliminar, auxiliando no diagnóstico e terapia antimicrobiana precoce. Na
análise do esfregaço também deve ser avaliado a presença de células inflamatórias (ex:
leucócitos), os quais são indicadores de processo infeccioso. Outras células como células
epiteliais em amostras respiratórias são igualmente úteis na análise da qualidade da
amostra. O fundo do esfregaço geralmente é composto de restos celulares de composição
protéica e cora-se em rosa.
Professora Dra. Andréa Emilia Marques Stinghen
Disciplina de Microbiologia Aplicada à Farmácia
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Representação esquemática dos principais morfotipos
bacterianos
FONTE: MAHON e MANUSELIS JR, 1995
Técnica
a) Cobrir o esfregaço por 1 minuto com solução fenicada de cristal violeta;
b) Lavar em água corrente;
c) Cobrir o esfregaço, durante 1 minuto com solução de lugol fraco;
d) Lavar em água corrente;
e) Descorar com álcool-acetona, até o descorante fluir límpido;
f) Cobrir o esfregaço com solução de fucsina básica por 30 segundos.
g) Lavar em água corrente;
h) Secar e observar ao microscópio sob objetiva de imersão (1000x).
Professora Dra. Andréa Emilia Marques Stinghen
Disciplina de Microbiologia Aplicada à Farmácia
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