universidade federal de minas gerais

Cristianele Lima Cardoso
ESTRUTURA ANATÔMICA, QUÍMICA E INDUÇÃO DE
GALHAS EM MIKANIA NUMMULARIA DC. (ASTERACEAE)
Dissertação
apresentada
ao
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas
Gerais como requisito para a
obtenção do título de Mestre em
Biologia Vegetal.
Orientadora: Dra Rosy Mary dos Santos Isaias
Co-orientador: Hildeberto Caldas de Sousa
Belo Horizonte
2005
FICHA CATALOGRÁFICA
CARDOSO, Cristianele lima
79 p.
Dissertação de Mestrado – Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais. Departamento de Botânica.
1.Galha entomógena; 2. Anatomia; 3.Polifenóis
I. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de
Botânica.
COMISSÃO JULGADORA
-------------------------------------------------Prof. Dr. Geraldo Luiz Gonçalves Soares
---------------------------------------------Prof. Dr. Fernando Henrique A. Vale
-----------------------------------------------------Profa. Dra. Rosy Mary dos Santos Isaias
Orientadora
ÍNDICE
Agradecimentos ................................................................................................................... I
Introdução Geral ................................................................................................................. 1
Capítulo I: Estrutura anatômica e vulnerabilidade do corpo vegetativo de Mikania nummularia
Dc. (Asteraceae) a galhadores ................................................................................................ 8
Resumo ................................................................................................................................... 9
Introdução ............................................................................................................................... 10
Material e métodos .................................................................................................................. 12
Resultados e discussão ............................................................................................................ 14
Figuras ..................................................................................................................................... 20
Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 29
Capítulo II: Padrões morfológicos e histoquímicos em galhas de ambrosia de Mikania
nummularia DC. (Asteraceae)................................................................................................. 34
Resumo ................................................................................................................................... 35
Introdução ............................................................................................................................... 36
Material e métodos ................................................................................................................. 39
Resultados .............................................................................................................................. 41
Figuras .................................................................................................................................... 45
Discussão ................................................................................................................................ 55
Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 59
Capítulo III: Impacto de galhas de ambrosia no teor de fenóis totais em
Mikania nummularia DC. (Asteraceae) ................................................................................. 64
Resumo ................................................................................................................................... 65
Introdução ............................................................................................................................... 66
Material e métodos .................................................................................................................. 68
Resultados e discussão ............................................................................................................ 70
Figuras ..................................................................................................................................... 74
Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 77
AGRADECIMENTOS
A Rosy Mary dos Santos Isaias, pelo incentivo, colaboração e dedicação. Por fazer de
suas férias longos momentos de trabalho.
Ao Professor e co-orientador Hildeberto Caldas de Sousa, por todas as contribuições,
incentivo e confiança.
A todos amigos do laboratório de Anatomia Vegetal pela amizade e auxílio.
À Marta, pela amizade e por incentivar-me nos momentos difíceis.
A Jaciara e Ana Silva pela ajuda e dedicação nas correções, principalmente nas etapas
finais.
Ao Ernesto pela amizade e colaboração nas coletas.
Ao Professor Marco Antônio A. Carneiro pela ajuda na identificação dos insetos.
À Socorro pelo grande auxílio nas medições dos fenóis.
Ao curso de Pós-graduação em Biologia Vegetal pela oportunidade.
Aos meus pais e irmãos pelo apoio em todas as etapas deste trabalho, principalmente nos
momentos mais difíceis. Por acreditarem que sempre podemos melhorar.
Ao meu primo Henry, Tia Cecília e Tio Sérgio pela ajuda, carinho e dedicação desde a
graduação.
À minha Dindinha, pelo incentivo e carinho.
À Eluza pela amizade, ajuda e ótima convivência.
INTRODUÇÃO GERAL
___________________________________________________________________________
A família Asteraceae é cosmopolita, com cerca de 23000 espécies, sendo bem
representada nas regiões temperadas e subtropicais (Cronquist 1981). De acordo com Bremer
(1994), as espécies de Asteraceae estão distribuídas em três subfamílias, 17 tribos e cerca de 1535
gêneros. O gênero Mikania pertence à tribo Eupatorieae e apresenta uma grande variabilidade
morfológica, podendo habitar os mais diversos ambientes (Ritter et al. 1992). Para o gênero, são
citadas cerca de 430 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais da América, das
quais 170 são encontradas no Brasil (King & Robinson 1987). Algumas espécies de Mikania
podem causar sérios problemas como invasoras, outras são utilizadas como medicinais (Ritter
2002).
As espécies de Mikania podem ser herbáceas, arbustivas ou trepadeiras, sublenhosas a
lenhosas. A filotaxia é predominantemente oposta. As folhas apresentam uma série de
características morfológicas importantes para a delimitação das espécies. Podem ser sésseis ou
pecioladas, ter consistência coriácea até membranácea, ser glabras ou pilosas em diferentes
intensidades, com maior densidade de tricomas na face abaxial (Ritter 2002). O gênero possui
várias espécies com ocorrência de galhas, como registrado por Fernandes et al. (2001) e Gagné et
al. (2001).
Mikania nummularia é uma espécie subarbustiva encontrada nos campos de altitude da
Cadeia do Espinhaço. No Parque Estadual do Itacolomi, Ouro Preto, MG, ocorre entre 1200 e
1600 m de altitude, possuindo grande incidência de formação de galhas.
Galhas ou cecídios são células, tecidos ou órgãos de plantas, decorrentes da influência
química e/ou mecânica de organismos parasitos (Mani 1964). Meyer e Maresquelle (1965)
definem galhas como toda a manifestação, positiva ou negativa, de diferenciação anormal,
induzida na planta por um animal ou por um parasita de planta.
As galhas podem ocorrer em fungos, algas, briófitas, pteridófitas, gimnospermas e
angiospermas, sendo predominantes no último grupo. Os galhadores, por sua vez, podem ser
troquelmintos, nematódios, ácaros, insetos, algas, fungos, vírus, bactérias e fanerógamas (Meyer
1987, Mani 1992, Williams 1994). Aquelas causadas por animais, os zoocecídeos, possuem
crescimento limitado e seu desenvolvimento é dependente do estímulo contínuo nas células
vegetais pelo agente indutor. Os zoocecídeos são importantes ferramentas do ponto de vista
ecológico e evolutivo e dentre estes se destacam aqueles causados por insetos, principalmente da
família Cecidomyiidae (Diptera), a qual desenvolveu, especialmente o hábito de induzir galhas
(Meyer 1987).
De acordo com Mani (1964), existe um maior número e variedade de galhas nas partes
epígeas das plantas do que nas partes hipógeas. Aproximadamente 70% das galhas da América do
Sul são em folhas, 20% em ramos e galhos, 7% em botões e apenas 1 a 2% em flores, frutos e
raízes. A seleção da planta e órgãos hospedeiros depende comumente da sinalização mecânica
e/ou químicos, como pubescência e metabólitos secundários, detectados pelos fitófagos na
superfície das plantas. Estas sinalizações possuem grande importância, principalmente, durante os
primeiros estágios da escolha da fonte de alimento (Sädler 1986, Woodhead & Chapman 1986).
Na associação biológica entre o indutor da galha e a planta hospedeira, aparentemente, só
o primeiro recebe as vantagens. A planta sofre perda de substâncias, que são desviadas para a
produção de partes não essenciais ao custo das essenciais, além de perturbações no fluxo da seiva
(Mani 1964). Em casos de ataques muito intensos, parte do vegetal ou todo ele pode morrer,
como observado por Taft e Bissing (1988) em carvalhos atacados por cinipídeos.
De acordo com Price et al. (1987) e Fernandes et al. (1987), as galhas, inegavelmente,
representam uma vantagem seletiva para os indutores. Esta hipótese é reforçada pelo
desenvolvimento, em geral, de uma camada de tecido nutritivo na galha, pela proteção contra
variações bruscas de temperatura e pela presença de estruturas que desempenham funções
protetoras, como tricomas glandulares, que secretam substâncias repelentes ou pegajosas, as
quais inibem insetos que poderiam atacar a galha.
Nas galhas entomógenas, não se sabe precisamente quais os mecanismos reguladores do
desenvolvimento. O estímulo que desencadeia as formações das mesmas pode ser mecânico e/ou
químico (Carter 1939, Madden & Stone 1984) e pode ter sua origem na atividade alimentar ou na
oviposição do galhador (Mani 1964, Abrahamson & Weis 1987, Hori 1992, Rohfritsch 1992,
Rohfritsch & Anthony 1992).
Insetos galhadores são altamente específicos (Futuyma 1992) e induzem morfotipos de
galhas característicos para cada sistema galhador-órgão da planta hospedeira. A grande
complexidade das galhas está relacionada às alterações ocorridas nos sistemas de tecidos vegetais
e seu desenvolvimento é regulado pelo galhador (Redfern & Askew 1992).
As mudanças ocorridas em virtude da formação das galhas incluem alterações nos tecidos
de revestimento, preenchimento e vascular (Mani 1964, Meyer & Maresquelle 1983, Vecchi
1999). Podem também ocorrer mudanças nas células, em relação aos metabólitos, os quais estão
envolvidos com a nutrição do galhador ou associadas à sua proteção (Feeny 1975, Cornel 1983,
Meyer & Maresquelle 1983, Meyer 1987, Abrahamson & Weis 1987, Bronner 1992, Rohfritsch
1992, Isaias 1998, Soares et al. 2000).
As abordagens propostas no estudo do sistema galhador-Mikania nummularia visam
esclarecer as diferenças estruturais específicas nos órgãos da planta hospedeira na sinalização
para herbívoros galhadores, caracterizar estruturalmente os morfotipos e elucidar a influência das
variações sazonais do galhador e sua relação com as defesas constitutivas das plantas.
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CAPÍTULO I
ESTRUTURA ANATÔMICA E VULNERABILIDADE DO CORPO VEGETATIVO DE
MIKANIA NUMMULARIA DC. (ASTERACEAE) A GALHADORES
___________________________________________________________________________
Resumo
Os caracteres estruturais e químicos das plantas determinam sua resistência ou vulnerabilidade ao
ataque de herbívoros galhadores. Dentre as características estruturais estão aquelas relacionadas a
esclerofilia e a
pilosidade e dentre as químicas, a produção e acúmulo de metabólitos
secundários. Em uma mesma planta, a variabilidade dessas características pode funcionar como
mecanismo de sinalização diferencial percebido por insetos galhadores na seleção dos órgãos
hospedeiros. Uma espécie de Asteraceae particularmente interessante devido a grande abundância
de galhas em seus órgãos vegetativos é Mikania nummularia. Ao longo de um ano, cem
indivíduos foram coletados no Parque Estadual do Itacolomi, Ouro Preto, MG e analisados em
laboratório quanto ao número de galhas. Órgãos vegetativos sadios foram processados de acordo
com metodologias usuais para o estudo anatômico. Quanto à presença das galhas, o caule
apresentou 91% das infestações, seguido pela folha com 9%. Não foram registradas galhas nas
raízes. Em M. nummularia, as características estruturais e químicas dos caules comumente tidas
como anti-herbivóricas parecem ter favorecido o estabelecimento e sobrevivência dos herbívoros
galhadores. Já as raízes, embora estruturalmente favoráveis, encontram-se em ambiente de pouca
exploração pelos galhadores. As folhas, por sua vez, podem ser sítios alternativos de oviposição.
Palavras chaves: anatomia, galhas, Mikania nummularia, vulnerabilidade.
Introdução
Os caracteres estruturais e químicos das plantas determinam sua resistência ou vulnerabilidade ao
ataque de herbívoros. As características estruturais incluem esclerofilia e pilosidade (Woodman
& Fernandes 1991, Fernandes 1994) e as químicas, a produção e acúmulo de metabólitos
secundários (Gottlieb et al. 1996). A epiderme das plantas pode apresentar barreiras como
cutícula e compostos fenólicos, além de estruturas especializadas denominadas tricomas, que são
divididos em duas categorias: glandulares e não-glandulares (tectores). A quantidade e qualidade
dos tricomas variam de espécie para espécie e em uma mesma planta de órgão para órgão.
Tricomas tectores estão envolvidos nos mecanismos de defesas estruturais, enquanto que os
glandulares, devido a natureza de seu exsudato, atuam também na defesa química, secretando
uma ampla variedade de substâncias tais como terpenóides, taninos e carboidratos (Johnson 1975,
Levin 1973). Todavia, os tricomas podem, para alguns insetos especialistas, funcionar a seu favor
fornecendo proteção contra predadores e parasitóides e atuando na manutenção de um microambiente propício (Woodman & Fernandes 1991).
Metabólitos secundários possuem várias funções, podendo-se citar a defesa contra herbivoria
(Mani 1964, Abrahamson et al. 1991), proteção contra os raios UV e atividade antioxidante
(Gottlieb et al. 1996, Kandaswami & Middleton Jr. 1994). Porém em alguns sistemas podem
funcionar como sinalizadores na relação galhador-planta (Soares et al. 2000).
A presença ou ausência dos caracteres estruturais e químicos parece funcionar como mecanismo
de sinalização diferencial percebido pelos insetos galhadores na seleção de suas plantas
hospedeiras (Dicke 2000, Mayhew 2001). Galhadores são insetos altamente específicos, que
além de localizar a espécie vegetal, necessitam adaptar-se à estrutura e ao metabolismo desta
espécie, com o objetivo de sucesso no estabelecimento da interação (Futuyma 1992). Esta relação
estreita resulta em morfotipos de galhas específicos para cada sistema galhador-órgão da planta
hospedeira, uma vez que, apesar das galhas serem formadas exclusivamente de tecidos vegetais,
o seu desenvolvimento é regulado pelo galhador (Redfern & Askew 1992).
Todos os órgãos das plantas estão sujeitos à formação de galhas, entretanto existe um
maior número e maior variedade nas partes epígeas do que nas partes hipógeas, sendo as folhas as
mais infestadas pelos indutores (Mani 1964, Dreger-Jauffret & Shorthouse 1992, Lima et al.
2000). Este fato pode ocorrer devido à maior disponibilidade de recursos neste órgão, o que
influencia diretamente a diversidade e densidade de insetos fitófagos (Collevatti & Sperber
1997).
Diversos organismos são agentes cecidogênicos (Meyer 1987, Dreger-Jauffret &
Shorthouse 1992, Mani 1992, Williams 1994), entretanto os insetos são os mais abundantes com
diversas ordens capazes de induzirem galhas, podendo-se citar hemípteros, himenópteros,
lepidópteros, coleópteros e dípteros. Os galhadores são capazes de atuar em uma grande
diversidade de famílias de plantas, tendo a família Asteraceae, nas regiões tropicais, um grande
número de infestações (Fernandes et al. 1997, Gonçalves-Alvim & Fernandes 2000, Fernandes et
al. 2001). Dentre as Asteraceae, o gênero Mikania possui várias espécies susceptíveis à indução
de galhas, como registrado por Fernandes et al. (2001) e Gagné et al. (2001).
Mikania nummularia é uma espécie subarbustiva encontrada nos campos de altitude da
Cadeia do Espinhaço. No Parque Estadual do Itacolomi, Ouro Preto, MG, é encontrada entre
1200 e 1600 m de altitude. Apresenta grande incidência de galhas causadas por insetos, o que
pode estar relacionado ao ambiente estrutural e químico de seus órgãos vegetativos. O objetivo
deste trabalho é relacionar as características estruturais e químicas do corpo vegetativo de M.
nummularia com a sua vulnerabilidade a herbívoros galhadores.
Materiais e Métodos
Os espécimes de Mikania nummularia utilizados no presente estudo foram obtidos em
uma população localizada no Parque Estadual do Itacolomi, nas coordenadas de 20o 25’ 47,3’’S e
43o 29’ 03,4’’W . O Parque está situado a sudeste de Belo Horizonte-MG, nos municípios de
Ouro Preto e Mariana, e segundo Sousa et al. (1998), tem uma área de 7543 ha, apresentando
como principais tipos vegetacionais florestas estacionais semideciduais e ripárias, e campos
rupestres, onde se localizam os indivíduos da espécie em questão.
A coleta de indivíduos foi realizada bimestralmente no ano de 2001, da seguinte forma:
em um transecto no sentido norte-sul foram coletados, aleatoriamente, 20 indivíduos com todo o
corpo vegetativo (primeira coleta) e 80 com somente o corpo aéreo (demais coletas), totalizando
uma amostragem final de 100 indivíduos. As galhas em cada órgão vegetativo foram contadas.
Para estudos anatômicos, porções de órgãos vegetativos de plantas sadias foram fixadas
em FAA (formaldeído 37%, ácido acético e etanol 50oGL) (Johansen,1940), ainda no campo, por
cerca de 48 horas e, em seguida, estocadas em etanol 70oGL.
Para a montagem de lâminas permanentes, fragmentos do material fixado foram desidratados em
série n-butanólica e incluídos em Histosec (Kraus & Arduin 1997). O material foi cortado em
micrótomo rotatório (Jung-BIOCUT mod. 2035), com espessura de 12-14 µm e afixado às
lâminas utilizando-se adesivo de Bissing (Kraus & Arduin 1997). Após hidratação em série
etanólica, os cortes foram submetidos à coloração em safranina e azul de astra (1:9 v/v) (Kraus &
Arduin 1997), desidratados em série etanólica e montados em Entellan.
Cortes transversais, à mão livre, foram clarificados em solução de hipoclorito de sódio 50% e
corados com safranina e azul de astra (1:9 v/v) (Kraus & Arduin 1997). Os mesmos foram
montados entre lâmina e lamínula com gelatina glicerinada de Kaiser (Kraus & Arduin 1997).
A epiderme foi dissociada em mistura de Jeffrey (ácido crômico 10%:ácido nítrico 10%, 1:1, v/v)
(Johansen, 1940), lavadas em água destilada e coradas com azul de astra (Kraus & Arduin 1997).
As lâminas contendo os fragmentos destacados foram montadas em gelatina glicerinada de
Kaiser (Kraus & Arduin, 1997).
Foram realizados testes histoquímicos para a detecção de polifenóis, lipídios e amido.
Polifenóis fenólicas foram testados em material fixado em FAA, pela reação com solução de
cloreto férrico 2% em etanol 95 oGL (Gahan 1984). A presença de lipídios foi analisada em
material recém coletado através da reação com Solução saturada de Sudan black B em etanol 70
o
GL (Pearse 1968) ou de Sudan red B em etanol 70 oGL (Brundett et al. 1991) e a presença de
amido foi investigada com reagente de Lugol (Jensen 1962).
As fotomicrografias foram obtidas utilizando-se fotomicroscópio (Olympus – BH2/BHS) e
câmara digital (Motic 3500) acoplada ao microscópio (Olympus modelo BH2-BHS).
Resultados e discussão
Morfologia e Insfestação
Os indivíduos de Mikania nummularia (figura 1) estudados, são subarbustos que variam
de 18 a 30 cm de altura. Apresentam sistema radicular axial, caule ereto, com muitas
ramificações, folhas inteiras com margem crenada e filotaxia oposta.
Em M. nummularia, há uma porcentagem maior de galhas em caules (91%), seguida por
infestação de 9% em folhas (figura 2). A maior abundância das galhas nos caules ocorre ao longo
de todo o ano (figura 3). A preferência dos galhadores pelos caules de M. nummularia se
contrapõe a constatação de diversos autores (cf. Mani 1964, Dreger-Jauffret & Shorthouse 1992)
de que as folhas constituem-se sítios preferenciais de oviposição para herbívoros galhadores. As
raízes não apresentaram galhas no período de amostragem. Este dado corrobora os existentes na
literatura especializada, que mostram uma baixa infestação por organismos galhadores nas partes
hipógeas das plantas (Mani 1964, Dreger-Jauffret & Shorthouse 1992, Lima et al. 2000). A figura
3 representa a ocorrência de galhas ao longo do ano de 2001, mostrando um menor número em
janeiro, em pleno período chuvoso, subindo um pouco em março, e alcançando o máximo em
maio, no inicio do período seco. Em agosto, final do período seco, este número voltou a cair e em
novembro, no início do período chuvoso, a densidade cai bruscamente. Estas variações não foram
ainda elucidads, mas podem estar relacionadas com as condições ambientais e com o ciclo de
vida do galhador e da planta hospedeira.
Estrutura e Vulnerabilidade
Raiz - mesmo aquelas delgadas (ca. de 1mm de diâmetro) já apresentam crescimento
secundário. O sistema de revestimento é formado por epiderme unisseriada com células
isodiamétricas de pequenas dimensões. A camada subepidérmica é uma exoderme com células
isodiamétricas maiores que as células epidérmicas (figura 4). Em algumas amostras, foi
observada periderme, cujo felogênio se instala na camada subjacente à exoderme (figura 5).
O córtex é formado por 5 a 10 camadas de células parenquimáticas entre as quais existem
espaços que não apresentam acúmulo de substâncias (figura 6), diferente do registrado por
Machado et al. (2004) em Smallanthus sonchifolius (Asteraceae), onde os espaços são
armazenadores de substâncias lipídicas. Nas região cortical de raízes de M. nummularia, também
pode ocorrer a diferenciação de algumas células parenquimáticas em esclereídes (figura 6).
Na região mais interna do córtex, em frente aos pólos de floema, ocorrem canais
secretores delimitados por um epitélio formado por 5 a 12 células contendo gotículas lipídicas
(figuras 6 e 7). A presença destes canais, em tal posição, também foi registrada em outras
espécies de Asteraceae por Willians (1954) e Melo-de-Pinna & Menezes (2002), inclusive com a
presença de gotículas lipídicas em espécies de Lychnophora (Luque et al. 1997). Algumas células
que limitam a face interna desses canais apresentam estrias de Caspary (figura 7), o que
demonstra a sua origem endodérmica, conforme relatado em Willians (1954), Bremer (1994),
Melo-de-Pinna & Menezes (2002) e Machado et al. (2003) para outros gêneros de Asteraceae.
O cilindro vascular é formado por 5 a 7 cordões floema
e número igual de pólos de
protoxilema. A parte central é preenchida por fibras do xilema (Figura 4).
As características estruturais e químicas da raiz parecem propiciar um ambiente favorável
a galhadores, como grande área parenquimática e reserva lipídica nos canais secretores. Porém,
tais caracteres não foram atrativos suficientes para os galhadores neste órgão, visto que não
ocorreram galhas. Tal fato pode estar ligado ao menor número de especialistas em formar tais
estruturas nas partes hipógeas das plantas, como relatado por Mani (1964), Dreger-Jauffret &
Shorthouse (1992) e Lima et al. (2000).
Caule – Em início de crescimento secundário apresenta epiderme uniestratificada com
células de paredes poucas espessadas e cutícula delgada (figura 8). A epiderme possui numerosos
tricomas glandulares e tectores (figura 9) e estômatos anomocíticos (figura 10). Os tricomas
glandulares (figura 9) apresentam a porção basal formada por uma célula arredondada, pedúnculo
unisseriado com 5 a 6 células de pequenas dimensões e cabeça secretora formada por uma única
célula de grande dimensão. Os tricomas tectores são plurisseriados, com células mais largas na
porção basal e estreitas na apical (figura 9). A epiderme apresenta grande quantidade de
polifenóis (figura 11).
A camada subepidérmica é a exoderme com células isodiamétricas pequenas. Logo
abaixo, tem-se 8 a 12 camadas de células parenquimáticas (figura 12), que são interrompidas por
parênquima clorofiliano nas regiões sub-estomáticas (figura 13).
Nas camadas intermediárias do parênquima cortical observam-se células em início de lignificação
(figura 14). O cilindro central é um eustelo, que alterna feixes de dimensões variadas. A porção
central do caule é ocupada por parênquima medular constituído por células arredondadas de
dimensões relativamente grandes (figura 15).
Externamente ao cilindro central, encontra-se uma endoderme com a presença nítida de estrias de
Caspary (figura 14) e de grãos de amido (figura 16). Há também grande quantidade de canais
delimitados em parte pela endoderme (figura 14). Hoehne et al. (1952) também registraram a
presença de endoderme com estrias de Caspary em caules de espécies de Asteraceae. A existência
de estrias de Caspary e bainha amilífera em Asteraceae não é regra, podendo ocorrer endoderme
em caule sem tais características, como registrado em Ianthopappus corymbosus por Melo-dePinna & Menezes (2002).
No caule em crescimento secundário, a exoderme apresenta-se suberificada (figura 17), com
células alongadas anticlinalmente contendo antocianinas (figura 18). Na camada subjacente a
exoderme instala-se o felogênio com nítidas divisões periclinais (figura 19), formando a
periderme (figura 20). O córtex permanece e há diferenciação de 2 a 3 camadas de esclereídes
formando um anel (figuras 19 e 21). O xilema (figura 21) ocupa a maior parte da região central .
O caule de M. nummularia apresentou algumas características que poderiam funcionar como
defesa contra galhadores, como o grande número de tricomas e presença de fenólicos na
epiderme. Os tricomas são considerados como estruturas de defesa mecânica das plantas contra
insetos herbívoros, dificultando o seu deslocamento, ou ainda, a inserção das partes bucais nos
tecidos vegetais (Levin 1973, Woodman & Fernandes 1991, Panda & Khush 1995). Já os
derivados fenólicos são capazes de inibir a alimentação e afetar o crescimento dos herbívoros.
Porém, neste sistema, isto parece não ser uma barreira para os indutores, já que foi verificada
maior incidência de galhas neste órgão. Talvez, na verdade, estas características estejam
funcionando como mecanismos de proteção e de sinalização da planta hospedeira para o
galhador. O grande número de tricomas estaria fornecendo proteção contra os estresses luminoso
e higrotérmico (Woodman & Fernandes 1991, Fahn 1990). Além disso os polifenóis
concentrados nas células epidérmicas inibiriam a ação de predadores e parasitóides pela redução
da palatabilidade. Estes fatos podem indicar o mecanismo adaptativo específico dos insetos
galhadores (Cornell 1983), demonstrando a inexistência de barreiras absolutas à herbivoria
(Herms & Mattson. 1992), uma vez que os herbívoros desenvolvem estratégias para sobrepujar os
mecanismos de resistência de seus hospedeiros (Herms & Mattson 1992).
Outros fatores que poderiam estar relacionados à grande incidência de galhas nos caules são: a
grande área parenquimática que pode funcionar como reserva hídrica, já que o estresse hídrico
pode ser uma constante ameaça ao desenvolvimento dos galhadores (Isaias 1998) e também a
presença de um anel de esclereídes funcionando como proteção mecânica das galhas (Mani 1964,
Kraus et al. 1996).
Folha – o pecíolo apresenta epiderme uniestratificada (figura 22) coberta por tricomas
glandulares e tectores. (figura 23). Somente os tricomas glandulares apresentaram conteúdo
fenólico (figura 23). Logo abaixo da epiderme, encontram-se 6 a 10 camadas de células
parenquimáticas arredondadas com esclereídes intercalados e esparsos (figura 24). Três feixes
vasculares colaterais encontram-se alternados (figura 22 e 24) e circundados cada um por
endoderme, onde são observados grãos de amido próximos à região floemática (figura 25).
Notam-se 1 a 3 canais secretores adjacentes aos feixes vasculares (figuras 24, 26 e 27). De acordo
com Menezes et al. (2003), a ocorrência de esclerênquima é rara em pecíolos, mas é comum a
presença de endoderme com grãos de amido, como observado em M. nummularia.
A lâmina foliar é dorsiventral, pilosa (figura 28) e hipostomática (figuras 29 e 30). A
epiderme na face adaxial é pluriestratificada e na abaxial é uniestratificada, ambas com cutícula
delgada. Na face adaxial, a epiderme possui células básicas com diâmetros maiores do que
aquelas da face abaxial (figuras 28, 29 e 30), característica observada por Breitwieser (1993) e
Breitwieser & Ward (1998) em espécies da tribo Inuleae. Tal relação também foi verificada por
Melo-de-Pinna & Menezes (2002) em Ianthopappus corymbosus. Na face abaxial, verifica-se
maior densidade de tricomas glandulares e tectores uni e pluricelulares (figura 30), o que é
condizente com os dados da literatura para o gênero Mikania (Ritter 2002). Apenas os tricomas
glandulares possuem conteúdo fenólico (figura 31).
O parênquima paliçádico apresenta duas camadas formadas de células altas e estreitas,
sendo que a segunda pode estar interrompida por canais secretores (figura 28). O parênquima
lacunoso possui de 4 a 6 camadas de células curtas que delimitam poucos e pequenos espaços
intercelulares (figuras 28 e 32).
A região da nervura central apresenta epiderme uniestratificada e 2 a 3 camadas de células com
paredes espessas na face abaxial, seguida de 3 a 4 camadas de células parenquimáticas com
esclereídes entremeadas (figura 33). O feixe vascular está associado a canais secretores (figura
34). Estes canais secretores são comuns em Asteraceae (Luque et al. 1997, Melo-de-Pinna &
Menezes 2002). A região lateral da nervura é ocupada por parênquima clorofiliano (figura 28 e
35).
As nervuras de maior porte possuem epiderme adaxial pluriestratificada e abaxial
unestratificada, seguidas por 2 a 3 camadas de células parenquimáticas (figura 32). O feixe
vascular é colateral, não observando-se a presença de canais secretores. As regiões corticais
laterais ao feixe vascular são ocupadas por parênquima clorofiliano (figura 35).
A presença de menor densidade de tricomas na superfície foliar e polifenóis somente nos
tricomas glandulares propiciariam um ambiente adequado aos galhadores, já que tais estruturas
podem ser ditas como protetoras. Porém, para galhadores de M. nummularia tal fato parece
representar fator negativo à indução. Se compararmos com o órgão mais infestado-o caule, as
características acima citadas são relacionadas com a abundância de galhas e a menor incidência
daquelas pode representar condições microclimáticas e bióticas mais estressantes. Nem mesmo a
presença de grande disponibilidade nutricional nas folhas parece ser atrativo, demonstrando que
os caracteres acima citados podem ser variáveis utilizadas na seleção dos órgãos hospedeiros por
parte dos herbívoros galhadores. Além
disso, esses caracteres parecem funcionar como
marcadores para regiões de maior vulnerabilidade, sendo fundamentais na definição da
preferência pelo sítio de oviposição.
Em M. nummularia, as características estruturais e químicas dos caules comumente tidas
como anti-herbivóricas parecem ter favorecido o estabelecimento e sobrevivência dos herbívoros
galhadores. Já as raízes, embora estruturalmente favoráveis, encontram-se em ambiente de pouca
exploração pelos galhadores. As folhas, por sua vez, podem ser sítios alternativos de oviposição,
não sendo preferenciais por questões ainda não elucidadas.
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CAPÍTULO II
PADRÕES MORFOLÓGICOS E HISTOQUÍMICOS EM GALHAS DE AMBROSIA DE
MIKANIA NUMMULARIA DC. (ASTERACEAE)
Resumo
Galhas são descritas como produto da associação interespecífica de uma planta com outro
organismo, caracterizado por um crescimento vegetal anormal em resposta à presença do indutor,
sendo a relação galhador-planta específica. Esta especificidade é responsável por uma grande
variedade morfológica de galhas, que é decorrente de alterações estruturais e químicas ocorridas
nos sistemas de revestimento, fundamental e vascular do órgão hospedeiro. Tendo em vista a
abundância de galhas e os vários morfotipos destas nos órgãos vegetativos de Mikania
nummularia, o objetivo deste trabalho foi identificar, em nível de família, os organismos
indutores dos diferentes morfotipos, caracterizá-los estruturalmente e detectar histoquimicamente
substâncias do metabolismo primário e secundário, avaliando seus possíveis papéis de nutrição e
sinalização. Os diferentes morfotipos em fase de maturação foram coletados no Parque Estadual
do Itacolomi, Ouro Preto, MG e processados em laboratório de acordo com as técnicas usuais em
anatomia e histoquímica. Foram definidos cinco morfotipos de galhas. Três tipos em caules e
dois em folhas. Todas as galhas são de ambrosia e os indutores pertencem à família
Cecidomyiidae. As alterações observadas denotam um padrão de desenvolvimento similar para
todos os morfotipos independentemente do órgão hospedeiro e da forma externa. Muito embora a
formação de morfotipos distintos em uma mesma espécie vegetal possa ser um indicativo da
grande diversidade da fauna de galhadores associados, a semelhança anatômica e histoquímica
apresentada pelas galhas de M. nummularia não permitem a sustentação dos morfotipos
propostos. Deste modo, podemos concluir que aos caracteres morfológicos externos devem ser
associados critérios da morfologia interna para o estabelecimento de morfotipos e para a
avaliação da diversidade de galhas em populações vegetais.
Palavras-chave: galhas de ambrosia, Mikania, anatomia, histoquímica, morfotipos
Introdução
As galhas são descritas como produto da associação interespecífica de uma planta com
outro organismo, caracterizado por um crescimento vegetal anormal em resposta à presença do
indutor (Mani 1964). Existem diferentes tipos de indutores, podendo estes ser vírus, bactérias,
fungos, protozoários, nematódios, ácaros ou insetos (Meyer 1987, Mani 1992, Williams 1994).
Dentre os galhadores, os insetos são considerados os de maior importância ecológica devido aos
aspectos nutricionais e às estratégias de indução e formação da galha (Price et al. 1987). Em
especial, podem-se citar os insetos da família Cecidomyiidae (Diptera) que desenvolveram
principalmente o hábito galhador (Meyer 1987).
As relações galhador-planta são específicas, sendo responsáveis por uma grande
variedade morfológica de galhas (Fernandes et al. 1995, Fernandes et al. 2001). Estas exibem
considerável complexidade nos padrões de desenvolvimento e de estrutura, os quais estão
relacionados com modificações da polaridade e do número de divisões celulares, bem como com
o maior ou menor crescimento das células afetadas (Mani 1964, Meyer & Maresquelle 1983,
Isaias 1998). Estes padrões de desenvolvimento estão associados ao tipo de indutor e às
alterações ocorridas nos sistemas de revestimento, fundamental e vascular do órgão hospedeiro.
As alterações são dependentes do grau de diferenciação e idade das células e dos tecidos no
momento da infestação (Isaias 1998, Vecchi 1999).
Os tecidos que constituem as galhas são formados em virtude de processos fisiológicos
estimulados pelo agente galhador (Mani 1992). Durante seu crescimento, a galha precisa de
recursos energéticos e atua como um dreno (McCrea et al. 1985, Abrahamson & Weis 1987)
desviando para o indutor nutrientes que seriam destinados aos tecidos sadios da planta e
influenciando a performance do galhador (Larson & Whitham 1991, 1997). Assim, forma-se um
tecido nutritivo que representa uma reação da planta à presença do inseto (Bronner 1977,
Shorthouse 1986, Bronner 1992). Porém, em determinados tipos de galhas, a formação deste
tecido não ocorre. Nas galhas de ambrosia, por exemplo, (Bisset & Borkent 1988, Arduin &
Kraus 2001) o galhador se alimenta de hifas de fungo que se desenvolvem dentro da loja. Nas
galhas induzidas por insetos sugadores (Meyer 1987, Rohfritsch & Antony 1992), a nutrição do
galhador é fornecida diretamente via floema.
Além dos tecidos associados à nutrição do indutor, os outros tecidos da planta hospedeira
podem ou não apresentar variações em virtude da formação das galhas. O sistema de
revestimento em galhas pode ser representado por uma epiderme uni ou pluriestratificada, glabra
ou pilosa, ou, ainda, por uma periderme. Pode ocorrer a redução do número de estômatos e a sua
não funcionalidade causada pelo colapso de uma ou de ambas as células-guarda (Mani 1964,
Meyer & Maresquelle 1983, Vecchi 1999). O sistema fundamental é, geralmente, constituído por
várias camadas celulares, sendo freqüente a presença de um tecido mecânico formado por
esclereídes que circundam, parcial ou totalmente, a loja (Mani 1964, Vecchi 1999). Quanto à
vascularização, as galhas podem ter feixes vasculares de duas origens distintas, ou seja, feixes já
existentes no órgão hospedeiro ou feixes formados após a ação do galhador (Mani 1964, Meyer
& Maresquelle 1983).
Além das alterações estruturais, mudanças metabólicas relacionadas com nutrição do
inseto ou de sua proteção são comuns. Nos tecidos nutritivos das galhas podem ser acumulados
lipídios, carboidratos ou proteínas (Meyer & Maresquelle 1983, Meyer 1987, Bronner 1992,
Rohfritsch 1992, Isaias 1998), enquanto que nas células parenquimáticas mais distantes da loja é
comum o acúmulo de metabólitos secundários (Feeny 1975, Purohit et al. 1979, Cornel 1983,
Abrahamson & Weis 1987, Arduin et al. 1991, Isaias 1998, Soares et al. 2000).
Tendo em vista a abundância de galhas nos órgãos vegetativos de Mikania nummularia, o
presente trabalho tem como objetivos identificar, em nível de família, os organismos indutores
dos diferentes morfotipos observados, caracterizar estruturalmente os morfotipos das galhas em
estágio de maturação para sua melhor delimitação, detectar histoquimicamente as substâncias dos metabolismos
primário e secundário e avaliar seus possíveis papéis na nutrição das larvas e sinalização na
interação.
Materiais e Métodos
Galhas de Mikania nummularia foram coletadas em áreas de campo rupestre do Parque
Estadual do Itacolomi, Ouro Preto, MG nas coordenadas de 20o 25’ 47,3’’S e 43o 29’ 03,4’’W.
Os morfotipos foram separados com base em características da forma externa e localização no
corpo vegetativo da planta. Amostras (n=20) de cada morfotipo foram medidas no maior
diâmetro com auxílio de um paquímetro digital (Digimess). Para a obtenção dos galhadores,
ramos de órgãos galhados foram colocados em recipientes de vidro contendo algodão úmido e
tampados com tecido de malha fina. Após a eclosão, os galhadores foram conservados em etanol
70oGL e enviados a especialistas para identificação.
Para os estudos anatômicos, amostras dos morfotipos de galhas foram fixadas em FAA
(formaldeído 37%, ácido acético e etanol 50oGL) (Johansen 1940) por no mínimo 48 horas e em
seguida estocadas em etanol 70oGL. A montagem de lâminas permanentes foi realizada a partir
da desidratação das galhas em série n-butanólica e inclusão em Histosec (Kraus & Arduin
1997). O material foi cortado transversalmente (12-14 µm) em micrótomo rotativo (JungBIOCUT mod. 2035). Os cortes foram afixados às lâminas histológicas utilizando-se adesivo de
Bissing (Kraus & Arduin 1997). Após hidratação em série etanólica, os mesmos foram
submetidos à coloração em safranina e azul de astra (1:9 v/v) (Kraus & Arduin 1997),
desidratados em série etanólica e montados com resina sintética (Entellan).
Cortes transversais à mão livre foram clarificados em solução de hipoclorito de sódio
50%, lavados em água corrente e corados com safranina e azul de astra (1:9 v/v) (Kraus &
Arduin 1997). A montagem entre lâmina e lamínula foi realizada com gelatina glicerinada de
Kaiser (Kraus & Arduin 1997).
Polifenóis foram testados em material fixado em FAA, pela reação com solução de cloreto
férrico 2% em etanol 95oGL (Gahan 1984). A presença de lipídios foi analisada através da
reação com solução saturada de Sudan black B em etanol 70 oGL (Pearse 1968) ou de Sudan red
B em etanol 70oGL (Brundett et al. 1991) e a de amido pelo reagente de Lugol (Jensen 1962).
Fotomicrografias foram obtidas utilizando-se fotomicroscópio (Olympus – BH2/BHS) e
câmara digital (Motic 3500) acoplada ao microscópio (Olympus - BH2/BHS).
Resultados
Os adultos eclodidos das galhas de M. nummularia pertencem a espécies não descritas de
Cecidomyiidae (Diptera). No interior das lojas de todas as galhas, são observadas larvas de
coloração
esbranquiçada.
Além
dos
indutores,
nas
lojas
podem
ser
encontrados
concomitantemente Hymenoptera parasitóides.
Utilizando-se a forma e localização das galhas como parâmetros, foram definidos cinco
morfotipos de galhas em órgãos vegetativos de M. nummularia. Três tipos em caules e dois em
folhas.
Galha caulinar fusiforme: Apresenta-se como um intumescimento alongado (figura 1)
com diâmetro médio de 3,9 mm, podendo ter cor marrom ou verde. Possui de 1 a 3 lojas
esferoidais, instaladas no parênquima medular (figura 2).
A epiderme da galha é uniestratificada e pilosa com células básicas isodiamétricas de
paredes pouco espessadas e tricomas glandulares e tectores uni- ou pluricelulares (figura 3). Na
epiderme foram detectados polifenóis (figura 4). A camada subepidérmica é uma exoderme com
células grandes e isodiamétricas, observando-se a formação do felogênio na camada subjacente
(figura 4). Internamente, notam-se 3 a 7 camadas de tecido parenquimático. Nas camadas
intermediárias do parênquima cortical encontram-se 1 a 3 camadas de esclereídes dispostas em
anel contínuo (figura 3). Encontram-se também alguns canais secretores. O sistema vascular
possui feixes colaterais, com cordões de fibras de floema primário (figura 5). A porção central da
galha é ocupada por 3 a 13 camadas de tecido parenquimático (figura 3), seguida por 2 a 7
camadas de esclereídes que circundam um parênquima formado por numerosas células de
pequenas dimensões e paredes delgadas (figura 6). As lojas delimitadas por este parênquima são
revestidas por hifas de fungos com reação positiva para lipídios (Figura 7).
Galha caulinar elíptica: Apresenta-se como um intumescimento globoso e alongado
(figura 8) com diâmetro médio de 5,9 mm, podendo ter cor marrom ou verde. Possui de 2 a 6
lojas arredondadas instaladas no parênquima medular (figuras 9 e 10).
A epiderme da galha é uniestratificada com células isodiamétricas de paredes pouco
espessadas e com tricomas glandulares e tectores uni- ou pluricelulares (figura 11). A epiderme
apresenta polifenóis (figura 12). A camada subepidérmica é uma exoderme com células grandes e
isodiamétricas. Observa-se a instalação do felogênio na camada subjacente (figuras 11 e 12).
Logo abaixo, notam-se 4 a 7 camadas de tecido parenquimático (figura 10). Nas camadas
intermediárias do parênquima cortical encontram-se 1 a 3 camadas de esclereídes dispostas em
anel contínuo (figuras 10 e 11). Canais secretores estão presentes na região cortical (figuras 10 e
11).O sistema vascular possui feixes colaterais com cordões de fibras floemáticas (figura 10). A
porção central da galha é ocupada por 5 a 13 camadas de tecido parenquimático que é seguido
por porções arredondadas formadas por 2 a 7 camadas de esclereídes que delimitam um
parênquima formado por células de tamanho reduzido (figuras 10 e 13). As lojas acham-se
revestidas por hifas de fungos, os quais apresentam conteúdo lipídico (figura 13).
Galha caulinar globosa: Apresenta-se como um intumescimento globoso (figura 14) de
cor marrom ou verde com diâmetro médio de 4,3mm. Possui 1 a 3 lojas arredondadas instaladas
no parênquima medular (figura 15).
A epiderme da galha é uniestratificada com células isodiamétricas de paredes pouco
espessadas (figura 16) e com tricomas glandulares e tectores (figura 17). As células epidérmicas
armazenam polifenóis (figura 18). A camada subepidérmica é uma exoderme com células
grandes e isodiamétricas (figuras 17 e 18) as quais fazem limite interno com 6 a 9 camadas de
tecido parenquimático (figura 16). Nas galhas localizadas nos caules em início de crescimento
secundário, observa-se a instalação do felogênio (figuras 17 e 18). Nas camadas intermediárias do
parênquima cortical observam-se 2 a 3 camadas de esclereídes dispostas em anel contínuo e
canais secretores próximos ao sistema vascular (figuras 16 e 17). O sistema vascular é formado
por feixes colaterais delimitados externamente por cordões de fibras floemáticas (figura 16). A
porção central é ocupada por 3 a 9 camadas de tecido parenquimático, seguidas por 2 a 4
camadas de esclereídes que circundam um parênquima com numerosas camadas de células de
tamanho reduzido (figura 19). As lojas são revestidas por hifas de fungos, os quais apresentam
reação positiva para lipídios (figura 20).
Galha peciolar: Apresenta-se como intumescimento globoso (figura 21), de cor verde com
diâmetro médio de 2,6 mm. Possui 1 a 2 lojas arredondadas instaladas na região parenquimática
(figuras 22 e 23).
A epiderme é uniestratificada com células isodiamétricas de paredes pouco espessadas e
coberta com tricomas tectores e glandulares (figura 24). Os tricomas glandulares apresentam
polifenóis (figura 25). Logo abaixo da epiderme, encontram-se várias camadas de células
parenquimáticas com esclereídes entremeadas (figura 26). Formam-se 3 a 7 camadas de
esclereídes que circundam 3 a 10 camadas de células parenquimáticas de tamanho reduzido
(figura 23). Estas delimitam a loja que é revestida por hifas de fungos, as quais apresentam
conteúdo lipídico (figura 27). Três feixes vasculares colaterais podem dispor-se ao redor do anel
esclerenquimático (figuras 22 e 26).
Galha laminar: Apresenta-se como um intumescimento verde e proeminente para ambas
as faces (figura 28) com diâmetro médio de 1,7 mm. Possui loja única, arredondada situada no
mesofilo (figura 29).
A epiderme na face adaxial é pluriestratificada e na face abaxial é uniestratificada. A
epiderme na face adaxial possui células com diâmetros maiores do que aquelas verificadas na
face abaxial. Observam-se poucos tricomas (figura 30 e 31). Abaixo da epiderme formam-se 2 a
4 camadas circulares de esclerênquima circundando um parênquima com células de pequeno
diâmetro dispostas ao redor da loja (figuras 30 e 32). Uma massa de hifas de fungos (figura 32)
com conteúdo lipídico encontra-se no interior da câmara. Os parênquimas paliçádico e esponjoso
são observados nas laterais do anel esclerificado, onde também se verifica a presença de alguns
canais secretores (figura 31). Não há neoformação de tecidos vasculares e as galhas não se
encontram associadas aos feixes. São observados feixes vasculares apenas em tecidos sadios
próximos às galhas.
Discussão
Os galhadores de M. nummularia são Cecidomyiidae (Diptera), família de insetos com
cerca de 8000 espécies descritas (Skuhravá & Skuhrávy 1994), e dentre os Diptera, aquela que
apresenta maior diversidade (Gagné 1994) com, p. ex., cerca de 580 espécies galhadoras somente
no norte da Europa (Meyer 1987). Os cecidomiídeos galhadores desenvolveram com sucesso o
hábito galhador em vários taxa de plantas (Meyer 1987) e possuem um alto grau de
especificidade à suas plantas hospedeiras (Skuhravá et al. 1997). Suas galhas são observadas
principalmente nas folhas, mas podem também ocorrer nos caules (Dreger-Jauffret &
Shourthouse 1992, Fernandes et al. 1993, Gagné et al. 1998, Fernandes et al. 2001, Madeira et al.
2002), assim como observado em M. nummularia.
Quando comparadas com o órgão sadio (ver capítulo 1), as galhas em M. nummularia
apresentam poucas modificações estruturais e histoquímicas indicando que a presença dos
galhadores tem pouca influência nos processos morfogênicos e nos metabolismos primário e
secundário da planta hospedeira. Em todas as galhas, é comum hiperplasia e hipotrofia em torno
das lojas, as quais possuem hifas de fungos e a formação de um anel esclerenquimático. A
formação de células lignificadas foi descrita para diversos sistemas galhador-planta e tem sido
associada à proteção do indutor contra inimigos naturais (Mani 1964, Meyer & Maresquelle
1983, Kraus et al. 1996). Entretanto, a presença de parasitóides nas galhas de M. nummularia
indica que o anel esclerenquimático não confere proteção eficaz ao galhador, conferindo suporte
mecânico às galhas como proposto por Shorthouse (1973).
Nas galhas foliares, houve sensível diminuição do número de tricomas nas laminares e
ausência de endoderme nas peciolares. A redução dos tricomas pode ser ocasionada por divisões
ou expansão das células epidérmicas básicas ocorridas após a diferenciação dos precursores dos
tricomas, tornando-os mais espaçados, como descrito por Glover (2000) para o crescimento foliar
padrão. A não diferenciação da endoderme pode indicar uma interrupção ou desvio no processo
de diferenciação dos tecidos do hospedeiro. A não formação de tecidos comuns aos órgãos sadios
já foi observada por Lalonde e Shourthouse (1984) em galhas do tefritídio Urophora carduii em
Cirsium arvense e é um fenômeno bastante comum em galhas (Dreger-Jauffret & Shorthouse
1992, Rohfritsch & Anthony 1992).
As hifas de fungos presentes nas lojas das galhas de M. nummularia são, provavelmente,
provenientes de conídios, introduzidos no tecido vegetal durante a oviposição como observado
por Bisset & Borkent (1988). E, de modo semelhante, às galhas de Cecidomyiidae em Baccharis
dracunculifolia (Arduin & Kraus 2001), ocorrem exclusivamente na loja. A ampla ocorrência dos
fungos e a ausência de tecido nutritivo nas galhas de M. nummularia indicam serem as hifas,
ricas em lipídios, a única fonte de alimento para as larvas dos cecidomiídeos. Desta forma,
podemos classificar estas galhas como galhas de ambrosia (Neger 1908 apud Arduin & Kraus
2001, Mani 1964, Arduin & Kraus 2001). Os dípteros indutores de galhas de ambrosia são então
considerados endomicetófagos. Segundo Bisset & Borkent (1988), a endomicetofagia é
considerada um caráter plesiomórfico, do qual surgiu o hábito endofitófago no qual o inseto passa
a se alimentar do tecido nutritivo cuja diferenciação foi por ele induzida.
Diversos autores (Bissett & Borkent 1988, Arduin & Kraus 2001) apontam a importância
das galhas de ambrosia como base para elaboração de modelos evolutivos, através dos quais se
busca interpretar o surgimento e a quase exclusividade do hábito galhador na família
Cecidomyiidae. As galhas de ambrosia constituem modelos de estudos ecológicos interessantes
pelo fato de mostrarem uma interação complexa que acarreta alterações do tecido vegetal.
A estrutura das galhas depende de fatores associados ao hospedeiro e ao galhador
(Dreger-Jauffret & Shorthouse 1992, Abrahamson & Weis, 1987). Como os cecidomiídeos
galhadores de M. nummularia se alimentam dos fungos e não diretamente dos tecidos vegetais,
há que se elucidar o modo pelo qual a forma das galhas é definida. A indução e o
desenvolvimento das galhas são estritamente dependentes da presença do indutor em contato com
os tecidos vegetais (Mani 1964, Mani 1992, Hori 1992), sua estrutura é uma resposta direta da
forma de alimentação do inseto indutor (Rohfritsch 1992). Em M. nummularia, os fungos
endofíticos constituem o sítio de alimentação dos indutores, interferindo, pelo menos
parcialmente, na indução e no desenvolvimento das galhas de ambrosia provavelmente pela
produção de reguladores de crescimento. Todos os crescimentos anormais implicam na atividade
anormal de reguladores de crescimento, e há registros de produção de fitormônios por fungos
patogênicos (Wheeler 1975), mesmo na ausência de anormalidades de crescimento visíveis.
As galhas induzidas por fungos são comumente descritas como formas indistintas (Mani
1964, Mani 1992, Preece & Hick 1994). Segundo Preece & Hick (1994), a principal mudança
histológica causada por fungos galhadores é a hipertrofia celular próximo ao local de instalação
dos soros, seguida de um aumento substancial do volume dos espaços intercelulares. Tendo em
vista a compacidade do tecido parenquimático e as dimensões celulares diminutas nas
adjacências das lojas, podemos tecer algumas inferências sobre a interação M. nummularia
-Cecidomyiidae- Fungi aqui estudada. M. nummularia tem desvios estruturais exclusivamente no
parênquima medular em função da presença dos outros dois organismos, indicando a formação de
um campo cecidogênico espacialmente restrito. Dadas as características fisiológicas dos fungos,
podemos afirmar que eles utilizam os substratos produzidos por M. nummularia para sintetizar as
reservas lipídicas, altamente energéticas, as quais estão sendo utilizadas pelo cecidomiídeo. Além
de agir como um parasita, uma vez que obtém da planta substrato para a síntese dos lipídios
armazenados em suas hifas, o fungo das galhas de ambrosia tem uma relação simbiótica com o
cecidomiídeo. Este por sua vez parasita M. nummularia que é a promotora do abrigo e
mantenedora das bases fisiológicas necessárias ao sistema. As formas utilizadas na definição dos
5 morfotipos de galhas são, pois, produto de uma interação tritrófica. Deste modo, é possível que
a similaridade morfológica dos morfotipos seja conseqüência da intermediação do fungo e não
somente da especificidade Cecidomyiidae-M. nummularia.
Embora os galhadores sejam capazes de induzir galhas nos diversos órgãos vegetais, é
relativamente incomum que uma espécie induza galhas em mais de uma espécie de hospedeiro
(Dreger-Jauffret & Shorthouse 1992). Deste modo a formação de morfotipos distintos em uma
mesma espécie vegetal pode ser um indicativo da grande diversidade da fauna de galhadores
associados (Redfern & Askew 1992, Krishnan & Franceschi 1988, Kraus et al. 2002). Entretanto,
em M. nummularia a semelhança anatômica e histoquímica apresentada por estas galhas não
permitem a sustentação dos morfotipos propostos. As alterações observadas denotam um padrão
de desenvolvimento similar para todos os morfotipos independentemente do órgão hospedeiro e
da forma externa. Deste modo, podemos concluir que aos caracteres morfológicos externos
devem ser associados critérios da morfologia interna para o estabelecimento de morfotipos e para
a avaliação da diversidade de galhas em populações vegetais.
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CAPÍTULO III
IMPACTO DE GALHAS DE AMBROSIA NO TEOR DE FENÓIS TOTAIS EM
MIKANIA NUMMULARIA DC. (ASTERACEAE)
___________________________________________________________________________
Resumo
A família Asteraceae caracteriza-se por espécies pouco lenhosas que investem mais na
biossíntese de derivados das vias do acetato e mevalonato do que na produção de derivados da
via do chiquimato. Apesar deste padrão químico, não se pode descartar a possibilidade de que
essas substâncias sejam importantes sinalizadores para galhadores em uma Asteraceae, como
Mikania nummularia. O impacto das galhas sobre a produção de derivados fenólicos é variável
podendo ser de estímulo ou de inibição. O objetivo do presente estudo é avaliar o impacto de
galhas de ambrosia induzidas por uma espécie ainda não identificada de Diptera: Cecidomyiidae
sobre os níveis de fenóis totais de Mikania nummularia. O conteúdo total de derivados fenólicos
em amostras de caules de plantas sadias, em porções sadias de caules galhados e em galhas isoladas
foi determinado pelo método de Follin-Dennis. Os teores obtidos variaram entre 1,24 e 2,40 mg de
EAT/g, o que corresponde a 0,124% e 0,240% do peso seco de amostra vegetal. A baixa produção
de fenólicos de M. nummularia é coerente com o padrão quimico-evolutivo descrito para
Asteridae, as quais exibem uma forte tendência ao abandono da rota biosintética do chiquimato
que é responsável pela produção da grande maioria dos derivados fenólicos de origem vegetal. O
menor teor de fenóis totais observado no tecido galhado pode ser um indicativo de que o indutor da
galha de ambrosia em M. nummularia e/ou o fungo associado a ele sejam susceptíveis aos efeitos
tóxicos dos derivados fenólicos e a interferência na sua biossíntese seja uma “estratégia de
desarmamento” das defesas químicas da planta hospedeira. A produção de fenólicos em Mikania
nummularia é baixa, sendo influenciada por fatores bióticos (galhas) e abióticos. Além disso, os
fenólicos no sistema fungo-Cecidomyiidae-M.nummularia parecem funcionar como sinalizadores
e não como estruturas anti-herbivóricas.
Palavras-Chave: Galhas de ambrosia, fenóis totais, Mikania nummularia, Asteraceae
Introdução
Metabólitos secundários são substâncias citadas como elementos importantes dos
mecanismos de defesa das espécies vegetais contra os seus predadores (Harborne 1993). Gottlieb
et al. (1996) sugerem que nas angiospermas há um investimento diferencial na produção dessas
substâncias, sendo que táxons predominantemente lenhosos investem mais na produção de
derivados da via do chiquimato, enquanto que espécies pertencentes a táxons predominantemente
herbáceos investem mais na biossíntese de derivados das vias do acetato e mevalonato. A família
Asteraceae, que caracteriza-se por espécies pouco lenhosas (Cronquist 1981, Ritter 2002), é um
exemplo desse segundo padrão químico.
Do ponto de visto químico, as espécies de Mikania (Asteraceae) se caracterizam pela
ocorrência de terpenóides (monoterpenóides, diterpenoides, triterpenóides e sesquiterpenóides), e
de alguns poucos derivados fenólicos da via do chiquimato como por exemplo cumarinas e
flavonóides (Rodrigues et al. 1999). Muito embora esse padrão químico seja característico de um
táxon que investe menos intensamente na biossíntese de fenólicos, não se pode descartar a
possibilidade de que essas substâncias sejam importantes sinalizadores para a biota associada.
Um exemplo disso é a reação de hipersensitividade relacionada a produção de fenólicos
observada em Lactuca spp. (Asteraceae) como resposta a infecção do fungo Bremia lactuca
(Sedlárová & Lebeda, 2001). Confirmando o papel sinalizador dessas substâncias em espécies de
Asteraceae, Abrahamson et al. (1991) observaram variações na produção de fenólicos em
Solidago altissima parasitada por Eurosta solidaginis, um tefritídeo galhador.
Galhas entomógenas podem ser definidas como o resultado de uma modalidade de
parasitismo altamente especializada, na qual um inseto indutor provoca alterações
morfoanatômicas e químicas na espécie vegetal hospedeira (cf. Isaias 1998, Formiga 2003,
Moura 2003). Dentre as alterações químicas mais estudadas, destaca-se o papel estimulador das
galhas na produção de derivados fenólicos (Hartley 1998, Abrahamson & Weiss 1997, Purohit et
al. 1979) ou sua inibição (Kraus & Spiteller 1997, Nyman & Julkunen-Tiito, 2000) em
decorrência do processo cecidogênico. Os autores supracitados basearam suas conclusões em
resultados de uma única análise química. Enquanto, Formiga (2003) verificou que o impacto das
galhas sobre os níveis de fenóis totais em folhas de Aspidosperma spruceanum (Apocynaceae)
apresentou um perfil sazonal, principalmente relacionado a variações na pluviosidade.
Provavelmente os derivados fenólicos têm funções variadas e relacionadas a cada sistema
galhador-planta hospedeira, face as peculiaridades de cada interação.
Em galhas de ambrosia, nas quais ocorre mutualismo entre os insetos indutores e fungos
endofíticos, as variações nos teores de fenólicos ainda não foram investigadas. Hifas provenientes
de conídios, são introduzidas no tecido vegetal durante a oviposição do indutor (Cecidomyiidae,
Diptera) da galha (Bissett & Borkent 1988). O termo ambrosia, proposto por Schmidberger (1836
apud Arduin 2001), designa um grupo de fungos que mantêm relações mutualísticas com alguns
insetos (saúvas, cupins, besouros e dípteros) sendo alguns desses alguns desses só encontrados
nestas associações (Beauverie 1910 apud Arduin & Kraus 2001); foi Neger (1908 apud Arduin &
Kraus 2001) que empregou este termo para as galhas onde estão presentes fungos que servem de
alimento para a larva do cecidomiídeo indutor ("Ambrosiagallen").
O objetivo do presente estudo é avaliar o impacto de galhas de ambrosia induzidas por
uma espécie ainda não identificada de cecidomiídeo sobre os níveis de fenóis totais em Mikania
nummularia DC (Asteraceae). Pretende-se também avaliar a interação da cecidogênese com
fatores ambientais, buscando assim contribuir para a compreensão do papel dos derivados
fenólicos no processo de sinalização para herbívoros galhadores.
Material e Métodos
Local de Coleta e Material Vegetal
Os espécimes de Mikania nummularia utilizados no presente estudo foram obtidos em
uma população localizada em área de campo rupestre do Parque Estadual do Itacolomi, situado a
sudeste de Belo Horizonte-MG, nos municípios de Ouro Preto e Mariana, nas coordenadas de 20o
25’ 47,3’’S e 43o 29’ 03,4’’W. O material testemunho foi depositado no Herbário Professor José
Badini (OUPR 9032), da Universidade Federal de Ouro Preto.
A coleta do material foi realizada bimestralmente no ano de 2001 (janeiro, março, maio,
agosto e novembro), da seguinte forma: em um transecto no sentido norte-sul foram coletados,
aleatoriamente, 20 indivíduos com todo o corpo vegetativo (primeira coleta) e 80 com somente o
corpo aéreo (demais coletas), totalizando uma amostragem final de 100 indivíduos. As galhas
caulinares classificadas como fusiformes foram contadas. Parte das amostras foi acondicionada
em sacos de papel para medição e dosagem de fenólicos.
Análise do Teor de Fenóis Totais
As análises do teor de fenóis totais foram feitas em amostras de caules de plantas sadias, em
porções sadias de caules galhados e em galhas isoladas. O material coletado foi seco à temperatura
ambiente e triturado. Amostras de 1g foram submetidas à extração por maceração estática em
etanol PA na proporção de 1:10 (material vegetal: solvente) 60oC por 1h. Todas as análises foram
realizadas com três repetições.
O conteúdo total de derivados fenólicos do material descrito acima foi determinado pelo
método de Follin-Dennis (Waterman & Mole, 1994). Em resumo, esse método se baseia na análise
espectrométrica dos produtos de reação dos derivados fenólicos presentes nos extratos com o
reagente de Follin-Denis. Esse reagente foi preparado misturando-se 750ml de água com 100g de
tungstato de sódio e 20g de ácido fosfomolíbdico, sendo que tal mistura foi mantida sob refluxo
por 2h. Ao final desse período, o volume do reagente foi aferido para 1L e este foi mantido em
um frasco escuro a 4°C. Os teores de fenóis totais dos extratos de M. nummularia foram obtidos
pela comparação das absorbâncias lidas a 760 nm em espectrofotômetro Uv/Vis (Spectronic 20
Genesys) com as absorbâncias de uma curva padrão de ácido tânico e representados como
miligramas de equivalentes de ácido tânico por grama de matéria seca (mg de EAT/g).
Resultados e Discussão
Variação de fenóis totais em caules de indivíduos sadios de Mikania nummularia
Durante o período de análise foram observadas baixas concentrações de fenólicos nos extratos
de caules de indivíduos sadios de M. nummularia (figura 1). Os teores obtidos variaram entre 1,24 e
2,40 mg de EAT/g, o que corresponde a 0,124% e 0,240% do peso seco de amostra vegetal,
respectivamente. Esses valores se mantiveram relativamente estáveis em todas as coletas,
observando-se um decréscimo acentuado na produção de fenólicos, em novembro de 2001, o mês
com a maior média de precipitação registrada (figura 2). Os máximos de produção de fenólicos em
caules de M. nummularia foram em maio e agosto, meses com as menores médias de precipitações
(figura 2).
A baixa produção de fenólicos de M. nummularia é coerente com o padrão quimicoevolutivo descrito para Asteridae, que segundo Gottlieb et al. (1996) exibem uma forte tendência
ao abandono da rota biossintética do chiquimato que é responsável pela produção da grande
maioria dos derivados fenólicos de origem vegetal.
A variação sazonal observada nos teores de fenóis totais em caules de indivíduos sadios
de M. nummularia sugere a influência dos fatores abióticos na produção dos derivados fenólicos.
Esse resultado é concordante com o descrito por vários estudos recentes (Tattini et al. 2004,
Karageorgou et al. 2002, Winkel-Shirley 2002) que indicam que os estresses luminoso e hídrico
podem ter um grande impacto na biossíntese de derivados fenólicos, como por exemplo
flavonóides e ácidos cinâmicos. Close & McArthur (2002) inclusive contestam o conceito
clássico de que os derivados fenólicos tenham como função principal a defesa contra a
herbivoria. Ao invés disso, esses autores sugerem que a função principal dessas substâncias seria
a proteção contra o estresse luminoso, que tal função se relaciona com a sua atividade
antioxidante e que os níveis de fenólicos variam em função das condições ambientais para
contrapor um dano potencial induzido pelo aumento da radiação luminosa.
Impacto das galhas de ambrosia sobre a variação de fenóis totais em caules de Mikania
nummularia
Em todo o período de realização do presente estudo, as galhas de ambrosia induzidas nos
caules de M. nummularia apresentaram teores extremamente baixos de fenólicos e bastante
inferiores aos obtidos do material sadio padrão, ou seja os caules de plantas sadias (figuras 1 e 3).
A produção de fenólicos nas galhas só é semelhante à observada nos tecidos sadios em novembro
de 2001, o mês com maior média de precipitação (figura 2) e com baixa insolação, sugerindo
mais uma vez que fatores ambientais estejam interagindo
com os fatores bióticos, o que
resultaria na modulação da produção de fenólicos observada no modelo galhador-hospedeiro em
estudo. Tal fato corrobora observações realizadas por Formiga (2003).
Esse resultado sugere que nos tecidos alterados pela cecidogênese ocorre a inibição da
biossíntese de derivados fenólicos. Esse impacto negativo sobre a produção de fenólicos já foi
observado por outros autores (Kraus & Spiteller, 1996; Nyman & Julkunen-Tiito, 2000), entretanto
o mecanismo pelo qual a formação das galhas inibe a produção desses metabólitos derivados do
chiquimato é desconhecido.
O menor de teor de fenóis totais observado no tecido galhado pode ser um indicativo de que
o indutor da galha de ambrosia em M. nummularia e/ou o fungo associado a ele sejam susceptíveis
aos efeitos tóxicos dos derivados fenólicos e a interferência na sua biossíntese seja uma “estratégia
de desarmamento” das defesas químicas da planta hospedeira. Entretanto, a confirmação de tais
hipóteses carece de estudos biossintéticos, assim como estudos metabólicos, fisiológicos e quimioecológicos dos organismos pertencente aos três níveis tróficos em questão.
Nas porções sadias de caules galhados, o impacto da cecidogênese em M. nummularia é
bastante diferente do observado nas galhas. Esse material produz, de maneira geral, teores de
fenóis totais superiores ao material sadio padrão, isto é, os caules de plantas sadias e superiores
aos níveis de fenólicos das galhas (figura 3). A única exceção é notada quando se compara o teor
de fenóis totais no material sadio padrão e o da porção sadia de caules galhados no mês de maio
de 2001.
A análise da figura 4, onde encontram-se representadas as diferenças percentuais entre o
teor de fenólicos da porção sadia dos caules galhados e o teor de fenólicos dos caules de plantas
sadias e de galhas, facilita a visualização da magnitude do estímulo da produção de fenólicos nos
tecidos adjacentes as galhas.
Quando comparado aos tecidos sadios padrão (caules de plantas sem galhas) esse estímulo é
mais acentuado no mês de novembro de 2001 quando atinge 70%. Mais uma vez observa-se a
interação dos fatores bióticos (processo cecidogênico) e abióticos (luz e disponibilidade hídrica) na
modulação da produção de fenólicos em M. nummularia.
São surpreendentes as diferenças na produção de fenólicos em M. nummularia quando se
compara o tecido sadio dos ramos galhados com as galhas, pois o estímulo na produção de fenólicos nos
tecidos adjacentes às galhas é superior durante quase todo o período amostrado. Em janeiro de 2001, mês
no qual esse estímulo é menor, a produção de fenólicos nos tecidos galhados é 97% superior ao
observado nas galhas. Tal aumento na produção de fenólicos atinge um máximo no mês de maio de 2001.
Estímulos tão dramáticos podem ser caracterizados como uma reação hipersensível dos
tecidos adjacentes às galhas. A reação de hipersensitividade em um sistema galhador-hospedeiro
já foi observada por Fernandes et al. (2000) em Bauhinia brevipes. Entretanto, nesse modelo a
reação hipersensível impediu o desenvolvimento de galhas. No modelo do presente estudo, o
aumento de fenóis foi observado em tecidos adjacentes as galhas, o que pode indicar a produção
de elicitores da biossíntese de fenólicos na galha de ambrosia de M. nummularia. Cabe aqui
ressaltar a presença do fungo, o que é característico desse tipo de galha, uma vez que já é
conhecida a ação estimulante de fungos na produção de derivados fenólicos em plantas (Chen &
Chen 2000; Shein et al. 2001).
Segundo Mani (1964), Abrahamson et al. (1991) e Harborne (1993), os metabólitos
secundários atuam na defesa contra herbivoria. Já para Dicke (2000) e Mayhew (2001) a presença
destas substâncias químicas pode funcionar como mecanismo de sinalização diferencial
percebido pelos insetos galhadores na seleção de suas plantas hospedeiras. Nos meses de maio e
agosto ocorre maior concentração de derivados fenólicos, concomitante a um aumento do número
de galhas (figura 5), o que pode ser um indicativo do mecanismo sinalizador dos fenólicos.
Em Mikania nummularia notou-se baixo investimento na produção de fenólicos, sendo a
presença destes influenciada por fatores bióticos (galhas) e abióticos. Além disso, os fenólicos no
sistema fungo-Cecidomyiidae-M.nummularia parecem funcionar como sinalizadores e não como
estruturas anti-herbivóricas.
3,50
mg de EAT/g
3,00
2,50
CPS
2,00
GAL
1,50
CGAL
1,00
0,50
0,00
janeiro
março
maio
agosto
novembro
Figura 3. Impacto das galhas de ambrosia sobre a variação de fenóis totais em caules
de Mikania nummularia. (mg de EAT/g= miligramamas de equivalentes de ácido tânico
por grama de matéria seca, CPS= caules de plantas sadias, GAL= galhas, CGAL=
porção sadia de caules galhados).
180,00
160,00
140,00
120,00
%
100,00
A
80,00
B
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00
janeiro
março
maio
agosto
novembro
Figura 4. Teor de fenóis totais da porção sadia do caule galhado representado como o
aumento percentual relativo do teor de fenóis totais dos caules de plantas sadias (A) e
das galhas de ambrosia de Mikania nummularia. Os valores representados referem-se a
diferença, convertida em percentagem, entre o teor de fenóis totais da porção sadia do
caule galhado e o teor de fenóis totais dos caules de plantas sadias (A) ou galhas (B).
5 ,0 0
4 ,0 0
3 ,0 0
NG P
m g E AT / g
2 ,0 0
1,0 0
0 ,0 0
ja n e ir o
m a rç o
m a io
a gosto
nove m bro
Figura 5. Comparação da variação do número de galhas por planta (NGP) e do teor de
fenóis totais em caules de plantas saidas de Mikania nummularia. (mg de EAT/g=
miligramamas de equivalentes de ácido tânico por grama de matéria seca).
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